專利名稱：新型環(huán)焦磷酸酯類化合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型環(huán)焦磷酸酯類化合物及其制備方法，尤其涉及采用微波輔助的分 子內(nèi)焦磷酸化方法制備的環(huán)焦磷酸酯類化合物。環(huán)腺苷二磷酸核糖(cADPR)是內(nèi)源性的細胞內(nèi)鈣離子激動劑，近年來研究表明它 還可以作為細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的第二信使。由于CADra在細胞內(nèi)易酸解和酶解，而且CADra 類似物合成困難，因而迫切需要穩(wěn)定性強，活性高，合成方便的CADra類似物作為藥理學(xué)工 具，對CADra在細胞內(nèi)的作用機制進行研究。目前合成CADra類似物的方法主要有三種酶法合成、仿生合成和化學(xué)法合成。其 中酶法合成和仿生合成對底物的局限性較大。日本ShUto小組發(fā)明的化學(xué)合成法是目前國 際上制備CADra類似物的主要方法。該方法的關(guān)鍵是分子內(nèi)焦磷酸化反應(yīng)，Shuto小組的 方法是“利用碘為催化劑，使用微量注射泵緩慢的將原料注入到反應(yīng)器中完成焦磷酸化反 應(yīng)”，使用微量注射泵的目的在于保證反應(yīng)原料在反應(yīng)器中始終保持超稀狀態(tài)，以避免原料 發(fā)生分子間二聚。該方法需要超稀溶液環(huán)境，并使用大量的溶劑和嚴格的無水條件(使用 分子篩作為干燥劑)，而且需要長反應(yīng)時間(如IOmg的原料就需要10小時反應(yīng)時間)，這 些因素不僅使得反應(yīng)操作繁瑣，反應(yīng)成本高，而且限制了反應(yīng)的規(guī)模。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中反應(yīng)條件苛刻、反應(yīng)時間極長的缺陷，本發(fā)明的目的在 于提供結(jié)構(gòu)簡單、合成方便、具有良好穩(wěn)定性和活性的環(huán)焦磷酸酯類化合物及其制備方法， 本發(fā)明的目的還在于提供一種微波輔助的分子內(nèi)焦磷酸化方法。為達到上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案本發(fā)明提供具有通式I所示結(jié)構(gòu)的環(huán)焦磷酸酯類化合物 式中的X為OCH2或者CH2，Y為H、鹵素或CH2CH2 = CH2。其中所述鹵素優(yōu)選為I、Br或Cl。在本發(fā)明的實施例中，優(yōu)選所述X為OCH2時，所述Y為H或CH2CH2 = CH2 ；或所述 X為CH2時、Y為H。更優(yōu)選所述X為OCH2時、Y為H。
背景技術(shù)：
5
通式I表示的環(huán)焦磷酸酯類化合物的制備方法，包括如下步驟(1)將500mg 1_疊氮_2，3_丙叉-β-D-核糖(VII)溶于50ml乙腈中，加入等摩爾 質(zhì)量的化合物(IV)，依次加入IO-IOOmol %碘化亞銅，IOOmol %二異丙基乙基胺，當(dāng)Y被取 代時，再加入100-120mol%溴代琥珀酰亞胺或烯丙基溴，室溫攪拌3_15小時后蒸干溶劑， 柱層析使用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，包含產(chǎn)品的洗脫液濃縮后得化合物(VIII)；(2)將300mg化合物(VIII)溶于50ml乙腈中，依次加入5倍摩爾質(zhì)量的三氯氧磷 和二異丙基乙基胺，冰浴條件下攪拌5-10小時，向反應(yīng)混合物中加入0. 2摩爾每升的氫氧 化鈉水溶液，繼續(xù)攪拌0. 5小時，加入稀鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液至中性，蒸干溶劑加入20ml水，使 用乙酸乙酯萃取2次，水相蒸干后C18柱層析，使用乙腈和TEAB緩沖溶液梯度洗脫，包含產(chǎn) 物的洗脫液凍干后得到化合物(IX)。(3)將活化好(使用馬弗爐300°C烘烤7小時)的3A分子篩和IOOmg碘置于反應(yīng) 瓶中，加入50ml無水吡啶，室溫下攪拌，將IOmg化合物(IX)溶解到5ml吡啶后在20小時 內(nèi)注入上述反應(yīng)瓶中，繼續(xù)攪拌1-2小時，過濾掉分子篩，蒸干溶劑后加入IOml水，使用氯 仿萃取3次、水相蒸干后C18柱層析、乙腈和TEAB緩沖液梯度洗脫，包含產(chǎn)物的洗脫液凍干 后得化合物(X)。(4)將化合物⑴溶于IOml 50%的甲酸水溶液中，室溫攪拌2小時后，蒸干溶劑 后，使用乙腈和TEAB緩沖液梯度洗脫的C18柱層析，包含產(chǎn)物的洗脫液凍干后得化合物 (XI)。(5)將化合物(XI)酸化即得通式I化合物。
a. CuX,DIPEA, CH3CN(NBS or CH2 = CHCH2Br) ；b. (1) POCl3, DIPEA，CH3CN, 0°C，12h. (2)0. IM TEAB ；c. I2，3AMS，prydine ；d. 50% HC00H.
將超稀溶液中制備分子內(nèi)焦磷酸酯的方法，即上述步驟(3)改進為微波輔助的分 子內(nèi)焦磷酸化方法，其步驟如下將化合物(IX)溶于5-10ml無水吡啶中，加入10倍摩爾質(zhì)量的碘，60_90°C (90°C 為最佳)微波加熱5-20分鐘后，將反應(yīng)物冷卻至室溫后，蒸干溶劑，加入IOml水，使用氯仿 萃取3次、水相蒸干后C18柱層析、乙腈和TEAB緩沖液梯度洗脫，包含產(chǎn)物的洗脫液凍干后 得到化合物(X)。 在上述制備方法中，原料化合物(IV)按以下步驟制備(1)將0. 4mmol 2_(2_羥乙氧基)乙基胺或4_氨基丁醇溶于無水20ml乙腈 中，依次加入0. 6mmol叔丁氧甲酸酐和1. 2mmol三乙胺，加熱回流10-24小時后冷卻至室 溫，加入10%稀鹽酸中和反應(yīng)液，蒸干溶劑，反應(yīng)殘渣用水和乙酸乙酯萃取，有機相用水洗 三次后加入無水硫酸鈉干燥；蒸干有機相，減壓柱層析，石油醚-乙酸乙酯體系洗脫，包含 產(chǎn)品的洗脫液濃縮后得到化合物(II)；(2)0. 66讓ol化合物(II)溶于IOml干燥的吡啶中，依次加入TPSCl (1. 32mmol)， PSS (1. 32mmol)和1. 32mmol 1_H四唑；室溫攪拌24小時后，蒸干溶劑，常壓柱層析分離；石 油醚-乙酸乙酯體系洗脫，包含產(chǎn)品的洗脫液濃縮后得化合物(III)；(3)將0. 4mmol化合物(III)溶于2ml 25% (ν/ν)三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，冰 浴條件下反應(yīng)0.5小時，蒸干溶劑。反應(yīng)殘渣溶于Iml干燥的二氯甲烷中。將上述反應(yīng)液 在冰浴條件下加入到使用DCC活化好的丙炔酸二氯甲烷溶液中，反應(yīng)12小時后蒸干溶劑， 柱層析，乙酸乙酯石油醚體系分離，包含產(chǎn)品的洗脫液濃縮后得化合物(IV)；所述DCC活化好的丙炔酸二氯甲烷溶液是將35mg的丙炔酸在氬氣保護下溶于 1. 5ml干燥的二氯甲烷中，反應(yīng)液溫度降至_30°C。1. 2倍摩爾量的DCC溶于Iml干燥的二 氯甲烷中，慢慢注入到丙炔酸溶液中，反應(yīng)液在0°C以下攪拌0. 5小時制得。另一原料1-疊氮-2，3_丙叉-β-D-核糖(VII)可以參照文獻制備，例如按照 Carbohydrate Research 232，1992，359-365 中的方法，按如下方法制備1)將四乙酰核糖溶于二氯甲烷中，加入疊氮化鈉和四氯化錫，室溫攪拌72小時 后，中和反應(yīng)液，過濾后蒸干溶劑，柱層析得1-疊氮_2，3，5-三乙?；?β -D-核糖；2)將1-疊氮_2，3，5-三乙?；?β-D-核糖溶于無水甲醇中，加入無水碳酸鉀，室 溫攪拌5小時后蒸干溶劑，柱層析得到1-疊氮-β-D-核糖；將1-疊氮-β-D-核糖溶于丙 酮中，加入碘，室溫攪拌3小時后，加入硫代硫酸鈉水溶液還原過量的碘，蒸干溶劑，柱層析 得1-疊氮_2，3-丙叉-β-D-核糖。 a. (Boc)2O, (CH3CH2)3N ；b. PSS, TPSC1, tetrazole ；c. ICF3COOH, CH2Cl2 ； 2. Propiolic acid, DCC, CH2Cl2 ；d. NaN3, SnCl4, CH2Cl2 ；e. IK2CO3, CH3OH ；2. I2/acetone.本發(fā)明的cTDPRE為膜透性的cADTO類似物，具有結(jié)構(gòu)簡單、合成方便等特點；產(chǎn)物 自身穩(wěn)定性好，可以作為研究CADra介導(dǎo)細胞內(nèi)鈣庫鈣離子釋放，CADra參與的細胞內(nèi)鈣信 號傳導(dǎo)等各方面的材料，是一種理想的藥理學(xué)工具；本發(fā)明的微波輻射下非超稀溶液中的 制備分子內(nèi)焦磷酸酯的方法克服了超稀溶液中制備分子內(nèi)焦磷酸酯反應(yīng)對化學(xué)制備CADPR 類似物反應(yīng)規(guī)模的限制，并且簡化了反應(yīng)設(shè)備，反應(yīng)時間大大縮短到15分鐘，開辟了一條 新的制備cADra類似物的技術(shù)路線，以滿足cADra類似物的大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅用于例證 的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。所有溶劑、原料和試劑如不特別指名，均為分析純或化學(xué)純。溶劑的無水處理按照 常規(guī)方法進行。產(chǎn)物分離、鑒定的儀器和方法薄層層析硅膠GF254、柱層析粗孔硅膠(200-300 目)、硅膠H均為青島海洋化工廠生產(chǎn)；TLC通過254nm紫外檢測或用5%磷鉬酸乙醇溶液 顯色；熔點使用XT-4A型熔點儀測定，溫度計未校正；紅外光譜使用DE-983G紅外光譜儀 測定，溴化鉀壓片；糖漿用液膜法。FAB和MALDI-T0F由VG-ZAB-HS和Bruker APEX II， HR-FAB使用 BrukerBIFLEX III 質(zhì)譜儀測定；紫外光譜使用 Pharmacia LKB Biochrom 4060 分光光度計測定。核磁共振譜使用Varian VXR-500, JEOL AL300, Bruker Advance 300核 磁共振儀測定，氫譜、碳譜以TMS為內(nèi)標；磷譜以85% H3PO4為外標；元素分析使用PE-240C 元素分析儀測定。注射泵用Cole-Parmer公司生產(chǎn)的74900型。HPLC使用Gilson高效液 相儀，使用Delter Paker C-18半制備柱分離。微波合成儀使用瑞典Biotage全自動微波 合成儀。實施例1.7-N-(5”-磷酰基乙氧基乙基)_5，-磷?；?1，2，3-三氮唑-4-酰胺 基-1-β -D-呋喃核糖5’，5” -環(huán)焦磷酸酯的合成(cTDPRE，式I中X = OCH2, Y = H)1.合成叔丁基 2-(2-羥乙氧基)乙基甲酸酯(Tert-butyl-2-(2-hydroxyethoxy)ethylcarbamate)525mg 2_(2_羥乙氧基)乙基胺溶于20ml無水乙腈中，依次加入1. 42g叔丁氧甲 酸酐和1. 75ml三乙胺，加熱回流反應(yīng)24小時，停止反應(yīng)，冷卻至室溫。加入10%的鹽酸中 和反應(yīng)液，蒸干溶劑。反應(yīng)殘渣用水和乙酸乙酯萃取，有機相用水洗三次后加入無水硫酸鈉 干燥。蒸干有機相，減壓柱層析得叔丁基2-(2_羥乙氧基)乙基甲酸酯932mg，無色液體， 收率 91%。1H NMR (300MHz, CDCl3) δ 3. 68-3. 66 (t，2H)，3. 52-2. 46 (m，4H)，3. 28-3. 24 (m， 2H)，1. 38(s,9H).2.合成0-2-[(2-丙炔酰胺)乙氧基]乙基-S，S- 二苯硫基磷酸酯 (0-2-[ (2-propiolamido)ethoxy]ethyl S, S-diphenyl phosphorodithioate)將叔丁基2- (2-羥乙氧基)乙基甲酸酯(135mg，0. 66mmol)溶于干燥的吡啶 (IOml)中，依次加入 TPSCl (461mg，13. 2mmol)，PSS(488mg, 13. 2mmol)和 1_H 四唑(92mg, 13.2mmol)。室溫攪拌24小時后，TLC檢測原料點已經(jīng)消失，蒸干溶劑，常壓柱層析分離得 0-2-[(2-丙炔酰胺)乙氧基]乙基S，S-二苯硫基磷酸酯76mg，無色液體，收率93%。1H NMR (300MHz, CDCl3) δ 7. 26-7. 56 (m，10H)，4. 30-4. 37 (m，2H)，3. 63-3. 66 (t，J = 4. 5Hz, 2H)，3· 37-3. 50 (t, J = 4. 5Ηζ，2Η)，3· 28-3. 30 (m, 2Η)，1. 43(s，9H) ；13C NMR(75MHz, CDCl3)， 155. 8，135. 3，129. 5，126. 4,79. 1,70. 3,69. 6,69. 9,40. 3,28. 4. Anal. (C21H28N1O5P1S2)C 53. 72，H 6. 01，Ν2· 98，F(xiàn)ound :C 53. 97，H 6. 29，N 2. 90.3.合成0-2-[(2-丙炔酰胺)乙氧基]乙基-S，S- 二苯硫基磷酸酯 (0-2-[ (2-propiolamido)ethoxy]ethyl S, S-diphenyl phosphorodithioate)將0-2-[(2-丙炔酰胺)乙氧基]乙基S，S- 二苯硫基磷酸酯(180mg，0. 40mmol) 溶于二氯甲烷(2ml)中，加入三氟乙酸(1ml)，室溫攪拌0.5小時，蒸干溶劑，除去殘留的三 氟乙酸后再溶于干燥的二氯甲烷中。將上述反應(yīng)液在冰浴條件下加入到使用DCC活化好的 丙炔酸(35mg，0. 5mmol) 二氯甲烷溶液中，反應(yīng)12小時后蒸干溶劑，柱層析得0_2_[ (2-丙 炔酰胺)乙氧基]乙基-S，S-二苯硫基磷酸酯140mg，產(chǎn)率86%。1H NMR(300MHz, CDCl3) δ 7. 34-7. 55 (m, 10H)，4. 33-4. 34 (m, 2H)，3. 64-3. 67 (t,2H)，3. 44-3. 49 (t,2H)，
3.41-3. 42(t，2H)，2· 44(s, 1H) ； 13C NMR(75MHz, CDCl3), 152. 3，135. 3，129. 6，126. 3,73. 2， 69. 6,69. 1,67. 2,39. 5. Anal. (C19H20N1O4P1S2)，C 54. 14，H 4. 78，N 3. 32 ；Found :C 54. 41，H
4.80，N 3. 37.4.合成1-疊氮-2，3-丙叉-β -D-核糖將20g(62.9mmol)四乙酰核糖溶于干燥的二氯甲烷(250ml)中，加入疊氮化鈉 8. 17g(125. 8mmol)和四氯化錫(8. 2g，32mmol)，室溫攪拌72小時后，加入飽和碳酸氫鈉中 和反應(yīng)液，過濾后有機相蒸干后柱層析得1-疊氮_2，3，5-三乙酰基-β -D-核糖15g，收率 80%;將上述所得1-疊氮-2，3，5-三乙酰基-β-D-核糖溶于無水甲醇中，加入無水碳酸鉀， 室溫攪拌5小時后蒸干溶劑，柱層析得到1-疊氮_ β -D-核糖；將1-疊氮-β -D-核糖溶 于丙酮中，加入碘lg，室溫攪拌3小時后，加入硫代硫酸鈉水溶液還原碘至溶液無色，蒸干 溶齊U，柱層析得 I-疊氮 _2，3-丙叉-β-D-核糖 9. 3g，收率 86%。1H NMR(300MHz，CDCl3) δ 5. 11 (d, J = 6Ηζ，1Η)，5. 54-4. 50(m，lH)，4. 35-4. 31(m，lH)，3. 89-3. 84(dd，J1 = IOHz, J2 = 3. 6Hz, 1H)，3. 76-3. 70 (dd, J1 = IOHz，J2 = 3. 6Hz)，3. 45 (m, 1H)，2. 56-2. 53 (d, 1H)， 1. 56 (s，3H)，1. 38 (s, each 3H). IR 2010m—1.
5.合成7-N-[[雙_5”-(苯硫基)磷?；鵠乙氧基乙基]_2，，3，_0_亞異 丙基-1，2，3-三氮唑-4-酰氨基-l-β -D-呋喃核糖(7-N-[ [Bis-5”-(phenylthio) phosphoryl]-ethoxyethyl]-2'，3，-O-isopropylidene-1,2，3-triazole-4-amide-l-β ~r ibofuranoside)將1-疊氮-2，3-丙叉- β -D-核糖(26mg，0. 12mmol)溶于乙腈中，力口入 0-2-[(2-丙炔酰胺)乙氧基]乙基-S，S-二苯硫基磷酸酯(50mg，0. 12mmol)，依次加入 碘化亞銅(2mg，0.01mmol)，二異丙基乙基胺(20 μ 1，0. 12mmol)，室溫攪拌3小時后蒸干 溶劑，反應(yīng)殘渣用水和乙酸乙酯萃取，有機相用水洗滌3次后加入無水硫酸鈉干燥。減壓 蒸出乙酸乙酯，粗產(chǎn)物用常壓硅膠柱層析分離得7-N-[[雙-5”-(苯硫基)磷?；鵠乙 氧基乙基]-2，，3，-0-亞異丙基-1，2，3-三氮唑-4-酰氨基-l-β -D-呋喃核糖74mg，收 率 96 %。1H WR(500MHz，CDCl3)S8.15(s，lH)，7.34-7.55(m，10H)，5.82(d，J = 8.5Hz， 1H)，4. 75 (dd, J = 3. 5，7Hz，1H)，4. 56-4. 59 (m, 1H)，4. 52-4. 48 (m, 1H)，4. 33-4. 36 (m, 2H)， 3. 00(dd, J = 13，3Hz，1H)，3. 82(dd, J = 3，13Hz, 1H)，3. 69-3. 71(m，2H)，3. 55-3. 65(m，4H)， 1. 43，1. 61 (each s, each 3H) ；13CNMR(75MHz, CDCl3)，160. 2，142. 1，135. 3，129. 5，126. 3， 126. 0，121. 5,110. 6,86. 2. ,73. 9,73. 3,69. 6,67. 2,67. 0,66. 9,65. 2,39. 0,26. 6,25. 0.31P NMR(CDC13,121. 5Hz, decoupled with 1H)，51. 05 (s) · Anal. (C27H33N4O8P1S2), calculate for C50. 93，H 5. 22，N 8. 80，found C 51. 08，H 5. 42，N 8. 71.6、合成7-N-[5”-(苯硫基)磷酰基乙氧基乙基]_5，-磷酰基_2，，3，_0_亞異丙 基 1，2，3_ 三氮唑-4-酰氨基-l-β -D-呋喃核糖(7-N-[[4，，-(phenylthio)phosphoryl]-b utyl]-5' -phosphoryl-2',3，-O-isopropylidene-1,2,3-triazole-4-amide-l-β -ribofu ranoside)將7-N-[[雙-5”_(苯硫基)磷酰基]乙氧基乙基]_2，，3，-0-亞異丙基_1，2， 3-三氮唑-4-酰氨基-1-β-D-呋喃核糖(13mg，0. 02mmol)溶于乙腈中，依次加入三氯氧磷 (llmg,0. 07mmol)和二異丙基乙基胺(9mg，0. 07mmol)，冰浴條件下攪拌8小時，向反應(yīng)混合 物中加入0. 2摩爾每升的氫氧化鈉水溶液，繼續(xù)攪拌0. 5小時，加入稀鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液至中 性，蒸干溶劑，萃取，柱層析，凍干后得到7-N-[5”-(苯硫基)磷酰基乙氧基乙基]-5’-磷酰 基-2，，3，-0-亞異丙基-1，2，3-三氮唑-4-酰氨基-1- β -D-呋喃核糖的三乙胺鹽11. 5mg, 收率 70%。1H NMR(500MHz, D2O)，δ 8. 57 (s, 1H)，7. 30-7. 55 (m, 5H), 6. 03 (d, J = 8Hz, 1H)， 5. 08(dd, J = 3，8Hz，1H)，4· 94-4. 98 (m, 1H)，4· 69(d, J = 8Hz, 1Η)，4· 26(dd, J = 13. 5，IHz, 1Η)，4· 07-4. 23(m，2H)，3· 87 (dd, J=I, 13. 5Hz, 1Η)，3. 72-3. 74(m，2H)，3· 70 (t, J = IlHz, 2Η) ,3. 56(t, J = 11Ηζ,2Η), 1. 46-1. 60 (each s，each 3Η). 31P NMR(D20,81Hz), δ 18. 31 (br, s), 2. 75 (br, s). HRMS (ESI)m/z calculate for C21H29N4O12P2S1 623. 0983, found623. 0984.7.合成7-N-(5”_磷酰基乙氧基乙基)_2’，3’ -0-亞異丙基-5’ -磷?；?1，2， 3-三氮唑-4-酰氨基-1-β -D-呋喃核糖-5，，5” -環(huán)焦磷酸酯(7-N-[5”-(phenylthio) phosphoryl ethoxyethyl]-5' -phosphoryl-2',3'-O-isopropylidene-1,2,3-triazole_4 -amide-1-β -ribofuranoside)將活化好的3A分子篩2. Og和碘(83mg，326 μ mol)置于反應(yīng)瓶中，加入50ml無水 吡啶，室溫下攪拌，將7-N- [5 ”-(苯硫基)磷?；已趸一鵠-5 ’ -磷?；?2 ’，3 ’ -0-亞異 丙基-1，2，3-三氮唑-4-酰氨基-Ι-β-D-呋喃核糖的三乙胺鹽(IOmgUjym0I)溶于無水
10吡啶(5ml)中，以微量注射泵20小時內(nèi)注入上述反應(yīng)瓶中，注入完畢繼續(xù)攪拌1小時，過濾 掉分子篩，濾餅用少量水洗滌，蒸干溶液，加入水和氯仿分液，水相用氯仿洗滌三次，蒸干水 相，加入1M的TEAB (lml)，蒸干，將上述混合物溶于0. 05M的TEAB緩沖溶液(1ml)，反向C18 柱HPLC分離，梯度為30min內(nèi)0-80%乙腈，0. 05MTEAB流速為5ml/min，檢測波長為260nm， 收集31min主峰，凍干后得7-N-(5”_磷?；已趸一?-2’，3’ -0-亞異丙基-5’ -磷酰 基-1，2，3-三氮唑-4-酰氨基-1- 0 -D-呋喃核糖-5，，5”-環(huán)焦磷酸酯的三乙胺鹽6. 2mg， 收率 72 %。NMR(300Hz, D20) 8 8. 48 (s, 1H)，5. 97 (d, J = 8Hz, 1H), 4. 81-4. 89 (m, 2H)， 4. 57-4. 60 (m, 1H)，4. 23 (d, J = 13Hz, 1H)，3. 85 (d, J = 13Hz, 1H)，3. 39-3. 60 (m, 8H)，1. 30， 1. 45 (each s, each 3H). 31P NMR(D20, 81Hz), 8 -9. 11 (br, s), -11. 4(br, s). HRMS (ESI) calculate for C15H25N4012P2 m/z 515. 0939，found 515. 0925.8.合成7-N-(5”_磷酰基乙氧基乙基)-5，-磷?；?1，2，3-三氮唑-4-酰胺 基-1- 3 -D-呋喃核糖 5，，5” -環(huán)焦磷酸{7-N-[ (4” -phosphoryl)butyl]-2，，3，-0_is opropylidene-5' -phosphoryl-1,2,3-triazole-4-amide_l-旦-ribofuranoside-5，, 4，，-cyclicpyrophosphate} (cTDPRE)將7-N-(5”_磷?；已趸一?-2，，3，_0_亞異丙基_5，-磷?；鵢1，2，3_三 氮唑-4-酰氨基-1-0-D-呋喃核糖_5，，5”-環(huán)焦磷酸酯的三乙胺鹽(6mg，8.4iimol)溶 于50%的甲酸水溶液(1. 5mL)，室溫下攪拌2小時，蒸干溶劑，加入0. 05M的TEAB (2ml)，蒸 干，將上述混合物溶于0. 05M的TEAB緩沖溶液(lml)，反向C18柱HPLC分離，梯度為50min， 0-50 %乙腈，0. 05M TEAB,流速為5ml/min，檢測波長為230nm，收集30min主峰，凍干后得 7-N-(5”_磷?；已趸一?-5，-磷?；?1，2，3-三氮唑-4-酰胺基-1-0 -D-呋喃核 糖 5，，5”_ 環(huán)焦磷酸酯(cTDPRE)三乙胺鹽 4. 6mg，產(chǎn)率為 82. 5 %。NMR(500MHz, D20) 8 8. 67 (s, 1H)，6. 04 (d, J = 9Hz, 1H)，4. 54-4. 56 (m, 2H)，4. 14-4. 18 (m, 1H)，3. 93-4. 02 (m, 2H)，3. 80-3. 87 (m, 2H)，3. 69-3. 73 (m, 2H)，3. 53-3. 66 (m, 4H) 31P NMR(D20,81Hz) -8. 91 (br, s), -11. 39 (br, s). HRMS (ESI) m/z calculate for C12H19N4012P2 473. 0480, found473. 0477.實施例2. cTDPRC 的合成(式(I)中 X = CH2，Y = H)1.合成叔丁基4-羥基丁基氨基甲酸酯將4-氨基-1-丁醇(358mg)溶于無水乙腈(10ml)中，依次加入叔丁氧甲酸酐 (0. 78g)和三乙胺(0.9ml)，60°C加熱反應(yīng)24小時。冷卻至室溫，加入10 %的鹽酸中和反 應(yīng)液，蒸干溶劑。反應(yīng)殘渣用水和乙酸乙酯萃取，有機相用水洗三次后加入無水硫酸鈉干 燥。蒸干有機相，減壓柱層析得到735mg叔丁基4-羥基丁基氨基甲酸酯，收率90%。咕 NMR(300MHz, CDC13)3. 64-3. 60(t，2H)，3. 11-3. 09 (m, 2H)，1. 56-1. 51(m，4H)，1. 30(s,9H).2.合成0-4-Boc-氨基丁基S，S_ 二苯硫基磷酸酯將叔丁基4-羥基丁基氨基甲酸酯(115mg，0.61mmol)溶于干燥的吡啶(10ml) 中，依次加 A TPSC1 (425mg, 1. 22mmol), PSS(450mg, 1. 22mmol)和 1_H 四唑(84mg, 1.2mm0l)。室溫攪拌48小時后，TLC檢測原料點已經(jīng)消失，蒸干溶劑，柱層析分離得 到 269mg O-4-Boc-氨基丁基 S，S-二苯硫基磷酸酯，收率 95 %。iHNMRQOOMHz，CDC13) 8 7. 36-7. 56 (m, 10H)，4. 18-4. 25 (m, 2H)，3. 08-3. 10 (t，2H)，1. 26-1. 72 (m, 4H)，1. 45 (s, 9H). 13C NMR(75MHz, CDC13)，155. 9，135. 3，129. 3，126. 4,79. 1,67. 8,39. 9,28. 4,27. 5， 26. 1. Anal. (C^H^NiO^iS^，C 55. 61, H 6. 22，N 3. 09，F(xiàn)ound C 55. 90，H 6. 44，N 3. 17.
3.合成0-4-(丙炔酰胺)丁基-S，S- 二苯硫基磷酸酯將O-4-Boc-氨基丁基S，S-二苯硫基磷酸酯(181mg，0.40mmol)溶于25% (v/v)三 氟乙酸的二氯甲烷溶液(2ml)中，冰浴條件下反應(yīng)0. 5小時，TLC檢測原料點已經(jīng)完全消失。 蒸干溶劑，用少量甲醇帶干幾次除去三氟乙酸。反應(yīng)殘渣溶于lml干燥的二氯甲烷中。將上 述溶液在冰浴條件下注入到使用DCC活化的35mg丙炔酸(0. 5mmol)干燥二氯甲烷溶液中， 反應(yīng)24小時，蒸干溶劑。反應(yīng)殘渣用水和乙酸乙酯萃取，有機相使用無水硫酸鈉干燥。蒸 干有機相，柱層析得到0-4-(丙炔酰胺)丁基-S，S-二苯硫基磷酸酯140mg，產(chǎn)率為86%。 iffiMROOOMHz，CDC13) 6 7. 34-7. 57 (m, 10H) ,6. 19 (b, 1H), 4. 19-4. 26(m，2H)，3. 23-3. 38 (t, 2H), 2. 80 (s, 1H)，1. 50-1. 75(m,4H). 13C NMR(75MHz, CDC13)，152. 2，135. 3，129. 5，126. 3， 73. 2,67. 7,39. 1,34. 8,27. 5,25. 4. Anal. (C19H20N103P1S2), C56. 28，H 4. 97, N 3. 45，F(xiàn)ound :C 56. 31，H 5. 12，N 3. 42.其它步驟同實施例1，得到cTDPRC(式I中X = CH2, Y = H)。力NMR(500MHz, D20) 8 8. 68 (s, 1H) ,6. 04(d, J = 9Hz, 1H) , 4. 53-4. 57 (m, 2H) , 4. 11-4. 17 (m, 1H)， 3. 94-4. 03 (m, 2H)，3. 82-3. 88 (m, 1H)，3. 67-3. 73 (m, 1H)，3. 54-3. 5 (m, 1H)，3. 37-3. 42 (m, 1H)，1. 71-1. 90 (m, 4H). 31P NMR(81MHz, D20) 8 -10. 64 (br, s)，-11. 59 (br, s). HRMS (ESI)m/z calculate for C12H19N40nP2 457. 0531, found457. 0526.實施例3. cTDPRE 的合成(式(I)中 X = 0CH2, Y = CH2 = CH2CH2)將0-2-[(2-丙炔酰胺)乙氧基]乙基S，S- 二苯硫基磷酸酯50mg(0. 12mmol)， 26mg (0. 12mmol) 1-疊氮-2，3-丙叉-3 _D_ 核糖，2mg 碘化亞銅(0. Olmmol)，29mg 烯丙基溴 (0. 24mmol)和20 yl 二異丙基乙基胺(0. 12mmol)依次加入到5ml干燥的乙腈中，室溫攪拌 3小時，減壓蒸干溶劑。反應(yīng)殘渣用水和乙酸乙酯萃取，有機相用水洗滌3次后加入無水硫 酸鈉干燥。減壓蒸出乙酸乙酯，粗產(chǎn)物用常壓硅膠柱層析分離得到化合物N-[5”-(苯硫基) 磷酰基乙氧基乙基]-2，，3，-0-亞異丙基-5，-磷酰基-5-烯丙基-1，2，3-三氮唑-4-酰 氨基-1-0-D-呋喃核糖，無色糖漿 69mg，收率 85%。NMR(500MHz，CDC13) S 8. 09 (s， 1H), 7. 32-7. 56 (m, 10H), 5. 82 (d, J = 8. 5Hz，1H)，5. 41 (d，J = 7Hz，1H)，4. 76-4. 78 (m， 1H)，4. 68-4. 72 (m, 1H)，4. 45-4. 48 (m, 1H)，4. 30-4. 37 (m, 1H)，4. 20-4. 27 (m, 1H)，4. 05 (dd, J = 3，13Hz，lH)，3. 78-3. 81(dd，J = 3Hz，13Hz，1H)，3. 40-3. 48 (m，1H)，3. 23-3. 29 (m， 1H)，1. 62-1. 78 (m, 7H, )，1. 43 (s, 3H) 13C NMR(125MHz, CDC13) 160. 3，141. 8，135. 3，129. 5， 126. 4，126. 2,110. 6,86. 2,74. 1,73. 4,68. 1,66. 8,65. 3,38. 5,27. 7,26. 5,25. 3,25. 0.31P NMR(CDC13,121. 5Hz, decoupled with 咕)，51. 1 (s) Anal. (Q^NAP^^ , calculate for C 52. 25，H 5. 36，N 9. 03 ； found C 52. 02，H 5. 54，N9. 06.其它步驟同實施例1，得到 cTDPRE (式 I 中 X = 0CH2，Y = CH2 = CH2CH2)。 NMR (500MHz，D20)，S 6. 00—5. 92 (m，1H)，5. 77 (d，J = 9Hz，1H)，5. 19 (d，J = 10Hz, 1H), 5. 00 (d, J = 17. 5Hz)，4. 62-4. 59 (m, 1H)，4. 47 (m, 1H)，4. 19-4. 15 (m, 1H)，4. 07-3. 95 (m, 2H)，4. 01-3. 89(m，2H)，3. 81-3. 55(m，8H). 31P NMR(D20,81Hz), 8 -10. 7(br, s), -12. 5(br, s). HRMS (ESI) calculate for (M+Na+) C15H24N4012P2+Na+, 537. 0758，found 537. 0745.實施例4. cTDPRE 的合成(式 I 中 X = 0CH2，Y = I)將0-2-[(2-丙炔酰胺)乙氧基]乙基-S，S- 二苯硫基磷酸酯(5mg，0. 012mmol)， 1-疊氮-2，3-丙叉-3 -D-核糖(3mg, 0. 014mmol)，碘化亞銅(2. 7mg, 0. 014mmol)，溴代琥珀酰亞胺(2. 5mg,0.014mmol)和二異丙基乙基胺(2 u 1,0. 012mmol)依次加入到干燥的四氫 呋喃(2ml)中，室溫攪拌3小時，停止攪拌，減壓蒸干溶劑。反應(yīng)殘渣用水和乙酸乙酯萃取， 有機相用水洗滌3次后加入無水硫酸鈉干燥。減壓蒸出乙酸乙酯，粗產(chǎn)物用硅膠柱層析分 離得到化合物7-N-[[雙-5”-(苯硫基)磷?；鵠乙氧基乙基]-2’，3’-0-亞異丙基-5-碘 代-1，2，3-三氮唑-4-酰氨基-1- 3 -D-呋喃核糖9mg,收率98%。其它步驟同實施例1，得到cTDPRE (式I中X = 0CH2, Y = I)。實施例5. cTDPRE 的合成(式 I 中 X = 0CH2, Y = Br)將0-2-[(2-丙炔酰胺)乙氧基]乙基-S，S- 二苯硫基磷酸酯(5mg，0. 012mmol)， (3mg，0. 014mmol) 1-疊氮-2，3-丙叉-3 _D_ 核糖，溴化亞銅(2. lmg, 0. 014mmol)，溴代琥珀 酰亞胺(2. 5mg,0.014mmol)和二異丙基乙基胺(2 u 1,0. 012mmol)依次加入到干燥的四氫 呋喃(2ml)中，室溫攪拌3小時，停止攪拌，減壓蒸干溶劑。反應(yīng)殘渣用水和乙酸乙酯萃取， 有機相用水洗滌3次后加入無水硫酸鈉干燥。減壓蒸出乙酸乙酯，粗產(chǎn)物用硅膠柱層析分 離得到化合物7-N-[[雙-5”-(苯硫基)磷?；鵠乙氧基乙基]-2’，3’-0-亞異丙基-5-溴 代-1，2，3-三氮唑-4-酰氨基-1-3 -D-呋喃核糖7mg,收率77%。其它步驟同實施例1，得到cTDPRE (式I中X = 0CH2，Y = Br)。實施例6. cTDPRE 的合成(式 I 中 X = 0CH2，y = CI)將0-2-[(2-丙炔酰胺)乙氧基]乙基S，S- 二苯硫基磷酸酯(5mg，0. 012mmol)， 1-疊氮-2，3-丙叉-3 -D-核糖(3mg, 0. 014mmol)，氯化亞銅(1. 5mg, 0. 014mmol)，氯代溴代 琥珀酰亞胺？(2. 0mg,0. 015mmol)和二異丙基乙基胺(2iU，0. 012mmol)依次加入到干燥 的四氫呋喃(2ml)中，室溫攪拌3小時，停止攪拌，減壓蒸干溶劑。反應(yīng)殘渣用水和乙酸乙 酯萃取，有機相用水洗滌3次后加入無水硫酸鈉干燥。減壓蒸出乙酸乙酯，粗產(chǎn)物用硅膠柱 層析分離得到化合物7-N-[[雙-5”-(苯硫基)磷酰基]乙氧基乙基]_2’，3’-0-亞異丙 基-5-氯代-1，2，3-三氮唑-4-酰氨基-1- 0 -D-呋喃核糖3mg，收率40%。其它步驟同實施例1，得到cTDPRE (式I中X = 0CH2，Y = C1)。實施例7.微波輻射下非超稀溶液中制備分子內(nèi)環(huán)焦磷酸酯方法。將7-N-[5”_ (苯硫基)磷?；已趸一鵠-5，-磷?；?2，，3，-0-亞異丙基-1， 2，3-三氮唑-4-酰氨基-1-0-D-呋喃核糖的三乙胺鹽(10mg，12.4iimol)溶于無水吡啶 (8ml)中，加入(83mg，327iimol)碘，微波輻射15min，溫度保持在90°C。反應(yīng)完畢蒸干溶液， 加入水和氯仿分液，水相用氯仿洗滌三次，蒸干水相，加入的TEAB(lml 1M)，蒸干，將上述混 合物溶于TEAB緩沖溶液(0. 05M, lml)，反向C18柱HPLC分離，梯度為30min內(nèi)0_80 %乙腈， 0.05M TEAB流速為5ml/min，檢測波長為260nm，收集31min主峰，凍干后得7-N-(5”-磷酰 基乙氧基乙基)-2，，3，-0-亞異丙基-5，-磷?；?1，2，3-三氮唑-4-酰氨基-1- 0 -D-呋 喃核糖-5，，5”-環(huán)焦磷酸酯的三乙胺鹽7. 3mg，收率85%。NMR(300Hz, D20) 8 8. 48 (s, 1H) ,5. 97 (d, J = 8Hz，1H)，4. 81-4. 89(m，2H)，4. 57-4. 60(m，1H)，4. 23(d，J = 13Hz，lH)， 3. 85 (d, J = 13Hz, 1H) ,3. 39-3. 60(m，8H)，1. 30，1. 45(s，3H)，1. 43 (s, 3H). 31PNMR(D20, 81Hz), 8 -9. 11 (br, s), -11. 4 (br, s). HRMS (ESI) calculate forC15H25N4012P2 m/z 515.0939， found 515. 0925.實施例8實施例2-6中的反應(yīng)物的微波輻射下分子內(nèi)環(huán)合反應(yīng)步驟同實施例7，得到環(huán)焦
13磷酸酯類化合物，與實施例2-6所得產(chǎn)物一致。 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，對本發(fā)明而言僅僅是說明性的，而非限制性 的。本專業(yè)技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進行許多改變， 修改，甚至等效，但都將落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
具有通式I的環(huán)焦磷酸酯類化合物，式中的X為OCH2或者CH2，Y為H、鹵素或CH2CH2＝CH2。F2009100874989C0000011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)焦磷酸酯類化合物，其特征在于所述Y為I、Br或Cl。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)焦磷酸酯類化合物，其特征在于所述X為OCH2時、Y為H 或CH2CH2 = CH2 ；或所述X為CH2時、Y為H。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)焦磷酸酯類化合物，其特征在于所述X為OCH2時、Y為H。
5.制備權(quán)利要求1所述的環(huán)焦磷酸類化合物的方法，其中包括如下步驟(1)將500mg1-疊氮_2，3-丙叉-β-D-核糖(VII)溶于50ml乙腈中，加入等摩爾質(zhì) 量的化合物(IV)，依次加入IO-IOOmol %碘化亞銅，IOOmol %二異丙基乙基胺，當(dāng)Y被取代 時，再加入100-120mol%溴代琥珀酰亞胺或烯丙基溴，室溫攪拌3_15小時后蒸干溶劑，柱 層析使用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，包含產(chǎn)品的洗脫液濃縮后得化合物(VIII)；(2)將300mg化合物(VIII)溶于50ml乙腈中，依次加入5倍摩爾質(zhì)量的三氯氧磷和二 異丙基乙基胺，冰浴條件下攪拌5-10小時，向反應(yīng)混合物中加入0. 2摩爾每升的氫氧化鈉 水溶液，繼續(xù)攪拌0. 5小時，加入稀鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液至中性，蒸干溶劑加入20ml水，使用乙 酸乙酯萃取2次，水相蒸干后C18柱層析，使用乙腈和TEAB緩沖溶液梯度洗脫，包含產(chǎn)物的 洗脫液凍干后得到化合物(IX)；(3)將活化好(使用馬弗爐300°C烘烤7小時)的3A分子篩和IOOmg碘置于反應(yīng)瓶中， 加入50ml無水吡啶，室溫下攪拌，將IOmg化合物(IX)溶解到5ml吡啶后在20小時內(nèi)注入 上述反應(yīng)瓶中，繼續(xù)攪拌1-2小時，過濾掉分子篩，蒸干溶劑后加入IOml水，使用氯仿萃取 3次、水相蒸干后C18柱層析、乙腈和TEAB緩沖液梯度洗脫，包含產(chǎn)物的洗脫液凍干后得化 合物⑴；(4)將化合物(X)溶于IOml50%的甲酸水溶液中，室溫攪拌2小時后，蒸干溶劑后，使 用乙腈和TEAB緩沖液梯度洗脫的C18柱層析，包含產(chǎn)物的洗脫液凍干后得化合物(XI)；(5)將化合物(XI)酸化即得通式I化合物 а.CuX, DIPEA, CH3CN(NBS or CH2 = CHCH2Br) ；b. (I)POCl3, DIPEA, CH3CN, 0 °C，12h. (2)0. IM TEAB ；c. I2，3AMS，prydine ；d. 50% HC00H.。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的環(huán)焦磷酸酯類化合物的制備方法，其特征在于1-疊氮-2， 3-丙叉-β -D-核糖按如下步驟制備1)將四乙酰核糖溶于二氯甲烷中，加入疊氮化鈉和四氯化錫，室溫攪拌72小時后，中 和反應(yīng)液，過濾后蒸干溶劑，柱層析得1-疊氮_2，3，5-三乙?；?β -D-核糖；2)將1-疊氮-2，3，5-三乙酰基-β -D-核糖溶于無水甲醇中，加入無水碳酸鉀，室溫 攪拌5小時后蒸干溶劑，柱層析得到1-疊氮_ β -D-核糖；將1-疊氮-β -D-核糖溶于丙酮 中，加入碘，室溫攪拌3小時后，加入硫代硫酸鈉水溶液還原過量的碘，蒸干溶劑，柱層析得 1-疊氮_2，3-丙叉-β -D-核糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的環(huán)焦磷酸酯類化合物的制備方法，其特征在于所述化合物 (IV)按以下步驟制備(1)將0.4mmol2-(2-羥乙氧基)乙基胺或4-氨基-1-丁醇溶于無水20ml乙腈中， 依次加入0. 6mmol叔丁氧甲酸酐和1. 2mmol三乙胺，加熱回流10-24小時后冷卻至室溫，加 入10%稀鹽酸中和反應(yīng)液，蒸干溶劑，反應(yīng)殘渣用水和乙酸乙酯萃取，有機相用水洗三次后 加入無水硫酸鈉干燥；蒸干有機相，減壓柱層析，石油醚-乙酸乙酯體系洗脫，包含產(chǎn)品的 洗脫液濃縮后得到化合物(II)；(2)0.66mmol化合物(II)溶于IOml干燥的吡啶中，依次加入TPSCl (1. 32mmol)， PSS (1. 32mmol)和1. 32mmol 1_H四唑；室溫攪拌24小時后，蒸干溶劑，常壓柱層析分離；石 油醚-乙酸乙酯體系洗脫，包含產(chǎn)品的洗脫液濃縮后得化合物(III)；(3)將0.4mmOl化合物(III)溶于2ml25% (ν/ν)三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，冰浴 條件下反應(yīng)0.5小時，蒸干溶劑。反應(yīng)殘渣溶于Iml干燥的二氯甲烷中。將上述反應(yīng)液在 冰浴條件下加入到使用DCC活化好的丙炔酸二氯甲烷溶液中，反應(yīng)12小時后蒸干溶劑，柱層析，乙酸乙酯石油醚體系分離，包含產(chǎn)品的洗脫液濃縮后得化合物(IV)；
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的環(huán)焦磷酸酯類化合物的制備方法，其特征在于所述DCC活化 好的丙炔酸二氯甲烷溶液是將35mg的丙炔酸在氬氣保護下溶于1. 5ml干燥的二氯甲烷中， 反應(yīng)液溫度降至-30°C ；再將1. 2倍摩爾量的DCC溶于Iml干燥的二氯甲烷中，慢慢注入到 丙炔酸溶液中，反應(yīng)液在0°C以下攪拌0. 5小時制得。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的環(huán)焦磷酸酯類化合物的制備方法，其特征在于，所述步驟3) 的分子內(nèi)環(huán)焦磷酸酯替換為以下方法制備將化合物(IX)溶于5-10ml無水吡啶中，加入 10倍摩爾質(zhì)量的碘，60-90°C (90°C為最佳)微波加熱5-20分鐘后，將反應(yīng)物冷卻至室溫 后，蒸干溶劑，加入IOml水，使用氯仿萃取3次、水相蒸干后C18柱層析、乙腈和TEAB緩沖 液梯度洗脫，包含產(chǎn)物的洗脫液凍干后得到化合物(X)。
10.微波輻射非超稀溶液中分子內(nèi)環(huán)焦磷酸酯的制備方法在環(huán)腺苷二磷酸核糖 (cADPR)類似物合成中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了新型環(huán)焦磷酸酯類化合物及其制備方法，本發(fā)明所提供的環(huán)焦磷酸酯類化合物具有通式(I)的結(jié)構(gòu)，其中X為OCH2或者CH2，Y為H、鹵素或CH2＝CH2CH2。本發(fā)明的cTDPRE為膜透性的cADPR類似物，具有結(jié)構(gòu)簡單、合成方便、活性高等特點，產(chǎn)物自身具有穩(wěn)定性好，可以作為研究cADPR介導(dǎo)細胞內(nèi)鈣庫鈣釋放及cADPR參與的細胞內(nèi)鈣信號傳導(dǎo)的藥理學(xué)工具分子。本發(fā)明的微波輻射制備分子內(nèi)焦磷酸酯的方法避免了目前合成分子內(nèi)焦磷酸酯方法的超稀溶液條件，簡化了合成操作，便于實現(xiàn)cADPR類似物的大規(guī)模制備。
文檔編號C07H1/00GK101928313SQ200910087498
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月23日
發(fā)明者張亮仁, 張禮和, 李凌君, 楊振軍 申請人:北京大學(xué)