專利名稱：睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(cntf)的n-末端化學(xué)修飾及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用聚乙二醇(PEG)N末端化學(xué)修飾睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)的 偶合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(Ciliary neurotrophic factor, CNTF)最初是從雞的眼組 織睫狀節(jié)中提取出來，因?qū)逘罟?jié)神經(jīng)元有營養(yǎng)作用并可維持雞副交感神經(jīng)節(jié)的存活而得 名。CNTF是由一個(gè)約200個(gè)氨基酸殘基組成的酸性蛋白質(zhì)，分子量為20 24kD，在第17 位有一個(gè)Cys，分子內(nèi)無二硫鍵，無分泌信號，無N-糖基化位點(diǎn)和信號及肽，能耐受劇烈的 化學(xué)處理(LamA，F(xiàn)uller F, Miller J, et al. Gene, 1991,102 :271_276)。研究發(fā)現(xiàn)，CNTF 具有多種功能，在神經(jīng)系統(tǒng)，肌肉系統(tǒng)，肥胖癥及其相關(guān)疾病的治療中具有重要意義，具有 廣闊的臨床開發(fā)前景。CNTF在機(jī)體內(nèi)，具有半衰期短，免疫原性強(qiáng)，毒性大的特點(diǎn)。這些特點(diǎn)限制了其在 臨床治療中的應(yīng)用。在其他治療用蛋白質(zhì)藥物的研究中，發(fā)現(xiàn)解決蛋白類藥物在機(jī)體內(nèi)半 衰期短，免疫原性強(qiáng)等問題的方法。其中方法之一，是將蛋白質(zhì)與水溶性聚合物共價(jià)結(jié)合成 偶聯(lián)物。其中所使用的水溶性聚合物包括聚乳糖、聚乙二醇、聚合氨基酸等。其中聚乙二醇 的使用較為普遍。聚乙二醇-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物具有優(yōu)秀的臨床適應(yīng)癥。如，良好的熱穩(wěn)定性、 抗酶解、增加水溶性、延長半衰期、降低免疫原性和毒性(Inada，et al. , J. Bioact. And CompatiblePolymers, 5 :343 (1990) ；Delgalo, et al. , Critical Reviews in Therapeutic Drug Carriersystems, 9 249(1992) ；katre, Advanced Drug Delivery Systems，10 :91 (1993))。自1991年第一種用PEG修飾的藥物PEG-ADA被FDA批準(zhǔn)上市 后，制藥公司積極推進(jìn)PEG修飾藥物蛋白質(zhì)的技術(shù)。近幾年上市的的產(chǎn)品有PEG-干擾素、 PEG-粒細(xì)胞集落刺激因子、PEG-天冬酰胺酶、PEG-生長抑素以及PEG-利巴韋林等。而且， 還有數(shù)幾十種的PEG修飾的蛋白藥物處于研究或臨床實(shí)驗(yàn)階段。國內(nèi)專利CN1011185762A報(bào)道用甲氧基聚乙二醇-琥珀酰胺丙酸脂修飾睫狀神經(jīng) 營養(yǎng)因子及其變異體，其修飾位點(diǎn)位于睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子及其變異體賴氨酸的ε _氨基。 修飾后的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子及其變異體保持了睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子在體內(nèi)的活性，改善了睫 狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，能降低睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的免疫原性。但天然睫 狀神經(jīng)營養(yǎng)因子具有9個(gè)賴氨酸，其變異體(A17R63A15)也有7個(gè)賴氨酸。通過甲氧基聚乙 二醇_琥珀酰胺丙酸脂修飾后很難得到均一性的PEG化睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子及其變異體。因 此本公司采用另外一種修飾方法修飾天然睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子及其變異體，該制備方法簡便 易行，且形成均一產(chǎn)物，便于實(shí)施。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種使用聚乙二醇(PEG)N末端化學(xué)修飾睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因 子(CNTF)的偶合物及其制備方法。對于聚乙二醇分子來說，可通過多種方法將其加到蛋白質(zhì)上。總的來說，聚乙二 醇分子是通過一個(gè)分子上的反應(yīng)基團(tuán)而聯(lián)到蛋白質(zhì)分子上的。PEG的偶聯(lián)的主要基團(tuán)是氨 基、巰基和羧基(Veroneee FM, Biomaterials，2001，22 :405)，絕大部分修飾劑主要與Lys 的ε-氨基和N-末端的氨基進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)的。目前存在的方法在任何反應(yīng)基團(tuán)上提供非 選擇性附著反應(yīng)，無論這些基團(tuán)是存在蛋白質(zhì)內(nèi)(如，Lys的側(cè)鏈基團(tuán))，還是在N-末端上， 從而造成產(chǎn)物的不均一性。如果這些治療蛋白質(zhì)在組合物中各批量間有區(qū)別，人們將無法對其生物活性進(jìn)行 預(yù)測。不同位點(diǎn)的的聚乙二醇分子穩(wěn)定性不同，這一情況可能導(dǎo)致這些分子從蛋白質(zhì)中解 離出來。當(dāng)然，如果這些分子是隨機(jī)附著而因此隨機(jī)解離，那么治療用蛋白質(zhì)的藥物動(dòng)力學(xué) 就不可能準(zhǔn)確預(yù)測。從生產(chǎn)角度考慮，獲準(zhǔn)進(jìn)入市場的治療用蛋白質(zhì)的保存將增添麻煩。本發(fā)明采用一種還原性烷基化反應(yīng)的PEG對睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子進(jìn)行修飾，這種PEG 修飾不僅修飾效果好，還因?yàn)檫@種還原性烷基化反應(yīng)選擇性激活CNTF的N-末端殘基的氨基 基團(tuán)，從而使PEG選擇性的附著到CNTF的N-末端，從而形成穩(wěn)定和單一的PEG修飾偶合物。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子，其中每一 分子睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的N-末端與一分子的聚乙二醇類聚合物通過化學(xué)鍵相連。所述聚 乙二醇為醛基活化的mPEG，優(yōu)選丙醛基和丁醛基活化的mPEG，分子量為10KD-40KD。進(jìn)一步 優(yōu)選為丁醛基活化的mPEG，分子量為20KD。所述的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子是天然的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子。優(yōu)選的是，所述的睫狀 神經(jīng)營養(yǎng)因子是天然睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的突變體或天然睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的變異體。更 優(yōu)選的是，所述的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子是的變異體為天然睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子第17位的半胱 氨酸突變?yōu)楸彼?、?3位的谷氨酸突變?yōu)榫彼幔瑫r(shí)去除C端15個(gè)氨基酸的變異體 (A17R63A 15)。本發(fā)明還提供了一種修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的制備方法，包括如下步驟將CNTF的磷酸鹽緩沖液與mPEG-ButyrALD在加入硼氰化鈉4_37°C條件下，反應(yīng) 1-48小時(shí)，然后采用常規(guī)方法進(jìn)行分離純化，獲得本發(fā)明的CNTF偶聯(lián)物。其中，CNTF的磷酸鹽緩沖液中CNTF的濃度為1-lOmg/mL，優(yōu)選CNTF的磷酸鹽 緩沖液中CNTF的濃度為l_2mg;睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子與聚乙二醇類聚合物混合質(zhì)量比為 1 0.5-20，優(yōu)選為1 1 ；反應(yīng)溫度為4-37°C，優(yōu)選的為4°C;反應(yīng)時(shí)間為1-48小時(shí)，優(yōu)選 為24小時(shí)；磷酸鹽緩沖液的pH為4-7，優(yōu)選為6. 5 ；本發(fā)明提供了色譜方法分離CNTF及其CNTF偶合物的方法，包括如下步驟上游構(gòu)建的rhCNTF經(jīng)表達(dá)后，獲得rhCNTF的包涵體。包涵體經(jīng)洗滌后，用包涵 體溶解液(25mmol/L Tris-HCl pH8. 0，7mol/L 鹽酸胍，0. 25mol/L NaCl,2mmol/L EDTA)溶 解包涵體。溶解液中逐步加入10倍體積的復(fù)性液(25mmol/LTriS-HClpH8. 0)，置于4°C、 lOOr/min攪拌，進(jìn)行稀釋復(fù)性。復(fù)性樣品上Q_s印harose層析柱，分別用洗脫液1 (25mmol/ LTris-HCl ρΗ8·0,0. 15mol/L NaCl)和洗脫液 2(25mmol/L Tris-HCl ρΗ8·0,0. 4mol/L NaCl)進(jìn)行洗脫，分別收集洗脫峰。
睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子與聚乙二醇類聚合物經(jīng)反應(yīng)后的的樣品，用10XDDW透析后上 DEAESepharose F. F 層析柱，用洗脫 1 (10mmol/L Tris-HCl pH8. 0,0. 02mol/L NaCl)、洗脫 2(10mmol/LTris-HCl pH8. 0,0. 06mol/LNaCl)、洗脫 3 (10mmol/LTris-HCl pH8. 0,0. 3mol/ LNaCl)進(jìn)行洗脫，分別收集穿透峰及各個(gè)洗脫峰，并取樣分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。經(jīng)DEAE Sepharose F. F層析柱分離的偶合物，上凝膠(用10mmol/L ΡΒ，ρΗ7·4平 衡Superdex 75)柱，再用lOmmol/L PB，pH7.4平衡。隨后收集先后出來的峰I和峰II。分 別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。由上述公開的技術(shù)方案可見，本發(fā)明的CNTF偶聯(lián)物修飾率高，且形成均一產(chǎn)物， 制備方法簡便易行，便于實(shí)施。


圖1為rhCNTF純化的SDS-PAGE圖，其中1為復(fù)性(Q柱上樣)，2為穿透，3為洗脫 1，4為洗脫2，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)圖2為反應(yīng)pH值對修飾反應(yīng)的影響的SDS-PAGE圖，其中1為pH5. 0，2為pH5. 5， 3為pH6. 5，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖3為rhCNTF與PEG的摩爾比對修飾反應(yīng)的影響SDS-PAGE圖，其中1為1 1， 2為1 2，3為1 3，4為1 4，5為1 5，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖4為反應(yīng)溫度對修飾反應(yīng)的影響SDS-PAGE圖，其中M為marker，1為25°C /2hr, 2 為 25°C /4hr，3 為 37°C /2hr ；4 為 37°C /4hr，5 為 4°C /12hr,6 為 4°C /24hr。圖5為rhCNTF濃度對修飾反應(yīng)的影響SDS-PAGE圖，其中1為lmg/mL，2為2mg/ mL, 3 為 3mg/mL, 4 為 4mg/mL, 5 為 5mg/mL, M 為 marker。圖6為反應(yīng)時(shí)間對修飾反應(yīng)的影響SDS-PAGE圖，其中M為marker，1為48hr，2為 36hr，3 為 24hr。圖 7 為純化產(chǎn)物 rhCNTF (A17R63 Δ 15)及 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)的 SDS-PAGE 圖， 其中M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為rhCNTF，2為PEG修飾rhCNTF，3為DEAE-穿透，4為DEAE洗脫峰 1，5為DEAE洗脫峰2，6為DEAE洗脫峰3，7為凝膠洗脫峰II前半峰，8為凝膠柱洗脫II后 半峰，9為凝膠柱洗脫I圖8為PEG-rhCNTF純度分析圖。圖9為PEG-rhCNTF修飾位點(diǎn)分析肽圖。圖10 為 rhCNTF (A17R63 Δ 15)的圓二色光譜圖。圖 11 為 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)的圓 二色光譜圖。表 1 為 rh-CNTF (A17R63 Δ 15)和 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)經(jīng) CNBr 裂解后 HPLC 肽段 分析。
具體實(shí)施例方式實(shí)例1、rhCNTF的上游構(gòu)建與表達(dá)根據(jù)Gene Bank獲得CNTF cDNA序列，將其第17位的半胱氨酸突變?yōu)楸彼帷⒌?63位的谷氨酸突變?yōu)榫彼?，同時(shí)去除C端的15個(gè)氨基酸。委托寶生物工程(大連)有限 公司全基因人工合成，并嵌入？肌18載體且命名為？肌18-^^^^仏1、63八15)/1)!15(1。
質(zhì)粒pUC18_rhCNTF (A17R63 Δ 15) /DH5 α和表達(dá)載體質(zhì)粒pET_3c用限制性內(nèi)切 酶Nde I和BamH I雙酶切，根據(jù)1 %瓊脂糖電泳結(jié)果，回收pET_3c酶切后約4638bp的 片段，回收pUC18-rhCNTF/DH5 α酶切后約550bp的片段，將兩個(gè)片段用T4連接酶進(jìn)行連 接，用LB-Amp平板篩選重組子，Nde I和BamH I雙酶切鑒定，陽性克隆。正確質(zhì)粒命名為 pET-3c-rhCNTF。參見圖1。再將質(zhì)粒pET_3c_rhCNTF轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) plysS宿主菌中，篩選 正確表達(dá)的工程菌命名pET-3c-rhCNTF/BL21 (DE3) plysS。為用于表達(dá)的載體和宿主菌菌購 于Novagen公司，Nde I和BamH I酶購于寶生物工程(大連)有限公司。 將上述表達(dá)最佳工程菌株劃線接種于LA瓊脂平板(胰蛋白胨2g，酵母提取物lg， NaC12g，瓊脂3g，加水定溶至200mL，121°C，高壓滅菌30min，當(dāng)溫度降到50°C左右時(shí)加入 Amp至終濃度為lOOug/mL，取適量倒培養(yǎng)皿，凝固后即成LA瓊脂平板)，37°C培養(yǎng)過夜。從 過夜培養(yǎng)的LA平板上挑取菌苔接種于含LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g， NaCllOg，加水定溶至lOOOmL，121°C，高壓滅菌30min即可)試管中，37°C培養(yǎng)12小時(shí)，然后 按1 %的比例轉(zhuǎn)接到含200mLLB培養(yǎng)液的IOOOmL三角瓶中，37°C培養(yǎng)過夜即成為上罐種子 液。將上罐種子液按5%的比例接種于含20LM9YT培養(yǎng)液的30L發(fā)酵罐中，37°C培養(yǎng)，整過 發(fā)酵過程中，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、通空氣量、通純氧量來保持溶氧在30%以上，用28%的氨水調(diào) 節(jié)PH并保持在7. O。至菌液0D600 = 10 14時(shí)，加入終濃度為0. 5mmol/L IPTG，繼續(xù)培 養(yǎng)4小時(shí)后停止發(fā)酵，收集菌液，SOOOrpm離心10分鐘，棄上清，收集菌體放入_20°C冰箱保 存?zhèn)溆?。?shí)例2、rhCNTF的純化從-20°C冰箱中取出菌體，按1 10(m/v)放入細(xì)菌裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH8. 0,5mmol/L EDTA，0. 2mg/mL溶菌酶)中，37°C下攪拌1小時(shí)，冷卻后超聲(400W，工作時(shí) 間5s，間歇5s，超聲40個(gè)循環(huán))，12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀用洗滌液A (20mmol/ LTris-HCl pH 8. 0，5mmol/LEDTA, 2mol/Lurea, 1 % TritonX-100)溶解，37 °C 攪拌 30min， 12000rpm 離心 10 分鐘，棄上清，沉淀用洗滌液 B (20mmol/LTris-HCl pH8. 0,4mol/LUrea, 1. Omol/LNaCl)溶解，37°C攪拌30min,再12000rpm離心10分鐘，收集包涵體(沉淀)。包涵體的溶解以原菌液體積的10 %加包涵體溶解液(25mmol/LTriS-HCl pH8. 0，7mol/L 鹽酸胍，0. 25mol/L NaCl,2mmol/L EDTA)溶解包涵體，溶解液經(jīng) S印hacryl S-200凝膠柱分離后，目的蛋白置于4°C復(fù)性液(25mmol/LTriS-HCl pH8. 0)中進(jìn)行透析復(fù) 性。用Q-S印harose 平衡液(25mmol/L Tris-HCI pH8. 0)平衡 Q_s印harose 柱。上樣 復(fù)性液樣品，再平衡。分別用洗脫 1 (25mmol/LTris-HClpH8. 0,0. 15MNaCl)、洗脫 2(25mmol/ L Tris-HClpH8. 0,0. 4mol/LNaCl)進(jìn)行洗脫，分別收集洗脫峰。用15% SDS-PAGE檢測純化 效果。由圖1可見rhCNTF的純度可達(dá)95%以上。實(shí)例3、修飾物的制備以及修飾條件的選擇rhCNTF原液(濃度為10mg/mL，緩沖為100mmol/L PB PH7. 0)由本實(shí)驗(yàn)室制備， mPEG-ButyrALD-20KD (純度> 95%，相對分子質(zhì)量為20X103)購自Nektar公司，氰基硼氫 化鈉(CH3BNNa)溶液購自ACROS公司，SDS-PAGE相關(guān)試劑及溶液和各種分析純均為上海生 工產(chǎn)品。恒溫磁力攪拌儀(江蘇中大儀器廠)，電泳儀、DEAE Sepharose F. E. ,Superdex 75 凝膠、AKTA explore層析系統(tǒng)、SDS-PAGE電泳系統(tǒng)均為Pharmacia公司產(chǎn)品。
1、反應(yīng)pH值對修飾產(chǎn)物的影響rhCNTF原液分別用 100mmol/L PB (pH5. 0、pH5. 5和pH6. 5)緩沖液稀釋樣品至2mg/ mL，各取一份加入lmol/L CH3BNNa母液(作為偶聯(lián)活化劑)至溶液中，使終濃度為20mmol/ L。按質(zhì)量比 1 2 (rhCNTF :mPEG-ButyrALD-20KD)稱取 mPEG-ButyrALD-20KD 加入 rhCNTF 原液中，4°C /lOOr/min攪拌反應(yīng)24h。分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，SDS-PAGE電泳掃描后 經(jīng)凝膠系統(tǒng)分析，確定PEGl-rhCNTF所占總蛋白的比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖2)，pH值在5. 0、5. 5、6. 0的條件下，PEGl-rhCNTF所占比例分 別為30. 79%,33. 03%,40. 96%。說明pH5. 0的修飾率最低，其次是pH5. 5，而且pH5. 5修 飾條件下有少量蛋白質(zhì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，PH6. 5的條件下修飾率最高。三種pH條件下生 成的多聚PEG-rhCNTF產(chǎn)量無明顯差距，故最后確立lOOmmol/L PB pH6. 5為反應(yīng)緩沖。2、rhCNTF與PEG的修飾比例對修飾產(chǎn)物的影響 rhCNTF 原液用 IOOmmol/LPB ρΗ6· 5 緩沖液稀釋樣品至 2mg/mL,補(bǔ)入 lmol/L CH3BNNa母液，使終濃度為 20mmol/L。按rhCNTF與mPEG-ButyrALD-20KD質(zhì)量比為 A(1 1)、 B(1 2) X(1 3) ,D(l 4) ,E(l 5)分別稱取 mPEG-ButyrALD-20KD 加入 rhCNTF 原液 中，40C /100r/min攪拌反應(yīng)24hr，分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，SDS-PAGE電泳掃描后經(jīng)凝 膠系統(tǒng)分析，確定PEGl-rhCNTF所占總蛋白的比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖3)，在 rhCNTF 與 mPEG-ButyrALD_20KD 質(zhì)量比為 A(1 1)、 B(1 2)、C(1 3)、D(1 4)、E(1 5)時(shí)，PEGl-rhCNTF 所占比例分別為 38. 55 %、 39. 19 %,39. 67 %A0. 12 %Al. 52 % ；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，rhCNTF 與 mPEG-ButyrALD_20KD 質(zhì)量 比越大，修飾產(chǎn)物中多聚體所占比例越高，分別為25. 37%,29. 08%,33. 35%,36. 28%, 43. 16%。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)考慮到生產(chǎn)成本和PEG-rhCNTF的純化，選擇rhCNTF與 mPEG-ButyrALD-20KD質(zhì)量比為1 1的修飾比例為最佳。3、反應(yīng)溫度對修飾產(chǎn)物的影響rhCNTF 原液用 IOOmmol/L PB ρΗ6· 5 緩沖液稀釋樣品至 2mg/mL,補(bǔ)入 Imol/ LCH3BNNa 母液，使終濃度為 20mmol/L。取 rhCNTF 與 mPEG-ButyrALD_20KD 質(zhì)量比 1 1，分 別在4°C反應(yīng)12hr和24hr、25°C和37°C各反應(yīng)2hr和4hr，100r/min攪拌反應(yīng)，分別取樣進(jìn) 行SDS-PAGE電泳，SDS-PAGE電泳掃描后經(jīng)凝膠系統(tǒng)分析，確定PEGl-rhCNTF所占總蛋白的 比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖4)，在4°C反應(yīng)12hr和24hr、25°C和37°C各反應(yīng)2hr和4hr 的條件下，PEGl-rhCNTF 所占比例分別為 35. 97%,38. 35%,36. 09%,43. 11 %,34. 05%, 45.22%。三種溫度條件下，修飾率基本一致；同時(shí)，隨修飾時(shí)間的延長，修飾率越高。考慮 到蛋白在低溫下更穩(wěn)定，因此選擇4°C為修飾反應(yīng)的溫度條件。 4、rhCNTF濃度對修飾產(chǎn)物的影響rhCNTF 原液用 100mmol/L PB ρΗ6· 5 緩沖液稀釋樣品為 1. Omg/mL, 2. Omg/mL, 3. Omg/mL, 4. Omg/mL, 5. Omg/mL 共五份，按 rhCNTF 與 mPEG-ButyrALD_20KD 質(zhì)量比 1 1 的 比例加入mPEG-ButyrALD-20KD，4°C，100r/min攪拌反應(yīng)24hr，分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳 分析，SDS-PAGE電泳掃描后經(jīng)凝膠系統(tǒng)分析，確定PEGl-rhCNTF所占總蛋白的比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖5)，rhCNTF 濃度在 1. Omg/mL, 2. Omg/mL, 3. Omg/mL, 4. Omg/mL, 5. Omg/mL 時(shí)，PEGl-rhCNTF 所占比例分別為 49. 58%,49. 87%,48. 77%,42. 53%,40. 70%。蛋白濃度為1. Omg/mL, 2. Omg/mL時(shí)，PEGl_rhCNTF所占比例基本一致，當(dāng)?shù)鞍诐舛冗M(jìn)一步提 高時(shí)PEGl-rhCNTF所占比例反而減少，多聚體明顯增多。因此確定rhCNTF的濃度為1 2mg/mL為修飾反應(yīng)中rhCNTF的最適濃度。5、反應(yīng)時(shí)間對修飾產(chǎn)物的影響rhCNTF 原液用 100mmol/L PB pH6. 5 緩沖液稀釋樣品至 2mg/mL 補(bǔ)入 lmol/L CH3BNNa 母液，使終濃度為 20mmol/L。取 rhCNTF 與 mPEG-ButyrALD_20KD 質(zhì)量比 1 1， 4°C，100r/min攪拌反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間分別為24hr、36hr、48hr，分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳， SDS-PAGE電泳掃描后經(jīng)凝膠系統(tǒng)分析，確定PEGl-rhCNTF所占總蛋白的比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖6)，反應(yīng)時(shí)間在24hr、36hr、48hr條件下，PEGl-rhCNTF所占比 例分別為43. 88%,43. 71%,40. 97% ；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨修飾時(shí)間的延長，多聚PEG_rhCNTF所占 比例分別為明顯增高，因此選擇24hr為修飾反應(yīng)時(shí)間。
實(shí)例4、PEGl-rhCNTF 的純化修飾后樣品PEGl-rhCNTF，用10XDDW透析過夜，透析后樣品上DEAE Sepharose F. F 層析柱。DEAE Sepharose F. F 層析柱用 Buffer A(10mmol/L Tris PH 8. 0)平衡，上 樣，再平衡，分別用洗脫 l(10mmol/LTris-HCl pH8. 0，0. 02mol/LNaCl)、洗脫 2 (lOmmol/ LTris-HClpH8. 0,0. 06mol/LNaCl)、洗脫 3 (lOmmol/L Tris-HCl ρΗ8· 0,0. 3mol/LNaCl)進(jìn)行 洗脫，分別收集穿透峰及各個(gè)洗脫峰，并取樣分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。收集DEAE Sepharose F. F 層析純化后的 PEGl-rhCNTF 樣品，上 Superdex 75 凝膠 柱。Superdex 75凝膠柱用lOmmol/L PB，pH7. 4平衡，平衡好后上樣，再用lOmmol/L PB, PH7.4平衡。隨后收集先后出來的峰I和峰II。分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖7)，DEAE Sepharose 柱能有效將多聚 PEG-rhCNTF(A17R63 Δ
禾口單聚PEG-rhCNT(A17R63Δ 15)、rh-CNTF(A17R63Δ 15)較好地分離，穿透部分為多聚 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)和少量單聚 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)，洗脫 1 將結(jié)合在 DEAE 填 料上的多聚 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)和單聚 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)洗脫，洗脫 2 為單 聚PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)，即目的蛋白，洗脫3將未修飾的rh-CNTF (A17R63 Δ 15)洗脫。 Superdex 75 凝膠層析能將多聚 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)與單聚 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)能 有效的分離，洗脫 I 為多聚 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)，洗脫 II 為單聚 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)
實(shí)例5、PEG-rhCNTF的理化特性鑒定1、純度分析型RP-HPLC 為 Waters 600controller，流動(dòng)相 A 液(0. 1 %三氟乙酸、5% 乙 腈)，流動(dòng)相B液(0. 三氟乙酸、95%乙腈)。上樣量20 μ 1，流速為lmL/min，梯度洗脫 70min(A液從100%至30%，B液從O至70% )，檢測波長為214nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖8)，PEG-rhCNTF純度達(dá)95%以上。2、PEG-rhCNTF修飾位點(diǎn)分析本品mPEG修飾設(shè)計(jì)為專一 N末端修飾，用mPEG進(jìn)行蛋白質(zhì)PEG修飾主要 位于N末端的NH2殘基，同時(shí)有部分修飾在賴氨酸的《-冊2殘基上。為證明是否在 rhCNTF(A17R63 Δ 15)的N端第一個(gè)氨基酸上單一共價(jià)結(jié)合一個(gè)mPEG分子，通過選用專一 性強(qiáng)的合適酶，裂解較少位點(diǎn)后對獲得的裂解肽段進(jìn)行分析和分離純化。根據(jù)rhCNTF氨 基酸序列分析，該肽段含有7個(gè)Lys(K)，3個(gè)Met(M)，因此不適合用常規(guī)的Lys內(nèi)肽酶(Endo-Iys)來裂解Lys，用CNBr來裂解Met進(jìn)行分析較理想。具體方法為分別用CNBr 對 rhCNTF (A17R63 Δ 15)禾Π PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)進(jìn)行 裂解，RP-HPLC分析裂解產(chǎn)物，確定保留時(shí)間有差異肽段，以確證差異肽段是否為第一肽段 被PEG修飾。rhCNTF(A17R63 Δ 15)的氨基酸序列如下NH2-AFTEHSPLTPHRRDLASRSIWLARKIRSDLTALTESYVKHQGLNKNINLDSADGMPVASTDRWSE LTEAERLQENLQAYRTFHVLLARLLEDQQVHFTPTE⑶FHQAIHTLLLQVAAFAYQIEELMILLEYKIPRNEADGMP INVGDGGLFEKKLWGLKVLQELSQWTVRSIHDLRFISSHQTG-COOH其中三個(gè)Met分別位于rhCNTF(A17R63 Δ 15)的氨基酸序列的第55位、第126位和 第141位，用CNBr裂解Met后將形成四個(gè)肽段。樣品處理和溴化氰酶切分別取rhCNTF (A17R63 Δ 15)和 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15) 約10mg，移入分子截留量3000透析袋用DDW透析過夜，再移入2mL安瓿瓶中凍干。分別用 ImL 還原緩沖液(含 6mol/L 鹽酸胍的 0. Imol/LTris-HCL lmmol/L EDTA 的緩沖液，pH8. 3， 2mmol/LDTT)溶解凍干樣品，通N2，然后迅速封閉，37°C 1小時(shí)，再分別加100 μ 1 50mmol/L 碘乙酸(NaOH中和)，再次充N2，于暗處37°C保溫1小時(shí)。加β -巰基乙醇至終濃度1 %結(jié) 束反應(yīng)，然后用DDW充分透析，凍干。分別加溴化氰裂解液(溴化氰0.3g，加70%甲酸ImL 使之溶解)4mL溶解，室溫放置24小時(shí)，裂解液加水3. 6mL，再凍干，凍干物加5mL水溶。分析型RP-HPLC分析流動(dòng)相A液，即0. 1 %三氟乙酸溶液，吸取1. OmL分析純的 三氟乙酸，加超純水配制成IOOOmL的溶液，搖勻后經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾，脫氣后備用；流動(dòng) 相B液，即0. 1 %三氟乙酸-乙腈溶液，吸取1. OmL三氟乙酸，加入IOOOmL乙腈(色譜純) 中，搖勻后經(jīng)0. 45 μ m疏水濾膜過濾，脫氣后備用；上樣量20 μ 1，流速為lmL/min，梯度洗脫 70min(A液從100%至30%，B液從0至70% )，檢測波長為214nm，分別進(jìn)樣中間體樣品和 自制對照品樣品。記錄色譜圖。制備型RP-HPLC色譜獲取差異肽段洗脫條件同分析色譜，上樣4mL，流速為20mL/ min,收集分析色譜所對應(yīng)差異肽段，并按分析型RP-HPLC方法對該肽段分析。差異肽段分 子量測定取rhCNTF (A17R63A 15)所對應(yīng)差異肽段，委托中科院上海生化所進(jìn)行質(zhì)譜分子量 分析，確定該肽段在蛋白中位置。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(表1)，rhCNTF(A17R63 Δ 15)和 PEG-rhCNTF(A17R63 Δ 15)經(jīng)溴化氰裂 解后肽圖分析結(jié)果與預(yù)測結(jié)果一致，主要有4個(gè)肽段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明圖(9)(Α、B)，rhCNTF (A17R63 Δ 15)和 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)肽圖 中有3個(gè)肽段保留時(shí)間相同，僅肽段3保留時(shí)間有差異，rhCNTF(A17R63Δ 15)為42. 722min, PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)為 47. 469min。收集 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)的肽段 3，用與肽圖相 同的RP-HPLC方法分析，保留時(shí)間與肽圖對應(yīng)肽段相同，且為單一色譜峰，見圖(9) (C)。該 肽段經(jīng)質(zhì)譜分子量分析為28428Da，與預(yù)測值28231Da(PEG分子量21998Da+第一肽段分子 量6233. 03)僅相差0.7%，與預(yù)測值一致。3、rhCNTF (A17R63 Δ 15)與 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15) 二級結(jié)構(gòu)的測定本研究采用圓二色光譜(J-810型圓二色光譜儀，日本Jasco公司)檢測單 聚 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)的二級結(jié)構(gòu)。單聚 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15) (320 μ g/mL)和 rhCNTF(A17R63Δ 15) (350 μ g/mL)溶液以測試樣品緩沖液(0. 05mol/L 的 Tris-HCl, pH 7. 4) 為空白液，在波長190nm 250nm范圍內(nèi)掃描，速度為500nm/min，樣品池規(guī)格為5mm。室溫下檢測測單聚 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)以及 rhCNTF (A17R63 Δ 15)的二級結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rhCNTF(A17R63 Δ 15)禾Π PEG-rhCNTF (A17R63Δ 15)的 CD 圖譜圖(10) 和圖(11)所示，由圖譜可見單聚PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)在208nm以及222nm處負(fù)向值與 rhCNTF(A17R63 Δ 15)相近，它們的譜形結(jié)果是一致的。表明單聚PEG-rhCNTF(A17R63 Δ 15)與 rhCNTF (A17R63 Δ 15) 二級結(jié)構(gòu)一致，均以α-螺旋的二級結(jié)構(gòu)為主。兩者的二級結(jié)構(gòu)成分和 含量沒有明顯差異。4、rhCNTF (A17R63 Δ 15)與 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)分子構(gòu)象的測定將單聚PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)與 rhCNTF (A17R63 Δ 15)的樣品溶于 ρΗ7. 4 的 Tris-HCl，兩個(gè)蛋白樣品濃度均為320 μ g/mL，使用熒光光度計(jì)(F-2500型，日本Hitachi公 司)測定其熒光光譜，狹縫5nm，PMT電壓400v。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，比較單聚PEG-rhCNTF(A17R63Δ 15)與未修飾的rhCNTF(A17R63Δ 15) 的熒光光譜，可發(fā)現(xiàn)兩者基本一致，rhCNTF(A17R63Δ 15)最大發(fā)射波長為348nm，單聚 PEG-rhCNTF(A17R63 Δ 15)的最大發(fā)射波長為346nm，這表明聚乙二醇修飾前后分子構(gòu)象沒有 發(fā)生明顯改變。實(shí)例 6、rhCNTF (A17R63 Δ 15)與 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)體外生物活性測定取10日齡雞胚(Ε40)背根神經(jīng)節(jié)(DRG)，在D-Hanks液中用0. 125%胰酶消化并打 散成5 X 105mL的單細(xì)胞懸液，在60mm塑料培養(yǎng)皿上預(yù)培養(yǎng)4小時(shí)以除去非神經(jīng)元細(xì)胞，然 后在依次用多聚鳥氨酸_層粘連蛋白包被過的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔加入2000個(gè)神經(jīng) 元及100 μ L含胎牛血清(10% )的DMEM培養(yǎng)液，分別加入lOOng/mL經(jīng)包涵體復(fù)性后純化 的 rhCNTF (A17R63 Δ 15)(設(shè)為實(shí)驗(yàn)組)、100ng/mL 經(jīng)純化的 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)。37°C、 5% C02下培養(yǎng)24小時(shí)后傾去培養(yǎng)液，觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PEG-rhCNTF(A17R63A15)組、rhCNTF (A17R63 Δ 15)組和對照組的存 活細(xì)胞數(shù)分別為85士7、173士 12和無生長(P < 0.01)，表明PEG-rhCNTF(A17R63Δ 15)禾口 rhCNTF (A17R63 Δ 15)均對雞胚背根神經(jīng)有營養(yǎng)作用，但PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)的促神經(jīng)生 長的作用明顯低于rhCNTF(A17R63 Δ 15)，保留生物活性50%左右。實(shí)例7、rhCNTF (A17R63 Δ 15)與 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)在 BALB/C 小鼠體內(nèi)免疫原 性的研究取60只20-25g的BALB/C小鼠，隨機(jī)分成三組(空白溶媒組、rhCNTF組、 PEG-rhCNTF 組)。rhCNTF 組按 0. 5mg/kg 隔日注射一次，連續(xù) 28 天；PEG-rhCNTF 組按 0. 5mg/ kg隔日注射一次，連續(xù)28天。于注射后15天、21天和28天分別眼眶取血，測定小鼠體內(nèi) 產(chǎn)生抗CNTF的抗體滴度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白組未產(chǎn)生抗體；rhCNTH組于15天開始出現(xiàn)抗體，28天時(shí)抗體 滴度達(dá)到1 :10240 ；而PEG-rhCNTF組15天未產(chǎn)生抗體，28天時(shí)抗體滴度僅為1 :160。結(jié)果 證明PEG化rhCNTF體內(nèi)免疫原性極大的降低。實(shí)例8、rhCNTF (A17R63 Δ 15)與 PEG-rhCNTF (A17R63 Δ 15)在新西蘭兔體內(nèi)的藥代動(dòng) 力學(xué)的研究取新西蘭大白兔24只，隨機(jī)分成二組(rhCNTF組、PEG-rhCNTF組)。rhCNTF組 按1. Omg/kg皮下注射；PEG-rhCNTF組按1. 0mg/kg皮下注射；于注射后0、30min、60min、 lhr、2hr、4hr、4hr、24hr、48hr、72hr、96hr、120hr、144hr 從耳靜脈取血。采用 CNTF ELISAKit (R&D公司)測定血清中CNTF的血藥濃度，用標(biāo)準(zhǔn)品曲線計(jì)算rhCNTF、PEG-rhCNTF血單 次給藥后體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rhCNTF的半衰期 tal/2 為 1. 56hr，tM/2 為 4. 31hr，AUC(0_tn)為 15. 81mg/L · min, Cmax 為 1. 25mg/L ；而 PEG-rhCNTF 的半衰期 tal/2 為 24. 51hr, tM/2 為 75. 49hr, AUC (0-tn)為 87. 20mg/L · min, Cmax 為 0. 51mg/L。結(jié)果證明 PEG 化 rhCNTF 的體 內(nèi)半衰期顯著延長，具有長效作用。表 1
權(quán)利要求
一種化學(xué)修飾的CNTF偶聯(lián)物，偶聯(lián)物的特征在于，具有如下結(jié)構(gòu)式式中為聚乙二醇鏈；NH-為N末端氨基；CNTF為睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子。F200910103826XC0000011.tif,F200910103826XC0000012.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CNTF偶聯(lián)物，其特征在于，所述CNTF為天然的睫狀神經(jīng)營養(yǎng) 因子或天然睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的突變體或天然睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的變異體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CNTF偶聯(lián)物，其特征在于，所述偶聯(lián)部分是聚二醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)修飾，其特征在于，聚乙二醇以N末端化學(xué)修飾睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子。
5.根據(jù)權(quán)利要求3和4所述的聚乙二醇，其特征在于，所述聚乙二醇為醛基活化的 mPEG，其分子量為10KD-40KD。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CNTF偶聯(lián)物制備方法，其特征在于，包括如下步驟將CNTF的磷酸鹽緩沖液與mPEG-ButyrALD在加入硼氰化鈉4_37°C條件下，反應(yīng)1_48 小時(shí)，然后采用常規(guī)方法進(jìn)行分離純化，獲得本發(fā)明的CNTF偶聯(lián)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，CNTF的磷酸鹽緩沖液中CNTF的濃度為 1-lOmg/mlo
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，反應(yīng)中CNTF與mPEG的質(zhì)量比為1 0.5-20。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，磷酸鹽緩沖液的pH為4.0-7. 0。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，采用的常規(guī)分離方法為色譜分離法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)的化學(xué)修飾及其制備方法，其特征為它是以分子量為10KD-40KD的聚乙二醇N末端化學(xué)修飾睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子。本發(fā)明的CNTF偶聯(lián)物修飾率高，且形成均一產(chǎn)物，制備方法簡便易行，便于實(shí)施。同時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果表明，修飾后的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子保持了睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子在體內(nèi)的活性，而且能顯著降低其免疫原性、改善其在體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。
文檔編號C07K17/08GK101885776SQ20091010382
公開日2010年11月17日 申請日期2009年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月12日
發(fā)明者張繼蘭, 梅翔, 王彥, 范開, 陳勇, 陳海容 申請人:重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司