專利名稱：一種含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的殼聚糖人工神經(jīng)移植物及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)療器械領(lǐng)域，特別涉及一種含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子人工神經(jīng)移植物及其制備方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)實(shí)社會(huì)中交通事故、工傷事故、運(yùn)動(dòng)意外及臨床手術(shù)等事件均會(huì)造成周圍神經(jīng)損傷，臨床上但當(dāng)中長(zhǎng)距離的神經(jīng)缺損不能依靠端對(duì)端的縫合來(lái)彌補(bǔ)神經(jīng)缺失時(shí)，就不得不依靠移植物來(lái)橋接修復(fù)。近年來(lái)，基于生命科學(xué)與工程學(xué)的原理和技術(shù)發(fā)展起來(lái)的組織工程學(xué)為構(gòu)建神經(jīng)移植替代品提供了一條新的出路。采用組織工程技術(shù)修復(fù)神經(jīng)損傷的研究主要集中在設(shè)計(jì)和構(gòu)建新的組織工程神經(jīng)橋接裝置，目前這類橋接物通常是單獨(dú)采用生物材料，通過(guò)將其加工成管狀結(jié)構(gòu)的神經(jīng)引導(dǎo)通道，為神經(jīng)的再生提供適當(dāng)?shù)目臻g和引導(dǎo)作用。但對(duì)于長(zhǎng)距離、粗大神經(jīng)缺損，這類單純由生物材料組成的導(dǎo)管由于缺乏神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等微環(huán)境物質(zhì)的支持，取得的修復(fù)效果非常有限。這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)距離神經(jīng)缺損修復(fù)早期，神經(jīng)斷端內(nèi)細(xì)胞分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子有限，難以在長(zhǎng)距離或較粗的神經(jīng)導(dǎo)管中發(fā)揮作用。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NTF)是一組超出普通維持生存所必須的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以外的、對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起特殊營(yíng)養(yǎng)作用的多肽分子。研究表明神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、創(chuàng)傷愈合、免疫調(diào)節(jié)及腫瘤發(fā)生等方面都發(fā)揮著重要的生物學(xué)調(diào)節(jié)作用。各種NTF因子在單獨(dú)發(fā)揮作用的同時(shí)，還通過(guò)相互促進(jìn)和協(xié)同作用產(chǎn)生放大效應(yīng)，使它們?cè)隗w內(nèi)發(fā)揮出更大的生物學(xué)活性。這些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子包括神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素_3 (NT-3)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-4 (NT-4)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(⑶NF)等?，F(xiàn)有研究表明，在神經(jīng)缺損修復(fù)中需要生物微環(huán)境如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等物質(zhì)的作用，這提示人工神經(jīng)移植物上含有一定濃度的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，將能夠提高缺損神經(jīng)的修復(fù)效果，尤其是對(duì)長(zhǎng)距離、粗大神經(jīng)缺損。因此，理想的組織工程人工神經(jīng)移植物應(yīng)該包含支架材料、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和種子細(xì)胞三部分，其中要求具有良好的生物相容性和生物降解吸收功能，并具備適宜的機(jī)械性能、三維結(jié)構(gòu)和一定的通透性；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子應(yīng)具有合適濃度、良好釋放率和盡量長(zhǎng)的釋放時(shí)間。目前用于人工神經(jīng)移植物材料一類是自體非神經(jīng)組織，如靜脈導(dǎo)管，但其機(jī)械強(qiáng)度不夠，易于塌陷。另一類包括(1)不可降解吸收材料，如硅膠管、聚四氟乙烯等，這些材料不能夠被人體吸收，長(zhǎng)時(shí)間存在可引起慢性的異物反應(yīng)，對(duì)再生的神經(jīng)造成損傷；(2)可降解吸收材料，如聚乳酸、聚乙烯酸、殼聚糖等。殼聚糖為一種天然高分子聚合物，具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，有著良好的生物相容性，安全無(wú)毒，還具有抗凝血等多種生物活性和優(yōu)良的抗菌性，且容易獲得。有文獻(xiàn)公開(kāi)了應(yīng)用殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)引管作為神經(jīng)再生室橋接大鼠坐骨神經(jīng)缺損，結(jié)果表明殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)引管為大鼠坐骨神經(jīng)再生提供一個(gè)良好的再生微環(huán)境，再生坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)良好(于炎冰等，殼聚糖導(dǎo)管橋接周圍神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)研究，中華神經(jīng)外科雜志，2000，Vol. 16，No. 6, P375-378)。中國(guó)專利99123745. 5公開(kāi)了一種用于神經(jīng)修復(fù)的導(dǎo)管，主要由殼聚糖、明膠、戊二醛、醋酸、氫氧化鈉、多聚賴氨酸組成。但是作為交聯(lián)劑的戊二醛具有一定的毒性。隨著人工神經(jīng)移植物材料研究的逐漸成熟和完善，在材料上固定神經(jīng)生長(zhǎng)因子這方面的研究逐步成為神經(jīng)再生領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。中國(guó)專利01136314. 2，公開(kāi)了一種引導(dǎo)和促進(jìn)神經(jīng)有效再生的脫乙酰度為15-45%的甲殼質(zhì)生物套管，該套管管壁上還可以進(jìn)一步包括0. 3%-3%的海藻鹽和5-10% 的促神經(jīng)生長(zhǎng)因子藥物。但是該法制得的套管缺乏豐富的能提供神經(jīng)軸突攀附生長(zhǎng)的管道。中國(guó)專利20041009259. 9公開(kāi)了一種由殼聚糖外管壁和具有軸向多通道的生物來(lái)源填充基質(zhì)組成的神經(jīng)組織工程管狀支架，該支架具有7 50的軸向通道，通道內(nèi)徑為200 500 μ m，各通道間具有相互連通的微孔。但該法需要將多根一定直徑的不銹鋼針平行貫穿固定在殼聚糖管內(nèi)，步驟繁瑣且產(chǎn)品孔徑較大，神經(jīng)導(dǎo)管抗拉強(qiáng)度有限。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的殼聚糖人工神經(jīng)移植物及其制備方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是
一種含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的殼聚糖人工神經(jīng)移植物，包括殼聚糖人工神經(jīng)移植物支架和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，其特征在于所述殼聚糖人工神經(jīng)移植物支架管腔內(nèi)分布有豐富的孔隙，促進(jìn)神經(jīng)再生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子均勻吸附固定在支架管腔內(nèi)外表面以及管腔內(nèi)的孔隙表面。上述殼聚糖人工神經(jīng)移植物支架為孔隙率為50%_90%且孔徑為IOMm-IOOMm的具有多孔結(jié)構(gòu)抗拉強(qiáng)度高的神經(jīng)導(dǎo)管。支架內(nèi)徑為0. 5-8mm，壁厚0. l_3mm。上述殼聚糖人工神經(jīng)移植物支架不含有發(fā)泡劑和/或交聯(lián)劑。本發(fā)明所述殼聚糖人工神經(jīng)移植物支架吸附固定的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3( NT-3 )、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(⑶NF )中的一種或幾種。本發(fā)明還提供了一種所述殼聚糖人工神經(jīng)移植物支架的制備方法，步驟包括
(1)將弱酸溶解殼聚糖得到濃度為3%-6%的溶液，將溶液倒入模具，置于-60°c-90°C， 冷凍2-4小時(shí)；
(2)將冷凍后殼聚糖冰體置于堿性溶液中和固定，用水清洗；
(3)對(duì)步驟(2)得到的定型的殼聚糖冷凍干燥，得到具有多孔結(jié)構(gòu)、抗拉強(qiáng)度高的殼聚糖神經(jīng)移植物支架；
(4)將殼聚糖神經(jīng)移植物支架浸泡在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子溶液中，利用材料表面豐富的孔隙吸附固定神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。上述步驟得到的吸附有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的神經(jīng)移植物支架可直接進(jìn)行使用，或者還可以將其進(jìn)一步進(jìn)行凍干，便于長(zhǎng)期保存和運(yùn)輸使用。上述殼聚糖人工神經(jīng)導(dǎo)管通過(guò)將殼聚糖用弱酸溶解、注模、冷凍成型、中和固定、 清洗、冷凍干燥工藝，將殼聚糖加工成具有多孔結(jié)構(gòu)、抗拉強(qiáng)度高的神經(jīng)導(dǎo)管。在制造過(guò)程中，可以通過(guò)改變殼聚糖溶液的濃度來(lái)調(diào)節(jié)導(dǎo)管管壁的孔隙率，殼聚糖溶液濃度越高，所得到的產(chǎn)品越致密，孔隙率越低；通過(guò)改變冷凍成型溫度調(diào)節(jié)所生成的冰晶大小以控制殼聚糖導(dǎo)管管壁的孔徑，冷凍溫度越低，生成冰晶越小，所得產(chǎn)品孔徑就越小。此外可通過(guò)改變殼聚糖的脫乙?；潭纫钥刂茖?dǎo)管的降解速度，脫乙?；潭仍礁撸瑢?dǎo)管降解速度越快。上述殼聚糖人工神經(jīng)導(dǎo)管的制備方法使用的弱酸是醋酸、磷酸、檸檬酸、乳酸中的任意一種或幾種。將本發(fā)明所述殼聚糖人工神經(jīng)導(dǎo)管預(yù)先稱重后浸泡于已知濃度和體積的市售神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子產(chǎn)品溶液(例如30yg/2ml的NGF溶液)中，用常規(guī)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子ELISA方法檢測(cè)并計(jì)算浸泡液中殘留的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的量，可計(jì)算得到吸附固定在神經(jīng)導(dǎo)管上的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的量。通過(guò)浸泡時(shí)間控制本發(fā)明產(chǎn)品每克神經(jīng)導(dǎo)管上吸附神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的量為 1 μ g-10mgo使用掃描電鏡檢測(cè)本發(fā)明所述人工神經(jīng)移植物支架孔徑為lOMffl-lOOMffl。采用常規(guī)乙醇浸泡法測(cè)定本發(fā)明所述人工神經(jīng)移植物支架孔隙率為50%_90%。本發(fā)明產(chǎn)品具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，合適的孔徑、孔隙率及通透性，能夠模擬正常神經(jīng)結(jié)構(gòu)，能夠提供軸突攀附生長(zhǎng)的管道及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，并且可以承載利于神經(jīng)修復(fù)和再生的細(xì)胞，本發(fā)明的產(chǎn)品含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，所用殼聚糖材料為天然可降解性材料，與人體有著良好的生物相容性，制得的產(chǎn)品不含有由制備工藝帶入的外源性毒、副作用的發(fā)泡劑和交聯(lián)劑。由于本發(fā)明導(dǎo)管管壁具有相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)的神經(jīng)導(dǎo)管更小的孔徑和更高的孔隙率和比表面積，使得本發(fā)明所述導(dǎo)管具有更好的抗拉強(qiáng)度且能夠更好的吸附神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子， 更有利于輸送神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，給神經(jīng)細(xì)胞提供良好的生長(zhǎng)環(huán)境。使用效果好。本發(fā)明利用控制殼聚糖溶液濃度和冷凍溫度來(lái)控制神經(jīng)導(dǎo)管孔隙率和孔徑，方法簡(jiǎn)便易行，此外，可將制備好的神經(jīng)導(dǎo)管浸泡吸附固定神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子直接用于手術(shù)，或者將制備好的神經(jīng)導(dǎo)管浸泡在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子溶液中吸附固定，再進(jìn)行凍干，便于長(zhǎng)期保存和運(yùn)輸，使用方便。由于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為活性蛋白或肽類，很容易受到環(huán)境影響而失去活性，本發(fā)明將現(xiàn)有技術(shù)中將神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子溶液加入到制備神經(jīng)導(dǎo)管的材料中進(jìn)行制模成型改為先制備好神經(jīng)導(dǎo)管，再浸泡吸附固定，這能夠更好的保證神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的活性。通過(guò)將本發(fā)明產(chǎn)品在體外與神經(jīng)組織細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，經(jīng)形態(tài)觀察、酶代謝活力測(cè)定、神經(jīng)生長(zhǎng)因子的測(cè)定，顯示該產(chǎn)品具有良好的生物相容性。在大鼠動(dòng)物體內(nèi)使用該產(chǎn)品修復(fù)坐骨神經(jīng)1厘米距離缺損，結(jié)果表明該產(chǎn)品能有利于神經(jīng)再生，導(dǎo)致恢復(fù)損傷神經(jīng)功能的恢復(fù)，同時(shí)該產(chǎn)品具有很好的組織相容性。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
具體實(shí)施方式
。實(shí)施例1
用濃度為0. 5%的乳酸溶解殼聚糖得到殼聚糖的濃度為3%溶液。然后將溶液注入模具，經(jīng)-60°C冷凍預(yù)成型后，將材料退出模具，放入5%氫氧化鈉溶液，中和材料中的酸，固定成型后，用蒸餾水將過(guò)量的堿及生成的鹽清洗干凈后，放置到15yg/ml的神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (NGF)溶液中，利用材料表面豐富的孔隙固定30分鐘。然后經(jīng)冷凍干燥得到含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的殼聚糖人工神經(jīng)移植物，孔隙率89%，平均孔徑為87-98 μ m。實(shí)施例2
用濃度為8%的醋酸溶解殼聚糖得到殼聚糖的濃度為5%溶液。然后將溶液注入模具，經(jīng)-80°C冷凍預(yù)成型后，將材料退出模具，放入到10%碳酸鈉溶液中，中和材料中的酸固定成型后，用蒸餾水將過(guò)量的堿及生成的鹽清洗干凈后，然后經(jīng)冷凍干燥得到殼聚糖人工神經(jīng)移植物。在使用前，將殼聚糖人工神經(jīng)移植物放置到20μ g/ml堿性成纖維生長(zhǎng)因子 (bFGF)溶液中，利用材料表面豐富的孔隙固定1小時(shí)。然后經(jīng)冷凍干燥得到含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的殼聚糖人工神經(jīng)移植物，孔隙率77%，平均孔徑為55-67 μ m。
實(shí)施例3
用濃度為2%的磷酸溶解殼聚糖得到殼聚糖的濃度為6%溶液，然后將溶液注入模具， 經(jīng)-90°C冷凍預(yù)成型后，將材料退出模具，放入到5%氫氧化鈉溶液中，中和材料中的酸固定成型后，用蒸餾水將過(guò)量的堿及生成的鹽清洗干凈后，然后經(jīng)冷凍干燥得到殼聚糖人工神經(jīng)移植物。在使用前，將殼聚糖人工神經(jīng)移植物放置到20 μ g/ml腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF) 溶液中，利用材料表面豐富的孔隙固定2小時(shí)。然后經(jīng)冷凍干燥得到含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的殼聚糖人工神經(jīng)移植物，孔隙率53%，平均孔徑為11-23 μ m。
權(quán)利要求
1.一種含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的殼聚糖人工神經(jīng)移植物，包括殼聚糖人工神經(jīng)移植物支架和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，其特征在于所述殼聚糖人工神經(jīng)移植物支架管腔內(nèi)分布有豐富的孔隙，促進(jìn)神經(jīng)再生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子均勻吸附固定在支架管腔內(nèi)外表面以及管腔內(nèi)的孔隙表面。
2.如權(quán)利要求1所述殼聚糖人工神經(jīng)移植物，其特征在于所述殼聚糖人工神經(jīng)移植物支架為孔隙率為50%_90%且孔徑為IOMffl-IOOMffl的具有多孔結(jié)構(gòu)抗拉強(qiáng)度高的神經(jīng)導(dǎo)管。
3.如權(quán)利要求2所述殼聚糖人工神經(jīng)移植物，其特征在于所述殼聚糖人工神經(jīng)移植物支架內(nèi)徑為0. 5-8mm，壁厚0. l_3mm。
4.如權(quán)利要求1所述殼聚糖人工神經(jīng)移植物，其特征在于所述殼聚糖人工神經(jīng)移植物支架不含有發(fā)泡劑和/或交聯(lián)劑。
5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述殼聚糖人工神經(jīng)移植物，其特征在于所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3( NT-3 )、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(⑶NF )中的一種或幾種。
6.如權(quán)利要求5所述殼聚糖人工神經(jīng)移植物，其特征在于所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在神經(jīng)移植物支架材料上的量為1 μ g/g-10mg/g。
7.—種如權(quán)利要求1所述殼聚糖人工神經(jīng)移植物支架的制備方法，步驟包括(1)將弱酸溶解殼聚糖得到濃度為3%-6%的溶液，將溶液倒入模具，置于_60°C-90°C， 冷凍2-4小時(shí)；(2)將冷凍后殼聚糖冰體置于堿性溶液中和固定，用水清洗；(3)對(duì)步驟(2)得到的定型的殼聚糖冷凍干燥，得到具有多孔結(jié)構(gòu)、抗拉強(qiáng)度高的殼聚糖神經(jīng)移植物支架；(4)將殼聚糖神經(jīng)移植物支架浸泡在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子溶液中，利用材料表面豐富的孔隙吸附固定神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
8.如權(quán)利要求7所述殼聚糖人工神經(jīng)移植物支架的制備方法，其特征在于將吸附固定有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的殼聚糖人工神經(jīng)移植物進(jìn)一步進(jìn)行凍干。
9.如權(quán)利要求7所述殼聚糖人工神經(jīng)移植物的制備方法，其特征在于所述弱酸是醋酸、磷酸、檸檬酸、乳酸中的一種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的殼聚糖人工神經(jīng)移植物及制備方法，殼聚糖人工神經(jīng)移植物是在不添加任何發(fā)泡劑、交聯(lián)劑的情況下，通過(guò)弱酸溶解、注模、冷凍成型、中和固定、清洗、冷凍干燥等工藝，將殼聚糖加工成具有多孔結(jié)構(gòu)、抗拉強(qiáng)度高的神經(jīng)導(dǎo)管。在神經(jīng)導(dǎo)管中含有治療作用的細(xì)胞因子是堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(NT-3)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)等中的一種或多種。本發(fā)明的產(chǎn)品含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，所用材料均為可降解性材料，與人體有著良好的生物相容性。制得的產(chǎn)品不含有由于制備工藝帶入的外源性毒、副作用物質(zhì)。
文檔編號(hào)A61L27/20GK102343112SQ20111030266
公開(kāi)日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2011年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月9日
發(fā)明者丁斐, 張?zhí)? 楊宇民, 顧曉松 申請(qǐng)人:江蘇益通生物科技有限公司