專利名稱：：一種從牛奶中直接獲取活性蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)分離純化領(lǐng)域，具體涉及一種采用超大孔薄層瓊脂糖凝膠-玻璃珠復(fù)合介質(zhì)進行擴張床吸附,進而從牛奶中直接獲取活性蛋白的方法。
背景技術(shù)：
：牛奶蛋白質(zhì)主要由酪蛋白、乳清蛋白等完全蛋白質(zhì)組成，其所含氨基酸種類齊全、數(shù)量充足、比例適當(dāng)，適合于人體構(gòu)成肌肉組織，所以它不但能維持成人健康，還能促進兒童生長發(fā)育。牛奶蛋白質(zhì)容易消化吸收，消化率高達98%，生物價84，高于豬肉、魚和植物蛋白，因而牛奶是人類食物中蛋白質(zhì)的極好來源。傳統(tǒng)的牛奶生產(chǎn)方法一般包括標準化、殺菌、均質(zhì)、脫氣等主要工藝，這些都涉及牛奶的熱處理，影響牛奶中活性物質(zhì)的活性及牛奶的營養(yǎng)和口感，特別是加熱殺菌，如巴氏殺菌(表1)、超高溫殺菌Q34137'C，保持25s)的處理方式。因為高溫破壞了蛋白質(zhì)的三級四級等高級結(jié)構(gòu)即功能性結(jié)構(gòu)，只保留了蛋白質(zhì)的低級結(jié)構(gòu)即一級結(jié)構(gòu)(氨基酸)、二級結(jié)構(gòu)(蛋白肽)，同時破壞了維生素及卵磷脂等營養(yǎng)物質(zhì)，高溫工藝生產(chǎn)的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值大打折扣，因而經(jīng)過傳統(tǒng)生產(chǎn)方法得到的牛奶，其中大部分蛋白已失活。表l巴氏殺菌<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>現(xiàn)有的從牛奶中提取活性蛋白的技術(shù)，主要包括鹽沉淀、調(diào)節(jié)pH值等電點沉淀以及有機溶劑沉淀等。鹽沉淀是在經(jīng)預(yù)處理牛奶中加入硫酸銨等鹽溶液，調(diào)節(jié)鹽溶液濃度使活性蛋白沉淀析出，然后沉淀經(jīng)膜透析法洗去鹽分和離子，干燥得到活性蛋白。調(diào)pH值等電點沉淀是用磷酸或鹽酸調(diào)節(jié)經(jīng)預(yù)處理牛奶的pH值(58)，得到活性蛋白沉淀，然后將沉淀經(jīng)膜透析法洗去鹽分和離子，干燥得到活性蛋白。有機溶劑沉淀是通過調(diào)節(jié)在經(jīng)預(yù)處理牛奶中加入的有機溶劑的濃度，使活性蛋白沉淀析出，經(jīng)過濾后將沉淀干燥得到活性蛋白。彭平等發(fā)明的從牛奶中提取乳清蛋白及分離乳清蛋白中不同活性成分的方法(中國專利申請?zhí)?00310100350.7)，即采用在牛奶中加入不同濃度的乙醇攪拌均勻，靜置后再離心的方法得到乳清蛋白的不同成分。但是有機溶劑沉淀在室溫條件下所得的蛋白質(zhì)往往已發(fā)生變性，必須在低溫條件下進行沉淀，且靜置時間較長。王秀英等發(fā)明了一種從牦牛奶中提取的活性乳蛋白及其方法和應(yīng)用(中國專利申請?zhí)?00410040596)，步驟包括原料的選取、離心除雜去脂、巴斯德低溫殺菌、凝乳、離心過濾、除菌濃縮、超濾、離子交換純化蛋白、無菌過濾、薄膜蒸發(fā)、冷凍干燥及無菌真空包裝等。總之，現(xiàn)有的技術(shù)都涉及兩個以上的步驟，操作繁瑣，因此有必要開發(fā)一種簡捷高效的從牛奶中獲取活性蛋白的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種簡捷、高效的直接從牛奶中大規(guī)模提取活性蛋白的方法。本發(fā)明提供的利用擴張床吸附技術(shù)(也稱膨脹床吸附技術(shù))從牛奶中直接獲取活性蛋白的方法包括如下步驟利用超大孔薄層瓊脂糖凝膠-玻璃珠復(fù)合介質(zhì)進行擴張床吸附試驗，待床層穩(wěn)定后，直接將牛奶以自下而上的方式進料，乳液直接通過床層，部分活性蛋白被介質(zhì)吸附。然后用水洗去滯留在床層中的牛奶，接著用一定濃度的氯化鈉溶液進行洗脫，將被吸附的活性蛋白洗脫下來，進行收集后可直接凍干得到具有活性的蛋白，或用凝膠色譜對蛋白組分進行進一步分離，可獲得高純度的活性蛋白。所述的擴張床吸附介質(zhì)為粒徑分布在50300pm之間的超大孔薄層瓊脂糖凝膠-玻璃珠復(fù)合介質(zhì)。該介質(zhì)為陰離子交換介質(zhì)，是由瓊脂糖凝膠薄層包裹玻璃珠惰性內(nèi)核所得。該介質(zhì)的特點是瓊脂糖凝膠殼層的平均厚度大約在2030pm之間，瓊脂糖凝膠層不僅有瓊脂糖凝膠介質(zhì)所特有的2050nm的擴散L，而且有孔徑在16拜的流通孔，這些超大孔的存在有利于提高蛋白等在介質(zhì)內(nèi)的傳質(zhì)。而玻璃珠惰性內(nèi)核使得介質(zhì)具有較大的密度(1.7g/mL)，縮短了傳質(zhì)路徑，加快了傳質(zhì)速率，所以該介質(zhì)是一種適用于擴張床操作的新型分離介質(zhì)。所述的牛奶來源于奶牛場的新鮮牛奶，對其進行適當(dāng)稀釋或者直接從中獲取活性蛋白。本發(fā)明提供的從牛奶中直接獲取活性蛋白的方法，其特征在于如經(jīng)過離心、過濾或其他膜分離過程獲取牛奶中的蛋白，易使蛋白變性失活。而直接采用擴張床吸附技術(shù)，以自下而上的進料方式使層析介質(zhì)膨脹擴張進行吸附，吸附介質(zhì)處于懸浮狀態(tài)，顆粒之間存在較大的空隙，使料液中的固體能夠通過。因此利用本發(fā)明，能夠?qū)⒑懈鞣N活性蛋白及其他雜質(zhì)的鮮牛奶直接引入吸附柱，各種雜質(zhì)直接通過，部分活性蛋白被吸附，實現(xiàn)了從牛奶中直接獲取活性蛋白。實驗證明，該技術(shù)是一種高效集成的分離技術(shù)，僅需一步操作即可得到活性蛋白，有效的保證了操作過程中牛奶的活性，與現(xiàn)有的生產(chǎn)活性蛋白的方法相比，擴張床吸附操作法時間4短，產(chǎn)品活性損失小，整個過程不向牛奶中添加任何物質(zhì)，是一種簡捷、高效的獲取牛奶中活性蛋白的方法。圖1為超大孔薄層瓊脂糖凝膠-玻璃珠復(fù)合介質(zhì)的顯微鏡照片。圖2為用超大孔薄層瓊脂糖凝膠-玻璃珠復(fù)合介質(zhì)提取牛奶中活性蛋白的洗脫圖譜。圖3為用超大孔薄層瓊脂糖凝膠-玻璃珠復(fù)合介質(zhì)提取稀釋的牛奶中活性蛋白的洗脫圖譜。圖4為提取的活性蛋白的SDS-PAGE圖譜。其中1表示牛奶經(jīng)0.1mol/L的NaCl溶液洗脫得到的洗脫峰；2表示牛奶經(jīng)0.2mol/L的NaCl溶液洗脫得到的洗脫峰；3表示稀釋10倍的牛奶經(jīng)0.1mol/L的NaCl溶液洗脫得到的洗脫峰；4表示標準分子量蛋白。具體實施例方式實施例l(1)床層平衡用超純水以191cm/h的流速自下而上平衡擴張床吸附介質(zhì)使床層的膨脹率為2左右，保持約2030min，直至擴張床層穩(wěn)定。其中擴張床吸附介質(zhì)為粒徑分布在50300tim之間的超大孔薄層瓊脂糖凝膠-玻璃珠復(fù)合介質(zhì)，該介質(zhì)的具體形態(tài)如圖1所示。(2)進料吸附將鮮牛奶直接進樣，由于蛋白溶液比水的粘度大，為維持膨脹比不變，調(diào)節(jié)進料流速為229cm/h，當(dāng)與擴張床出口處相連接的核酸蛋白檢測儀示數(shù)維持不變時，證明床層中的介質(zhì)已經(jīng)吸附飽和，此時停止進料，進料過程中注意保證床層的穩(wěn)定性。(3)沖洗進料完畢后，保持床層擴張，以229cm/h的流速通入810倍柱體積的超純水，清洗去滯留在床層中未被吸附的雜蛋白，直到核酸蛋白檢測儀的示數(shù)不再變化為止。(4)洗脫在220"C情況下，將床層改為固定床操作，以115cm/h的流速依次通入0.1mol/L、0.2mol/L的NaCl溶液，洗去被吸附的牛奶中的活性蛋白，在核酸蛋白檢測儀出口處收集樣品。洗脫圖譜如圖2所示。圖2中洗脫峰A經(jīng)SDS-PAGE的電泳條帶如圖4中的條帶1所示。洗脫峰B的電泳條帶如圖4中的條帶2所示。(5)高鹽洗脫以115cm/h的流速用1.0mol/L的NaCl溶液，洗去與介質(zhì)結(jié)合較牢固的雜質(zhì)。的雜質(zhì)。(6)介質(zhì)再生用510倍擴張床體積的0.010.5mol/L堿溶液(優(yōu)選為NaOH溶液)沖洗介質(zhì)。實施例2(1)床層平衡用超純水以191cm/h的流速自下而上平衡擴張床吸附介質(zhì)約2030min，直至擴張床層穩(wěn)定。其中擴張床吸附介質(zhì)為粒徑分布在50300pm之間的超大孔薄層瓊脂糖凝膠-玻璃珠復(fù)合介質(zhì)。(2)進料吸附將經(jīng)過超純水稀釋10倍的鮮牛奶進樣，由于蛋白溶液比水的粘度大，為維持膨脹比不變，調(diào)節(jié)進料流速為229cm/h，當(dāng)與擴張床出口處相連接的核酸蛋白檢測儀示數(shù)維持不變時，證明床層中的介質(zhì)巳經(jīng)吸附飽和，此時停止進料，進料過程中注意保證床層的穩(wěn)定性。(3)沖洗進料完畢后，保持床層擴張，以229cm/h的流速通入810倍柱體積的超純水，清洗去滯留在床層中未被吸附的雜蛋白，直到核酸蛋白檢測儀的示數(shù)不再變化為止。(4)洗脫在220'C情況下，將床層改為固定床操作，以115cm/h的流速依次通入0.1mol/L、0.2mol/LNaCl溶液，洗脫去被吸附的牛奶中的活性蛋白，在核酸蛋白檢測儀出口處收集樣品。洗脫圖譜如圖3所示。圖3中洗脫峰C經(jīng)SDS-PAGE的電泳條帶如圖4中的條帶3所示。(5)高鹽洗脫以115cm/h的流速用1.0mol/L的NaCl溶液，洗去與介質(zhì)結(jié)合較牢固的雜質(zhì)。(6)介質(zhì)再生用510倍擴張床體積的0.010.5mol/L堿溶液(優(yōu)選為NaOH溶液)沖洗介質(zhì)。權(quán)利要求1.一種從牛奶中直接獲取活性蛋白的方法，包括如下步驟利用超大孔薄層瓊脂糖凝膠-玻璃珠復(fù)合介質(zhì)進行擴張床吸附試驗，待床層穩(wěn)定后，將牛奶以自下而上的方式進料，乳液直接通過床層，部分活性蛋白被介質(zhì)吸附。然后用水洗去滯留在床層中的牛奶，接著用一定濃度的氯化鈉溶液進行洗脫，將被吸附的活性蛋白洗脫下來，進行收集后可得到具有活性的蛋白，或用凝膠色譜對蛋白組分進行進一步分離，可獲得高純度的活性蛋白。2.如權(quán)利要求1所述的從牛奶中直接獲取活性蛋白的方法，其特征在于所述的分離介質(zhì)為超大孔薄層瓊脂糖凝膠-玻璃珠復(fù)合介質(zhì)。3.如權(quán)利要求1所述的從牛奶中直接獲取活性蛋白的方法，其特征在于所述的方法簡便快速，整個過程不向牛奶中添加任何物質(zhì)，從而不會對牛奶的后續(xù)加工造成影響。4.如權(quán)利要求1所述的從牛奶中直接獲取活性蛋白的方法，其特征在于將權(quán)利要求2中所述的超大孔薄層復(fù)合介質(zhì)用于擴張床，方法簡單，易于實現(xiàn)。5.如權(quán)利要求1所述的從牛奶中直接獲取活性蛋白的方法，其特征在于所述的方法只需用一定濃度的氯化鈉溶液就能洗脫被吸附的活性蛋白。全文摘要本發(fā)明提供了一種從牛奶中直接獲取活性蛋白的方法。本方法采用擴張床吸附技術(shù)，以超大孔薄層瓊脂糖凝膠-玻璃珠復(fù)合介質(zhì)為吸附介質(zhì)，采用自下而上的進料方式，牛奶直接通過床層，牛奶中部分活性蛋白被介質(zhì)吸附，吸附完成后，用一定濃度的氯化鈉溶液洗脫，即可獲得活性蛋白，該蛋白可直接冷凍干燥。該技術(shù)是一種高效集成的分離技術(shù)，經(jīng)一步操作即可得到活性蛋白。整個過程不向牛奶中添加任何物質(zhì)，操作時間短，產(chǎn)品活性損失小，是一種簡捷、高效的獲取牛奶中活性蛋白的方法。文檔編號C07K1/00GK101538325SQ20091013659公開日2009年9月23日申請日期2009年5月8日優(yōu)先權(quán)日2009年5月8日發(fā)明者斌代,鑫周,趙艷霞,鐵德馨,曉陳申請人:鑫周