一種基于dna質(zhì)量鑒定牛奶中脂肪和蛋白質(zhì)含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品科學(xué)領(lǐng)域，具體主要依托牛奶中牛基因組DNA質(zhì)量來鑒定生鮮牛奶中脂肪和蛋白質(zhì)含量變化情況。該方法擬建立冷藏(I?5°C )條件下牛奶中DNA含量質(zhì)量與牛奶主要營養(yǎng)品質(zhì)(乳脂肪、乳蛋白)的相關(guān)關(guān)系，有利于為乳品加工企業(yè)和廣大消費者提供尚品質(zhì)原料奶。
【背景技術(shù)】
[0002]生鮮牛奶中蛋白質(zhì)和脂肪含量是評價牛奶營養(yǎng)品質(zhì)最為重要的兩個指標，同時也常被作為原料奶收購的標準。兩個指標的檢測方法多采用物理化學(xué)方法。
[0003]蛋白質(zhì)含量測定常用的有4種經(jīng)典方法:凱氏定氮法、雙縮脲法、Folin-酚試劑法(Lowry法)、紫外吸收法和考馬斯亮藍法。凱氏定氮法的缺點是耗時長，靈敏度低，樣品中的含氮化合物會影響蛋白含量的測定；要想準確測定出蛋白含量，可以先測定出總含氮量，再用三氯乙酸將樣品溶液中的蛋白沉淀除去，然后測定溶液的非蛋白含氮量，最后從總含氮量中扣除非蛋白含氮量就可以比較準確地測定出樣品的真正蛋白含量。雙縮脲法測定范圍為I?1mg蛋白質(zhì)，干擾這一測定的物質(zhì)主要有:硫酸錢、Tris緩沖液和某些氨基酸等；此法的缺點是靈敏度差，常用于需要快速、但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。Folin-酚試劑法是由Lowry在雙縮脲方法的基礎(chǔ)上發(fā)展的，比雙縮脲法靈敏，可檢測的最低蛋白質(zhì)量達5 μ g ;缺點是費時較長，要精確控制操作時間，各項操作必須精確控制時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多；對雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應(yīng)，而且對Lowry反應(yīng)的影響更大。紫外吸收法的特點是測定蛋白質(zhì)含量的準確度較差，專一性差，干擾物質(zhì)多，若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾；雖可以校正，但還是存在一定的誤差；在用標準曲線法測定蛋白質(zhì)含量時，對那些與標準蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差?？捡R斯亮藍法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法，因而正在得到廣泛的應(yīng)用；其特點是靈敏度高，最低蛋白質(zhì)檢測量可達Iyg;測定快速、簡便，只需加一種試劑，完成一個樣品的測定一般只需要5分鐘左右；干擾物質(zhì)少，如干擾Lowry法的大部分因素均不干擾此測定法。
[0004]脂肪測定的方法較多，有索氏抽提法、酸水解法、伊尼霍夫氏堿法、哥特里-羅紫法、蓋勃氏法、巴布科克氏法等。索氏抽提法和酸水解法多用于食品中脂肪的檢測，而酸水解法測得的為游離及結(jié)合脂肪的總量。哥特里-羅紫法、蓋勃氏法、巴布科克氏法和伊尼霍夫氏堿法多用于乳與乳制品脂肪的傳統(tǒng)檢測。乳制品中脂肪酸含量和種類的定量檢測使用氣相色譜法，但樣品前處理過程復(fù)雜；首先都必須對脂肪進行皂化和甲酯化，再利用氣相色譜法測定其中脂肪酸的含量，此種方法耗時長、耗材多；高效液相色譜法不僅能檢測脂肪酸的含量，同時也可以測出各種脂肪酸在其中的位置分布情況，該方法準確性和重現(xiàn)性好，但樣品準備過程復(fù)雜，耗時長。韓瑞麗等利用高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器與氣相色譜-質(zhì)譜連用法測定牛奶甘油三酯sn-2位脂肪酸組成，該法省去了傳統(tǒng)測定中費時費力的薄層色譜分離步驟，精密度高、結(jié)果可靠。林觀平等使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀定性定量分析了湛江湖光牛奶脂肪酸組成和含量，該方法高效易行，準確可靠，節(jié)省時間，適合大標量樣品的檢測。王麗杰等利用近紅外漫反射光譜技術(shù)和偏最小二乘方回歸法檢測和分析了牛奶中蛋白質(zhì)含量，該方法具有快速、成本低和能同時無損測量多種成分等優(yōu)點，但是需要大量的牛奶來建立模型，且需要有牛奶中乳蛋白含量的數(shù)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可以通過牛奶中?；蚪MDNA質(zhì)量鑒定生鮮牛奶中脂肪和蛋白質(zhì)含量的方法，該方法通過牛奶中牛基因組DNA的分離提取，測定DNA含量和純度，采用瓊脂糖凝膠電泳法測定DNA大小，運用牛內(nèi)參引物和特異性引物開展PCR擴增，綜合分析判斷牛奶中所提取DNA的質(zhì)量，根據(jù)DNA含量與牛奶中乳蛋白、乳脂肪的關(guān)系方程，確定牛奶中乳蛋白和乳脂肪的含量。
[0006]為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn):
[0007]—種基于DNA質(zhì)量鑒定牛奶中脂肪和蛋白質(zhì)含量的方法，該方法包括進行牛奶中?；蚪MDNA質(zhì)量的測定，通過牛奶中?；蚪MDNA的質(zhì)量反應(yīng)牛奶中脂肪含量和通過牛奶中?；蚪MDNA的質(zhì)量反應(yīng)牛奶中蛋白質(zhì)含量；
[0008]所述的牛奶中?；蚪MDNA的質(zhì)量與牛奶中脂肪含量呈負相關(guān)，牛奶中?；蚪MDNA的質(zhì)量與牛奶中蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)；
[0009]所述的牛奶中牛基因組DNA質(zhì)量包括牛奶中?；蚪MDNA含量、牛奶中?；蚪MDNA純度、牛奶中?；蚪MDNA瓊脂糖凝膠電泳條帶質(zhì)量和牛奶中?；蚪MDNA的PCR擴增能力。
[0010]具體的，采用牛奶中?；蚪MDNA含量代表牛奶中?；蚪MDNA質(zhì)量，通過牛奶中牛基因組DNA的含量反應(yīng)牛奶中脂肪含量和通過牛奶中?；蚪MDNA的含量反應(yīng)牛奶中蛋白質(zhì)含量；
[0011]牛奶中?；蚪MDNA的含量與牛奶中脂肪含量呈負相關(guān)，牛奶中?；蚪MDNA的含量與牛奶中蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)。
[0012]更具體的，該方法還包括建立牛奶中蛋白質(zhì)含量與牛奶中?；蚪MDNA含量的線性回歸方程和建立牛奶中脂肪含量與牛奶中?；蚪MDNA含量的線性回歸方程。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，所帶來的技術(shù)效果是:
[0014](I)首次建立了牛奶中?；蚪MDNA質(zhì)量與牛奶中乳蛋白、乳脂肪含量的關(guān)聯(lián)性，為牛奶中乳蛋白、乳脂肪營養(yǎng)品質(zhì)的鑒別提供一種新方法；
[0015](2)本發(fā)明操作簡單、費用低、應(yīng)用前景廣闊，對于牛奶的營養(yǎng)品質(zhì)檢測具有重要的意義。
【附圖說明】
[0016]圖1為奶樣中提取的?；蚪MDNA純度測定結(jié)果；
[0017]圖2為奶樣中提取的牛基因組DNA含量測定結(jié)果；
[0018]圖3為奶樣中牛基因組DNA凝膠電泳結(jié)果，M:DL2000marker ;1、2、3、4、5、6、7、8、9分別表示第0.1、1、2、3、4、5、6、7、15天牛奶中?；蚪MDNA條帶；
[0019]圖4為牛內(nèi)參引物的PCR擴增結(jié)果，M:DL2000marker ;1、2、3、4、5、6、7、8、9分別表示第0.1、1、2、3、4、5、6、7、15天牛奶中?；蚪MDNA為模板擴增內(nèi)參引物的PCR產(chǎn)物條帶；
[0020]圖5為牛特異性引物的PCR擴增結(jié)果，M:DL2000marker ;1、2、3、4、5、6、7、8、9分別表示第0.1、1、2、3、4、5、6、7、15天牛奶中?；蚪MDNA為模板擴增特異性引物的PCR產(chǎn)物條帶；
[0021]圖6為牛奶乳蛋白含量測定結(jié)果；
[0022]圖7為牛奶乳脂肪含量測定結(jié)果；
[0023]圖8為乳蛋白含量與牛奶中?；蚪MDNA含量的相關(guān)性結(jié)果；
[0024]圖9為乳脂肪含量與牛奶中?；蚪MDNA含量的相關(guān)性結(jié)果；
[0025]以下結(jié)合具體實驗和發(fā)明人給出的具體實施例對本發(fā)明作更詳細的描述。
【具體實施方式】
[0026]研究發(fā)現(xiàn)，牛奶中蛋白質(zhì)含量、脂肪含量與牛奶中體細胞數(shù)(SCC)具有密切關(guān)系。美國農(nóng)業(yè)部規(guī)定，每毫升生鮮牛奶中SCC必須小于75萬個，否則不準用于加工巴氏殺菌乳等市售乳品；歐盟自1992年6月起就規(guī)定，原料奶必須小于40萬個/mL才準許出售給加工廠用于生產(chǎn)乳制品；新西蘭和澳大利亞規(guī)定的標準也是SCC〈40萬個/mL。同時，牛奶中牛奶中DNA含量主要來源于牛奶中的體細胞，牛奶中的體細胞數(shù)量一般達到10?30萬個/mL就可以提取出牛奶中?；蚪MDNA，本實驗室前期已經(jīng)建立了比較穩(wěn)定的牛奶中?；蚪MDNA的提取方法。
[0027]本發(fā)明所述的牛奶中?；蚪MDNA質(zhì)量包括牛奶中牛基因組DNA含量、牛奶中?；蚪MDNA純度、牛奶中?；蚪MDNA瓊脂糖凝膠電泳條帶質(zhì)量和牛奶中?；蚪MDNA的PCR擴增能力；
[0028]牛奶中?；蚪MDNA瓊脂糖凝膠電泳條帶質(zhì)量指的是瓊脂糖凝膠電泳條帶的亮度和大??；
[0029]牛奶中牛基因組DNA的PCR擴增能力指以牛奶中的?；蚪MDNA為模板，組成PCR體系，進行PCR擴增，再通過PCR產(chǎn)物條帶的亮度和大小判斷擴增結(jié)果。
[0030]本發(fā)明通過探索測定牛奶中脂肪和蛋白質(zhì)含量與?；蚪MDNA質(zhì)量的相關(guān)性，希望依托DNA質(zhì)量鑒別生鮮牛奶中脂肪和蛋白質(zhì)含量變化情況，通過大量的實驗研究發(fā)現(xiàn)不同貯藏條件下牛奶中牛基因組DNA含量與其純度、瓊脂糖凝膠電泳及PCR擴增結(jié)果的變化規(guī)律基本一致，因此，選擇具有數(shù)據(jù)的DNA含量代表DNA質(zhì)量來判斷其與牛奶中脂肪和蛋白質(zhì)之間的關(guān)系。
[0031]本發(fā)明所述的冷藏是指在溫度為2°C條件下貯藏；本發(fā)明所述的室溫下貯藏是指在20°C下貯藏。
[0032]實施例一:
[0033]1、實驗樣品來源
[0034]牛奶樣本采集于陜西省西安市郊區(qū)奶牛養(yǎng)殖戶家中的5頭成年奶牛，每個樣品的采取量為15mL，裝入15mL的離心管中。采集后，立即置于冰盒中帶回，置于冰箱中冷藏保存15天，待用。
[0035]2、試驗試劑
[0036]乙醇(95%體積分數(shù)以上)、無水碳酸鈉、氯化鈉、異戊醇等試劑為分析純試劑或溶液、95%乙醇、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、Triton-x 100、Tris-CU EDTA_Na、十二烷基硫酸鈉、濃鹽酸、蛋白酶、EDTA、Na2-EDTA、冰乙酸均購自于西安森博生物有限公司。
[0037]磷酸緩沖液(PBS)的配置:分別稱取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4L 44g，KH2PO40.24g，將各種物質(zhì)溶解于800mL蒸餾水中，調(diào)pH至7.4，加蒸餾水定容至IL ;
[0038]OP 乳化劑的配置:90% 的 Triton-x 10020mL, 95% 乙醇 125mL，0.9g/L NaCl 溶液855mL ；
[0039]DNA 提取緩沖液的配置:NaCl 1M/L，Tris-Cl 0.5M/L，EDTA-Na 0.5M/L，pH 調(diào)至7.5 ?8.0 ;
[0040]20% SDS裂解液的配置:將20g的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶解于80mL雙蒸水于68°C加熱溶解，用濃HCl調(diào)至PH7.2，定容至lOOmL，4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0041]蛋白酶K的配置:將20mg蛋白酶溶解于ImL無菌三蒸水，-20°C備用；
[0042]TE緩沖液的配置:分別稱取pH為8.0的1M/L Tris-Cl 2mL和0.5M/L EDTA0.4mL，將其兩種溶液混合均勾，加蒸饋水定容至200mL，調(diào)pH至8.0 ;
[0043]電泳緩沖液(IXTAE)的配置:稱取24.2g Tris-Cl, 1mL 0.5M/L 的 Na2-EDT