專利名稱：：一種提制煙堿的微生物處理工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種煙草中活性成分煙堿的提取技術(shù)，特別是涉及一種利用微生物發(fā)酵法處理煙草提制活性成分煙堿的技術(shù)。
背景技術(shù)：
：我國煙草資源豐富，每年煙葉產(chǎn)量450-500萬噸，除用作巻煙生產(chǎn)外，其中約有近25%的煙葉、煙末等下腳料被廢棄，造成環(huán)境污染。其實，煙草中富含煙堿(含量為1~3%)、加尼醇(含量為0.3~0.5°/。)、果膠、煙酸等多種特殊的天然植物素。煙堿，又稱尼古丁(Nicotine),因其具有蒸薰、胃毒、觸殺功能以及迅速降解無殘留等特點，是生產(chǎn)綠色食品的理想的高效殺蟲劑和生物農(nóng)藥，主要具有以下特點①低毒、低殘留；②用量低；③作為天然物質(zhì)，在環(huán)境中易分解，不造成二次污染；④有效期較長，一般為20天左右；對害蟲不易產(chǎn)生抗藥性，殺蟲廣鐠。作為農(nóng)用殺蟲劑，廣泛用于糧食、油料、蔬菜、水果、牧草等農(nóng)作物的噴霧防治殺蟲，是保護生態(tài)環(huán)境的生物活性農(nóng)藥。此外，煙堿還廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥工業(yè)上，是研制治療心血管、皮膚病、蛇毒等疾患藥物的特種原料，用其所制得的檸檬酸煙堿還可用于高級香煙的品種改良等。目前，從煙葉中提制煙堿的傳統(tǒng)工藝主要有水蒸氣蒸餾法、溶劑萃取法和離子交換法；近年來還出現(xiàn)了微波協(xié)助萃取法、超聲波協(xié)助萃取法、超臨界流體萃取法、碳化脫羧法等方法。其中，①水蒸氣蒸餾法水是提取天然煙堿的較為原始的工藝，操作方便，但是處理設(shè)備龐大，效率低，所得產(chǎn)品煙堿的純度不高；②溶劑萃取法雖已有一定的工業(yè)基礎(chǔ)，但因煙堿從有機相轉(zhuǎn)入水相后進4亍分離時，在生產(chǎn)上相界面極易產(chǎn)生乳化層而導致停產(chǎn)，且萃取劑多為揮發(fā)性有機溶劑，具有揮發(fā)性，對環(huán)境的一定污染；③超臨界流體萃取法雖具有萃取能力強、溶劑回收簡單，節(jié)省能源等優(yōu)點，但超臨界流體C02,對煙堿的溶解能力受煙草原料含水量的影響較大，只有在煙草的含水量在25%時，C02才能有效的萃取尼古丁，且高壓設(shè)備投資和維修費用大，設(shè)計和制造技術(shù)要求高，萃取釜還不能進行連續(xù)操作，生產(chǎn)能力較低。這些提制方法的局限性，使得煙堿的生產(chǎn)成本高，提取率不理想，尤其是高純度產(chǎn)品的提取率低，存在著"提取率、能源消耗和環(huán)境污染"之間尖銳矛盾，難以滿足市場需求。近年來，生物酶工程技術(shù)開始廣泛應(yīng)用于中草藥提取中。只要選用恰當?shù)拿妇捎梦⑸锇l(fā)酵，通過某些極性低的脂溶性成分轉(zhuǎn)化為易溶于水的糖苦類的過程，不僅能分解植物組織，去除影響液體制的雜質(zhì)，如淀粉、蛋白質(zhì)、果膠等，還能迅速有效釋放出有效成分，有利于提取物的分離、提取，避免萃取劑的揮發(fā)造成的污染和浪費。其工藝簡單，操作方便。綜上所述，隨著煙草工業(yè)、精細化工、制藥、有機合成、國防、農(nóng)藥等的迅速發(fā)展，市場對煙堿的需求與日倶增，利用微生物處理煙草，提高煙草中有效成分的提取率和純度，既解決煙草制造企業(yè)的污染排放問題，避免二次污染的產(chǎn)生，還能為社會創(chuàng)造良好的經(jīng)濟效益，這也完全符合目前國家強調(diào)"節(jié)能減排"的總體思路。
發(fā)明內(nèi)容針對于此，本發(fā)明的目的在于，提供一種提取工藝簡單，產(chǎn)品的提取高，污染小的提制煙堿的微生物處理工藝。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種提制煙堿的孩史生物處理工藝，包括以下步驟(1)、煙葉的預(yù)處理將煙葉在80°C~ll(TC烘30min2hr，粉碎，然后經(jīng)60目篩篩分，選用粒徑小于60目的煙葉；(2)、菌種培育選用白腐直菌和管嚢酵母，分別經(jīng)過斜面培養(yǎng)、一級種子試管培養(yǎng)后，按重量比1:1將兩菌種接種入搖瓶培養(yǎng)；將培養(yǎng)好的混合菌種接種入裝液量為60ml的250ml三角瓶中，接入量為5%,29。C,180rpm，混合培養(yǎng)48hr;(3)、煙葉的發(fā)酵將步驟(l)預(yù)處理后的煙葉轉(zhuǎn)入發(fā)酵裝置中，加入豆粕和水，其中煙葉與水的重量比為3:2070,豆粕的重量百分量為5%~25%;將步驟。)的混合菌種接入發(fā)酵裝置中，接種量為20%~60%,調(diào)節(jié)pH為5~9,溫度25°C~40°C,發(fā)酵時間12hr~72hr;(4)、煙堿的提取過濾步驟(3)的發(fā)酵液，向濾液中加入有機萃取劑，經(jīng)萃取、分離，取有機相層，減壓蒸餾后，得煙堿。優(yōu)選的，步驟(l)中的煙葉篩分為依次經(jīng)20目、40目和60目篩。優(yōu)選的，步驟(2)中的菌種還包括康寧木霉。優(yōu)選的，步驟(3)中將煙葉轉(zhuǎn)入發(fā)酵裝置之前，對煙葉進行微波處理。孩i波輸出功率為900W,頻率為2450mhz;處理時間30s。4吏用微波預(yù)處理煙葉，在微波照射下，煙葉內(nèi)部結(jié)構(gòu)蓬松化，有利于微生物進入植物組織內(nèi)部，促進煙葉中纖維素類物質(zhì)的降解，從而增大了煙堿的游離度。優(yōu)選的，步驟(3)中煙葉與水的重量為3:20。優(yōu)選的，步驟(3)煙葉的發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度為30°C,發(fā)酵時間為48hr，pH為6。優(yōu)選的，步驟(4)中有機萃取劑為氯仿、乙醚或乙酸乙酯。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有效利用了生產(chǎn)香煙后的煙草，采用微生物發(fā)酵方式來提取煙葉中的煙堿；將廢棄煙葉烘干、粉碎、篩分處理，便于發(fā)酵過程有效地進行；選用白腐直菌和管嚢酵母，利用兩種微生物協(xié)同處理煙葉，提高煙堿提取量，將發(fā)酵液經(jīng)有機溶劑萃取處理，再減壓蒸餾有機相即得到煙堿。本發(fā)明采用復(fù)合微生物處理來提取煙堿，通過白腐直菌、管嚢酵母等微生物降解、破壞經(jīng)微波處理的煙草中的纖維素、半纖維素等植物組織，有效釋放附著在組織結(jié)構(gòu)上的煙堿，提高煙堿的溶出率和提取率；可同時有效降解煙草中有機酸、蛋白質(zhì)等，減少煙堿提取過程中的乳化現(xiàn)象，同時減少有機溶劑的使用量。本方法煙堿提取率高，有機溶劑使用少，回收率高，有效實現(xiàn)廢次煙草的減量化和煙草資源化再利用。整個工藝過程提高煙草中有效成分的提取率和純度，開創(chuàng)了一條提制煙堿的新途徑，既解決煙草制造企業(yè)的污染排放問題，還能為社會創(chuàng)造良好的經(jīng)濟效益。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細描述，本部分的描述僅是示范性和解釋性，不應(yīng)對本發(fā)明的保護范圍有任何的限制作用。實施例1一種提制煙堿的微生物處理工藝，是釆用微生物處理工藝發(fā)酵煙草，依下述步驟完成(1)、將40g~50g廢棄的煙葉洗凈，晾干后，在80。CU0。C的烘箱中烘30min2hr后取出，用粉碎機粉碎后連續(xù)經(jīng)過20、40、60目的分子篩分別篩分，得到粒徑小于60目的煙葉，用塑料袋分裝，備用。(2)、根據(jù)微生物降解植物組織的特性，特選取微生物菌種白腐直菌、康寧木霉、管嚢酵母，分別進行斜面培養(yǎng)和一級種子試管培養(yǎng)、二級種子搖瓶培養(yǎng)。①斜面培養(yǎng)麥芽汁酵母培養(yǎng)基取大麥芽一定數(shù)量，粉碎，加4倍于麥芽量的水，保溫糖化，不斷攪動，經(jīng)過數(shù)小時后，紗布過濾，除去殘渣，煮沸，用濾布過濾，得澄清的麥芽汁。加瓊脂2%,pH值為7，高溫滅菌20分鐘，液體直接裝入試管中于一定溫度滅菌20分鐘。在30。C條件下，培養(yǎng)數(shù)天后，涂布分離與劃線分離，得固體麥芽汁培養(yǎng)基。從原始菌種斜面上挑取一環(huán)酵母菌，直線法接種于麥芽汁斜面上，置于培養(yǎng)箱中一定溫度，培養(yǎng)3天~4天，使菌絲長滿斜面。PDA霉菌培養(yǎng)基馬鈴薯去皮，切成小塊，加水煮沸，用紗布過濾，加葡萄糖，瓊脂，補水，pH值為7，融化瓊脂，趁熱分裝到試管中。從原始菌種斜面上挑取一環(huán)，直線法接種于PDA斜面上，置于培養(yǎng)箱中一定溫度，培養(yǎng)3天4天，使菌絲長滿斜面。②種子液體培養(yǎng)一級種子試管培養(yǎng)在5ml的PDA液體培養(yǎng)基中，接種，搖勻后，置于培養(yǎng)箱中，29。C培養(yǎng)24hr。二級種子搖瓶培養(yǎng)以5%的接種量接種到裝液量為60ml的250ml三角瓶中，29°C，180rpm,培養(yǎng)36hr。③混合種子搖瓶培養(yǎng)分別按5%比例將三種培養(yǎng)好的菌種子液接入裝液量為60ml的250ml三角瓶中，29°C，180rpm,培養(yǎng)48hr。(3)、取預(yù)處理后的煙葉10g轉(zhuǎn)入發(fā)酵裝置中，加入水100ml,豆粕為5g,接入培養(yǎng)好的混合菌種，總接種量為20%,用HzS04調(diào)節(jié)發(fā)酵體系的pH為9，溫度為25。C，發(fā)酵72hr。(4)、將步驟(3)發(fā)酵體系經(jīng)漏斗過濾，濾液轉(zhuǎn)入錐形瓶，濾渣轉(zhuǎn)入燒杯，用于制備活性炭，待用。(5)、將步驟(4)所得濾液，取lml離心后，于60ml分液漏斗中，加入pH為5.00的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液2ml，飽和甲基橙溶液2ml,充分搖勻后，加入氯仿5ml，萃取2min,靜置分層，取出下層氯仿層，采用釆用分光光度法測定溶液體系中煙堿含量，數(shù)據(jù)記錄及處理。(6)、將步驟(4)所得濾液，加入0.5~1.5倍體積有才幾溶液氯仿或乙酸乙酯萃取二次，蒸餾，得煙堿0.276g。實施例2(1)、將煙葉在105。C烘lhr，粉碎，經(jīng)60目篩篩分，選用粒徑小于60目的煙葉10g,用輸出功率為卯OW,頻率為2450mhz的微波處理30s;(2)、選用白腐直菌和管嚢酵母，經(jīng)斜面培養(yǎng)、一級種子試管培養(yǎng)后，將培養(yǎng)好的兩個菌種按1:1比例接種入60ml的250ml三角瓶中進行二級混合種子搖床培養(yǎng)，混合菌種接入量為5°/。，29°C，180rpm,培養(yǎng)48hr;(3)、將步驟(l)預(yù)處理后的煙葉10g轉(zhuǎn)入發(fā)酵裝置中，加入1.5g的豆粕和60ml水，接入接種量為40%的煙葉重量的混合菌種于發(fā)酵裝置中，調(diào)節(jié)pH為5，溫度3(TC,發(fā)酵48hr后取樣lml,離心后，采用分光光度法測定溶液體系中煙堿含量，測得煙石成濃度為3.29g/l，高7于未發(fā)酵處理煙堿濃度(未發(fā)酵煙堿濃度為1.24g/l);煙堿溶出率為2.84%。(4)、煙堿的提取過濾步驟(3)的發(fā)酵液，向濾液中加入有機萃取劑氯仿，經(jīng)萃取、分離，取有機相層，減壓蒸餾后，得煙堿。將濾液轉(zhuǎn)入250ml分液漏斗中，分2次加入氯仿80ml進行萃耳又，取下層有機相減壓蒸餾，得到煙堿粗品的質(zhì)量為0.605g，經(jīng)精餾提純后的煙堿^0.246g，氯仿的回收率為81.14%。實施例3(1)、將煙葉在80。C烘2hr，粉碎，經(jīng)20目和60目篩篩分，選用粒徑小于60目的煙葉10g，用輸出功率為900W,頻率為2450mhz的微波處理30s;(2)、選用白腐直菌和管嚢酵母，經(jīng)斜面培養(yǎng)、一級種子試管培養(yǎng)后，將培養(yǎng)好的兩個菌種按1:1比例接種入60ml的250ml三角并瓦中進行二級混合種子搖床培養(yǎng)，混合菌種接入量為5%，29°C，180rpm,培養(yǎng)48hr;(3)、將步驟(l)預(yù)處理后的煙葉20g轉(zhuǎn)入發(fā)酵裝置中，加入5g的豆粕和160ml水，接入接種量為60%的煙葉重量的混合菌種于發(fā)酵裝置中，調(diào)節(jié)pH為7，溫度40。C,發(fā)酵12hr后取樣lml,離心后，采用分光光度法測定溶液體系中煙堿含量，測得煙堿濃度為3.43g/l,高于未發(fā)酵處理煙堿濃度(未發(fā)酵煙堿濃度為1.24g/l);煙堿溶出率為3.84%。(4)、煙堿的提取過濾步驟(3)的發(fā)酵液，向濾液中加入有機萃取劑乙醚，經(jīng)萃取、分離，取有機相層，減壓蒸餾后，得煙堿。將濾液轉(zhuǎn)入500ml分液漏斗中，分2次加入乙醚100ml進行萃取，取下層有機相減壓蒸餾，得到煙堿粗品的質(zhì)量為1.315g，經(jīng)精餾提純后的煙堿0.501g，乙醚的回收率為83.36%。表l不同固液比(煙葉重量水的體積)與煙石威含量煙葉發(fā)酵中加入水，煙葉與水的重量比例(g/ml)為3:20~70<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2輔津牛比和煙-威含量煙葉發(fā)酵中，豆粕的重量百分量為5%~25%<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表4煙葉發(fā)酵中pH和煙石咸含量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表5煙葉發(fā)酵中發(fā)酵溫度和煙堿含量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表6煙葉發(fā)酵中發(fā)酵時間與煙堿含量_時間(h)122436486072濃度(g/1)1.2951.3571.3981.4261.3501.123以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。10權(quán)利要求1、一種提制煙堿的微生物處理工藝，包括以下步驟(1)、煙葉的預(yù)處理將煙葉在80℃～110℃烘30min～2hr，粉碎，然后經(jīng)60目篩篩分，選用粒徑小于60目的煙葉；(2)、菌種培育選用白腐直菌和管囊酵母，分別經(jīng)過斜面培養(yǎng)、一級種子試管培養(yǎng)后，按重量比1∶1將兩菌種接種入搖瓶培養(yǎng)；將培養(yǎng)好的混合菌種接種入裝液量為60ml的250ml三角瓶中，接入量為5％，29℃，180rpm，混合培養(yǎng)48hr；(3)、煙葉的發(fā)酵將步驟(1)預(yù)處理后的煙葉轉(zhuǎn)入發(fā)酵裝置中，加入豆粕和水，其中煙葉與水的重量比為3∶20～70，豆粕的重量百分量為5％～25％；將步驟(2)的混合菌種接入發(fā)酵裝置中，接種量為20％～60％，調(diào)節(jié)pH為5～9，溫度25℃～40℃，發(fā)酵時間12hr～72hr；(4)、煙堿的提取過濾步驟(3)的發(fā)酵液，向濾液中加入有機萃取劑，經(jīng)萃取、分離，取有機相層，減壓蒸餾后，得煙堿。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的提制煙堿的微生物處理工藝，其特征在于步驟(l)中的煙葉篩分為依次經(jīng)20目、40目和60目篩。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的提制煙堿的微生物處理工藝，其特征在于步驟(2)中的菌種還包括康寧木霉。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的提制煙堿的微生物處理工藝，其特征在于步驟(3)中將煙葉轉(zhuǎn)入發(fā)酵裝置之前，對煙葉進行微波處理。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的提制煙堿的微生物處理工藝，其特征在于步驟(3)中煙葉與水的重量為3:20。6、根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的提制煙堿的微生物處理工藝，其特征在于步驟(3)煙葉的發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度為30°C,發(fā)酵時間為48hr,pH為6。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的提制煙堿的微生物處理工藝，其特征在于步驟(3)中豆粕的重量百分含量為15%。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的提制煙堿的微生物處理工藝，其特征在于步驟(4)中有機萃取劑為氯仿、乙醚或乙酸乙酯。全文摘要本發(fā)明公開一種提制煙堿的微生物處理工藝，包括以下步驟(1)煙葉的預(yù)處理；(2)菌種培育；(3)煙葉的發(fā)酵；(4)煙堿的提取。本發(fā)明采用復(fù)合微生物處理來提取煙堿，通過白腐直菌、管囊酵母等微生物降解、破壞經(jīng)微波處理的煙草中的纖維素、半纖維素等植物組織，有效釋放附著在組織結(jié)構(gòu)上的煙堿，提高煙堿的溶出率和提取率；可同時有效降解煙草中有機酸、蛋白質(zhì)等，減少煙堿提取過程中的乳化現(xiàn)象，同時減少有機溶劑的使用量。本方法煙堿提取率高，有機溶劑使用少，回收率高，有效實現(xiàn)廢次煙草的減量化和煙草資源化再利用。文檔編號C07D401/04GK101671326SQ20091019096公開日2010年3月17日申請日期2009年9月21日優(yōu)先權(quán)日2009年9月21日發(fā)明者夏曉芳,殷鐘意,王星敏,鄭旭煦申請人:重慶工商大學