專利名稱：一種3’8”-雙芹菜素型雙黃酮類化合物的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雙黃酮類化合物的應(yīng)用領(lǐng)域，尤其涉及一種3'8"-雙芹菜素型雙黃酮 類化合物的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
老年性癡呆即阿爾茨海默病(Alzheimer disease)，是一種原發(fā)性腦退行性疾病， 是老年人的多發(fā)病和常見(jiàn)病，臨床上以進(jìn)行性的記憶和認(rèn)知功能障礙為特征。老年性癡 呆是由多種原因引起，涉及多種病理機(jī)制和多種病理表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病，其最主要病 理表現(xiàn)是在大腦皮層和海馬出現(xiàn)由淀粉樣蛋白(13-amyloid protein)聚集形成的老年斑 (senile plague, SP)，以及神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle, NFT)和神經(jīng)細(xì)胞缺 失。研究普遍認(rèn)為，老年性癡呆患者腦中13淀粉樣蛋白的異常增加與沉積是啟動(dòng)神經(jīng)元 退行性病變的核心事件。1992年，Hardy等人提出了淀粉樣蛋白的級(jí)聯(lián)假說(shuō)，認(rèn)為腦內(nèi)異 常增多的13淀粉樣蛋白和其他危險(xiǎn)因素共同作用，啟動(dòng)了阿爾茨海默病的發(fā)病過(guò)程，并在 其發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。P淀粉樣蛋白是由膜內(nèi)淀粉樣前體蛋白(amyloidprecursor protein, APP)的異常水解和錯(cuò)誤折疊所致。P淀粉樣蛋白從可溶狀態(tài)到不溶狀態(tài)的轉(zhuǎn)變 是阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。P淀粉樣蛋白在大腦中的過(guò)量生成、聚集和沉積 可引起神經(jīng)元鈣穩(wěn)態(tài)失衡，自由基大量產(chǎn)生，激活炎性因子，引起腦組織局部炎癥等一系列 反應(yīng)，繼而出現(xiàn)中樞整合功能異常。進(jìn)一步研究表明，膽堿能系統(tǒng)的紊亂也源于P淀粉樣 蛋白的過(guò)度生成和聚集。國(guó)際上普遍認(rèn)同，抑制P淀粉樣蛋白分泌是預(yù)防及治療老年性癡 呆的有效治療手段。 目前已有的被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療老年癡呆的藥物均為乙酰膽堿酶抑制劑，主 要包括他克林、以安理申、艾斯能、石杉?jí)A甲。這些藥物均屬對(duì)癥治療藥物，在顯著治療或緩 解老年性癡呆的發(fā)展方面也未見(jiàn)突破性進(jìn)展。越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，老年性癡呆與腦 內(nèi)13淀粉樣蛋白水平密切相關(guān)，因此從天然中草藥中篩選治療老年癡呆的中藥提取物或 有效成分是近年來(lái)國(guó)際老年性癡呆研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。 雙黃酮是由二分子黃酮衍生物聚合而成的二聚物，常見(jiàn)的是由二分子芹菜素(或
其甲醚衍生物)構(gòu)成。聚合方式有三種類型 (1)3口，8"-雙芹菜素型，如銀杏葉中的銀杏素等； (2)8，8〃 -雙芹菜素型，如柏黃酮； (3)雙苯醚型如扁柏黃酮。 目前，尚未有將3' 8"-雙芹菜素型雙黃酮類化合物在抑制|3淀粉樣蛋白中的效 果研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種來(lái)源于紅豆杉的3' 8"_雙芹菜素 型雙黃酮類化合物的制備方法。
本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供上述3' 8"-雙芹菜素型雙黃酮類化合物的應(yīng)用。 本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn) 本發(fā)明3' 8"_雙芹菜素型雙黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)式如下通式所示
其中，RrR6為氫、羥基、C廣Q。烷氧基團(tuán)、CQ。酰氧基團(tuán)、異戊烯基或-0(^20，但不 包括R廣Re同時(shí)為氫或同時(shí)為羥基的結(jié)構(gòu)。 本發(fā)明3'8"-雙芹菜素型雙黃酮類化合物的制備方法為用乙醇熱回流浸提紅豆 杉枝葉粗粉得到總浸膏，經(jīng)反相正相柱層析和凝膠、重結(jié)晶分離得到3' 8"-雙芹菜素型雙 黃酮類化合物。
上述制備方法優(yōu)選如下步驟 (1)取云南紅豆杉枝葉風(fēng)干，粉碎，過(guò)80目篩，用8倍樣品量體積95%乙醇加熱回 流提取3次，每次1小時(shí)，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮，回收乙醇得浸膏或濃縮液；
(2)浸膏或濃縮液中加入丙酮，按1 : 1的質(zhì)量比拌硅膠(80 100目)，晾干；
(3)以8倍樣品質(zhì)量的硅膠裝柱，石油醚作洗脫劑，先用3個(gè)柱體積石油醚洗脫，除 去色素等脂溶性物質(zhì)，然后用5個(gè)柱體積石油醚丙酮洗脫； (4)收集洗脫液，減壓濃縮得到粗提物。粗提物部分繼續(xù)過(guò)硅膠柱，用體積比分別
為7 : 3、6 : 4、5 : 5的石油醚乙酸乙酯洗脫劑依次洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，
薄層層析檢測(cè)，合并相同流份，共得到5個(gè)流份，將流份中含有黃色沉淀的流份5用甲醇加
熱溶解，反復(fù)重結(jié)晶得到3' 8"-雙芹菜素型雙黃酮類化合物。 其中，所述步驟(3)中石油醚與丙酮的體積比優(yōu)選55 : 45。 本發(fā)明3' 8"-雙芹菜素型雙黃酮類化合物可用于制備抑制淀粉樣蛋白的生成或 聚集的藥物。該藥物除了含有本發(fā)明3'8"-雙芹菜素型雙黃酮類化合物外，還可含有藥學(xué) 上可以接受的載體。 本發(fā)明3' 8"-雙芹菜素型雙黃酮類化合物還可用于制備治療或預(yù)防阿爾茨海默 病的藥物。該藥物除了含有本發(fā)明3'8"-雙芹菜素型雙黃酮類化合物外，還可含有藥學(xué)上 可以接受的載體。 上述藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，包括但不限于稀釋劑、 賦型劑(如水等)；填充劑(如淀粉、蔗糖等)；黏合劑(如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠或聚 乙烯吡咯烷酮)；濕潤(rùn)劑(如甘油)；崩解劑(如瓊脂、碳酸鈣或碳酸氫鈉)；吸收促進(jìn)劑(如 季銨化合物)；表面活性劑(如十六烷醇)；吸收載體(如高嶺土和皂黏土)；潤(rùn)滑劑(如滑 石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂或聚乙二醇等)外還可以加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明化合物可以制備成各種劑型的藥物，制備方法為藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法。例 如，使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。本發(fā)明的化合物可以組 合物的形式通過(guò)口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、膠囊等，制成液體制劑如水或油懸 浮劑或其它液體制劑如糖漿等。用于腸胃外給藥時(shí)候，可將其制成注射用的溶液、水或油性 懸浮劑等。優(yōu)選的形式是片劑、膠囊或注射劑。 本發(fā)明化合物用于制備藥物時(shí)，優(yōu)選含有重量比為0. 1% -99. 5%的化合物活性 成分，最優(yōu)選含有重量比為0. 5% _95%的化合物活性成分。 本發(fā)明化合物的施用量可根據(jù)用藥途徑、患者的年齡、體重、所治療的疾病的類型 和嚴(yán)重程度等變化，其日計(jì)量可以是0.01-10mg/kg體重，優(yōu)選0. l-5mg/kg體重。可以一次 或多次使用。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果 本發(fā)明3' 8"_雙芹菜素型雙黃酮類化合物用于制備抑制老年斑的形成或者治療 阿爾茨海默病的藥物，可以有效減少13淀粉樣蛋白的產(chǎn)生，還可以使聚集狀態(tài)的淀粉樣蛋 白的解聚，預(yù)防或減少老年斑；本發(fā)明3'8"-雙芹菜素型雙黃酮類化合物來(lái)源于紅豆杉，制 備工藝簡(jiǎn)單易行，收得率高。


圖1為3' 8"_雙芹菜素型雙黃酮類化合物對(duì)|3淀粉樣蛋白聚集影響示意圖；
圖2為3' 8"-雙芹菜素型雙黃酮類化合物對(duì)13淀粉樣蛋白解聚作用示意圖；
圖3為3'8"_雙芹菜素型雙黃酮類化合物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞作用示意圖，其中，1為 金松雙黃酮與P淀粉樣蛋白混合組，2為金松雙黃酮組。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限 定。 實(shí)施例1 從人工栽培云南紅豆杉中制備金松雙黃酮的方法 人工栽培云南紅豆杉枝葉，風(fēng)干，粉碎80目，用8倍體積量95%乙醇加熱回流提取 3次，每次1小時(shí)，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮，回收乙醇得浸膏或濃縮液。浸膏以丙酮溶解， 按1 : 1的質(zhì)量比拌硅膠(80-100目)，晾干。稱取8倍樣品質(zhì)量硅膠(200-300目)，以石 油醚作為洗脫劑，濕法裝柱，先用3個(gè)柱體積石油醚洗脫，除去色素等脂溶性物質(zhì)，然后用5 個(gè)柱體積石油醚丙酮(體積比為55 : 45)洗脫。收集該部分洗脫液，減壓濃縮得到粗 提物A(Part A)。 Part A繼續(xù)過(guò)硅膠柱，用石油醚乙酸乙酯(體積比分別7 : 3、6 : 4、 5 : 5)作洗脫劑，得到A1-A5，5個(gè)流份，流份A5用甲醇加熱溶解，反復(fù)重結(jié)晶得到高純度的 金松雙黃酮，純度可以達(dá)到98wt% 。
金松雙黃酮的結(jié)構(gòu)如下所示
OH O 金松雙黃酮(sciadopitysin)。
實(shí)施例2 1、金松雙黃酮對(duì)13淀粉樣蛋白聚集以及對(duì)聚集狀態(tài)A |3的作用。 1. 1實(shí)驗(yàn)方法建立|3淀粉樣蛋白體外老化模型，采用硫磺素T熒光分析，通過(guò)體
外孵育方式觀察候選藥物干預(yù)P淀粉樣蛋白聚集和纖維形成作用以及對(duì)老化纖維的解聚作用。
(1)溶液配制 硫磺素T溶液取3mg粉末溶于甘氨酸-NaOH緩沖液(50mM， pH8. 5)中，儲(chǔ)備液濃 度為lmM。工作濃度稀釋為5 ii M ; |3淀粉樣蛋白溶液13淀粉樣蛋白粉末用磷酸緩沖液PBS(O. 1M， pH7. 4)配制成 25 M的溶液，分裝儲(chǔ)存于-80°C ，用時(shí)融化、稀釋； 藥物溶液溶于二甲亞砜(DMSO，dimethylsulfoxide)，配成lmg/ml濃度，-20。C低 溫冰箱保存，臨用時(shí)按要求(用培養(yǎng)液或PBS)稀釋至所需濃度，使匿SO終濃度小于或等于 1% (v/v)。 (2)藥物對(duì)13淀粉樣蛋白聚集的影響取50iiM的13淀粉樣蛋白蛋白 lOiU，加入lOiU的化合物，混勻(冰上操作)，于37°C中共同孵育48h。孵育結(jié) 束后，所有樣品加入5iiM的Th-T磷酸緩沖液180ia，充分混合后，用96孔黑板，
立即進(jìn)行熒光檢測(cè)。設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)(excitation wavelength, ) 二450nm， 發(fā)射波長(zhǎng)(emission wavelength, ,A￡ a)=482nm，記錄5min末的熒光強(qiáng)度
(Fluorescencelntensity， FI)，重復(fù)測(cè)定三次實(shí)驗(yàn)所測(cè)結(jié)果的平均值代表其熒光程度。
(3)藥物對(duì)已老化纖維的作用13淀粉樣蛋白在上述條件下，先孵育48h，然后加 入藥物再孵育48h。采用(2)中相同方法測(cè)定。 1. 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果隨著金松雙黃酮濃度增加，對(duì)13淀粉樣蛋白聚集的抑制逐漸增加， 當(dāng)濃度達(dá)到50iiM時(shí)，抑制率達(dá)到47. 7% (見(jiàn)圖l)。當(dāng)濃度為12. 5iiM時(shí)，金松雙黃酮可 以使得老化纖維明顯減少，當(dāng)濃度達(dá)到50 M時(shí)，可以使得50. 78%的老化纖維解聚(見(jiàn)圖 2)。 2、利用SH-SY5Y細(xì)胞模型，應(yīng)用MTT法評(píng)估候選金松雙黃酮的細(xì)胞毒性。
(1)試驗(yàn)方法MTT溶液取125mg MTT粉末用50ml無(wú)菌PBS(O. 01mmol/L， pH7. 4) 溶解，配成2. 5mg/ml，在超聲清洗儀振蕩數(shù)十秒，濾過(guò)除菌，然后于4t:避光保存。兩周內(nèi)使 用有效，最好現(xiàn)配現(xiàn)用。 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37°C、 5% (A培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。 接種細(xì)胞將生長(zhǎng)良好的SH-SY5Y細(xì)胞，小心棄去培養(yǎng)皿內(nèi)的大部分細(xì)胞培養(yǎng)液，用0. 25%胰酶消化4min后，1000rpm/min離心5min ;棄去離心后上清液，重新加入DMEM，用 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，轉(zhuǎn)移單細(xì)胞懸液至培養(yǎng)皿并調(diào)整細(xì)胞密度為8 X 104個(gè)/ml 。用8道加 樣器吸取單細(xì)胞懸液加入96孔板中，100 ii 1/孔，即8000個(gè)細(xì)胞/孔。
藥物干預(yù)在37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后吸去上清液，分別用
培養(yǎng)基稀釋的不同濃度藥物處理細(xì)胞，設(shè)立不加任何處理因素的對(duì)照組，空白孔，每個(gè)濃度 設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，加入10iiM的13淀粉樣蛋白與化合物混合液100iil，與細(xì)胞于37t:，5^ 。02培養(yǎng)箱中作用48h。每孔加入2. 5mg/ml的MTT 20 yl，于37°C ， 5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4h。棄去上清，每孔加入100 ii 1的DMSO，振蕩15秒，測(cè)量490nm處的吸收值(A)。
細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)各組細(xì)胞存活率(％ )=(試驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)X 100% ，從 而得出各組細(xì)胞存活率。 (2)試驗(yàn)結(jié)果金松雙黃酮對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞無(wú)明顯毒性，并且當(dāng)濃度增加到10 y M 時(shí)，可以促進(jìn)細(xì)胞增長(zhǎng)(見(jiàn)圖3)。
權(quán)利要求
一種3’8”-雙芹菜素型雙黃酮類化合物的制備方法，其特征在于所述3’8”-雙芹菜素型雙黃酮類化合物是從紅豆杉枝葉中提取得到的。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的3'8"-雙芹菜素型雙黃酮類化合物的制備方法，其特征在于 所述制備方法為用乙醇熱回流浸提紅豆杉枝葉粗粉得到總浸膏，經(jīng)反相正相柱層析和凝 膠、重結(jié)晶分離得到3' 8"-雙芹菜素型雙黃酮類化合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的3'8"-雙芹菜素型雙黃酮類化合物的制備方法，其特征在于 所述制備方法為(1) 取紅豆杉枝葉風(fēng)干，粉碎，過(guò)80目篩，用8倍樣品量體積95%乙醇加熱回流提取3 次，每次1小時(shí)，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮，回收乙醇得浸膏或濃縮液；(2) 浸膏或濃縮液中加入丙酮，按1 : 1的質(zhì)量比拌硅膠(80 100目)，晾干；(3) 以8倍樣品質(zhì)量的硅膠裝柱，石油醚作洗脫劑，先用3個(gè)柱體積石油醚洗脫，除去色 素等脂溶性物質(zhì)，然后用5個(gè)柱體積石油醚丙酮洗脫；(4) 收集洗脫液，減壓濃縮得到粗提物。粗提物部分繼續(xù)過(guò)硅膠柱，用體積比分別為7 : 3、6 : 4、5 : 5的石油醚乙酸乙酯作洗脫劑依次洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，薄層層析檢測(cè)，合并相同流份，共得到5個(gè)流份，將流份中含有黃色沉淀的流份5用甲醇加熱 溶解，反復(fù)重結(jié)晶得到3' 8"-雙芹菜素型雙黃酮類化合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的3'8"-雙芹菜素型雙黃酮類化合物的制備方法，其特征在于 步驟(3)中所述石油醚與丙酮的體積比為55 : 45。
5. 權(quán)利要求1至4中任意一條權(quán)利要求所述制備方法制得的3' 8"-雙芹菜素型雙黃 酮類化合物的應(yīng)用，其特征在于所述3' 8"-雙芹菜素型雙黃酮類化合物用于制備抑制13 淀粉樣蛋白的生成或聚集的藥物。
6. 權(quán)利要求1至4中任意一條權(quán)利要求所述制備方法制得的3' 8"-雙芹菜素型雙黃 酮類化合物的應(yīng)用，其特征在于所述3' 8"-雙芹菜素型雙黃酮類化合物用于制備治療或預(yù) 防阿爾茨海默病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種3’8”-雙芹菜素型雙黃酮類化合物及其制備方法與應(yīng)用，該化合物的制備方法為用乙醇熱回流浸提紅豆杉枝葉粗粉得到總浸膏，經(jīng)反相正相柱層析和凝膠、重結(jié)晶分離得到3’8”-雙方芹菜素型雙黃酮類化合物。本發(fā)明3’8”-雙芹菜素型雙黃酮類化合物用于制備抑制老年斑的形成或者治療阿爾茨海默病的藥物，可以有效減少β淀粉樣蛋白的產(chǎn)生，還可以使聚集狀態(tài)的β淀粉樣蛋白的解聚，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，濃度高時(shí)還可以促進(jìn)細(xì)胞增長(zhǎng)；本發(fā)明制備方法工藝簡(jiǎn)單，收得率高。
文檔編號(hào)C07D311/40GK101712670SQ200910193990
公開(kāi)日2010年5月26日 申請(qǐng)日期2009年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月17日
發(fā)明者古練權(quán), 李艷萍, 歐田苗, 顧瓊, 黃志紓 申請(qǐng)人:中山大學(xué)