專利名稱：一種黃連堿單體的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從植物中分離化合物單體的方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種黃連堿單體的
分離純化方法。
背景技術(shù)：
黃連(Rhizoma coptidis)為毛茛科黃連屬植物黃連(Coptis chinensisFranch.)、三角口十黃連(Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao)或云連(CoptisteetaWall.)的干燥根莖，分別習(xí)稱"味連"、"雅連"、"云連"。黃連性味苦寒，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)，具有清熱燥濕，瀉火解毒的功效。用于濕熱痞滿，嘔吐吞酸，瀉痢，黃疸，高熱神昏，心火亢盛，心煩不寐，目赤，牙痛，消渴，癰腫疔瘡；外治濕疹，濕瘡，耳道流膿。
黃連堿是黃連的特征性化學(xué)成分，也是黃連中活性最高的原小檗堿型生物堿，其英文名為Coptisine，化學(xué)名為Bis [1， 3]benzodioxolo [5， 6_a :4' ， 5' _g] quinolizinium，6，7-dihydro-，分子式為C19H14N04+，分子量為320. 32，屬于原小檗堿型生物堿，其結(jié)構(gòu)式如
下
由于黃連堿是黃連的特征性化學(xué)成分，如果能以黃連堿作為該藥材及其相關(guān)制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，既能較真實(shí)地反映其質(zhì)量又具有專屬性，可對(duì)黃連藥材及其制劑的質(zhì)量控制起到重要作用。 但是，發(fā)明人通過檢索大量文獻(xiàn)現(xiàn)，目前只有關(guān)于黃連中總生物堿的提取或小檗堿的分離純化報(bào)道，如中國專利申請200810069671. 8公開了 "一種黃連總生物堿提取工藝"，中國專利申請200710098436. 9公開了 "一種從中藥提取物中分離小檗堿類總生物堿的方法"等，未見與黃連堿單體分離工藝的相關(guān)報(bào)道。究其原因，與黃連堿的性質(zhì)和黃連中其它原小檗堿型生物堿的干擾有關(guān)，常規(guī)分離純化方法不能有效的將它們進(jìn)行分離。從黃連藥材的HPLC分析圖譜(如圖1所示，參考文獻(xiàn)高效液相色譜法測定黃連藥材中小檗堿型生物堿的含量，藥物分析雜志，2003， 23 (5))可以看到，黃連堿峰的前面分別為藥根堿和表小檗堿，后面分別為巴馬亭和小檗堿，5個(gè)峰的保留時(shí)間很接近；其原因是這幾個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)相近，其理化性質(zhì)也比較相近，對(duì)于常規(guī)的分離介質(zhì)，如硅膠、氧化鋁、大孔樹脂、聚酰胺等，都不能將它們很好分離。因此，迄今為止，尚沒有可有效分離制備黃連堿的成熟工藝報(bào)道，更沒有高純度的黃連堿單體化合物面市。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中無高純度黃連堿的分離制備方法、因而缺 少高純度黃連堿單體化合物、無法通過黃連堿的含量測定加強(qiáng)對(duì)黃連藥材及其制劑的質(zhì)量 控制等問題，提供一種黃連堿單體的分離純化方法。該方法操作簡便，生產(chǎn)周期短，分離效 率高，工藝穩(wěn)定，成本低廉，可實(shí)現(xiàn)大量黃連堿單體的高純度分離制備，得到的黃連堿單體 純度高，可作為含量測定的對(duì)照品使用。 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
—種黃連堿單體的分離純化方法，包括下述主要步驟
(1)、提取 將黃連藥材粉碎成粗粉，按照藥材重量乙醇溶液體積=iKg : (8 io)L計(jì)算，
加入體積百分比為85 95%的乙醇溶液，回流提取3 4次，每次2 3小時(shí)，過濾，收集、
合并濾液。 本步驟通過乙醇回流提取，得到的提取液(濾液)中主要含有小檗堿、黃連堿等總
生物堿成分。 (2)、濃縮 將步驟(1)收集、合并的濾液回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度為1. 05 1. 10g/mL(約 9(TC測定)，靜置析晶8 12小時(shí)，過濾，除去沉淀物(沉淀物中的晶體為小檗堿，可純化制 得小檗堿產(chǎn)品)，黃連堿主要保留在濾液中，將濾液進(jìn)行下一步萃取處理。
(3)、萃取 向步驟(2)的濾液中加入氨水調(diào)pH8. 0 9. O，然后加入等體積氯仿萃取3 4 次，合并氯仿層，回收氯仿，固體殘?jiān)兄饕S連堿，待下一步處理。
本步驟中水層主要除去極性較大的雜質(zhì)。
(4)、溶解、過濾 按照固體物質(zhì)量溶劑體積=lg : 4 6ml，將步驟(3)萃取后所得的固體殘?jiān)?加吡啶、或四氫呋喃、或DMF溶解，溶解后的溶液用納米膜過濾，濾除顆粒雜質(zhì)，以免堵塞制 備色譜柱，濾液作為下一步制備黃連堿單體的原料。
(5)、高效制備液相色譜分離
采用填料為C18的色譜柱； 流動(dòng)相組成為乙腈40 60mmol/L磷酸二氫鉀溶液(磷酸二氫鉀溶液中含有 10 20mmol/L十二烷基磺酸鈉，以磷酸或冰乙酸調(diào)pH4. 0 5. 0) = 45 : 55 55 : 45 (v/ 檢測波長為345nm。 取步驟(4)所得的濾液進(jìn)樣，進(jìn)行黃連堿單體的制備分離，紫外檢測器在線監(jiān)測， 針對(duì)性收集黃連堿單體的制備餾分溶液，得黃連堿單體溶液。 在進(jìn)行高效制備液相色譜分離前，可通過液質(zhì)聯(lián)用或其它本技術(shù)領(lǐng)域常用的方法 確定高效液相色譜中黃連堿單體的峰形。 以液質(zhì)聯(lián)用方法為例，可與上述制備分離色譜條件相同，采用填料相同的色譜柱、 組成相同的流動(dòng)相、相同的檢測波長等，柱溫為室溫(無特別要求，室溫即可)；取步驟(4)所得的濾液進(jìn)樣，進(jìn)行黃連堿單體的高效液相分離純化，根據(jù)質(zhì)譜檢測結(jié)果，可確定黃連堿
單體在液相色譜中所對(duì)應(yīng)的峰形。 (6)、產(chǎn)品回收 將步驟(5)高效制備液相色譜分離得到的黃連堿單體溶液加熱回收乙腈，在剩下 的溶液中加入氨水調(diào)pH至8. 0 9. 0，再加入等體積氯仿萃取3 4次，合并氯仿溶液，再 在氯仿溶液中加入等體積水反向萃取1 2次，收集氯仿溶液，回收氯仿，固體干燥，即得到
黃連堿單體產(chǎn)品。 由于高效液相色譜對(duì)樣品溶液的純度、色澤等要求均較高，通過提取等簡單處理 得到的提取液不能直接作為樣品溶液進(jìn)入高效液相色譜系統(tǒng)，否則既可能達(dá)不到良好的分 離效果，還可能對(duì)高效液相色譜系統(tǒng)的色譜柱等配件產(chǎn)生難以逆轉(zhuǎn)的影響，縮短其使用周 期；而色譜柱等液相色譜的相關(guān)配件成本通常較高，其使用周期的縮短顯然將造成最終產(chǎn) 品的生產(chǎn)成本大大提高；因而，對(duì)進(jìn)入高效液相色譜的樣品溶液要求較高，其前處理過程非 常重要。 黃連藥材中除含有黃連堿外，還含有藥根堿、表小檗堿、巴馬亭、小檗堿等非常復(fù) 雜的成分，要獲得可直接進(jìn)入高效液相色譜系統(tǒng)的樣品，需要先進(jìn)行特殊的提取及分離純 化處理。針對(duì)黃連藥材中存在的各種成分的理化性質(zhì)，本發(fā)明方法通過前述步驟(1)、(2)、 (3)、 (4)的順序搭配，以及適當(dāng)?shù)膮?shù)組合，可有效提取出黃連藥材中的黃柏堿等成分，并 除去提取液中含有的小檗堿、顆粒物質(zhì)等大量雜質(zhì)，獲得可以進(jìn)入制備型高效液相色譜系 統(tǒng)的樣品溶液(即步驟(4)得到的濾液)，不至對(duì)高效液相色譜系統(tǒng)造成很大的影響，盡量 延長其使用周期，節(jié)約生產(chǎn)成本。 在高效液相色譜分離過程中，色譜條件的選擇非常重要，它對(duì)樣品溶液中各物質(zhì) 的出峰順序、峰形、分離效果等起著決定性的作用；色譜條件主要包括色譜柱(包括填料、 柱長及內(nèi)徑等)、流動(dòng)相(包括組成及流速等)、柱溫、檢測波長、檢測器等，各色譜條件的選
擇及其組合至關(guān)重要。 本發(fā)明人通過大量的試驗(yàn)研究及對(duì)比分析，確定了如上所述的各色譜條件，使樣 品溶液中各物質(zhì)的出峰時(shí)間、峰形、分離效果等最佳化，有利于黃連堿單體得到充分有效的 分離。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是 1、本發(fā)明方法采用制備型高效液相色譜系統(tǒng)對(duì)黃連堿單體進(jìn)行分離純化，通過最 適宜的前處理方法和色譜條件等，達(dá)到良好的分離效果，并且紫外檢測器在線監(jiān)測，過程直 觀，針對(duì)性收集黃連堿單體，目標(biāo)明確，避免了常規(guī)柱層析和先分離后檢測造成的資源浪 費(fèi)，且易于控制產(chǎn)品質(zhì)量。 2、本發(fā)明方法操作簡便，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)品收率高、純度高，產(chǎn)量大，工藝穩(wěn)定可 靠，重現(xiàn)性好，成本低廉，易于放大生產(chǎn)。 3.本發(fā)明方法各工藝步驟中的有機(jī)試劑均可回收再利用，溶劑消耗量少。 4.具有較高的學(xué)術(shù)價(jià)值。由于目前尚未有能規(guī)模生產(chǎn)黃連堿單體及對(duì)照品的方法
報(bào)道，本發(fā)明所得產(chǎn)品不但能有效改善黃連堿對(duì)照品缺乏的現(xiàn)狀，也能為產(chǎn)業(yè)化開發(fā)黃連
堿制劑提供高純度優(yōu)質(zhì)原料。


圖1是參考文獻(xiàn)"高效液相色譜法測定黃連藥材中小檗堿型生物堿的含量"中公 開的黃連藥材的HPLC分析圖譜；圖1中1是藥根堿，2是表小檗堿，3是黃連堿，4是巴馬 亭，5是小檗堿。 圖2是實(shí)施例1的黃連藥材中原小檗堿型生物堿的HPLC分析圖譜。 圖3是實(shí)施例1的高效制備液相色譜圖，圖中記錄為2針樣品(不同進(jìn)樣量)連
續(xù)進(jìn)樣色譜圖，圖中峰1、2為黃連堿。 圖4是實(shí)施例1的黃連堿單體產(chǎn)品復(fù)檢的HPLC分析圖譜。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實(shí)施例。 下述各實(shí)施例中，終產(chǎn)品黃連堿單體的純度復(fù)檢均采用反相分析型液相色譜 (RP-HPLC)法，色譜條件如下 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-50mmol/L磷酸二氫鉀溶液 (50 : 50)(混合液中加15mmol/L十二烷基硫酸鈉，再以磷酸調(diào)節(jié)pH為4. 0)為流動(dòng)相；柱 溫30°C ;流速1. 0ml/min ;檢測波長為345nm。
實(shí)施例1 本實(shí)施例黃連堿單體的分離純化方法，包括下述主要步驟
(1)、提取 取黃連藥材lkg，粉碎成粗粉，加入10L體積百分比為85%的乙醇溶液，回流提取 3次，每次2小時(shí)，過濾，收集、合并濾液(藥渣蒸干回收乙醇)。
(2)、濃縮 將步驟(1)收集、合并的濾液回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度為1. 10g/mL(約9(TC測 定)，靜置析晶8小時(shí)，過濾，除去沉淀物(沉淀物中的晶體為小檗堿，另行純化處理制得小 檗堿產(chǎn)品)，黃連堿主要保留在濾液中，將得到的濾液(約1. 5L)進(jìn)行下一步萃取處理。
(3)、萃取 向步驟(2)的濾液中加入氨水調(diào)pH8. 0，然后加入1. 5L氯仿萃取3 4次，合并氯 仿層，回收氯仿至干，固體殘?jiān)s80g，待下一步處理。
(4)、溶解、過濾將步驟(3)萃取后所得的固體殘?jiān)?80mL DMF溶解，溶解后的溶液用0. 45um膜 過濾，濾液作為下一步制備黃連堿單體的原料。
(5)、高效制備液相色譜分離 采用填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)的色譜柱，柱規(guī)格為50cmcm ;
流動(dòng)相組成為乙腈-60mmol/L磷酸二氫鉀溶液(磷酸二氫鉀溶液中含有 20mmol/L十二烷基磺酸鈉，以冰乙酸調(diào)pH4. 0) = 45 : 55 (v/v);
檢測波長為345nm ;室溫下操作。 取步驟(4)所得的濾液進(jìn)樣，每針進(jìn)樣量10g(以濾液樣品中所含的干品重量計(jì))， 進(jìn)行黃連堿單體的制備分離，紫外檢測器在線監(jiān)測，針對(duì)性收集黃連堿單體的制備餾分溶液，得黃連堿單體溶液。 在進(jìn)行高效制備液相色譜分離前，通過液質(zhì)聯(lián)用方法確定高效液相色譜中黃連堿 單體的峰形，采用的色譜條件同上，取步驟(4)所得的濾液進(jìn)樣，進(jìn)行黃連堿單體的高效液 相分離純化，根據(jù)質(zhì)譜檢測結(jié)果，確定黃連堿單體在液相色譜中所對(duì)應(yīng)的峰形。
(6)、產(chǎn)品回收 將步驟(5)高效制備液相色譜分離得到的黃連堿單體溶液加熱回收乙腈，得到剩 下的黃連堿水溶液2L，加入氨水調(diào)pH至8. 0，再加入2L氯仿萃取3次，合并氯仿溶液(約 6L)，再在氯仿溶液中加入6L水反向萃取2次，收集氯仿溶液，回收氯仿，固體于65t:干燥8 小時(shí)，得到黃連堿單體產(chǎn)品9. 8克。
整個(gè)生產(chǎn)流程用時(shí)約3天。 計(jì)算得產(chǎn)品收率為(9. 8/1000) X 100%= 0. 98%。 通過更換流動(dòng)相組分，利用反相分析型液相色譜(RP-HPLC)復(fù)檢產(chǎn)品純度，測得 結(jié)果為99. 20%。
實(shí)施例2 本實(shí)施例黃連堿單體的分離純化方法，包括下述主要步驟
(1)、提取 取黃連藥材10kg，粉碎成粗粉，加入80L體積百分比為95 %的乙醇溶液，回流提取 4次，每次3小時(shí)，過濾，收集、合并濾液(藥渣蒸干回收乙醇)。
(2)、濃縮 將步驟(1)收集、合并的濾液回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度為1. 05g/mL(約9(TC測 定)，靜置析晶12小時(shí)，過濾，除去沉淀物(沉淀物中的晶體為小檗堿，另行純化處理制得小 檗堿產(chǎn)品)，黃連堿主要保留在濾液中，將得到的濾液(約30L)進(jìn)行下一步萃取處理。
(3)、萃取 向步驟(2)的濾液中加入氨水調(diào)pH9. 0，然后加入30L氯仿萃取4次，合并氯仿層， 回收氯仿至干，固體殘?jiān)s900g，待下一步處理。
(4)、溶解、過濾 將步驟(3)萃取后所得的固體殘?jiān)?. 6L四氫呋喃溶解溶解，溶解后的溶液用 0. 45um膜過濾，濾液作為下一步制備黃連堿單體的原料。
(5)、高效制備液相色譜分離 采用填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)的色譜柱，柱規(guī)格為50cm Ocm ;
流動(dòng)相組成為乙腈-40mmol/L磷酸二氫鉀溶液(磷酸二氫鉀溶液中含有 10mmol/L十二烷基磺酸鈉，以冰乙酸調(diào)pH5. 0) = 55 : 45 (v/v);
檢測波長為345nm ;室溫下操作。 取步驟(4)所得的濾液進(jìn)樣，每針進(jìn)樣量25g(以濾液樣品中所含的干品重量計(jì))， 進(jìn)行黃連堿單體的制備分離，紫外檢測器在線監(jiān)測，針對(duì)性收集黃連堿單體的制備餾分溶 液，得黃連堿單體溶液。 在進(jìn)行高效制備液相色譜分離前，通過液_質(zhì)聯(lián)用方法確定高效液相色譜中黃連 堿單體的峰形，采用的色譜條件同上，取步驟(4)所得的濾液進(jìn)樣，進(jìn)行黃連堿單體的高效 液相分離純化，根據(jù)質(zhì)譜檢測結(jié)果，確定黃連堿單體在液相色譜中所對(duì)應(yīng)的峰形。
(6)、產(chǎn)品回收 將步驟(5)高效制備液相色譜分離得到的黃連堿單體溶液加熱回收乙腈，得到剩 下的黃連堿水溶液15L，加入氨水調(diào)pH至9. 0，再加入15L氯仿萃取4次，合并氯仿溶液(約 60L)，再在氯仿溶液中加入60L水反向萃取1次，收集氯仿溶液，回收氯仿，固體于7(TC干燥 12小時(shí)，得到黃連堿單體產(chǎn)品120克。
整個(gè)生產(chǎn)流程用時(shí)約4天。 計(jì)算得產(chǎn)品收率為(120/10000) X100%= 1. 20%。 通過更換流動(dòng)相組分，利用反相分析型液相色譜(RP-HPLC)復(fù)檢產(chǎn)品純度，測得 結(jié)果為98. 86%。
權(quán)利要求
一種黃連堿單體的分離純化方法，包括下述主要步驟(1)、提取將黃連藥材粉碎成粗粉，按照藥材重量∶乙醇溶液體積＝1Kg∶(8～10)L計(jì)算，加入體積百分比為85～95％的乙醇溶液，回流提取3～4次，每次2～3小時(shí)，過濾，收集、合并濾液；(2)、濃縮將步驟(1)收集、合并的濾液回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度為1.05～1.10g/mL，靜置析晶8～12小時(shí)，過濾，除去沉淀物，將濾液進(jìn)行下一步萃取處理；(3)、萃取向步驟(2)的濾液中加入氨水調(diào)pH8.0～9.0，然后加入等體積氯仿萃取3～4次，合并氯仿層，回收氯仿，固體殘?jiān)乱徊教幚恚?4)、溶解、過濾按照固體物質(zhì)量∶溶劑體積＝1g∶4～6ml，將步驟(3)萃取后所得的固體殘?jiān)舆拎ぁ⒒蛩臍溥秽?、或DMF溶解，溶解后的溶液用納米膜過濾，濾液作為下一步制備黃連堿單體的原料；(5)、高效制備液相色譜分離采用填料為C18的色譜柱；流動(dòng)相組成為乙腈-40～60mmol/L磷酸二氫鉀溶液，二者體積比為45∶55～55∶45；其中的磷酸二氫鉀溶液，還含有10～20mmol/L十二烷基磺酸鈉，并以磷酸或冰乙酸調(diào)pH4.0～5.0；檢測波長為345nm；取步驟(4)所得的濾液進(jìn)樣，進(jìn)行黃連堿單體的制備分離，紫外檢測器在線監(jiān)測，針對(duì)性收集黃連堿單體的制備餾分溶液，得黃連堿單體溶液；(6)、產(chǎn)品回收將步驟(5)高效制備液相色譜分離得到的黃連堿單體溶液加熱回收乙腈，在剩下的溶液中加入氨水調(diào)pH至8.0～9.0，再加入等體積氯仿萃取3～4次，合并氯仿溶液，再在氯仿溶液中加入等體積水反向萃取1～2次，收集氯仿溶液，回收氯仿，固體干燥，即得到黃連堿單體產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃連堿單體的分離純化方法，包括提取、濃縮、萃取、溶解過濾、高效制備液相色譜分離、產(chǎn)品回收等步驟。該方法操作簡便，生產(chǎn)周期短，分離效率高，工藝穩(wěn)定，成本低廉，可實(shí)現(xiàn)大量黃連堿單體的高純度分離制備，得到的黃連堿單體純度高，可作為含量測定的對(duì)照品使用。
文檔編號(hào)C07D491/22GK101781307SQ20091031135
公開日2010年7月21日 申請日期2009年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月13日
發(fā)明者劉丁, 夏柯, 文煥松, 郭建華 申請人:成都普思生物科技有限公司