專利名稱：新型抗原結(jié)合二聚體-復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
新型抗原結(jié)合二聚體-復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用在廣泛方面，本發(fā)明一般涉及新型二聚體-復(fù)合物(本文中稱為“非融合二聚體” 或NFD)，其包括單可變結(jié)構(gòu)域諸如例如納米抗體(Nanobodies)，涉及制備這些復(fù)合物的方 法及其應(yīng)用。這些非共價(jià)結(jié)合的二聚體-復(fù)合物由兩個相同的單體組成，所述單體分別包 括一個或多個單可變結(jié)構(gòu)域(同型二聚體)或包括兩個分別包括一個或多個單可變結(jié)構(gòu)域 的不同單體(異二聚體)。本主題的NFD已被典型地改變，例如與其單體負(fù)體相比提高或降 低的結(jié)合特性。本發(fā)明的NFD可以進(jìn)一步通過由柔性肽或半胱氨酸進(jìn)行連接來改造，從而 改善穩(wěn)定性。本發(fā)明還描述形成所述NFD的條件和可以避免所述二聚體形成的條件。例如， 本發(fā)明還提供通過向制劑中添加一種或多種增高單可變結(jié)構(gòu)域熔化溫度的賦形劑，諸如向 液體制劑中加入甘露醇或其他多元醇來抑制NFD，諸如(人血清)清蛋白結(jié)合納米抗體二聚 作用的方法。
背景技術(shù)：
常規(guī)抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)主要由來自重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域二者的超變環(huán)形成。 然而，功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)也可以由重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)單獨(dú)形成。在體內(nèi)，這樣的結(jié)合 位點(diǎn)已經(jīng)在駱駝(camels)和駱駝(camelids)中進(jìn)化為抗體的一部分，其僅由2個重鏈組 成且缺少輕鏈。此外，分析這些駱駝的僅有重鏈的抗體的VH(也稱為VHH)和來自常規(guī)人 抗體的VH結(jié)構(gòu)域之間氨基酸序列的差別有助于設(shè)計(jì)改變的人VH結(jié)構(gòu)域(LutzRiechmarm 禾口 Serge Muyldermans, J. of Immunological Methods (免疫學(xué)方法雜志)，卷 231，1-2 期， 1999,25-38)。類似地，已經(jīng)顯示出，通過界面殘基的突變研究以及與抗hCG VHH H14平行的 抗Her2抗體4D5的VH上的⑶R3的突變研究，發(fā)現(xiàn)一些突變促進(jìn)自主VH結(jié)構(gòu)域行為(即， 有益的溶解性和可逆的再折疊)(Barthelemy PA等，2008，J. of Biol. Chemistry (生物化 學(xué)雜志)，卷283，第6號，第3639-3654頁)。還發(fā)現(xiàn)通過將暴露的疏水性殘基替換為更加 親水的殘基來增加原先輕鏈界面的親水性改善自主VH結(jié)構(gòu)域行為。這些改造的VH顯示 出主要是處于高濃度的單體的，然而也發(fā)現(xiàn)低量的所述改造VH的二聚體和其他聚集體，推 測它們形成與關(guān)于VL-VH對相互作用的領(lǐng)域中所述的那些類似的相對弱相互作用。類似 地，認(rèn)為駱駝化VH，稱為CVH-E2，在溶液中以濃度依賴性方式，即以高于7mg/ml的濃度形 成二聚體(但注意，研究中未顯示數(shù)據(jù)；Dottorini等，Biochemistry (生物化學(xué))，2004， 43,622-628)。在該濃度以下，二聚體可能分解為單體且這些二聚體是否具有活性(即結(jié) 合抗原)尚不清楚。此外，近期報(bào)道了具有非常短的CDR3(僅6個殘基)的截短的美洲駝 源VHH(切割掉前7個氨基酸)，稱為VHH-R9，形成處于晶體結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域交換二聚體。由 于VHH-R9顯示出在溶液中具有功能性(針對半抗原的低Kd)并顯示出僅由單體組成，所以 二聚作用可能在非常緩慢的結(jié)晶過程中發(fā)生(4-5周)且一些因素諸如N端切割、高濃度條 件和短CDR3可以導(dǎo)致或促進(jìn)“聚合”現(xiàn)象(也具體參見Spinelli等，F(xiàn)EBS Letter (FEBS 書信)564，2004，35-40的結(jié)論部分)。S印ulveda等(J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志) (2003)333,355-365)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VH 二聚體(VHD)的自發(fā)形成在許多情況下允許生成具有抗 原結(jié)合特異性的分子。然而，基于關(guān)于非融合二聚體報(bào)道的自發(fā)形成(對比通過本文中報(bào) 告的PIA形成的二聚體)和穩(wěn)定性數(shù)據(jù)的缺乏，這些可能是與由Barthelemy (見前文)所述的那些類似的弱相互作用二聚體?？傊恍┪墨I(xiàn)描述了單可變結(jié)構(gòu)域二聚體及其片段 的形成，其a)主要影響相對弱的疏水性相互作用(其是例如根據(jù)濃度而可逆的)，和/或 b)僅在結(jié)晶過程中的另一種情形中發(fā)生(例如，作為晶體堆積力的結(jié)果)。而且，已經(jīng)描述 這些二聚體不再結(jié)合抗原(如在Spinelli (見前文)中)或尚不清楚這些二聚體是否是結(jié) 合二聚體(如在Dottorini (見前文)和Barthelemy (見前文)中)。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)在已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的二聚體-復(fù)合物可以在溶液中針對包括至少一個 單可變VHH結(jié)構(gòu)域的多肽形成，優(yōu)選針對包括利用本文中所述方法(即處理誘導(dǎo)的締合 (process-induced association)，引入使殘基去穩(wěn)定的CDR3/框架區(qū)4和/或以高溫和高 濃度保存)形成二聚體的單可變VHH結(jié)構(gòu)域的多肽形成，更優(yōu)選針對包括至少一個具有序 列SEQ ID NO 1-6和/或其變體的單可變VHH結(jié)構(gòu)域，例如具有與SEQ ID NO :1_6的同一 性為70%以上的序列的單可變VHH結(jié)構(gòu)域的多肽形成。這些穩(wěn)定的二聚體-復(fù)合物(本文 中也成為非融合二聚體或NFD)中的一些與它們的單體構(gòu)件相比可以保持至少50%的結(jié)合 功能性或甚至可以具有增大的結(jié)合親和力，其他的具有減小的或不再具有結(jié)合功能性。這 些NFD與例如Barthelemy (見前文)中所述的“瞬時”濃度依賴性二聚體相比更穩(wěn)定得多， 并且一旦形成，在廣泛濃度范圍內(nèi)很穩(wěn)定。這些NFD可以通過在單體構(gòu)件之間交換框架4區(qū) 由此兩者所述單體構(gòu)件互鎖而形成(參見多肽B NFD晶體結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)部分)。這些二聚體 典型地根據(jù)利用本文中所述的方法處理誘導(dǎo)的締合(PIA)和/或以相對高溫保存數(shù)周(諸 如例如37°C，4周)和以高濃度(諸如例如高于50mg/ml，例如65mg/ml)保存形成。本發(fā)明 還教導(dǎo)如何避免在i)例如所述包括單可變結(jié)構(gòu)域的多肽在非應(yīng)激條件(即不利于免疫球 蛋白解折疊的條件)下大規(guī)模生產(chǎn)或純化過程中，ii)通過具有增高單可變結(jié)構(gòu)域熔化溫 度的賦形劑的適當(dāng)制劑，例如通過具有甘露醇的制劑和/或iii)通過增加CDR3和/或框 架4區(qū)構(gòu)象的穩(wěn)定性來形成所述二聚體-復(fù)合物。^JLa)除非另外指出或定義，全部所用術(shù)語均具有其在本領(lǐng)域中的普通含義，該含 義對于技術(shù)人員而言是清楚的。參考例如標(biāo)準(zhǔn)手冊，諸如Sambrook等，“Molecular Cloning =A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊)〃(第二版)，卷 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press (冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)(1989) ；F. Ausubel 等，編，“Current protocols in molecular biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)流禾呈)〃 ,Green Publishing and Wiley Interscience，紐約(1987) ；Lewin, "Genes II (基因 II)”，John Wiley & Sons, M ^, N. Y. , (1985) ；Old "Principles of Gene Manipulation :An Introduction to Genetic Engineering (基因操作原則遺傳工程導(dǎo)論)”，第二版，University of California Press (加利福尼亞大學(xué)出版社)，Berkeley, CA (1981) ；Roitt 等， “Immunology (免疫學(xué))”(第六版)，Mosby/Elsevier, Edinburgh (愛丁堡)(2001) ；Roitt 等，Roitt，sEssential Immunology (Roitt 基礎(chǔ)免疫學(xué))，第十版.Blackwell Publishing, UK (2001)；和 Janeway 等，“ Immunobiology (免疫生物學(xué))”(第六版)，Garland Science Publishing/Churchill Livingstone，紐約(2005)，以及本文中引用的一般背景技術(shù)；b)除非另外指出，所有沒有特別詳細(xì)描述的方法、步驟、技術(shù)和操作均可以或已經(jīng)以本身已知的方式進(jìn)行，如應(yīng)該對技術(shù)人員清楚的。也參考例如標(biāo)準(zhǔn)手冊和本文中提及的 一般背景技術(shù)和其中引用的其他參考文獻(xiàn)；以及例如以下綜述Presta，Adv. Drug Deliv. Rev.(現(xiàn)代藥物遞送綜述)2006，58 (5-6) :640_56 ；Levin 和 Weiss，Mol. Biosyst.(分子 生物系統(tǒng))2006，2(1) 49-57 ；Irving 等，J. Immunol. Methods (免疫學(xué)方法雜志)，2001， 248(1-2)，31-45 ；Schmitz 等，Placenta(胎盤)，2000，21 附錄 A，S106-12，Gonzales 等， Tumour Biol.(腫瘤生物學(xué))，2005，26 (1)，31-43，其描述蛋白質(zhì)工程技術(shù)，諸如親和力成熟 和其他用于改進(jìn)蛋白質(zhì)諸如免疫球蛋白的特異性或其他所需性質(zhì)的技術(shù)。c)氨基酸殘基按照標(biāo)準(zhǔn)三字母或單字母氨基酸密碼顯示，如表A-2中提及地。表A-2 單字母和三字母氨基酸密碼
權(quán)利要求
穩(wěn)定的NFD，其可通過包括濃縮包含至少一個單可變結(jié)構(gòu)域的多肽的步驟的方法獲得。
2.按照權(quán)利要求1的穩(wěn)定的NFD，其中所述單可變結(jié)構(gòu)域是納米抗體諸如VHH，人源化 VHH,親合成熟的、穩(wěn)定化的或另外改變的VHH或其構(gòu)建體。
3.按照權(quán)利要求1的穩(wěn)定的NFD，其中單可變結(jié)構(gòu)域選自由SEQIDNO=I, SEQ ID NO: 2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :5，SEQ IDNO :6，SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO 10 組成的組。
4.按照權(quán)利要求1的穩(wěn)定的NFD，其中單可變結(jié)構(gòu)域選自由SEQIDNO :1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :5，SEQ IDNO :6，SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO 10組成的組。
5.按照權(quán)利要求1的穩(wěn)定的NFD，其中單可變結(jié)構(gòu)域選自由SEQIDNO=I, SEQ ID NO: 2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :5，SEQ IDNO :6，SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO 10 組成的組，和由與 SEQ ID NO :1，SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :5， SEQ ID NO :6,SEQ ID NO 9禾口 SEQ ID NO :10中任一種具有至少70%同一性的功能性序列 組成的組。
6.按照權(quán)利要求1的穩(wěn)定的NFD，其中單可變結(jié)構(gòu)域選自由SEQIDNO=I, SEQ ID NO: 2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :5，SEQ IDNO :6，SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO 10 組成的組，和由與 SEQ ID NO :1，SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :5， SEQ ID NO :6,SEQ ID NO 9禾口 SEQ ID NO :10中任一種具有至少70%同一性的功能性序列 組成的組；且其中所述序列特異性結(jié)合其至少一種靶分子。
7.按照權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的穩(wěn)定的NFD，其中所述多肽基本由一個單可變結(jié)構(gòu)域， 多個單可變結(jié)構(gòu)域，一個連接體或多個連接體組成。
8.按照權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的穩(wěn)定的NFD，其中所述濃縮步驟在蛋白A柱上進(jìn)行且 其中將大量多肽加載至所述柱上，例如2-5mg/ml樹脂蛋白A。
9.按照權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的穩(wěn)定的NFD，其中所述NFD與其靶分子的解離常數(shù)與 其相應(yīng)單體構(gòu)件與所述靶分子的解離常數(shù)大致相同。
10.按照權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的穩(wěn)定的NFD，其中不存在與其靶分子的特異性結(jié)合。
11.按照權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的穩(wěn)定的NFD，其中所述NFD與其靶分子的解離常數(shù)是 IOOnM以下。
12.包含至少一個單可變結(jié)構(gòu)域的多肽；其中所述至少一個單可變結(jié)構(gòu)域可以形成如 權(quán)利要求1-11中所述的NFD。
13.制備按照權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的NFD的方法，包括具有有利于疏水性相互作用 的條件的處理步驟。
14.制備如權(quán)利要求1-11中所述包含至少一個單可變結(jié)構(gòu)域，例如納米抗體的多肽的 單體多肽的方法；其中制備所述多肽的每一步均不產(chǎn)生多于50%，優(yōu)選40%，更優(yōu)選30%， 更優(yōu)選20%，甚至更優(yōu)選10%的相應(yīng)NFD;且其中所述方法中的每一步均避免有利于疏水 性相互作用的條件和/或其中所述方法避免這樣的條件，其中所述單可變結(jié)構(gòu)域部分解折 疊，例如CDR3通過例如升高的溫度諸如接近所述多肽解鏈溫度的溫度或例如37°C，在延長 的時間，例如數(shù)周諸如例如4周內(nèi)，部分解折疊。
15.藥物制劑，包括i)包含易于二聚化的納米抗體的多肽；和ii)多元醇。
全文摘要
在廣泛方面，本發(fā)明一般涉及包含單可變結(jié)構(gòu)域的新型二聚體-復(fù)合物(本文中稱為“非融合二聚體”或NFDs)，制備這些復(fù)合物的方法及其應(yīng)用。這些非共價(jià)結(jié)合的二聚體-復(fù)合物由兩個分別包含一個或多個單可變結(jié)構(gòu)域的相同單體(同型二聚體)或由分別包含一個或多個單可變結(jié)構(gòu)域的不同單體(異二聚體)組成。本主題的NFDs典型地已被改變，例如與其單體負(fù)體相比改進(jìn)的結(jié)合特征。本發(fā)明的NFDs還可以經(jīng)由柔性肽或半胱氨酸的連接來改造，從而改善穩(wěn)定性。本發(fā)明還描述了形成所述NFDs的條件和避免形成所述二聚體的條件。
文檔編號C07K16/18GK101965362SQ200980107695
公開日2011年2月2日 申請日期2009年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月5日
發(fā)明者亨德里克斯·雷內(nèi)瑞斯·雅各布斯·馬托伊斯·霍根博姆, 克里斯蒂娜·拉伯, 卡羅·布東, 埃爾斯·安娜·艾麗斯·拜爾內(nèi)特, 帕特里克·斯坦森斯, 彼得·卡斯特爾, 阿內(nèi)·布里熱, 馬克·約瑟夫·勞韋里斯 申請人:埃博靈克斯股份有限公司