專利名稱：多肽-聚合物偶聯(lián)物和其使用方法
多肽-聚合物偶聯(lián)物和其使用方法交叉參考本申請(qǐng)要求2008年3月觀日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/040，556的優(yōu)先權(quán)，通 過引用將該申請(qǐng)全文納入本文。
背景技術(shù)：
使用化學(xué)系鏈產(chǎn)生固相形式的生物學(xué)活性物質(zhì)是各種醫(yī)療和生物學(xué)應(yīng)用中的廣 泛主題?？墒褂没瘜W(xué)系鏈將生物學(xué)活性肽或蛋白質(zhì)連接于表面、將生物學(xué)活性賦予多孔性 或水凝膠植入物、或用于藥物遞送應(yīng)用。固相遞呈可改變生物學(xué)活性分子在生物環(huán)境中的 作用方式。發(fā)明_既述本發(fā)明提供多肽-聚合物偶聯(lián)物。也提供主題多肽-聚合物偶聯(lián)物的各種應(yīng)用。


圖1描繪了將重組蛋白(Sih，sonic hedgehog)嫁接于聚合物透明質(zhì)酸(HyA)的 生物偶聯(lián)物方案。圖2A和2B描繪了 Sih以及它與聚(丙烯酸)(pAAc)(圖2A)和HyA (圖2B)的偶 聯(lián)產(chǎn)物的凝膠電泳。圖3描繪了 Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和提出的Shh的多價(jià)性影響其生物學(xué)活性的機(jī)理的 示意圖。圖4描繪了可溶性Sih ( ，粗線)，可溶性Shh和可溶性HyA ( ■，虛線)，以及化學(xué) 計(jì)量比為 0. 6 1 ( Δ )、3· 5 1 (〇)、7 1 ( )、14 1 ( □)禾口 22 1 (χ)的 Shh-HyA 偶聯(lián)物的C3H10T1/2生物學(xué)活性結(jié)果。圖5A-C代表陰性對(duì)照樣品(圖5Α)、游離的可溶性Shh (圖5Β)和14 IShh/HyA 多價(jià)形式(圖5C)的雞胚尿囊膜(CAM)反應(yīng)的一系列顯微照片。圖6描繪了通過對(duì)CAM實(shí)驗(yàn)的顯微照片進(jìn)行圖像分析獲得的血管新生定量結(jié)果。圖7描繪了在C3H10T1/2細(xì)胞中Shh-HyA偶聯(lián)物的生物學(xué)活性的數(shù)值模型結(jié) 果。上圖代表在摻入空間相互作用的模型中，活性與Shh濃度的關(guān)系，其中化學(xué)計(jì)量比為 1 1-30 1。下圖代表在兩個(gè)模型和實(shí)驗(yàn)組中，EC5tl與取代水平的關(guān)系圖。定義術(shù)語“肽” “多肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指任何長(zhǎng)度氨基酸的多聚形 式，可包含編碼和非編碼氨基酸，化學(xué)或生物化學(xué)修飾或衍生的氨基酸以及具有修飾的肽 主鏈的多肽。術(shù)語“多肽”包括融合蛋白，包括但不限于具有異源氨基酸序列的融合蛋白， 具有異源和同源前導(dǎo)序列的融合蛋白，具有或不具有N末端甲硫氨酸殘基的融合蛋白；免 疫學(xué)標(biāo)記的蛋白質(zhì)等。術(shù)語“多肽”包括含有一個(gè)或多個(gè)脂肪酸部分、脂質(zhì)部分、糖部分和 碳水化合物部分的多肽。術(shù)語“多肽”包括翻譯后修飾的多肽。本文所用術(shù)語“共聚物”指含有多于一種亞基類型的聚合物。該術(shù)語包括具有兩種、三種、四種、五種或六種亞基類型的聚合物。術(shù)語“對(duì)象”、“個(gè)體”、“宿主”或“患者”在本文中可互換使用，指任何哺乳動(dòng)物或非 哺乳動(dòng)物物種的一個(gè)或多個(gè)成員。因此，對(duì)象和患者包括但不限于，人、非人靈長(zhǎng)動(dòng)物、犬、 貓、有蹄類(如馬、牛、豬(如家豬))、禽類、嚙齒類(如大鼠、小鼠)和其他對(duì)象。非人動(dòng)物 模型，特別是哺乳動(dòng)物，例如非人靈長(zhǎng)動(dòng)物、鼠科動(dòng)物(如小鼠、大鼠)、兔類動(dòng)物等可用于 實(shí)驗(yàn)研究?！爸委煛辈“Y和疾病包括(1)預(yù)防該病癥的至少一種癥狀，即使得可能暴露于或傾 向于發(fā)生該疾病，但尚未經(jīng)歷或顯示該疾病的癥狀的哺乳動(dòng)物不顯著發(fā)生該疾病的癥狀， (2)抑制該疾病，即阻滯或降低該疾病或其癥狀的發(fā)展，或C3)緩解該疾病，即引起該疾病 或其臨床癥狀的消退?！爸委熡行Я俊被颉坝行Я俊敝冈谝粋€(gè)或多個(gè)劑量中，與其它藥物聯(lián)合給予或單獨(dú)給 予哺乳動(dòng)物或其它對(duì)象治療疾病時(shí)，足以治療這種疾病的化合物的用量。“治療有效量”取 決于化合物、疾病及其嚴(yán)重程度、所治療對(duì)象的年齡、體重等。本文所用術(shù)語“單位劑型”指適合作為單一劑量用于人或動(dòng)物對(duì)象的物理上獨(dú)立 的單位，各單位含有預(yù)定量的本發(fā)明化合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或運(yùn)載體，該預(yù) 定量經(jīng)計(jì)算足以產(chǎn)生所需效果。本發(fā)明新型單位劑型的規(guī)格依賴于所用的具體化合物和要 達(dá)到的效果，以及各化合物在宿主中的相關(guān)藥效學(xué)性質(zhì)。術(shù)語“生理?xiàng)l件”包括與活細(xì)胞相容的條件，例如溫度、pH、鹽度等與活細(xì)胞相容的 基本為水性的條件。“藥學(xué)上可接受的賦形劑”、“藥學(xué)上可接受的稀釋劑”、“藥學(xué)上可接受的載體”和 “藥學(xué)上可接受的輔料”指用于制備通常安全、無毒、沒有不良的生物學(xué)或其它性質(zhì)的藥物 組合物的賦形劑、稀釋劑、載體和輔料，包括對(duì)于獸醫(yī)應(yīng)用和人體藥物應(yīng)用而言可接受的賦 形劑、稀釋劑、載體和輔料。說明書和權(quán)利要求書中所用的“藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋 劑、載體和輔料”包括這類賦形劑、稀釋劑、載體和輔料中的一種和一種以上。在進(jìn)一步描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解，本發(fā)明不限于本文所述的具體實(shí)施方式
，因?yàn)?它們當(dāng)然可能變化。應(yīng)理解，本文所用術(shù)語的目的只是描述具體實(shí)施方式
，不應(yīng)為限制性， 因?yàn)楸景l(fā)明范圍僅受所附權(quán)利要求書的限制。應(yīng)理解，給出數(shù)值范圍時(shí)，除非文中另有明確說明，該范圍上下限之間、以下限單 位的十分之一為間隔的各間插數(shù)值，以及所述范圍的任何其它標(biāo)稱或間插數(shù)值均包括在本 發(fā)明范圍內(nèi)。所述較小范圍內(nèi)可獨(dú)立地包含這些較小范圍的上下限，它們也屬于本發(fā)明范 圍，除非明確地排除所述范圍的上下限。所述范圍包含一個(gè)或兩個(gè)限值時(shí)，排除這一個(gè)或兩 個(gè)限值以外的范圍也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。除非另有說明，本文所用的所有科技術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理 解的通常含義。雖然也可采用與本文所述相似或等同的任何方法和材料實(shí)施或測(cè)試本發(fā) 明，但下面描述了優(yōu)選的方法和材料。本文所述的所有發(fā)表物通過引用納入本文，以公開或 描述與所引用發(fā)表物有關(guān)聯(lián)的方法和/或材料。應(yīng)注意到，本文和所附權(quán)利要求書所用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“這種”包括 復(fù)數(shù)含義，除非另有明確說明。因此，例如，提到“一種合成基材”包括多種這類基材，提到 “一種重組多肽”包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一種或多種重組多肽和其等同物，等等。還注意到，權(quán)利要求書可撰寫成排除任何任選要素。同樣，這種說明應(yīng)用作引用權(quán)利要求元素相 關(guān)地使用這類排除性術(shù)語，如“只有”、“僅僅”等，或使用“負(fù)”限制的前提基礎(chǔ)。本文討論的發(fā)表物只是因?yàn)槠?br> 公開日期早于本申請(qǐng)申請(qǐng)日。本文中沒有任何內(nèi)容 可被解釋為承認(rèn)本發(fā)明因在先發(fā)明而不早于這篇發(fā)表物。另外，所提供的發(fā)表日期可能與 實(shí)際
公開日期不同，可能需要單獨(dú)驗(yàn)證。發(fā)明詳述本發(fā)明提供多肽-聚合物偶聯(lián)物，其中這類偶聯(lián)物具有受控的連接化學(xué)計(jì)量性 質(zhì)。也提供主題多肽-聚合物偶聯(lián)物的各種應(yīng)用。在一些實(shí)施方式中，主題多肽-聚合物偶聯(lián)物具有下式X-(Y)n-Z,其中X是生物活性多肽；Y是任選的接頭部分，以使η為0或1到約10的整數(shù)；和Z是包含約50-100，000個(gè)亞基的生物相容性聚合物。相對(duì)于可溶形式多肽的活性，如相對(duì)于未偶聯(lián)于該聚合物的多肽的活性，偶聯(lián)于 聚合物基材的多肽的生物學(xué)活性提高。在一些實(shí)施方式中，主題多肽-聚合物偶聯(lián)物的多 肽的生物學(xué)活性比可溶(未偶聯(lián))形式多肽的生物學(xué)活性高至少約25%、至少約50%、至 少約75%、至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25 倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、 至少約500倍或至少約1000倍或1000倍以上。在一些實(shí)施方式中，主題多肽-聚合物偶聯(lián)物的多肽的生物學(xué)活性比以1 1摩 爾比偶聯(lián)于聚合物的多肽的生物學(xué)活性高至少約25%、至少約50%、至少約75%、至少約2 倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少 約40倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約500倍或至少約 1000倍或1000倍以上。在一些實(shí)施方式中，主題多肽-聚合物偶聯(lián)物的多肽的生物學(xué)活性比與聚合物混 合的多肽的生物學(xué)活性高至少約25%、至少約50%、至少約75%、至少約2倍、至少約5倍、 至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約 50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約500倍或至少約1000倍或1000 倍以上。例如，在一些實(shí)施方式中，主題多肽-聚合物偶聯(lián)物的多肽的EC5tl比可溶(未偶聯(lián) 形式)的多肽的EC5tl低至少約25%、至少約50%、至少約75%、至少約2倍、至少約5倍、 至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約 50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約500倍或至少約1000倍或1000 倍以上。不難利用合適的生物學(xué)活性實(shí)驗(yàn)測(cè)定主題多肽-聚合物偶聯(lián)物的多肽的生物學(xué) 活性是否相對(duì)于可溶(未偶聯(lián))形式多肽的生物學(xué)活性提高。所述多肽與聚合物的摩爾比可以是約5 1至約100 1、例如約5 1至約 7 1、約7 1至約10 1、約10 1至約12 1、約12 1至約15 1、約15 1至約 20 1、約 20 1 至約 25 1、約 25 1 至約 30 1、約 30 1 至約 35 1、約 35 1 至約 40 1、約 40 1 至約 45 1、約 45 1 至約 50 1、約 50 1 至約 60 1、約 60 1 至約70 1、約70 1至約80 1、約80 1至約90 1或約90 1至約100 1。例如，當(dāng)主題多肽-聚合物偶聯(lián)物包含誘導(dǎo)血管新生的多肽(如，該多肽是血管新 生多肽)時(shí)，在一些實(shí)施方式中，主題多肽-聚合物偶聯(lián)物的血管新生多肽誘導(dǎo)的新生血管 比與聚合物混合的、可溶(未偶聯(lián))形式的或以1 1摩爾比偶聯(lián)于聚合物的血管新生多 肽誘導(dǎo)的新生血管多至少約25%、至少約50%、至少約75%、至少約2倍、至少約5倍、至少 約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50 倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約500倍或至少約1000倍或1000倍 以上。聚合物偶聯(lián)生物活性多肽的合適聚合物包括含有約50個(gè)亞基至約100，000個(gè)亞基，例如 約50個(gè)亞基至約100個(gè)亞基、約100個(gè)亞基至約500個(gè)亞基、約500個(gè)亞基至約1，000個(gè) 亞基、約1，000個(gè)亞基至約5，000個(gè)亞基、約5，000個(gè)亞基至約10，000個(gè)亞基、約10，000 個(gè)亞基至約25，000個(gè)亞基、約25，000個(gè)亞基至約50，000個(gè)亞基或約50，000個(gè)亞基至約 100, 000個(gè)亞基的生物相容性聚合物。在一些實(shí)施方式中、所述直鏈聚合物包含100，000個(gè) 以上亞基。亞基可以全部相同，例如該聚合物是均聚物。在其它實(shí)施方式中，存在多于一種亞 基，例如，該聚合物是雜聚物或共聚物。在一些實(shí)施方式中，該聚合物是直鏈聚合物。在其 它實(shí)施方式中，該聚合物可包括一條或多條支鏈。合適的聚合物包括天然聚合物、半合成聚合物和合成聚合物。合適的天然聚合物包括透明質(zhì)酸、膠原、粘多糖、纖維素、多糖等。合適的半合成聚合物包括但不限于與醛或其前體交聯(lián)的膠原、二羧酸或其鹵化 物、二胺、纖維素衍生物、透明質(zhì)酸、殼多糖、殼聚糖、結(jié)冷膠、黃原膠、果膠或果膠酸、聚糖 (polyglycans)、甘露聚糖(polymarman)、瓊脂、瓊脂糖、天然樹膠和葡糖胺基葡聚糖。合適的合成聚合物包括但不限于衍生自下述化合物的聚合物或共聚物聚二曜 烷、聚磷腈、聚砜樹脂、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸)丁酯、聚(乙二醇)、聚(丙烯)、聚氨酯 樹脂、聚(甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)_甲酯、聚(甲基丙烯酸)_正丁酯、聚(甲基丙 烯酸)_叔丁酯、聚四氟乙烯、聚全氟丙烯、聚N-乙烯基咔唑、聚(甲基異丙烯酮)、聚α甲 基苯乙烯、聚乙烯乙酸酯、聚(氧甲烯)、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚氨酯、聚(乙烯基醇) 和聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯；乙烯乙烯醇共聚物(通常稱作商品名EVOH或商品名EVAL)；聚 甲基丙烯酸丁酯；聚(羥基戊酸酯) ’聚(L-乳酸)；聚己酸內(nèi)酯；聚(丙交酯-乙交酯共聚 物) ’聚(羥基丁酸酯)；羥基丁酸酯-戊酸酯共聚物；聚二_烷酮；聚原酸酯；聚酐 ’聚(乙 醇酸)(PGA)；聚(D，L-乳酸)(PLA) ；PGA和PLA的共聚物；乙醇酸-三亞甲基碳酸酯共聚 物；聚磷酸酯；聚磷酸酯聚氨酯 ’聚(氨基酸)；氰基丙烯酸酯；聚三亞甲基碳酸酯；聚(碳 酸亞胺酯)；(醚-酯)共聚物(如PE0/PLA)；聚草酸亞烷基酯；聚磷腈；聚氨酯；硅酮；聚 酯；聚烯烴；聚異丁烯和乙烯_α烯烴共聚物；丙烯酸類聚合物和共聚物；鹵乙烯聚合物和 共聚物、如聚氯乙烯；聚乙烯醚、如聚乙烯基甲醚；聚偏二鹵乙烯、如聚偏二氟乙烯和聚偏 二氯乙烯；聚丙烯腈；聚乙烯酮；聚乙烯基芳族化合物、如聚苯乙烯；聚乙烯酯、如聚乙酸乙 烯酯；乙烯基單體相互形成和與烯烴形成的共聚物、如乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物、丙烯6腈-苯乙烯共聚物、ABS樹脂和乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；聚酰胺、如尼龍66和聚己內(nèi)酰胺； 醇酸樹脂；聚碳酸酯；聚氧甲烯；聚酰亞胺；聚醚；環(huán)氧樹脂；聚氨酯；人造絲；人造絲-三 乙酸酯；纖維素；纖維素乙酸酯；纖維素丁酸酯；纖維素乙酸丁酸酯；玻璃紙；硝酸纖維素； 纖維素丙酸酯；纖維素醚；無定形特氟龍；和羧甲基纖維素。生物活性多肽偶聯(lián)的聚合物可包括多個(gè)選自下組的亞基透明質(zhì)酸、丙烯酸、乙二 醇、乙烯基、丙烯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酸羥乙酯、四氟乙烯、 甲醛、糖(如葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、阿拉伯糖等)、?；撬帷⑻鸩藟A、改性纖維素、羥乙基纖 維素、乙基纖維素、甲基纖維素、羥乙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、改 性淀粉、疏水改性淀粉、羥乙基淀粉、羥丙基淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉、氧化淀粉、氨基酸和 任何上述物質(zhì)的共聚物。在一些實(shí)施方式中，該聚合物不包含氨基酸。在一些實(shí)施方式中，該聚合物是透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸衍生物。透明質(zhì)酸衍生物包 括例如，部分或所有羧基官能團(tuán)被脂肪族、芳香族、芳基脂肪族、環(huán)脂肪族或雜環(huán)系列的醇 酯化的透明質(zhì)酸酯；與透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸的偏酯或全酯形成的琥珀酸半酯或琥珀酸半酯 的重金屬鹽；硫酸化或N-硫酸化透明質(zhì)酸。^li
主題多肽-聚合物偶聯(lián)物的多肽組分具有生物學(xué)活性，例如，在體內(nèi)和/或體外具 有一種或多種生物學(xué)活性。生物學(xué)活性包括例如，抗原結(jié)合；在真核細(xì)胞中激活信號(hào)傳導(dǎo)途 徑；誘導(dǎo)細(xì)胞增殖；誘導(dǎo)細(xì)胞分化；誘導(dǎo)血管新生；誘導(dǎo)凋亡；誘導(dǎo)血管新生；抑制血管新 生；減少凝集；減少細(xì)胞粘附；提高細(xì)胞粘附；控制細(xì)胞命運(yùn)；等。主題多肽-聚合物偶聯(lián)物的多肽組分可以是天然產(chǎn)生的多肽、重組多肽或合成多 肽。所述多肽可包含一個(gè)或多個(gè)非氨基酸部分，如脂質(zhì)部分、糖部分、碳水化合物部分等。在一些實(shí)施方式中，將一種多肽連接于聚合物，例如將具有相同氨基酸序列的多 個(gè)多肽連接于聚合物。在其它實(shí)施方式中，將兩種或多種多肽連接于聚合物，其中第一多肽 具有第一氨基酸序列，第二多肽具有不同于第一氨基酸序列的第二氨基酸序列(例如，第 二氨基酸序列與第一氨基酸序列的相同性為約95% -99%、約90% -95%、約85% -90%, 約 80% -85%、約 75% -80%、約 70% -75%、約 65% -70%、或小于 65% )。例如，所述第 一和第二多肽可靶向不同的細(xì)胞表面受體，例如，第一多肽可通過整聯(lián)蛋白受體提供細(xì)胞 粘附，第二多肽可活化結(jié)合的細(xì)胞，例如通過生長(zhǎng)因子受體等。在另一實(shí)例中，在目標(biāo)全能、 多潛能和多能祖細(xì)胞中，第一和第二多肽可誘導(dǎo)細(xì)胞分化，例如，第一和第二多肽均可誘導(dǎo) 肌生成，第一和第二多肽均可誘導(dǎo)心肌生成，第一和第二多肽均可誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生，第一和第 二多肽均可誘導(dǎo)祖細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞，或者第一和第二多肽均可誘導(dǎo)血細(xì)胞生成。在一些實(shí)施方式中，主題多肽-聚合物偶聯(lián)物的多肽組分是重組多肽，例如，該多 肽包括通常不以酰胺鍵連接于該多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。例如，可工程改造該多肽以包 含有利于連接于多肽-聚合物偶聯(lián)物的聚合物組分的氨基酸。例如，可工程改造該多肽以 包含有利于連接于多肽-聚合物偶聯(lián)物的聚合物組分的半胱氨酸殘基。該多肽的大小范圍可以是從2kDaa至約2000kDa，例如約2kDa至約5kDa、約5kDa 至約 lOkDa、約 IOkDa 至約 25kDa、約 25kDa 至約 50kDa、約 50kDa 至約 lOOkDa、約 IOOkDa 至 約 250kDa、約 250kDa 至約 500kDa、約 500kDa 至約 lOOOkDa、約 IOOOkDa 至約 2000kDa。在一些實(shí)施方式中，主題多肽-聚合物偶聯(lián)物的多肽組分包含可檢測(cè)標(biāo)記物。合適的標(biāo)記物包括例如，放射性同位素(如1mI嚴(yán)S等)；其產(chǎn)物產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的酶(如熒光 素酶、半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)；熒光標(biāo)記物(如熒光素異硫氰酸 酯、羅丹明、藻紅蛋白等)；通過金屬螯合基團(tuán)如EDTA連接于抗體的熒光發(fā)射金屬如152Eu, 或者其它鑭系元素；化學(xué)發(fā)光化合物，如魯米諾、異魯米諾、吖啶鎖鹽等；生物發(fā)光化合物， 如螢光素；熒光蛋白(如綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白等)；等?？捎糜谶B接于聚合物以產(chǎn)生主題多肽-聚合物偶聯(lián)物的感興趣多肽包括例如生 長(zhǎng)因子、受體、受體的多肽配體、酶、抗體、凝集因子、抗凝集因子、血管新生因子、抗-血管 新生因子等。合適的多肽包括直鏈多肽和環(huán)狀多肽。合適的多肽包括天然產(chǎn)生的多肽、合 成多肽等。合適的多肽包括但不限于干擾素(如IFNi、IFN-α、IFN-β、IFN-ω ；IFN- τ )； 胰島素(如諾和靈、優(yōu)泌林、優(yōu)泌樂、來得時(shí)、特慢胰島素等)；紅細(xì)胞生成素(“ΕΡ0”; 如普羅科(Procrit) 、易普萊克斯(Eprex) 或易普基(Epogen) (依泊汀-α)；阿耐斯 普(Aranesp) (達(dá)貝泊汀-α)；新雷克猛(NeoRecormon) 、易普金(Epogin) (依泊汀- β )等)；抗體(如單克隆抗體)(如利妥昔 (利妥昔單抗)；雷米克得(Remicade) (英夫利昔單抗)；賀賽汀 (曲妥珠單抗)；休米拉(Humira) (阿達(dá)木單抗)；仙萊爾 (Xolair) (奧馬珠單抗)；貝克薩(Bexxar) (托西莫單抗)；拉普替瓦(Raptiva) (依法 利珠單抗(efalizumab))；艾比特斯 (西妥昔單抗)；等)、包括單克隆抗體的抗原結(jié)合片 段；血液因子(如、Activase (阿替普酶)組織纖溶酶原激活物；諾瓦賽文(NovoSeven) (重組人因子Vila)；因子Vila;因子VIII(如克肌內(nèi)特(Kogenate) )；因子ιχ;β-珠 蛋白；血紅蛋白；等)；集落刺激因子(如紐迫基(Neupogen) (非格司亭；G-CSF)；紐拉 斯塔(Neulasta)(培非司亭)；粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺 激因子、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、巨核細(xì)胞集落刺激因子；等)；生長(zhǎng)激素(例如、促生長(zhǎng) 素、如健豪寧(Genotropin) 、紐托品(Nutropin) 、諾德人體生長(zhǎng)激素(Norditropin) 、恩增 (Saizen) 、斯洛替姆(Serostim) 、優(yōu)猛茁(Humatrope) 等；人生長(zhǎng)激素；等)；白介素(如 IL-I ；IL-2，包括例如阿地白介素(Proleukin) ; IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9 ； 等)；生長(zhǎng)因子(如雷格耐斯(Regranex) (貝卡普勒明(beclapermin) ；PDGF)；菲普拉斯 (Fiblast) (曲弗明；bFGF)；斯特基(Stemgen) (安西司亭；干細(xì)胞因子)；角質(zhì)形成細(xì)胞 生長(zhǎng)因子；酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、干細(xì)胞因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng) 因子等)；受體(如結(jié)合TNF-α的可溶性受體如恩利(Enbrel) (依那西普)；VEGF受體； 白介素受體；Y/S T細(xì)胞受體等)；神經(jīng)遞質(zhì)受體(如煙酸乙?；憠A受體、谷氨酸受體、 GABA受體等)；酶(如α -葡糖苷酶；塞拉酶(Cerazyme) (伊米苷酶；β -葡糖腦苷脂酶、 西利酶(Ceredase) (阿糖腦苷酶)；酶激活物(如組織纖溶酶原激活物)；趨化因子(如 IP-10 ；Mig ；Gro α /IL-8, RANTES ；MIP-I α ；MIP-I β ；MCP-I ；PF-4 ；等)；血管新生劑(如 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；抗血管新生劑(如VEGF受體)；神經(jīng)活性肽如緩激肽、膽囊收 縮素、胃泌素、促胰液素、催產(chǎn)素、促性腺素釋放激素、β -內(nèi)啡肽、腦啡肽、P物質(zhì)、促生長(zhǎng)素 抑制素、促乳素、甘丙肽、生長(zhǎng)激素釋放激素、鈴蟾肽、強(qiáng)啡肽、神經(jīng)降壓肽、促胃動(dòng)素、促甲 狀腺激素、神經(jīng)肽Y、黃體生成素、降鈣素、胰島素、胰高血糖素、加壓素、血管緊張素II、促 甲狀腺激素釋放激素、血管活性腸肽、睡眠肽等；其他蛋白質(zhì)如血栓溶解劑、心房利鈉肽、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、血小板生成素、松弛素、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白、促卵泡激素、人α-l抗 胰蛋白酶、白血病抑制因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、黃體生成素、巨噬細(xì)胞活化 因子、腫瘤壞死因子、嗜中性粒細(xì)胞趨化因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、金屬蛋白酶的組織抑制劑；血 管活性腸肽、血管生成素、促血管素、纖維蛋白；水蛭素；白血病抑制因子；IL-I受體拮抗 劑(如金奈特(Kineret) (阿那白滯素))；離子通道、如、囊性纖維化跨膜通道調(diào)節(jié)因子 (CFTR)；抗肌萎縮蛋白；肌養(yǎng)相關(guān)蛋白、腫瘤抑制蛋白；溶酶體酶酸性α-葡糖苷酶(GAA)；寸。合適的多肽包括sonic hedgehog蛋白(Sih)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白_4、白介 素-3 (IL-3)、干細(xì)胞因子-1 (SCF-I)、fms-樣酪氨酸激酶_3 (Flt3)配體、白血病抑制因 子(LIF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(FGF-2)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)。合適的多肽包括腦 衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3 (NT-3)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因 子-4(NT-4)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-5(NT-5)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因 子-I(IGF-I)、膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(⑶NF)和蛋白酶微管連接蛋白-1。合適的血 管新生多肽包括神經(jīng)生長(zhǎng)因子-1多肽、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)多肽、血小板衍生生長(zhǎng)因 子(PDGF)多肽、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)多肽和促血管生成素多肽。合適的多肽也包括凝集因子，如凝血酶等。合適的多肽也包括抗凝劑。合適的多 肽也包括細(xì)胞結(jié)合多肽。合適的多肽也包括例如，干蛋白、波形蛋白、普羅敏蛋白Trominin)/⑶133、SoniC hedgehog蛋白和其他hedgehog配體、Wnt配體、神經(jīng)聚糖/生腱蛋白C、Nurr 1、Pax_6、 Sox-2、Musashi-U NG2/CSPG-4、NeuroD3、神經(jīng)發(fā)生素1以及這些多肽的活性片段和子序 列。合適的多肽還包括例如，β微管蛋白ΙΙΙ、ΜΑΡ2、神經(jīng)元特異性烯醇酶、NCAM、 CDM、HAS、突觸蛋白I、突觸小泡蛋白、CAMK Iia、酪氨酸羥化酶、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、谷氨酸受 體、膽堿受體、煙酸A2、EphB2、GABA-A受體、5-羥色胺(5HT_;3)受體、膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶、以 及上述序列的片段和子序列。合適的多肽還包括例如，鈣通道；T-細(xì)胞抗原受體；趨化因子受體；鉀通道；神經(jīng) 遞質(zhì)受體(如5-羥色胺受體；GABA受體；谷氨酸受體；煙酸乙?；憠A受體；等)；生長(zhǎng)因 子受體(如表皮生長(zhǎng)因子受體；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體等)；骨形態(tài)發(fā)生蛋白；激活細(xì)胞信 號(hào)傳導(dǎo)途徑的多肽；等。主題多肽-聚合物偶聯(lián)物的多肽組分具有生物學(xué)活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難通過 設(shè)計(jì)用于檢驗(yàn)特定生物學(xué)活性的許多熟知實(shí)驗(yàn)確定給定多肽受否具有該生物學(xué)活性。測(cè) 定特定生物活性多肽的有用實(shí)驗(yàn)的例子包括但不限于GMCSF(Eaves，Α. C.和feves C. J.， 培養(yǎng)中的促紅細(xì)胞生成素(Erythropoiesisin culture).刊于McCullock E A(編) 《細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)-血液臨床學(xué)》(Cellculture techniques—Clinics in hematology). W B Saunders, Eastbourne,% 371-91 頁(1984) ；Metcalf, D.，International Journal of Cell Cloning 10:116-25(1992) ；Testa，N. G.，等，造血生長(zhǎng)因子測(cè)定(Assays for hematopoietic growth factors)，刊于Balkwi 11 F R(編)《細(xì)胞因子，實(shí)踐方法》 (Cytokines A practical Approach)，第 229-44 頁；IRL 牛津出版社，1991)EPO(生物試驗(yàn) (bioassay) :Kitamura 等，J. Cell. Physiol. 140 p323 (1989))；水蛭素(血小板凝集實(shí)驗(yàn):Blood CoagulFibrinolysis 7(2) :259-61(1996)) ；IFN α (抗-病毒實(shí)驗(yàn)Rubinstein 等，J. Virol. 37(2) :755-8(1981)；抗增殖實(shí)驗(yàn)Gao Y 等，Mol Cell Biol. 19(11) 7305-13(1999)；和生物實(shí)驗(yàn)Czarniecki 等，J. Virol. 49 p490 (1984)) ；GCSF(生物實(shí) 驗(yàn)=Shirafuji 等，Exp. Hematol. 17pll6(1989)；鼠 NFS-60 細(xì)胞的增殖(Weinstein 等， Proc Natl Acad Sci 83 :5010-4(1986))；胰島素(3H-葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)St印pan 等， Nature 409(6818) :307-12(2001)) ；hGH(Ba/F3_hGHR ±曾殖實(shí)驗(yàn) J ClinEndocrinol Metab 85(11) =4274-9(2000)；生長(zhǎng)激素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)Horm Res，51 期增刊 1 :7-12 (1999))；因子 X(因子X活性實(shí)驗(yàn):Van Wijk等Thromb Res22 :681-686(1981))；因子VII(采用前凝血酶 凝集時(shí)間的凝集實(shí)驗(yàn)BeIaaouaj 等，J. Biol. Chem. 275 :27123-8(2000) ；Diaz-Collier 等， Thromb Haemost 71:339-46(1994))。本領(lǐng)域已知用于活化細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的實(shí)驗(yàn)。本領(lǐng)域已知用于誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的 實(shí)驗(yàn)，它們包括例如，3H-胸苷攝取實(shí)驗(yàn)等。用于誘導(dǎo)血管新生的實(shí)驗(yàn)包括例如，雞胚尿囊膜 (CAM)實(shí)驗(yàn)、體外內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)、圓盤血管新生系統(tǒng)等。本領(lǐng)域已知用于誘導(dǎo)細(xì) 胞分化的實(shí)驗(yàn)，包括檢測(cè)與分化細(xì)胞類型有關(guān)的基因產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)。^^如上所述，在一些實(shí)施方式中，主題多肽-聚合物偶聯(lián)物包含將多肽連接于聚合 物的接頭基團(tuán)。合適的接頭包括肽接頭和非肽接頭。接頭肽可具有各種氨基酸序列。示范性肽接頭的長(zhǎng)度約為6-40個(gè)氨基酸，或者約 為6-25個(gè)氨基酸。示范性接頭包括聚(甘氨酸)接頭(如(Gly)n，其中η是2-約10的整 數(shù))；包含Gly和義！·的接頭；等。MM可利用各種偶聯(lián)方法和化學(xué)方式將多肽偶聯(lián)于聚合物?？刹捎枚喾N零長(zhǎng)度的、同 質(zhì)-雙功能和異質(zhì)-雙功能交聯(lián)試劑。零長(zhǎng)度交聯(lián)試劑包括將兩個(gè)內(nèi)在的化學(xué)基團(tuán)直接 偶聯(lián)而不引入外源物質(zhì)。催化形成二硫鍵的試劑屬于這一類別。另一個(gè)例子是誘導(dǎo)羧基 和伯氨基縮合形成酰胺鍵的試劑，如碳二亞胺、氯甲酸乙酯，伍德沃德試劑!((Woodward' s reagent K) O-乙基_5_苯基異嗯唑鐠_3 ‘-磺酸鹽)和羰二咪唑。同質(zhì)-和異質(zhì)-雙功 能試劑通常分別含有兩個(gè)相同或兩個(gè)不同的位點(diǎn)，它們可能與氨基、巰基、胍基、吲哚或非 特定基團(tuán)反應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，該聚合物包含與多肽上或接頭上的伯胺基團(tuán)反應(yīng)的氨基反應(yīng) 性基團(tuán)。合適的氨基反應(yīng)性基團(tuán)包括但不限于N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯、亞氨酸酯、異 氰酸酯、酰基商、芳基疊氮、對(duì)硝基苯基酯、醛和磺酰氯。在一些實(shí)施方式中，聚合物包含巰基反應(yīng)性基團(tuán)，例如用于與多肽中的半胱氨酸 殘基反應(yīng)。合適的巰基反應(yīng)性基團(tuán)包括但不限于馬來酰亞胺、烷基鹵、吡啶基二硫化物和 硫代鄰苯二甲酰亞胺。在其它實(shí)施方式中，將可溶于水和有機(jī)溶劑的碳二亞胺用作羧基反應(yīng)性試劑。這 些化合物能與游離羧基反應(yīng)形成假脲，然后可偶聯(lián)于可獲得的胺，產(chǎn)生酰胺連接。如上所述，在一些實(shí)施方式中，用同質(zhì)雙功能交聯(lián)劑將多肽偶聯(lián)于聚合物。在一些實(shí)施方式中，同質(zhì)雙功能交聯(lián)劑可與伯胺反應(yīng)?？膳c伯胺反應(yīng)的同質(zhì)雙功 能交聯(lián)劑包括NHS酯、亞氨酸酯、異硫氰酸酯、異氰酸酯、酰基鹵、芳基疊氮、對(duì)-硝基苯基酯、醛和磺酰氯。同質(zhì)雙功能NHS酯的非限制性例子包括二琥珀酰亞胺基戊二酸酯(DSG)、二琥珀 酰亞胺基辛二酸酯(DSS)、雙(磺基琥珀酰亞胺基)辛二酸酯(BS)、二琥珀酰亞胺基酒石 酸酯(DST)、二磺基琥珀酰亞胺基酒石酸酯(磺基-DST)、雙2-(琥珀酰亞胺基氧基羰氧 基)乙基砜(BS0C0EQ、雙2-(磺基琥珀酰亞胺基氧基羰氧基)乙基砜(磺基-BS0C0ES)、 乙二醇雙(琥珀酰亞胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇雙(磺基琥珀酰亞胺基琥珀酸酯)(磺 基-EGS)、二硫代雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯(DSP)和二硫代雙(磺基琥珀酰亞胺基丙酸酯 (磺基-DSP)。同質(zhì)雙功能亞氨酸酯的非限制性例子包括丙二酸亞氨酸二甲酯(dimethyl malonimidate, DMM)、琥珀酸亞氨酸二甲酯(dimethyl succinimidate, DMSC)、己二酸亞氨 酸二甲酯(dimethyl adipimidate, DMA)、庚二酸亞氨酸二甲酯(dimethyl pimelimidate, DMP)、辛二酸亞氨酸二甲酯(dimethyl suberimidate，DMS)、二甲基-3，3 ‘-氧基二丙酸 亞氨酸酯(dimethyl-3，3 ‘ -oxydipropionimidate，D0DP)、二甲基-3，3 ‘-(亞甲基二 氧)二丙酸亞氨酸酯(dimethyl-3,3' - (methylenedioxy) dipropionimidate, DMDP)、二 甲基-，3' -( 二亞甲基二氧)二丙酸亞氨酸酯(dimethyl_，3' -(dimethylenedioxy) dipropionimidate, DDDP)、二甲基-3，3' _(四亞甲基二氧)二丙酸亞氨酸酯 (dimethyl-3, 3 ‘ - (tetramethylenedioxy) dipropionimidate, DTDP)禾口二甲基-3,3' -二 硫代二丙酸亞氨酸酯(dimethyl-3，3' -dithiobispropionimidate，DTBP)。同質(zhì)雙功能異硫氰酸酯的非限制性例子包括對(duì)-亞苯基二異硫氰酸酯(DITC)和 4,4' -二異硫氰基_2，2' -二磺酸芪(DIDQ。同質(zhì)雙功能異氰酸酯的非限制性例子包括 二甲苯-二異氰酸酯、甲苯_2，4- 二異氰酸酯、甲苯-2-異氰酸酯-4-異氰酸酯、3-甲氧基 二苯基甲基-4，4' - 二異氰酸酯、2，2' - 二羧基_4，4'-苯偶氮基二異氰酸酯和六亞甲 基二異氰酸酯。同質(zhì)雙功能芳基鹵的非限制性例子包括1，5_ 二氟-2，4-二硝基苯(DFDNB) 和4，4' -二氟_3，3' -二硝基苯基-砜。同質(zhì)雙功能脂族醛試劑的非限制性例子包括乙 二醛、丙醛和戊二醛。同質(zhì)雙功能?；噭┑姆窍拗菩岳影ǘ人岬南趸交ァＭ?質(zhì)雙功能芳族磺酰氯的非限制性例子包括酚_2，4- 二磺酰氯和α -萘酚-2，4- 二磺酰氯。 氨基-反應(yīng)性同質(zhì)雙功能試劑的其他非限制性例子包括赤蘚醇二碳酸酯，它能與胺反應(yīng)生 成雙氨基甲酸酯。在一些實(shí)施方式中，同質(zhì)雙功能交聯(lián)劑可與游離巰基反應(yīng)?？膳c游離巰基反應(yīng)的 同質(zhì)雙功能交聯(lián)劑包括例如，馬來酰亞胺、吡啶基二硫化物和烷基鹵。同質(zhì)雙功能馬來酰亞胺的非限制性例子包括雙馬來酰亞胺己烷(ΒΜΗ)、Ν， N' -(1，3-亞苯基)雙馬來酰亞胺、N，N' -(1，2-亞苯基)雙馬來酰亞胺、苯偶氮基二馬 來酰亞胺和雙(N-馬來酰亞胺甲基)醚。同質(zhì)雙功能吡啶基二硫化物的非限制性例子包括 1，4_ 二-3' -(2'-吡啶基二硫)丙酰胺基丁烷(DPDPB)。同質(zhì)雙功能烷基鹵的非限制性 例子包括2，2' - 二羧基_4，4' -二碘乙酰胺基偶氮苯、α，α ‘ -二碘-對(duì)二甲苯磺酸、 α , α ‘ -二溴-對(duì)二甲苯磺酸、Ν，Ν'-雙(b_溴乙基)芐胺、N，N' -二(溴乙?；?苯 基胼和1，2-二(溴乙?；?氨基-3-苯基丙烷。如上所述，在一些實(shí)施方式中，用異質(zhì)雙功能試劑將多肽偶聯(lián)于聚合物。合適的異 質(zhì)雙功能試劑包括含有吡啶基二硫化物部分的氨基反應(yīng)性試劑；含有馬來酰亞胺部分的氨 基反應(yīng)性試劑；含有烷基鹵部分的氨基反應(yīng)性試劑；和含有烷基二鹵部分的氨基反應(yīng)性試劑。具有吡啶基二硫化物部分和氨基反應(yīng)性NHS酯的異質(zhì)雙功能試劑的非限制性例 子包括N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞胺基6-3-(2-吡 啶基二硫)丙酰胺基己酸酯(LC-SPDP)、磺基琥珀酰亞胺基6-3-(2-吡啶基二硫)丙酰胺 基己酸酯(磺基-冗5 0 、4-琥珀酰亞胺基氧基羰基-0-甲基-0-(2-吡啶基二硫)甲 苯(SMPT)和磺基琥珀酰亞胺基6-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯酰胺基己酸酯(磺 基-LC-SMPT)。含有馬來酰亞胺部分和氨基反應(yīng)性NHS酯的異質(zhì)雙功能試劑的非限制性例子 包括琥珀酰亞胺基馬來酰亞胺基乙酸酯(AMAQ、琥珀酰亞胺基3-馬來酰亞胺基丙酸酯 (BMPS) ,N-Y-馬來酰亞胺丁酰氧基琥珀酰亞胺酯(GMBS)N- γ -馬來酰亞胺丁酰氧基磺基 琥珀酰亞胺酯(磺基-GMBS)、琥珀酰亞胺基6-馬來酰亞胺基己酸酯(EMCS)、琥珀酰亞胺 基3-馬來酰亞胺基苯甲酸酯(SMB)、間-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)、 間-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯(磺基-MBS)、琥珀酰亞胺基4- (N-馬來 酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)、磺基琥珀酰亞胺基4-(Ν-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己 烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)、琥珀酰亞胺基4-(對(duì)-馬來酰亞胺苯基)丁酸酯(SMPB)和磺 基琥珀酰亞胺基4-(對(duì)-馬來酰亞胺苯基)丁酸酯(磺基-SMPB)。含有烷基鹵部分和氨基反應(yīng)性NHS酯的異質(zhì)雙功能試劑的非限制性例子包括 N-琥珀酰亞胺基-(4-碘乙?；?氨基苯甲酸酯(SIAB)、磺基琥珀酰亞胺基-(4-碘乙酰 基)氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)、琥珀酰亞胺基-6-(碘乙?；?氨基己酸酯(SIAX)、 琥珀酰亞胺基-6-(6-((碘乙?；?-氨基)己酰基氨基)己酸酯(SIAXX)、琥珀酰亞胺 基-6-(((4-(碘乙?；?-氨基)甲基)_環(huán)己烷-1-羰基)氨基己酸酯(SIACX)和琥珀酰 亞胺基-4((碘乙?；?_氨基)甲環(huán)己烷-1-羧酸酯(SIAC)。含有氨基反應(yīng)性NHS酯和烷基二鹵部分的異質(zhì)雙功能試劑的非限制性例子是 N-羥基琥珀酰亞胺基2，3-二溴丙酸酯(SDBP)。含有烷基鹵部分和氨基反應(yīng)性對(duì)-硝基苯 基酯部分的異質(zhì)雙功能試劑的非限制性例子包括對(duì)-硝基苯基碘代乙酸酯(NPIA)。組合物本發(fā)明提供包含主題多肽-聚合物偶聯(lián)物的組合物，包括藥物組合物。在一些實(shí)施方式中，主題組合物包含主題多肽-聚合物偶聯(lián)物，其中主題多肽-聚 合物偶聯(lián)物是均質(zhì)的，例如多肽-聚合物偶聯(lián)物的所有多肽均包含相同的氨基酸序列。例 如，在一些實(shí)施方式中，主題組合物包含多種(如多個(gè)拷貝)的主題多肽-聚合物偶聯(lián)物， 其中各多肽-聚合物偶聯(lián)物分子含有均具有相同氨基酸序列的多肽。在其它實(shí)施方式中，主題組合物包含兩種或多種主題多肽-聚合物偶聯(lián)物，例如， 主題組合物包含第一多肽-聚合物偶聯(lián)物和至少一種第二多肽-聚合物偶聯(lián)物；其中第一 多肽-聚合物偶聯(lián)物包含第一氨基酸序列的多肽，第二多肽-聚合物偶聯(lián)物包含不同于第 一氨基酸序列的第二氨基酸序列的多肽。在一些實(shí)施方式中，主題組合物包含第三或附加 的多肽-聚合物偶聯(lián)物。作為一個(gè)非限制性例子，第一多肽-聚合物偶聯(lián)物包含能結(jié)合整聯(lián) 蛋白的第一多肽；第二多肽-聚合物偶聯(lián)物包含能激活細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的第二多肽。也 可使用第一、第二等等多肽的各種其他組合。主題組合物中所述第一多肽-聚合物偶聯(lián)物 與所述第二多肽-聚合物偶聯(lián)物的比例可變，例如約為0 001 IO3至IO3 0.001。類似地，主題組合物包含第一、第二和第三多肽-聚合物偶聯(lián)物時(shí)，第一、第二和第三多肽-聚 合物偶聯(lián)物的比例可變。除主題多肽-聚合物偶聯(lián)物以外，主題組合物可包含以下一種或多種物質(zhì)鹽，如 妝(1、1%(1、1((1、1%504等；緩沖劑，如Tris緩沖液、N-(2-羥乙基)哌嗪-N' -(2-乙磺酸) (HEPES)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、2_(N_嗎啉代)乙磺酸鈉(MES)、3_(N_嗎啉代)丙 磺酸(MOPS)、N-三[羥甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)等；增溶劑；去污劑，如非離子 型去污劑，如吐溫-20等；蛋白酶抑制劑等。本發(fā)明提供包含主題多肽-聚合物偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物。合 適的賦形劑運(yùn)載體是，例如，水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等，和其組合。此外，如果需要，該 運(yùn)載體可含有少量輔助物質(zhì)，如濕潤(rùn)劑或乳化劑或PH緩沖劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解或明 白制備這類劑型的實(shí)際方法。參見例如，Remington' s Pharmaceutical Sciences(雷明 頓藥物科學(xué))，賓夕法尼亞州伊斯頓的馬克出版公司(Mack Publishing Company, Easton， Pa.)，第17版，1985。在任何情況下，給予的組合物或制劑含有足以在所治療對(duì)象中實(shí)現(xiàn)所 需狀態(tài)的藥物用量。藥學(xué)上可接受的賦形劑，如運(yùn)載體、佐劑、載體或稀釋劑容易通過公共 渠道獲得。而且，藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，如PH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、濕 潤(rùn)劑等容易通過公共渠道獲得。本文所用術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”和“藥學(xué)上可接受的賦形劑”可互換使用， 包括與主題多肽-聚合物偶聯(lián)物聯(lián)用時(shí)不顯著影響該偶聯(lián)物的生物學(xué)活性、不誘導(dǎo)宿主免 疫應(yīng)答并且不會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生任何顯著的不良生理影響的任何材料。例子包括但不限于任 何標(biāo)準(zhǔn)藥用載體，如磷酸緩沖鹽水、水、乳液如油/水乳液，以及各種濕潤(rùn)劑。其他載體也可 包括無菌溶液、片劑包括包衣片和膠囊。這類載體通常含有賦形劑如淀粉、牛奶、糖、某些類 型的粘土、明膠、硬脂酸或其鹽、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、滑石粉、植物脂肪或油、樹膠、二醇或 其他已知賦形劑。這類載體也可包括調(diào)味劑和著色添加劑，或其他成分。通過熟知的常規(guī) 方法配制含有這類載體的組合物?？筛鶕?jù)所選的給藥方式配制藥物組合物，包括例如局部、口服、經(jīng)鼻、靜脈內(nèi)、顱 內(nèi)、腹膜內(nèi)、腫瘤內(nèi)、腫瘤周(peritumoral)、皮下或肌肉內(nèi)給藥。就胃腸道外給藥，如皮下 注射而言，載體可包含水、鹽水、醇、脂肪、蠟或緩沖液。就口服給藥而言，可采用任何上述載 體或固體載體，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸 鎂。生物可降解微球(如聚乳酸聚乙醇酸)也可用作主題藥物組合物的載體。合適的生物 可降解微球參見例如，美國(guó)專利4，897，268和5，075，109。在一些實(shí)施方式中，通過胃腸道外，如靜脈內(nèi)途徑給予主題藥物組合物。因此，本 發(fā)明提供胃腸道外給藥組合物，其包含溶解于或懸浮于可接受的載體，優(yōu)選水性載體如水、 緩沖水、鹽水、磷酸-緩沖鹽水等的主題偶聯(lián)物。該組合物可視需要含有藥學(xué)上可接受的輔 助物質(zhì)以接近生理?xiàng)l件，如PH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、濕潤(rùn)劑、去污劑等?？赏ㄟ^常規(guī)滅菌技術(shù)對(duì)主題組合物滅菌，或者可以對(duì)其進(jìn)行過濾除菌。可將所得 的水溶液原樣包裝以供使用，或者將其凍干，在臨給藥前將凍干制劑與無菌水性載體混合。 該制劑的PH范圍可以是3至11，例如約pH 5至pH 9，或者約pH 7至pH 8?？芍踩氲慕M織和裝置在一些實(shí)施方式中，將主題多肽-聚合物偶聯(lián)物涂布在可植入的組織和裝置上、13層積在可植入的組織和裝置上、摻入可植入的組織和裝置中或形成可植入的組織或裝置， 可植入的組織和裝置可以是，例如，人造組織；組織植入物；可植入裝置(如血管內(nèi)支架、人 造關(guān)節(jié)、支架、植入物(如主動(dòng)脈移植物)、人造心臟瓣膜、腦脊液分流器、冠狀動(dòng)脈分流器、 起搏器電極、心內(nèi)膜電極等)的涂層；可植入藥物遞送系統(tǒng)；等。人造組織包括例如，合成心 臟瓣膜(如合成的主動(dòng)脈瓣、合成的僧帽瓣等)。支架包括例如，自膨脹支架、隨球囊而膨 脹的支架和支架-移植物。生物材料包括例如，膜、凝膠、海綿、紗布、無紡布、膜、微球、微膠 囊、線、導(dǎo)槽等。例如，在一些實(shí)施方式中，將主題多肽-聚合物偶聯(lián)物層積在或涂布于基質(zhì)上，或 者連接于基質(zhì)，以形成合成的可植入裝置。例如，基質(zhì)(也稱為“生物相容性基材”)是適合 植入對(duì)象且上面層積有、涂有或連接有主題多肽-聚合物偶聯(lián)物的的材料。生物相容性基 材植入對(duì)象后不引起毒性或損傷效應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物相容性基材是具有可形成 需要修復(fù)或替換的所需結(jié)構(gòu)的表面的聚合物。生物相容性基材也可形成需要修復(fù)或替換的 結(jié)構(gòu)的一部分。生物相容性基材提供層積、涂布或連接主題多肽-聚合物偶聯(lián)物的支持框 架。在一些實(shí)施方式中，連接有主題多肽-聚合物偶聯(lián)物的基質(zhì)或支架還包含結(jié)合于 含有多肽-聚合物偶聯(lián)物的基質(zhì)或支架的一種或多種細(xì)胞和/或一種或多種細(xì)胞類型。這 類基質(zhì)或支架可用于組織工程改造、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞移植等。在一些實(shí)施方式中，藥物遞送裝置包含主題多肽-聚合物偶聯(lián)物。例如，藥物釋放 裝置可基于擴(kuò)散系統(tǒng)、對(duì)流系統(tǒng)或易腐蝕系統(tǒng)(如，基于腐蝕的系統(tǒng))。例如，藥物釋放裝置 可以是電化學(xué)泵、滲透泵、電滲泵、汽壓泵或滲透爆發(fā)基質(zhì)，例如，將藥物摻入聚合物且伴隨 著浸漬了藥物的聚合材料(如可生物降解的、浸漬藥物的聚合材料)降解，聚合物釋放藥物 制劑。在其它實(shí)施方式中，藥物釋放裝置基于電擴(kuò)散系統(tǒng)、電解泵、泡騰泵、壓電泵、水解系 統(tǒng)等。在一些實(shí)施方式中，可對(duì)可植入藥物遞送系統(tǒng)進(jìn)行編程以便給予活性劑?？?編程的可植入系統(tǒng)的例子包括可植入輸液泵?？芍踩胼斠罕没蚺c這類泵聯(lián)用的裝置的 例子參見例如，美國(guó)專利號(hào) 4，350，155 ；5，443，450 ；5，814，019 ；5，976，109 ；6，017，328 ； 6，171，276 ；6，241，704 ；6，464，687 ；6，475，180 ；和 6，512，954。另一示范性裝置是思科洛美 (Synchromed)輸注泵(麥德托尼克公司(Medtronic))。可使用可植入藥物遞送裝置遞送任何藥劑，例如，免疫應(yīng)答修飾劑、抗增殖劑、抗 凋亡劑、抗-有絲分裂劑、抗血小板劑、鉬配位絡(luò)合物、激素、抗凝劑、纖維蛋白溶解劑、抗分 泌藥、抗遷移藥、免疫抑制劑、血管新生劑、血管緊張素受體阻斷劑、氮氧化物供體、反義寡 核苷酸、細(xì)胞周期抑制劑、皮質(zhì)類固醇、血管抑制性類固醇、抗寄生物藥、抗青光眼藥物、抗 生素、分化調(diào)節(jié)劑、抗病毒藥、抗癌藥和消炎藥。用途主題多肽-聚合物偶聯(lián)物可用于各種應(yīng)用，包括治療應(yīng)用(如藥物遞送、可植入裝 置、組織工程、再生醫(yī)學(xué))、診斷應(yīng)用、藥物發(fā)現(xiàn)和研究應(yīng)用。治療應(yīng)用主題多肽-聚合物偶聯(lián)物可用于各種治療應(yīng)用。例如，如上所述，主題多肽-聚合物偶聯(lián)物可連接于藥物遞送裝置，其中多肽-聚合物偶聯(lián)物的生物活性多肽組分產(chǎn)生功能性，藥物遞送裝置提供治療劑。例如，需要用治療 劑治療時(shí)，生物活性多肽可提供對(duì)特定細(xì)胞類型或組織類型的靶向，而藥物遞送裝置可以 局部方式提供治療劑。作為另一個(gè)實(shí)例，主題多肽-聚合物偶聯(lián)物的生物活性多肽組分本身可以是治療 劑，例如，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；在治療部位誘導(dǎo)血液凝結(jié)；抑制血小板聚集；誘導(dǎo)血管 新生；誘導(dǎo)細(xì)胞分化等。作為另一個(gè)實(shí)例，如上所述，主題多肽-聚合物偶聯(lián)物可連接于可植入醫(yī)療器械， 如支架、分流器、人造閥、導(dǎo)線、人造關(guān)節(jié)、移植物、電極等，其中主題多肽-聚合物偶聯(lián)物的 生物活性多肽組分提供所需活性，如減輕新內(nèi)膜增生性再狹窄；抑制細(xì)胞增殖；抑制細(xì)胞 粘附等。作為另一個(gè)實(shí)例，如上所述，主題多肽-聚合物偶聯(lián)物可連接于基質(zhì)或支架，其中 該多肽-聚合物偶聯(lián)物提供細(xì)胞結(jié)合。在細(xì)胞移植、組織工程等方法中，可將所述包含主題 多肽-聚合物偶聯(lián)物的基質(zhì)或支架(含有或不含結(jié)合于多肽-聚合物偶聯(lián)物的細(xì)胞)引入 個(gè)體體內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，主題多肽-聚合物偶聯(lián)物可用于在需要的個(gè)體中、在缺血組 織中或其附近誘導(dǎo)血管新生(如當(dāng)多肽是誘導(dǎo)血管新生的多肽時(shí))。研究應(yīng)用主題多肽-聚合物偶聯(lián)物可用于各種研究應(yīng)用，例如，用于研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途 徑等?？蓪⒅黝}多肽-聚合物偶聯(lián)物給予實(shí)驗(yàn)性非人動(dòng)物疾病模型，以檢測(cè)主題多肽-聚合 物偶聯(lián)物對(duì)模型中的生理應(yīng)答的影響。主題多肽-聚合物偶聯(lián)物也可用于藥物篩選應(yīng)用。實(shí)施例提供以下實(shí)施例的目的是向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完整地公開和描述如何制備和 使用本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)限制發(fā)明人認(rèn)為的發(fā)明范圍，也不代表下述實(shí)驗(yàn)是所進(jìn)行的 所有和僅有的實(shí)驗(yàn)。努力保證所用數(shù)值(如含量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但應(yīng)允許一些實(shí)驗(yàn)誤 差和偏差。除非另有說明，份數(shù)是重量份數(shù)，分子量是重均分子量，溫度是攝氏度，壓力是大 氣壓或接近大氣壓?？刹捎脴?biāo)準(zhǔn)縮寫，例如，bp，堿基對(duì)；1Λ，千堿基；pl，皮升；8或8沈，秒； min，分鐘；h或hr，小時(shí)；aa，氨基酸；1Λ，千堿基；bp，堿基對(duì)；nt，核苷酸；i.m.，肌內(nèi)；i.p.， 腹膜內(nèi)；s. c.，皮下等。實(shí)施例1 多肽-聚合物偶聯(lián)物的合成和鑒定通過采用碳二亞胺和馬來酰亞胺化學(xué)的兩步反應(yīng)將Sih的修飾重組形式生物偶 聯(lián)于直鏈聚合物聚丙烯酸(pAAc)和透明質(zhì)酸(HyA)，以便產(chǎn)生Sonichedgehog蛋白Ghh) 的活性很高的多價(jià)形式。即使在化學(xué)劑量比為30個(gè)Shh分子/直鏈HyA鏈(即30 1 Shh HyA)時(shí)，偶聯(lián)效率也有 75%。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)測(cè)定0. 6 1 Shh HyA至22 1 Shh HyA范圍內(nèi)的Shh分子/HyA直鏈化學(xué)計(jì)量比的偶聯(lián)物的生物學(xué)活性。結(jié)果表明，低 偶聯(lián)比能降低Shh生物學(xué)活性，而高比例則將此種活性提高到單體Shh的強(qiáng)度之上，其中可 溶性Shh單體和Sih HyA為7 1的偶聯(lián)Shh活性大約相等。此外，經(jīng)體內(nèi)雞胚尿囊膜 (CAM)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，高比例構(gòu)建物能提高血管新生。通過Sih HyA偶聯(lián)物和細(xì)胞表面受體之 間多種相互作用的動(dòng)力學(xué)模型獲得這些結(jié)果，在較低的總Shh濃度下產(chǎn)生較高水平的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。方法重組Shh和牛物偶聯(lián)技術(shù)使用以前所述大鼠Sih的N末端信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的cDNA(15)，通過PCR在蛋白 質(zhì)C末端上加入編碼額外半胱氨酸殘基和6x His標(biāo)簽的堿基對(duì)，以便分別進(jìn)行基于巰基 的反應(yīng)和蛋白質(zhì)純化。根據(jù)該蛋白質(zhì)的此區(qū)域遠(yuǎn)離其活性位點(diǎn)和連接的惰性分子不改變 蛋白質(zhì)活性的研究(16)，特別選擇這一系鏈連接位點(diǎn)。將所產(chǎn)生的修飾的Sih PCR產(chǎn)物 插入pBAD-HisA(加利福尼亞州卡爾斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad, CA))質(zhì) 粒中，通過DNA測(cè)序確認(rèn)得到的質(zhì)粒，通過阿拉伯糖誘導(dǎo)在BL21 (DE3). pLys. E大腸桿菌 (E. coli)中表達(dá)該蛋白。誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)后，裂解細(xì)胞，并用NiNTA(加州瓦倫西亞的凱杰 公司(Qiagen，Valencia，CA))結(jié)合純化表達(dá)的Sih，然后進(jìn)行咪唑洗脫。用含有10%甘油、 2mM EDTA和50 μ M ZnSO4的pH 7. 4PBS透析純化的蛋白質(zhì)。通過兩步反應(yīng)將純化的Shh偶聯(lián)于直鏈聚合物，一個(gè)是在聚合物的羧酸基團(tuán)上的 碳二亞胺化學(xué)反應(yīng)，另一個(gè)是在蛋白質(zhì)C末端半胱氨酸上的馬來酰亞胺反應(yīng)(圖1)。第一 個(gè)步驟是將[N- ε -馬來酰亞胺己酸]酰胼(EMCH，美國(guó)伊利諾斯州羅克福德的皮爾斯生物 技術(shù)公司(Pierce Biotechnology, Rockford, IL))加入所述直鏈聚合物以便隨后連接于該 蛋白。用相同步驟將此種非免疫原性酰胼-馬來酰亞胺異質(zhì)雙功能交聯(lián)劑加入這兩種直鏈 聚合物，但反應(yīng)條件略有不同。就？々4(偶聯(lián)物而言，將&^/1111的450，000 Da pAAc (賓夕 法尼亞州沃靈頓的多利科學(xué)公司(Polysciences, Warrington, PA))與3. 9mg/ml的1-乙 基-3-[3- 二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、1. lmg/ml的N-羥基磺基琥珀酰亞胺 (磺基-NHS)和0. 5mg/ml EMCH在pH 6. 5 MES緩沖液中室溫下反應(yīng)2小時(shí)，如小肽序列的 連接中所述(17)。就HyA活化而言，采用類似于以前所述用于連接酰胼的方法(9)，以及IO6 Da漏HyA (馬薩諸塞州劍橋的基酶公司(Genzyme，Cambridge ΜΑ))。將其溶解，并在0. IM MES緩沖液pH 5. 0中以3mg/ml與pAAc反應(yīng)中所用的相同濃度的EDC、磺基-NHS和EMCH 反應(yīng)過夜。連接EMCH后，通過在50，000MW截止值離心濾器(PG公司(Pall Gellman))中 進(jìn)行連續(xù)的稀釋和離心，從未偶聯(lián)試劑中分離所得的馬來酰亞胺活化的直鏈聚合物。然后將不同的化學(xué)計(jì)量給料比的活化聚合物與Shh反應(yīng)，以產(chǎn)生分子取代程度不 同的偶聯(lián)物。在含有50μΜ三(2-羧基乙基)鹽酸膦(TCEP，美國(guó)伊利諾斯州羅克福德的皮 爾斯生物技術(shù)公司)的0. IM MES緩沖液(pH 6. 5)中4°C反應(yīng)過夜，以便在反應(yīng)持續(xù)期間保 證C-末端Shh半胱氨酸呈還原狀態(tài)。反應(yīng)后，通過加入0. 5mM 二硫蘇糖醇并在4°C培育1 小時(shí)將所述直鏈聚合物上所有剩余的馬來酰亞胺基團(tuán)還原。通過凝膠電泳測(cè)定所有偶聯(lián)反應(yīng)，將反應(yīng)溶液與等質(zhì)量的未反應(yīng)Shh作比較以觀 察蛋白質(zhì)偶聯(lián)效率。此外，利用Spectra/P0r Float-A-Lyzer 裝置(美國(guó)加州RD的SL &司(Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA)) 0. IMES _7中夕夜(pH 6. 5)中3 析多組一式三份的Sih HyA偶聯(lián)反應(yīng)液(Shh與HyA的摩爾給料比為20 1和10 1) 過夜，以去除未偶聯(lián)的Sih。然后，用微型BCA測(cè)定(美國(guó)伊利諾斯州羅克福德的皮爾斯生 物技術(shù)公司)定量分析透析后的HyA-Shh溶液中的蛋白質(zhì)濃度。生物學(xué)活性測(cè)定為了檢測(cè)生物學(xué)活性，通過接觸Shh誘導(dǎo)鼠胚胎C3H10T1/2細(xì)胞(美國(guó)弗吉尼亞州瑪納薩斯的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection, Manassas VA))，使其分化成成骨細(xì)胞系，如其它文獻(xiàn)所述(18，19)。簡(jiǎn)要說，以5000個(gè)細(xì)胞/孔的密度 將細(xì)胞接種于含有正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基(αΜΕΜ加的96孔板。2天后，用低FBS (2% ) 培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基，并補(bǔ)充加入蛋白質(zhì)和偶聯(lián)物反應(yīng)溶液。測(cè)試條件包括I-IOOnM的可溶 性Shh ；相同濃度范圍的可溶性Shh和50 μ g/ml的未偶聯(lián)HyA ；或者 HyA偶聯(lián)物，其 含量應(yīng)使培養(yǎng)基溶液中的Shh濃度為1-ΙΟΟηΜ。再培育3天后，洗滌和裂解細(xì)胞，用熒光探 針9-Η-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸酯(DDA0，俄勒岡州尤金的分子探 針有限公司(Molecular Probes,Eugene,OR))測(cè)定堿性磷酸酶(ALP)活性以確定細(xì)胞裂解 物的分化水平。未偶聯(lián)的聚丙烯酸能夠抑制細(xì)胞分化，因此未對(duì)這些偶聯(lián)物進(jìn)行生物學(xué)活 性檢測(cè)。血管新牛測(cè)定Shh是已知的血管新生劑00)。用CAM窗口實(shí)驗(yàn)測(cè)定可溶性Shh和Shh HyA偶 聯(lián)物誘導(dǎo)血管新生。在37°C的濕潤(rùn)環(huán)境中孵育受精的白來杭雞蛋(美國(guó)康奈提格州富蘭 克林的查爾斯河(Charles River,Franklin CT))直到第8天，此時(shí)從雞蛋鈍端取出2ml蛋 白，并且在雞蛋殼的另一側(cè)開出一個(gè)Icm χ Icm的小窗口。將載有無菌PBS、0. 1 μ g Shh或 相當(dāng)于0. Iyg Shh的20 1 Shh HyA給料比偶聯(lián)物的無菌濾紙方塊直接放在正在發(fā)育 的CAM上。然后，用帕拉膠膜封住該窗，并將雞蛋放回孵育箱。3天后，用奧林巴斯SZX7立 體顯微鏡評(píng)價(jià)測(cè)試材料周圍的血管新生情況。用附連的QQtoImaging Qfire)相機(jī)拍攝高 分辨率的顯微照片。用圖像分析軟件ImageJ分析這些圖像，以便對(duì)環(huán)繞植入物且離開其邊 緣0. 1和0. 25cm的正方形區(qū)域內(nèi)每單位長(zhǎng)度上的血管數(shù)量進(jìn)行定量。測(cè)定每組的線形密 度測(cè)量值，以便用單向ANOVA對(duì)0. 1和0. 25cm距離的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析，然后對(duì) 每組進(jìn)行成對(duì)賀牧t檢驗(yàn)(Holm，st-tests)。Mshh HvA {mmm^w^m^^im建立描述對(duì)Shh單體起反應(yīng)的Gli轉(zhuǎn)錄效應(yīng)物表達(dá)的結(jié)合和運(yùn)輸數(shù)值模型01， 22)和描述多價(jià)配體-受體結(jié)合的數(shù)值動(dòng)力學(xué)模型03)(圖3)，以便對(duì)Sih HyA偶聯(lián)物 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)建模。在圖3中，顯示了在一個(gè)代表性細(xì)胞周圍的涉及多價(jià)偶聯(lián)物的Shh核 心信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)和假擬反應(yīng)。蛋白質(zhì)之間的箭頭代表結(jié)合或解離，從基因到蛋白質(zhì)的箭頭 代表表達(dá)，從蛋白質(zhì)到基因的箭頭代表激活或抑制。Smo，平滑蛋白(Smoothened)。在細(xì)胞 水平，Shh通過與其跨膜受體latched(Ptc)相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)換。不存在Shh時(shí)， Ptc抑制跨膜蛋白Smo的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，因而用作Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的阻抑物，如文獻(xiàn)所述(Lai 等，2004)。gli上調(diào)代表正反饋，而ptc上調(diào)導(dǎo)致負(fù)反饋。模擬研究以下各種機(jī)制的作用 HyA Shh偶聯(lián)物的結(jié)合(親合力)；偶聯(lián)物-Ptc復(fù)合物的內(nèi)化；和HyA Shh的降解。Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的無量綱方程式如下對(duì)于可溶性Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) ββ
權(quán)利要求
1.一種下式偶聯(lián)物 χ-⑴ n-z，其中X是生物活性多肽；Y是任選的接頭部分，其中η為0或1到約10的整數(shù)；和Z是包含約50-100，000個(gè)亞基的生物相容性聚合物，其中所述生物活性多肽與所述聚合物的摩爾比為至少約5 1。
2.如權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征在于，所述聚合物是包含選自下組的多個(gè)亞基 的直鏈聚合物透明質(zhì)酸、丙烯酸、乙二醇、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酸羥乙酯、甘 露醇、麥芽糖、葡萄糖、阿拉伯糖、?；撬帷⑻鸩藟A、改性纖維素、羥乙基纖維素、乙基纖維素、 甲基纖維素、羥乙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、改性淀粉、疏水改性淀 粉、羥乙基淀粉、羥丙基淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉、氧化淀粉和它們的共聚物。
3.如權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征在于，所述生物活性多肽是受體、受體的配體、 生長(zhǎng)因子、血管新生因子、誘導(dǎo)細(xì)胞分化的多肽、抗體或抑制細(xì)胞增殖的多肽。
4.如權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征在于，所述聚合物是直鏈聚(丙烯酸)。
5.如權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征在于，所述聚合物是透明質(zhì)酸。
6.如權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征在于，所述生物活性多肽與所述聚合物的摩爾 比為約5 1至約10 1。
7.如權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征在于，所述生物活性多肽與所述聚合物的摩爾 比為約10 1至約25 1。
8.如權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征在于，所述生物活性多肽與所述聚合物的摩爾 比為約25 1至約50 1。
9.如權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征在于，所述生物活性多肽的分子量為約2kDa至 lOOkDa。
10.一種藥物組合物，其包含a)權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物；和b)藥學(xué)上可接受的賦形劑。
11.一種可植入裝置，其包含權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物。
12.如權(quán)利要求11所述的可植入裝置，其特征在于，所述可植入裝置是支架、分流器、 人造閥、導(dǎo)線、人造關(guān)節(jié)、移植物或電極。
13.一種可植入藥物遞送裝置，其包含權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物。
14.一種治療方法，其包括給予需要的個(gè)體有效量的權(quán)利要求10所述藥物組合物、權(quán) 利要求11所述可植入裝置或權(quán)利要求13所述可植入藥物遞送裝置。
全文摘要
本發(fā)明提供多肽-聚合物偶聯(lián)物。也提供主題多肽-聚合物偶聯(lián)物的各種應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/705GK102046661SQ200980120124
公開日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2009年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月28日
發(fā)明者K·E·希利, K·薩哈, S·T·沃爾 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)