專利名稱:異胡豆苷內(nèi)酰胺類衍生物及制備和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬酶化學、藥物化學和藥理學領(lǐng)域,涉及異胡豆苷內(nèi)酰胺類衍生物及制備 方法,以及該類化合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
背景技術(shù):
生物堿由于其生物活性多樣性,受到越來越多人的關(guān)注。目前,對它的研究已經(jīng)發(fā) 展到了酶水平,其中對來源于長春花和蛇根木中的異胡豆苷合成酶的研究比較透徹(Hampp N, Zenk MH, Homogenous strictosidine synthase from cellsuspension cultures of Rauvolfia serpentine. Phytochemistry, 1988,27,3811-3815),該酶是催化合成異胡豆苷 的關(guān)鍵酶,后者又是許多萜類吲哚生物堿合成途徑中的關(guān)鍵中間體。異胡豆苷合成酶可以摧化色胺與裂環(huán)馬錢子堿通過Pictet-Spengler反應(yīng)得 至丨J 異古月豆苷(Ma X, Koepke J, Panjikar S, Fritzsch G, Stockigt J, The structure ofRauvolfia serpentine strictosidine synthase is a novel six-bladed beta-propeller foldin plant proteins. The Plant Cell,2006,18,907—920),但異胡豆 苷合成酶對底物的高度選擇性限制了其催化其它色胺衍生物與裂環(huán)馬錢子堿的反應(yīng)。隨著 人們對異胡豆苷合成酶三維結(jié)構(gòu)的深入研究,提出了對異胡豆苷合成酶進行合理設(shè)計、選 擇性地突變活性中心的氨基酸得到異胡豆苷的合成酶的突變體。這些研究進展為生物堿的 分子多樣性合成提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明即利用異胡豆苷合成酶及其突變體通過固定化酶的方 法合成了異胡豆苷衍生物,并利用其作為關(guān)鍵中間體通過簡單的一步化學方法合成一類新 的異胡豆苷內(nèi)酰胺類生物堿衍生物;根據(jù)全世界尤其是中國的常發(fā)腫瘤疾病譜及腫瘤細胞 的敏感性,我們選擇了人肺癌細胞(A549),人慢性髓原細胞白血病細胞(K562)細胞株作為 體外細胞毒活性藥理評價的指標,據(jù)此完成本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種異胡豆苷內(nèi)酰胺類衍生物,以及它們的可藥用鹽,具有 以下結(jié)構(gòu)通式<formula>formula see original document page 4</formula>式⑴其中W,X,Y,Z相同或不同,選用碳或氮;R1, R2, R3, R4相同或不同,選用氫,硝基,鹵素,羥基,胺基,酰基,含1 8個碳的飽 和或不飽和烴基或烷氧基或含1 8個碳的烷胺基或酰基;當W, X,Y, Z都為碳,R1, R2, R3, R4不能都為氫;
當RnR3, R4都為氫,R2不能為羥基。其優(yōu)選的式(1)化合物是I-I (3 α ,15 β ,16 α,17 β )-12-氮雜-19,20-雙脫氫-16-乙烯基-異胡豆苷內(nèi) 酰胺-17-β-D-葡萄糖苷
1-2 (3 α,15 β,16 α,17 β)-12-甲基-19,20-雙脫氫-16-乙烯基-異胡豆苷內(nèi) 酰胺-17-β-D-葡萄糖苷1-3 (3 α ,15 β ,16 α,17 β ) _10_ 氯-19,20-雙脫氫-16-乙烯基-異胡豆苷內(nèi)酰 胺-17-β-D-葡萄糖苷
<formula>formula see original document page 5</formula>3本發(fā)明的另一個目的是提供一種式(I)化合物的制備方法由色胺衍生物及裂環(huán) 馬錢子堿通過固定化的異胡豆苷合成酶及其突變體的催化下制得異胡豆苷衍生物(化合 物II),化合物II通過堿催化制備得到式(I)化合物,無機堿選用碳酸鈉、碳酸鉀或碳酸鋰,
反應(yīng)式為
<formula>formula see original document page 5</formula>其中W,X,Y,Z和基團RnR^RyR4的定義與前述式(I)中的相同。本發(fā)明的再一目的是提供異胡豆苷內(nèi)酰胺類衍生物在制備防治肺癌和慢性髓原 細胞白血病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明式(I)化合物具有重要的生物活性,體外對人肺癌細胞(A549),人慢性髓原細胞白血病細胞(K562)的細胞毒活性試驗表明此類衍生物對腫瘤細胞生長具有抑制作 用,可制備成為新的防治肺癌和慢性髓原細胞白血病藥物。本發(fā)明的有益之處是著重對新異胡豆苷內(nèi)酰胺類衍生物進行探索,提供了快速 兩步酶化學合成具有多個手性中心多環(huán)結(jié)構(gòu)的吲哚類生物堿的方法;提供的新異胡豆苷內(nèi) 酰胺類衍生物具有重要的生物活性,體外對多株腫瘤細胞有抑制作用,可成為新的防治肺 癌和慢性髓原細胞白血病藥物。
具體實施例方式下面通過具體的實施例進一步說明本發(fā)明。下述實施例給出了代表性化合物的合 成及相關(guān)結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)。必須說明,下述實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。 根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。實施例1 (3 α,15 β,16 α,17 β )-12-氮雜-19,20-雙脫氫-16-乙烯基-異胡豆 苷內(nèi)酰胺-17-β -D-葡萄糖苷(化合物1-1)的制備
<formula>formula see original document page 6</formula>
本例涉及到一類如式(I)所示的具有細胞毒活性的新異胡豆苷內(nèi)酰胺類衍生物 的一般合成方法。具體涉及(3 α,15 β,16 α,17 β)-12-氮雜-19,20-雙脫氫-16-乙烯 基_異胡豆苷內(nèi)酰胺-17- β -D-葡萄糖苷的合成室溫將IOmg異胡豆苷合成酶溶解在磷酸緩沖液(50mM,pH = 7. 0)中,并將其固定 在Ni-NTA柱子上。取1.61g 7-氮雜色胺(lOmmol),溶解在IOOmL磷酸鹽緩沖液(50mM,pH =7. 0)中。再將3. 88g裂環(huán)馬錢子堿(IOmmol)溶于IOOmL的磷酸鹽緩沖液(50mM,pH = 7.0)中。將兩者混合物后通過M-NTA柱,所得流出液用液氮冷卻后凍干燥,經(jīng)甲醇洗滌除 鹽后,制備液相分離得到相應(yīng)的12-氮雜異胡豆苷(II);取12-氮雜異胡豆苷(20毫克,0.0376毫摩爾)溶于碳酸鈉溶液中(5%,2.0毫 升),在氮氣保護下,75°C攪拌30分鐘,反應(yīng)完成后將反應(yīng)液冷凍干燥,凍干粗品加入適量 甲醇溶解后離心,取上清液,減壓蒸餾除去溶劑,得到的粗產(chǎn)物用制備液相分離得到(3 α, 15 β,16 α,17 β )-12-氮雜-19,20-雙脫氫-16-乙烯基-異胡豆苷內(nèi)酰胺-17- β -D-葡萄 糖苷(化合物1-1)。下面用統(tǒng)一方式表述合成得到的化合物的物理及化學數(shù)據(jù)。包括核磁共振氫譜 (1H NMR,數(shù)據(jù)于700MHz核磁共振儀得到)、核磁共振碳譜(13C NMR,數(shù)據(jù)于125MHz核磁共 振儀得到)、電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS) ;NMR譜圖峰形表示為單峰(S)、雙峰(d)、寬單峰(brs)、 雙雙峰(dd)、三重峰(t)、四重峰(q);耦合常數(shù)(J)的單位用赫茲(Hz)表示;化學位移值(δ )單位用ppm表示。
<formula>formula see original document page 7</formula>12-氮雜異胡豆苷(II):白色固體;收率61.7% ;Rf (氯仿/甲醇4 1)0. 10 ; ESI-MS m/z[M+H]+532 ;1H NMR(CD3OD, 700MHz) δ 8. 19(1H, brs, H-ll) ,7. 93(1H, d, J =7. 7Hz, H-9),7· 77(1H, s, H-17),7. 11 (1H, dd, J = 7. 7,4. 9Hz, H-10),5. 83 (1H, m, H-19),5. 81 (1H, d, J = 8. 4Hz, H-21),5. 34 (1H, d, J = 16. 8Hz, H-18E),5. 26 (1H, d, J = 10. 5Hz, H-18Z),4. 67 (1H, d, J = 11. 2Hz, H-I ' ),3. 94 (1H, dd, J = 11. 9,2. IHz, H_3), 3. 78 (3H, s, 0CH3-22),3. 71(1H,dd, J = 10. 5,2. IHz, H_6 ' a), 3. 63 (1H, dd, J = 11.2, 7. OHz, H-6 ' b) ,3. 46 (1H, ddd, J = 12. 6,5. 6,4. 2Hz,H_5b),3. 21-3. 40 (5H,m,H_5a, 2',3',4',5' ),3· 10(2H,m,H-6),3· 05(1H,m,H-15),2· 73(1H,m,H-20),2· 36(1H, m, H-14a) ,2. 22 (1H, m, H-14b) ; 13C NMR (125MHz,CD3OD) : δ 171. 2 (C—22),156. 8 (C—17), 149. 8 (C-13) , 144. O (C-Il) , 135. 3 (C-19) , 131. 8 (C_2) , 128. 5 (C_9) , 120. 6 (C_8), 119. 9(C-18) ,117. 1 (C-IO),108. 9(C_16),106. 6(C_7),100. 4 (C—21),97. 3(C_1 '), 78. 7 (C-2 ' ) 78. 0 (C-3 ' ),74. 7 (C_4 ' ),71.7(C_5' ),62.9(C_6' ),51. 0 (0CH3_22), 52. 6 (C-3),45. 4 (C—20),42. 0 (C_5),34. 6 (C—14),32. 3 (C—15),19. 2 (C_6)?;衔颕-I 淡黃色固體;收率52. 4% ;Rf (氯仿/甲醇4 1)0. 53 ;ESI-MS m/ z[M+H]+500 ;1H NMR(500MHz, CD3OD) δ 8. 12 (1Η, brs, H-ll) ,7. 83 (1H, dd, J = 7· 7,1. 4Hz, H-9) ,7. 36 (1Η, s, H-19) ,7. 11(1H, dd, J = 7. 7,4. 9Hz, H-10) ,5. 64 (1H, m, CH2CH_16), 5. 39 (1H, d, J = 2. 1Hz,H-17),5. 36 (1H, dd, J = 16. 8,1. 4Hz, CH2CH-16E),5. 30 (1H, dd, J = 10. 5,2. IHz, CH2CH-16Z),5. 09 (1H, m, H_3),4. 93 (1H, dd, J = 12. 6,5. 6Hz, H_5b),4. 55 (1H, d, J = 8. 4Hz, H-I' ) ,3. 84(1H, dd, J = 11. 9,2. 8Hz, H-6' a),3. 61(1H,dd, J = 11.9, 5. 6Hz, H-6' b),3. 10-3. 29(4H,m,H-2',H_3',H_4',H_5' ),2. 90-2. 96 (2H,m,H_5a, H-15),2. 78 (1H, m, H_16),2. 66-2. 69 (2H, m, H-6),2. 54 (1H, ddd, J = 13. 3,4. 2,2. IHz, H-14a),2· 05(1H,td,J = 14. 0,6· 3Hz,H-14b) ; 13C 匪R(125MHz,CD3OD) : δ 167. 1 (C-21), 149. 6 (C-13),149. 3 (C-19), 143. 0 (C_l 1), 136. 2 (C-2), 134. 3 (CH2CH_16), 127. 8 (C_9), 121. 9(C-8),120. 6(CH2CH-16) ,116. 7 (C-IO),109. 7 (C—20),109. 1 (C_7),100. 4 (C—17), 98.0 (C-I' ), 78. 3 (C-2 ' ),78. 0 (C_3 ' ),74. 3 (C_4 ' ) ,71. 4(C-5 ' ),62. 6 (C_6 '), 54. 9 (C-3),44. 7 (C—16),44. 5 (C_5),27. 2 (C—14),25. 0 (C—15) ,21. 7 (C_6)。實施例2 化合物1-2和1-3的制備根據(jù)實施例1的方法,以7-甲基色胺和5-氯色胺為原料,經(jīng)異胡豆苷合成酶及突 變體催化,與裂環(huán)馬錢子堿耦合成為相應(yīng)的12-甲基異胡豆苷和10-氯異胡豆苷為原料,分 別經(jīng)碳酸鉀和碳酸鋰催化后制備得到化合物1-2和1-3。
化合物1-2 淡黃色固體;收率56. ;Rf (氯仿/甲醇4 1)0. 56 ;ESI-MS m/ z[M+H]+513 ;1H 匪 R (500MHz ,CD3OD) δ 7. 65 (1Η, d, J = 8. OHz, H-9), 7. 45 (1H, d, J = 8. OHz, H-11) ,7. 37 (1H, s, Η-19),7· 15 (1Η, dd, J = 8. 0,7. 2Hz, Η-10),5· 64 (1H, m, CH2CH-16), 5. 39 (1H, d, J = 2. 1Hz,H-17),5. 37 (1H, dd, J = 16. 8,1. 4Hz, CH2CH-16E),5. 32 (1H, dd, J = 10. 5,2. IHz, CH2CH-16Z), 5. 10 (1Η,m,Η_3),4. 93 (1Η, dd, J = 12. 6,5. 6Hz,H_5b),4. 56 (1H, d, J = 8. 4Hz, H-I' ),3. 85 (1H, dd, J = 11. 9,2. 8Hz, H-6' a),3. 63 (1H, dd, J = 11. 9, 5. 6Hz, H-6' b),3. 12-3. 29(4H,m,H-2',H_3',H_4',H_5' ),2. 91-2. 97 (2H,m,H_5a, H-15),2. 80 (1H, m, H-16),2. 66-2. 69 (2H, m, H_6),2. 51 (1H, ddd, J = 13. 3,4. 2,2. IHz, H-14a),2· 40(s,3H),2· 03 (1H, dt, J = 14. 0,6. 3Hz, H-14b)?;衔?-3 白色固體;收率61.7% ;Rf (氯仿/甲醇4 1)0. 51 ;ESI-MS m/ z[M+H]+533 ;1H NMR(500MHz, CD3OD) δ 7. 49 (1Η, d, J = 8. OHz, H—12),7. 38 (1H,d, J = 1. 4Hz,H-9),7. 36(lH,s,H-19),7. 29(lH,dd,J = 8. 0,1. 4Ηζ,Η_11),5· 64(lH,m,CH2CH_16), 5. 40 (1H, d, J = 2. 1Hz,H-17),5. 36 (1H, dd, J = 16. 8,1. 4Hz, CH2CH-16E),5. 31 (1H, dd, J = 10. 5,2. IHz, CH2CH-16Z),5. 09 (1H, m, H_3),4. 93 (1H, dd, J = 12. 6,5. 6Hz, H_5b),4. 55 (1H, d, J = 8. 4Hz, H-I' ) ,3. 84(1H, dd, J = 11. 9,2. 8Hz, H-6' a),3. 61(1H,dd, J = 11.9, 5. 6Hz, H-6' b),3. 11-3. 28(4H,m,H-2',H_3',H_4',H_5' ),2. 91-2. 96 (2H,m,H_5a, H-15),2. 79 (1H, m, H_20),2. 67-2. 70 (2H, m, H_6a,6b),2. 52 (1H, ddd, J = 13. 3,4. 2,2. IHz, H-14R),2· 05 (1H, td, J = 14. 0,6. 3Hz, H-14S)。為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì),下面通過藥理實施例進一步說明本發(fā)明。藥理實 施例給出了代表性化合物的部分活性數(shù)據(jù)。必須說明,下述藥理實施例是用于說明本發(fā)明 而不是對本發(fā)明的限制,根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保 護的范圍。實施例3 化合物I-I對A549細胞的細胞毒活性A549(人肺癌)細胞用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)基中含10 %的胎牛血清, 100U/毫升青霉素和100U/毫升的鏈霉素。細胞以每孔5X IO3的濃度加入到96孔板中,在 37°C含5% CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。細胞存活率的測定用改良MTT法。細胞經(jīng)過24小時的孵育后,分別將新配的化 合物I-I的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中,使孔中化合物最終濃度分別為100微 克/毫升,33. 3微克/毫升,11. 1微克/毫升和3. 7微克/毫升。72小時后,加入10微升 MTT (5毫克/毫升)的磷酸鹽緩沖液,再繼續(xù)在37°C培養(yǎng)4小時后,離心5分鐘除去未轉(zhuǎn)化 的MTT,每孔中加入200微升二甲亞砜,以溶解還原的MTT晶體甲臜(formazan),所形成的 formazan用酶標儀在570nm波長下比色,細胞存活率由樣品相對于對照品的比值計算。其中化合物I-I對A549細胞半抑制濃度IC5tl由劑量效應(yīng)曲線得到?;衔?_1的 IC50 為 11. 3μΜ。本試驗以抗腫瘤一線用藥喜樹堿(CPT)作為陽性對照,CPT對人肺癌Α549細胞的半抑制濃度IC5tl為0. IluM0本試驗表明此類新異胡豆苷內(nèi)酰胺類衍生物對人肺癌Α549細胞具有較強的細胞毒性,有可能發(fā)展成為新的具有抗肺癌作用的藥物。實施例4 化合物1-2對人慢性髓原細胞白血病細胞(Κ562)的細胞毒活性
人慢性髓原細胞白血病細胞(K562)用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)基中含10%小牛血清,100U/毫升青霉素和100U/毫升鏈霉素。細胞以每孔1 X IO4個密度接種到96孔板 中,在37°C,5% CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。細胞存活率的測定方法用改良MTT法。細胞經(jīng)24小時的孵育后,分別將新配的化 合物1-2的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中,使孔中化合物的最終濃度分別為100 微克/毫升、50微克/毫升、25微克/毫升、5微克/毫升。72小時后,加入10微升MTT (5 毫克/毫升)的生理鹽水溶液,再繼續(xù)在37°C,5% CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時,每 孔中加入150毫升二甲亞砜,振蕩溶解生成的MTT晶體甲臜(formazan),所形成的甲臜用酶 標儀在570nm波長下比色,細胞存活率由樣品OD值對于對照OD值的比值計算。其中化合 物1-2對K562細胞的半數(shù)抑制濃度(IC5tl)由劑量效應(yīng)曲線得到。細胞存活率的測定用改良MTT法,具體方法同實施例4。對人慢性髓原細胞白血病K562細胞半抑制濃度IC5tl由劑量效應(yīng)曲線得到?;?物 1-2 的 IC50 為42. 1 μ M0本試驗以抗腫瘤一線用藥喜樹堿(CPT)作為陽性對照,CPT對人慢性髓原細胞白 血病細胞的半抑制濃度IC5tl為0. 6 μ Μ。本實驗表明此類新異胡豆苷內(nèi)酰胺類衍生物對人慢性髓原細胞白血病癌細胞 Κ562細胞具有細胞毒性,有可能發(fā)展成為新的具有抗慢性髓原細胞白血病作用的藥物。
權(quán)利要求
一種異胡豆苷內(nèi)酰胺類衍生物及其可藥用的鹽,具有以下結(jié)構(gòu)通式其中W,X,Y,Z相同或不同,選用碳或氮;R1,R2,R3,R4相同或不同,選用氫,硝基,鹵素,羥基,胺基,?;?~8個碳的飽和或不飽和烴基或烷氧基或含1~8個碳的烷胺基或?;划擶,X,Y,Z都為碳,R1,R2,R3,R4不能都為氫;當R1,R3,R4都為氫,R2不能為羥基。FSA00000081959400011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種異胡豆苷內(nèi)酰胺類衍生物及其可藥用的鹽,其特征在 于,所述化合物為I-I :(3α,15β,16α,17β)-12_氮雜-19,20-雙脫氫-16-乙烯基-異胡豆苷內(nèi)酰 胺-17-β-D-葡萄糖苷1-2 :(3α,15β,16α,17β)-12-甲基-19,20-雙脫氫-16-乙烯基-異胡豆苷內(nèi)酰 胺-17-β-D-葡萄糖苷1-3 (3 α,15β,16α,17β)-10_氯-19,20-雙脫氫-16-乙烯基-異胡豆苷內(nèi)酰 胺-17-β-D-葡萄糖苷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種異胡豆苷內(nèi)酰胺類衍生物及其可藥用的鹽的制備方法, 其特征在于,通過以下方案實現(xiàn)將色胺衍生物及裂環(huán)馬錢子堿通過固定化的異胡豆苷合 成酶及其突變體的催化下制得異胡豆苷衍生物式(II)化合物,式(II)化合物通過堿催化 制備得到式(I)化合物,無機堿選用碳酸鈉、碳酸鉀或碳酸鋰,反應(yīng)式為<image>image see original document page 2</image>其中:ff, X,Y,Z和基團R1, R2, R3, R4的定義與權(quán)利要求1中的相同。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種異胡豆苷內(nèi)酰胺類衍生物及其可藥用的鹽在制備防治 肺癌和慢性髓原細胞白血病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新異胡豆苷內(nèi)酰胺類衍生物以及它們的可藥用鹽,具有以下結(jié)構(gòu)通式。本發(fā)明還提供了制備方法,通過色胺衍生物與裂環(huán)馬錢子堿在固定化的異胡豆苷合成酶及其突變體催化新方法下制得新異胡豆苷衍生物,再經(jīng)堿催化一步合成該類衍生物。本發(fā)明提供的化合物體外細胞毒活性試驗表明,該類衍生物對腫瘤細胞生長具有制作用,可在制備防治腫瘤疾病藥物中進行應(yīng)用。
文檔編號C07H17/00GK101805383SQ20101014370
公開日2010年8月18日 申請日期2010年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月9日
發(fā)明者俞永平, 祝華建, 約阿施·史托克希特, 鄒宏斌 申請人:浙江大學