專利名稱：一種提取殘留阿維菌素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從抗生素廢液中提取殘留的有生物活性的抗生素組份的 方法，尤其涉及一種從阿維菌素的結(jié)晶母液中分離提取有效組份B1和相關(guān)的生物活性組 份的方法。
背景技術(shù)：
阿維菌素，英文名稱Avermectins，是由日本北里大學(xué)大村智等和美國Merck公司 首先開發(fā)的一類具有殺蟲、殺螨、殺線蟲活性的十六元大環(huán)內(nèi)酯化合物。阿維菌素自80年 代初問世以來已廣泛應(yīng)用于動物寄生蟲病防治和農(nóng)作物害蟲的防治。阿維菌素共包括8個組分Ala、Alb、A2a、A2b、Bla、Bib、B2a、B2b,主要有4種即 Ala、A2a、Bla和B2a，其中avermectinBla的生物活性最強。阿維菌素的生產(chǎn)工藝過程如下用經(jīng)優(yōu)選的高產(chǎn)斜面菌種制備液體菌種，然后發(fā) 酵培養(yǎng)260小時左右，發(fā)酵結(jié)束，將發(fā)酵液經(jīng)板框壓濾，棄濾液，得菌絲體濾餅經(jīng)干燥后用 甲醇提取，之后脫溶劑并轉(zhuǎn)相脫水溶性和部分醇溶性雜質(zhì)，然后加入適量的甲醇或乙醇進 行結(jié)晶，即可獲得阿維菌素結(jié)晶(B1組份)和結(jié)晶母液。在結(jié)晶母液中殘留有阿維菌素(B1)和阿維菌素的同系物A1、A2、B2組份，母液中 還含有8 18個碳的脂肪酸及其與甘油形成的酯類物質(zhì)，以上組份在脫凈溶劑后的母液中 所占的百分比組成為B1組份占5%左右；B2 + A2 + A1占40%左右；酯類雜質(zhì)占50%左右。 B1組份是現(xiàn)階段廣泛應(yīng)用于動、植物以防治害蟲和寄生蟲的組份，A1、A2、B2組份同樣具有 殺蟲活性，是有待于開發(fā)的組份。其中B2a組份是一種殺植物地下線蟲活性較高的組份之 一。然而，從母液中進一步采用結(jié)晶的方法直接分離其中殘留的活性組份，幾乎是不可能， 這是因為大量的酯類雜質(zhì)的存在和A組份不易結(jié)晶所致。我國自1993年開始生產(chǎn)阿維菌素至今年產(chǎn)量已達2000噸左右，但是在結(jié)晶母液 中殘留有15%左右的阿維菌素(占總量的百分比)由于提取不出來而被棄之或非法出售，尚 有阿維菌素B2a、A2a、Ala等活性成份均殘留在母液中而未被合理應(yīng)用，造成環(huán)境污染和資 源浪費。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對目前阿維菌素結(jié)晶母液活性成分難以提取的問題，提供一種 提取殘留阿維菌素的方法，它通過柱層析法在適當(dāng)?shù)臏囟葔毫刂葡?，使有效組分結(jié)晶收 率達90%以上，從而滿足了產(chǎn)業(yè)部門的需要，解決了人們長期渴望解決而未能獲得成功的 技術(shù)難題。本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的 一種提取殘留阿維菌素的方法，包括以下步驟
a、將結(jié)晶母液蒸餾脫除溶劑，獲得脫溶劑后的第一油狀液；
b、采用硅膠柱層析方法進一步分離第一油狀液柱層析用的固定相為硅膠，流動相為
3體積比為2/1的乙酸乙酯/石油醚，在柱溫50°C 60°C、柱壓大于0. 5MPa的條件下進行洗 脫，最先流出的組份為酯溶性雜質(zhì)；在酯溶性雜質(zhì)流出后改換單一溶劑乙酸乙酯為流動相， 將阿維菌Bl、Al、B2、A2四組份從柱子中洗脫出來，然后將洗脫液蒸餾脫除乙酸乙酯，獲得 含B1、A1、B2、A2四組份的第二油狀液；
c、采用碳十八烷基硅烷柱層析方法拆分所述第二油狀液中的Bl、Al、B2、A2四組份 柱層析用的固定相為C18，流動相為體積比為(81 90)/(10 19)的甲醇/水，在柱溫 50°C 60°C、柱壓大于0. 5MPa的條件下洗脫，最先流出的組份為酯溶性雜質(zhì)，其后依次為 B2a、A2a、Blb、Bla、Ala，分別回收含B2a、Blb和Bla的洗脫液，最后減壓蒸餾脫除溶劑獲得 Bl￡t、Blb、B2￡u優(yōu)選地，所述甲醇/水流動相的體積比為85/17。本發(fā)明還提供了一種提取殘留阿維菌素的方法，包括以下步驟
a、將結(jié)晶母液蒸餾脫除溶劑，獲得脫溶劑后的第一油狀液；
b、采用硅膠柱層析方法進一步分離第一油狀液柱層析用的固定相為硅膠，流動相為 體積比為2/1的乙酸乙酯/石油醚，在柱溫50°C 60°C、柱壓大于0. 5MPa的條件下進行洗 脫，最先流出的組份為酯溶性雜質(zhì)；在酯溶性雜質(zhì)流出后改換單一溶劑乙酸乙酯為流動相， 將阿維菌Bl、Al、B2、A2四組份從柱子中洗脫出來，然后將洗脫液蒸餾脫除乙酸乙酯，獲得 含B1、A1、B2、A2四組份的第二油狀液；
c、采用硅膠柱層析方法拆分所述第二油狀液中的B1、A1、B2、A2四組份柱層析用的固 定相為硅膠，流動相為體積比為9/9/2/1的乙酸乙酯/三氯甲烷/ 二氯甲烷/甲醇，柱溫為 50°C 60°C，柱壓維持在0. 5MPa 3MPa，最先流出的組份為含A組份的洗脫液，其后為含 B組份的洗脫液，然后將含B組份的洗脫液用蒸餾法脫除溶劑后，用乙醇或甲醇在60°C 70°C回流溶解，最后在攪拌條件下降溫至5°C 30°C，析出Bla?，F(xiàn)代高效液相色譜中，分離效果好壞很大程度上取決于色譜填料的選擇。層析法 利用不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配，以流動相對固定相中的混合物進行洗脫，混合物 中不同的物質(zhì)會以不同的速度沿固定相移動，最終達到分離的效果。本發(fā)明選擇價廉、安 全、環(huán)保的流動相，配合固定相，在適當(dāng)?shù)臏囟群蛪毫ο?，依?jù)柱層析原理有效地從阿維菌 素的結(jié)晶母液中分離提取出B1、A1、B2、A2組分。本發(fā)明提供的提取殘留阿維菌素的方法，在上述步驟b后，有兩種可供選擇的步 驟即C1或C2可以分離出各組分。步驟C1:
固定相十八烷基硅烷(C18)；
流動相甲醇/水=(81 90)/(10 19)；
在50 60°C，大于5公斤壓力條件下進行洗脫，采用紫外檢測儀進行在線監(jiān)測。其流 出組份先后順序為B2a、A2a、Blb、Bla、Ala，分步將上述組份回收；回收液減壓蒸餾除去部 分甲醇后，活性組份即可析出。就Bla而言，濃縮到Bla濃度為5% 6%時，于15°C左右即 可析出。步驟C2:
固定相仍為硅膠，流動相為體積比為9/9/2/1的乙酸乙酯/三氯甲烷/ 二氯甲烷/甲 醇，在50°C 60°C、大于5公斤壓力下進行柱層析，可將A (41+々2)與8 (Bl + B2)拆分
4開，即先流出柱的組份為Ala與A2a混合物，之后流出的組份為Bla與B2a的混合物。后者 經(jīng)脫溶劑后，用乙醇或甲醇在在60°C 70°C回流溶解，然后降到5°C 30°C進行結(jié)晶，Bla 可大部分結(jié)晶出來，結(jié)晶收率達理論收率的90%左右。由于Ala、A2a、Bla和B2a的結(jié)構(gòu)非常近似，分離上述四種物質(zhì)較為困難，常規(guī)柱層 析提取物質(zhì)成分的收率一般在理論收率的80%左右，而本發(fā)明提供的提取殘留阿維菌素的 方法收率可達90%以上，具有顯著的進步，且操作簡單，成本低。綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果
1、解決了現(xiàn)有技術(shù)阿維菌素結(jié)晶母液活性成分難以提取的問題，為今后從阿維菌素廢 液中有效分離提取活性組分開辟了方向；
2、分離提取工藝簡單；
3、選用的溶劑價廉、安全、環(huán)保，符合產(chǎn)業(yè)化需求；
4、結(jié)晶收率高，濃縮后析出的有效組分收率達理論產(chǎn)量的90%左右。
具體實施例方式實施例一
(1)取阿維菌素結(jié)晶母液14公斤，于70°C、真空度為0.08MPa條件下除凈溶劑，得第一 油狀液10公斤。經(jīng)高效液相色譜法HPLC分析，該油狀液含Bla5. 5%、B2al6. 7%、A2al4. 2%、 Alall. 1% ；
(2)向第一油狀液中加入10升乙酸乙酯和5升石油醚作流動相，60°C回流溶解備用；
(3)將硅膠柱用流動相洗脫平衡后，使液面降至床體面?zhèn)溆茫?br> (4)上樣，將用流動相溶解后的第一油狀液緩慢的加入到層析柱床體表面上，之后加壓 并打開下部洗脫液流出口，使樣液完全進入床體后，關(guān)閉下部洗脫液流出口，向床體上面緩 慢加滿流動相，并與貯有流動相的貯罐密封連接；打開下流出口，常壓洗脫約30分鐘后逐 漸加壓到0. 5Mpa、在50°C條件下洗脫，當(dāng)檢測出油酯類雜質(zhì)完全流出后，換用乙酸乙酯為 流動相于60°C、1. 5MPa條件下繼續(xù)洗脫，將Ala、A2a、Bla、B2a完全洗脫出來，回收洗脫液， 減壓蒸餾回收溶劑，得含Ala、A2a、Bla、B2a四組份的第二油狀物；
(5)采用碳十八烷基硅烷柱層析方法拆分所述第二油狀液中的B1、A1、B2、A2四組份 具體操作如下①將第二油狀液用甲醇溶解，緩慢加入到十八烷基硅烷柱床表面；②
打開下出口，使完全進入床體后，在50°C、0. 5Mpa下開始用甲醇/水流動相進行洗脫先用 比例為90/10的甲醇/水洗脫10分鐘，之后用比例為88/12的甲醇/水洗脫20分鐘，之后 用比例為85/15的甲醇/水進行洗脫15分鐘，采用可自動進行波長掃描的紫外檢測儀在線 檢測，最先流出的組份為少量的雜質(zhì)，之后依次流出B2a、A2a、Bib、Bla、Ala等組份；③分 別回收含各組份的洗脫液，將回收的洗脫液分別蒸餾除甲醇溶劑，即可獲得B2a、A2a、Bib、 Bla、Ala各組份，Bla收率為95. 6%,純度達80% ；B2a收率為94. 7%,純度達80%。實施例二
(1)取阿維菌素結(jié)晶母液14公斤，于70°C、真空度為0.08MPa條件下除凈溶劑，得第一 油狀液10公斤。經(jīng)高效液相色譜法HPLC分析，該油狀液含Bla5. 5%、B2al6. 7%、A2al4. 2%、 Alall. 1% ；
(2)向第一油狀液中加入14升乙酸乙酯和7升石油醚作流動相，50°C回流溶解備用；
5(3)將硅膠柱用流動相洗脫平衡后，使液面降至床體面?zhèn)溆茫?br> (4)上樣，將用流動相溶解后的第一油狀液緩慢的加入到層析柱床體表面上，之后加壓 并打開下部洗脫液流出口，使樣液完全進入床體后，關(guān)閉下部洗脫液流出口，向床體上面緩 慢加滿流動相，并與貯有流動相的貯罐密封連接；打開下流出口，常壓洗脫約30分鐘后逐 漸加壓到1. 5MPa，在60°C條件下洗脫，當(dāng)檢測出油酯類雜質(zhì)完全流出后，換用乙酸乙酯為 流動相于60°C、2MPa條件下繼續(xù)洗脫，將Ala、A2a、Bla、B2a完全洗脫出來，回收洗脫液，減 壓蒸餾回收溶劑，得含Ala、A2a、Bla、B2a四組份的油狀物；
(5)采用碳十八烷基硅烷柱層析方法拆分所述第二油狀液中的B1、A1、B2、A2四組份 具體操作如下①將第二油狀液用甲醇溶解，緩慢加入到十八烷基硅烷柱床表面；②
打開下出口，使樣品液完全進入床體后，在60°C、3Mpa下開始用體積比為85//17的甲醇/ 水流動相洗脫30分鐘，采用可自動進行波長掃描的紫外檢測儀在線檢測，最先流出的組份 為少量的雜質(zhì)，之后依次流出B2a、A2a、Blb、Bla、Ala等組份；③分別回收含各組份的洗脫 液將回收的洗脫液分別蒸餾除溶劑，即可獲得B2a、A2a、Bib、Bla、Ala各組份，Bla收率為 94%,純度達92% ；B2a收率為95%，純度達92%。實施例三
(1)取實施例1中第(4)步獲得的含Ala、A2a、Bib、Bla、B2a四組份的油狀物，用體積 比為2/1的乙酸乙酯/甲醇溶解，得樣液；
(2)將硅膠柱用流動相平衡好后，將上述樣液加入到平衡好的硅膠柱床表面，之后打開 下出口，待樣液完全進入柱床中后用流動相開始洗脫，柱溫為60°C、柱壓為3MPa，流動相為 體積比為9/9/2/1的乙酸乙酯/三氯甲烷/ 二氯甲烷/甲醇；用紫外檢測儀在線檢測，先 流出的組份為A組份(Ala + A2a)，之后為B組份(Bla + B2a)，分別回收，將含B組份的洗 脫液減壓蒸餾除凈溶劑，之后加入乙醇于70°C回流溶解，然后在攪拌條件下降溫到30°C左 右，過夜，Bla + B2a即可結(jié)晶析出，Bla + Bib收率可達90%左右，純度達90%(Bla + Bib)。實施例四
(1)取實施例2中第(4)步獲得的含Ala、A2a、Bib、Bla、B2a四組份的油狀物，用乙酸 乙酯溶解，得樣液；
(2)將硅膠柱用流動相平衡好后，將上述(1)中的樣液加入到平衡好的硅膠柱床表 面，之后打開下出口，待樣液完全進入柱床中后用流動相開始洗脫，柱溫為50°C、柱壓為 0. 5MPa，流動相為體積比為9/9/2/1的乙酸乙酯/三氯甲烷/ 二氯甲烷/甲醇；用紫外檢測 儀在線檢測，先流出的組份為A組份(Ala + A2a),之后為B組份(Bla + B2a),分別回收， 將含B組份的洗脫液減壓蒸餾除凈溶劑，之后加入甲醇于60°C回流溶解，然后在攪拌條件 下降溫到5°C左右，過夜，Bla + B2a即可結(jié)晶析出，Bla + B2a收率可達91%，純度達85% (Bla + B2a)。
權(quán)利要求
一種提取殘留阿維菌素的方法，包括以下步驟a、將結(jié)晶母液蒸餾脫除溶劑，獲得脫溶劑后的第一油狀液；b、采用硅膠柱層析方法進一步分離第一油狀液柱層析用的固定相為硅膠，流動相為體積比為2/1的乙酸乙酯/石油醚，在柱溫50℃～60℃、柱壓大于0.5MPa的條件下進行洗脫，最先流出的組份為酯溶性雜質(zhì)； 在酯溶性雜質(zhì)流出后改換單一溶劑乙酸乙酯為流動相，將阿維菌B1、A1、B2、A2四組份從柱子中洗脫出來，然后將洗脫液蒸餾脫除乙酸乙酯，獲得含B1、A1、B2、A2四組份的第二油狀液；c、采用碳十八烷基硅烷柱層析方法拆分所述第二油狀液中的B1、A1、B2、A2四組份柱層析用的固定相為C18，流動相為體積比為(81～90)/(10～19)的甲醇/水，在柱溫50℃～60℃、柱壓大于0.5MPa的條件下洗脫，最先流出的組份為酯溶性雜質(zhì)，其后依次為B2a、A2a、B1b、B1a、A1a，分別回收含B2a、B1b和B1a的洗脫液，最后減壓蒸餾脫除溶劑后獲得B1a、B1b、B2a。
2.一種如權(quán)利要求1所述的提取殘留阿維菌素的方法，其特征在于所述甲醇/水流動 相體積比為85/17。
3.一種提取殘留阿維菌素的方法，包括以下步驟a、將結(jié)晶母液蒸餾脫除溶劑，獲得脫溶劑后的第一油狀液；b、采用硅膠柱層析方法進一步分離第一油狀液柱層析用的固定相為硅膠，流動相為 體積比為2/1的乙酸乙酯/石油醚，在柱溫50°C 60°C、柱壓大于0. 5MPa的條件下進行洗 脫，最先流出的組份為酯溶性雜質(zhì)；在酯溶性雜質(zhì)流出后改換單一溶劑乙酸乙酯為流動相， 將阿維菌Bi、Al、B2、A2四組份從柱子中洗脫出來，然后將洗脫液蒸餾脫除乙酸乙酯，獲得 含B1、A1、B2、A2四組份的第二油狀液；C、采用硅膠柱層析方法拆分所述第二油狀液中的B1、A1、B2、A2四組份柱層析用的固 定相為硅膠，流動相為體積比為9/9/2/1的乙酸乙酯/三氯甲烷/ 二氯甲烷/甲醇，柱溫為 500C 60°C，柱壓維持在0. 5 3MPa，最先流出的組份為含A組份的洗脫液，其后為含B組 份的洗脫液，然后將含B組份的洗脫液用蒸餾法脫除溶劑后，用乙醇或甲醇在60°C 70°C 回流溶解，最后在攪拌條件下降溫至5°C 30°C，析出Bla。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從結(jié)晶母液中提取殘留阿維菌素的方法，包括酯類雜質(zhì)去除和利用C18柱或硅膠柱進一步分離各組份。本分離提取工藝簡單，選用的溶劑價廉、安全、環(huán)保，符合產(chǎn)業(yè)化需求，有效成分B1收率高，達90%左右。
文檔編號C07H17/08GK101838300SQ20101019202
公開日2010年9月22日 申請日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者儲消和, 吳雪萍, 沈德堂, 潘貞德 申請人:浙江升華拜克生物股份有限公司