專利名稱：梯度稀釋補料酶膜耦合反應及用于魚鱗膠原蛋白多肽制備的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種梯度稀釋補料酶膜耦合反應的方法及用于魚鱗膠原蛋白抗氧化 多肽的制備，屬于生物技術領域。
背景技術：
目前生物大分子物質的酶解反應與分離操作廣泛采用間歇式的方法，即在普通的 反應器中進行分批酶解反應，當反應結束后，通過加熱或者調節(jié)溶液PH值使蛋白酶變性失 活，再經(jīng)過離心、膜分離等操作，制得目標產品。這種傳統(tǒng)工藝存在如下問題酶解產物無 法從反應體系中分離出去，容易造成產物對反應過程的抑制效應，導致反應速度下降；產物 不及時分離出去，還會引起產物過度降解，導致其活性下降；隨著底物的消耗，反應后期出 現(xiàn)底物不足現(xiàn)象，產生酶催化活性過剩的問題；一個批次反應完后滅酶，進入下一批次的反 應，酶無法反復使用，引起生產成本升高。而近年大量的研究證明，酶解-膜分離耦合技術可以克服傳統(tǒng)酶解技術存在的酶 利用率低、反應后期底物不足、產物對反應的抑制效應和產物過度降解等缺陷，顯著提高酶 解反應效率和產物的活性?，F(xiàn)有的酶解-膜分離耦合技術制備多肽，主要是在不補料或者 在等濃度補料的情況下進行酶解和膜分離耦合反應。不補料酶解和膜分離耦合反應指配置 一定底物濃度的原料溶液，裝入反應器，調節(jié)反應液PH和反應溫度，然后加入蛋白酶，再在 恒速循環(huán)下進行連續(xù)酶解_膜分離耦合反應，收集透過液即得多肽溶液。不補料酶解和膜 分離耦合反應克服了產物對反應的抑制效應和產物過度降解的不足，但沒有解決酶利用率 低和反應后期底物不足的問題。等濃度補料酶解和膜分離耦合反應指隨著酶解的進行，不 斷補充一個恒定濃度的底物溶液進入反應器，這種方法解決了酶利用率低和反應后期底物 不足的問題，但存在的不足是隨著反應的進行，反應器中沉積的殘渣愈來愈多，濃度也愈 來愈大，因為水分不足，反應效率受到影響；靠近反應結束前一段時間補充進去的底物，由 于時間不足引起反應不完全。在酶解-膜分離耦合反應或者膜生物反應器應用于其它生物反應中也存在類似 問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為了克服上述現(xiàn)有技術中的不足，公開一種了新型的連續(xù)補料酶 膜耦合反應的技術方法，即梯度稀釋補料酶膜耦合反應的技術方法。梯度稀釋補料酶膜耦合反應的補料方式為將底物經(jīng)過梯度稀釋后，隨著反應的進 行，由高濃度到低濃度依次補充加入酶解反應器內。該方式吸取了先補料后補水的優(yōu)點，顯 著提高了反應效率，是一種新型的酶解-膜分離耦合反應方法。本發(fā)明所述的梯度稀釋補料酶解_膜分離耦合反應的方法，按照下述步驟進行 將底物以初始濃度，加入酶解反應器內，調節(jié)PH值和溫度至設定的值；啟動反應器與超濾 膜分離設備之間的循環(huán)泵，底物在系統(tǒng)內循環(huán)至一定時間后，停止循環(huán)，此時超濾裝置和管
3道均充滿料液；再向反應器內補充底物至初始體積，按照酶與底物的比例加入蛋白酶；啟 動循環(huán)泵，開始進行酶解反應；一定時間后開啟膜分離透過液放出閥，同時開啟底物溶液補 充閥；隨著反應的進行，將底物溶液經(jīng)過梯度稀釋后，按照濃度由高到低的順序依次補充加 入酶解反應器內，補充的速度與透過液放出的速度相等，保持反應器液位基本不變；反應過 程中保持酶解反應溫度、反應液PH值。本發(fā)明所述的梯度稀釋補料酶解-膜分離耦合反應用于魚鱗膠原蛋白抗氧化 多肽制備時，所用蛋白酶為Alcalase，酶解反應的底物濃度以質量計為1_4%，加酶量以 質量計為1_4%，酶解溫度為45-60°C，pH為8-10 ；隨著反應的進行，將底物溶液按照每 10-20min濃度降低0. 的速度進行梯度稀釋后，按照濃度由高到低的順序依次補充加 入酶解反應器內；所述的超濾膜分離裝置采用截留分子量為3kDa的膜組件。本發(fā)明應用梯度稀釋補料酶解_膜分離耦合反應制備多肽的方法制備生物活性 肽，克服傳統(tǒng)酶解技術以及傳統(tǒng)酶解_膜分離耦合反應技術存在的不足，顯著提高了酶解 反應效率、降低了酶的消耗量、增加了產品產率、提高了系統(tǒng)產能。


圖1本發(fā)明所述的梯度稀釋濃度添加圖，魚鱗膠原蛋白原始濃度為，按照 0. 5%為一個段進行濃度設定，即每20min濃度降低0. 5w%，其中前IOmin是梯度稀釋中的 始濃度在超濾系統(tǒng)中底物循環(huán)的時間；圖2為酶解產物的DPPH自由基的清除率與纖維素平板膜的截留分子量的關系圖。
具體實施例方式下面以魚鱗膠原蛋白抗氧化肽的制備為例，介紹本發(fā)明應用梯度稀釋補料酶 解-膜分離耦合反應制備魚鱗膠原蛋白抗氧化肽的方法。本發(fā)明中所述的原料魚鱗膠原蛋 白，市售產品；蛋白酶Alcalase 2.4L，諾維信(中國)生物技術有限公司，其中所述的底物 濃度和加酶量均為質量比。(1)本發(fā)明中通過測定魚鱗膠原蛋白轉化率來衡量本發(fā)明制備方法的技術效果， 其中蛋白含量的測定采用凱氏定氮法(GB/T5009. 3-2003)。蛋白轉化率以膜過濾透過液中蛋白質含量占原料液中蛋白質含量百分比計算Χ=·^^-χ100%
C0 X K0式中χ-蛋白轉化率，原料液蛋白含量，mg/mL Λ-原料液總體積，mL K1-透 過液蛋白含量，mg/mL ;Vr透過液總體積，mL。(2)本發(fā)明中通過測定酶解產物對DPPH自由基的清除率評價酶解產物的抗氧化 活性。酶解產物滅酶后稀釋到統(tǒng)一濃度，測定DPPH自由基的清除率。測定方法將酶解上清液稀釋成不同的濃度梯度，分別取2mL不同濃度的酶解 上清液于試管中，加入2mL濃度為0. 04mg/ml的DPPH溶液，混合均勻，反應20min后，于 3500rpm離心lOmin，取上清液在517nm處測其吸光值為Ai ；另各取2mL上述濃度上清液溶 液于試管中，分別加入無水乙醇2mL，反應20min后，于3500rpm離心分離lOmin，取上清液 在517nm處測其吸光值記為Aj ；以2mL 0. 04mg/mL DPPH和2mL無水乙醇反應做為參比，其吸光值記為Atl。E(DPPH) = [I-(Ai-Aj) /A0] X 100%式中E(dpph)-酶解上清液對DPPH自由基的清除率(％ )；A0-2mL DPPH溶液加入2mL無水乙醇的吸光值；Ai-2mL DPPH溶液加入2mL酶解上清夜的吸光值；Ar2mL無水乙醇加入2mL酶解上清液的吸光值。EC5tl的計算=EC5tl是酶解產物的DPPH清除率達到50%時的濃度。首先把樣品稀釋 成一系列濃度，測定各濃度樣品對DPPH的清除率，繪制清除率和濃度的關系曲線，在曲線 上查出樣品的EC5tl值。(3)超濾膜截留分子量的確定本發(fā)明中首先通過測定酶解產物的DPPH自由基的 清除率確定超濾膜的截留分子量，試驗按照下述步驟進行，底物濃度為2%的魚鱗膠原蛋白 溶液一調節(jié)反應液溫度至50°C，反應液pH至8. 5 —超濾泵的轉速120r/min，循環(huán)5min — 加入占底物0.5%的蛋白酶Alcalase—酶解40min—采用不同截留分子量的膜組件進行超 濾一收集透過液一測定產物對DPPH的清除率并計算EC5tl值。結果如圖2所示，綜合考慮酶 解產物對DPPH的清除率以及EC5tl值，本發(fā)明中優(yōu)選截留分子量為3kDa的超濾膜對酶解后 的產物進行超濾。(4)超濾得到的肽液濃度的測定方法采用陳俊輝，陶力，李俊等.生物化學實驗 [M],北京，科學出版社，2004 :244-249.所介紹的Folin-酚法。(5)多肽得率)以最終得到的目 標粗肽制品質量與投入的魚鱗膠原蛋 白質量的百分比計算。(6)單位酶產肽量Q(g肽^酶―1)定義為單位質量蛋白酶產生目標粗肽制品的質 量，以粗肽制品的質量與蛋白酶的質量比計算。單位酶產肽量是在考慮酶用量因素下表征 產物生成量的一個指標。對照例不補料連續(xù)酶膜耦合反應的最優(yōu)工藝條件底物濃度4%，加酶量1. 5%，酶解溫 度60°C，pH 9. 0，酶解時間30min，循環(huán)泵轉速120r ^irT1t5本對照例反應器中加入反應液 的量為400mL。進行酶解并收集透過液，計算其酶解參數(shù)，結果如表1所示。表1不補料酶膜耦合最優(yōu)條件下主要效果參數(shù)
蛋白轉化率Χ/% 多肽得率Υ/% 單位酶產肽量Q/g肽酶)ECso/mg mL1______________________________________________________________
97.7050.56142.6714.84實施例1本發(fā)明的梯度稀釋補料酶解_膜分離耦合反應用于魚鱗膠原蛋白抗氧化多肽制 備中的酶解工藝為底物濃度4%，加酶量1.5%，酶解溫度60°C，pH 9.0 ；所用蛋白酶為 Alcalase 2. 4L。酶解開始之前底物在系統(tǒng)內循環(huán)時間為5min ；初始酶解IOmin后，開啟膜 分離透過液放出閥，同時開啟底物溶液補充閥。將底物溶液按照每20min濃度降低0. 5w% 的速度進行梯度稀釋后，按照濃度由高到低的順序依次補充加入酶解反應器內，梯度稀釋 濃度添加圖見說明書附圖1。超濾膜分離裝置采用截留分子量為3kDa的膜組件。酶解時間
5180min，共消耗濃度為4%的底物蛋白液4000mL。按照上述梯度稀釋補料酶解_膜分離耦合工藝條件進行酶解并收集透過液，計算 其酶解參數(shù)，結果如表2所示。表2梯度稀釋補料連續(xù)酶解反應的酶解參數(shù)
蛋白轉化率Χ/% 多肽得率Υ/% 單位酶產肽量Q/g肽‘(g Ily1 ECso/mg mL權利要求
梯度稀釋補料酶膜耦合反應，其特征在于梯度稀釋補料酶膜耦合反應方法按照下述步驟進行將底物以初始濃度加入酶解反應器內，調節(jié)pH值和溫度至設定的值；啟動反應器與超濾膜分離設備之間的循環(huán)泵，底物在系統(tǒng)內循環(huán)至一定時間后，停止循環(huán)，此時超濾裝置和管道均充滿料液；再向反應器內補充底物至初始體積，按照酶與底物的比例加入蛋白酶；啟動循環(huán)泵，開始進行酶解反應；一定時間后開啟膜分離透過液放出閥，同時開啟底物溶液補充閥；隨著反應的進行，將底物溶液經(jīng)過梯度稀釋后，按照濃度由高到低的順序依次補充加入酶解反應器內。
2.權利要求1所述梯度稀釋補料酶膜耦合反應用于魚鱗膠原蛋白抗氧化多肽制備，其 特征在于所用蛋白酶為Alcalase ；酶解反應的底物濃度以質量計為1_4%，加酶量以質量 計為1_4%，酶解溫度為45-60°C，pH為8-10;超濾裝置中采用截留分子量為3kDa的超濾 膜；酶解開始之前底物在系統(tǒng)內循環(huán)時間為5min ；初始酶解IOmin后，開啟膜分離透過液放 出閥，同時開啟底物溶液補充閥。
3.根據(jù)權利要求2所述梯度稀釋補料酶膜耦合反應用于魚鱗膠原蛋白抗氧化多肽制 備，其特征在于其中所述的梯度稀釋是指將底物溶液按照每10-20min濃度降低0. 5 %的 速度進行稀釋，其后按照濃度由高到低的順序依次補充加入酶解反應器內。
全文摘要
本發(fā)明梯度稀釋補料酶膜耦合反應及用于魚鱗膠原蛋白多肽制備，按照下述步驟進行將底物以初始濃度加入酶解反應器內，調節(jié)pH值和溫度至設定的值；啟動反應器與超濾膜分離設備之間的循環(huán)泵，底物在系統(tǒng)內循環(huán)至一定時間后，停止循環(huán)；再向反應器內補充底物至初始體積，按照酶與底物的比例加入蛋白酶；啟動循環(huán)泵，開始進行酶解反應；一定時間后開啟膜分離透過液放出閥，同時開啟底物溶液補充閥；隨著反應的進行，將底物溶液經(jīng)過梯度稀釋后，按照濃度由高到低的順序依次補充加入酶解反應器內。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)酶解技術以及傳統(tǒng)酶解-膜分離耦合反應技術存在的不足，顯著提高了酶解反應效率、降低了酶的消耗量、增加了產品產率、提高了系統(tǒng)產能。
文檔編號C07K1/34GK101948894SQ20101025329
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月13日 優(yōu)先權日2010年8月13日
發(fā)明者任曉鋒, 何榮海, 王中斌, 馬海樂, 駱琳 申請人:江蘇大學