專利名稱：一種利用串聯(lián)固相萃取小柱分離純化微囊藻毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二種微囊藻毒素分離純化的方法，屬于生化分離技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉 及一種利用串聯(lián)固相萃取小柱分離純化微囊藻毒素的方法，特別適合于野外水華藍藻或室 內(nèi)培養(yǎng)微囊藻中微囊藻毒素MC-LR、MC-RR的純化。
背景技術(shù)：
水體富營養(yǎng)化日益嚴(yán)重，有害藍藻水華頻繁暴發(fā)已成為全球性的生態(tài)環(huán)境問題。 藍藻毒素是藍藻水華產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，研究表明藍藻毒素不僅造成水生態(tài)系統(tǒng)惡化， 而且可能威脅到人類健康。我國是世界上藍藻水華發(fā)生強度、頻率最高和持續(xù)時間最長的 國家之一，更為嚴(yán)重的是，我國淡水湖泊中發(fā)生的水華80%是有毒的，2007年震驚中外的無 錫飲用水危機事件就與藍藻水華有關(guān)。在有毒藍藻水華產(chǎn)生的毒素中，微囊藻毒素(MC)可 能是分布最廣毒性最大的種類之一。迄今為止，已經(jīng)鑒定的微囊藻毒素達80余種，但研究 最多的僅限于MC-LR、MC-RR、MC-YR、MC-LA和MC-LF等少數(shù)幾種(其中前3種是我國和亞 太地區(qū)有毒藍藻水華經(jīng)常檢出的毒素)，也僅美、日、德等少數(shù)幾家公司(如Sigma-Aldrich、 CalBiochem, Kanto Reagents、Wako等)可提供少量的這類純品。由于方法和技術(shù)等因素 使微囊藻毒素的制備比較困難，純品MC價格昂貴(以Sigma-Aldrich提供的價格計算，1 g MC純品價格高達500，000美元)。許多研究如用純毒素樣品進行試驗，其費用高得驚人，極 大地限制了研究的深入。但是，如果采用純度較高(859Γ90%)的毒素開展各種試驗，定性定 量時才采用純品MC進行校正，既可大大降低研究費用，又可克服藻毒素純度較低時含有較 多雜質(zhì)對研究造成的不利影響。我國近年來圍繞MC的研究涉及其產(chǎn)生機制、環(huán)境介質(zhì)中 濃度測定、有效去除方法研發(fā)及生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)等方面，這些研究均需要大量的純度較高 (80 90%)的MC。在這種背景下，研制開發(fā)在產(chǎn)量(10 mg以上)和純度上(85% 90%)均滿足 國內(nèi)需求的微囊藻毒素顯得非常緊迫和必要。目前從微囊藻中提取純化毒素的方法有多種，但是要同時獲得二種或二種以上較 高純度的微囊藻毒素都比較困難，主要技術(shù)瓶頸在于如何將微囊藻中含有的多種毒素進行 分離及如何去除雜質(zhì)的干擾。目前，C18反相色譜(如反相快速色譜)是常用的藻毒素富集 和去除雜質(zhì)的方法，但這一方法存在諸多缺點。一方面上樣量較大時，柱壓非常高，限制了 上樣量，也限制了流速，很難將MCs洗脫下來；另一方面，在洗脫過程中，一部分色素和藻毒 素同時被洗脫下來，很難分離，給后續(xù)的分離純化工作帶來很大影響；另一部分保留在柱子 上導(dǎo)致柱子污染而報廢整個色譜柱。因此，用常規(guī)的C18反相柱分離純化的方法存在成本 較高和上樣量較低等缺點。通過對中國專利網(wǎng)進行檢索，目前已有多項專利涉及分離純化MC的專利。閏海 等(CN01145121. 1)利用單一的SPE小柱富集MCs，利用30 50%的甲醇水溶液淋洗雜質(zhì)，用 60^100%甲醇洗脫毒素，可以從野外水華中獲得MC-RR和MC-LR，但不能將二者分開；或從 室內(nèi)培養(yǎng)藻中獲得MC-LR，但因使用單柱，限制了其分離效率，同時淋洗步驟(3(Γ50%甲醇 水溶液)會損失部分MC-LR，導(dǎo)致產(chǎn)量和產(chǎn)率不高。徐立紅等(CN200510024573. 9)利用多步層析法同時分離純化MC-LR和MC-RR，可制備毫克級純度》90%的毒素。該分離純化過 程復(fù)雜，包括一次反相硅膠柱分離，二次正相硅膠柱分離，得到的MC-LR和MC-RR再分別經(jīng) 制備HPLC和離子交換層析，最后用C18小柱脫鹽。分離純化過程使用的層析柱容量較大， 耗費試劑量大，但產(chǎn)量低(僅能獲得毫克級毒素)。宋立榮等(CN02139093. 2)利用中空纖維 超濾器除雜質(zhì)，經(jīng)C18柱初步純化獲得粗毒素，再經(jīng)制備HPLC和薄層層析等步驟純化微囊 藻毒素，適于毫克級微囊藻毒素的制備。該過程亦較復(fù)雜，從薄層層析上獲得毒素的過程 較為繁瑣。耿志明等(200910033693. 3)利用SPE柱先富集MCs，經(jīng)淋洗去除部分雜質(zhì)后洗 脫毒素，毒素濃縮蒸干后再經(jīng)過一個較大容量的C18層析柱進行分離，其分離純化過程類 似1996年Edwards等采用的反相快速色譜。由于洗脫液中含有甲酸或三氟乙酸，獲得的毒 素如不除酸，在長期的放置過程中會產(chǎn)生變化。虞銳鵬等(200710190610. 2)利用大孔吸附 樹脂替代C18填料，經(jīng)二次大孔吸附樹脂層析柱分離，得到純度> 80%的MC-RR、MC-YR和 MC-LR0但該方法需要使用大容量的層析柱(10X 100 cm)，且需經(jīng)二次層析柱分離過程。大 孔吸附樹脂盡管價格便宜，但樹脂中固有的有機物質(zhì)很難洗凈。除以上專利外，筆者的二 項專利(CN200410012921. 6、CN200410012920. 1 )，前者涉及利用一種有機萃取劑有效去除 大量色素及其它雜質(zhì)，主要應(yīng)用于前處理過程；后者利用反相制備液相色譜實現(xiàn)MC-RR和 [Dha7]MC-RR的分離純化，但一次純化的毒素量不足毫克。從以上專利的申請可以看出，目前我國對MC的研究需求有力地推動了 MC分離純 化的研發(fā)。但如前所述，上述方法還或多或少存在一些缺陷，具體表現(xiàn)在(1) 一次性獲得 的毒素量普遍較低；(2)分離純化步驟多，不能連續(xù)，毒素損失較大，產(chǎn)率低；(3)色素及其 它雜質(zhì)仍是影響毒素分離純化工藝的主要因素，這一問題未能較好解決。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種利用串聯(lián)固相萃取小柱分離純化微囊藻毒素的方 法，方法采用多個內(nèi)含硅膠顆粒的固相萃取小柱串聯(lián)組合，實現(xiàn)微囊藻毒素的快速富集、分 離和純化。方法分離效果好，上樣量大，操作簡便，成本低，一次性可得到不小于10 mg、純度 較高(HPLC-UV/DAD檢測達到85 90%)的二種微囊藻毒素(MC-LR和MC-RR)。為了達到上述目的，本發(fā)明在篩選多種色譜填料和優(yōu)化色譜分離條件的基礎(chǔ)上， 確定了固相萃取小柱的填料及其合理的色譜分離條件。本發(fā)明對微囊藻毒素的分離純化工 藝進行了重大改進和優(yōu)化，發(fā)明了一套利用串聯(lián)的SPE柱進行高負載、高效分離純化MCs的 方法，該方法可以一次性獲得IOmg以上的純度達859Γ90%的毒素，能滿足國內(nèi)眾多實驗室 進行微囊藻毒素研究時需要大量較純毒素(809Γ90%)的需求。一種利用串聯(lián)固相萃取小柱分離純化微囊藻毒素的方法，其步驟如下
Α、藻粉材料收獲野外水華藍藻或室內(nèi)培養(yǎng)的銅綠微囊藻(Microcys tis aeruginosa ), W、喪、〒徵(54 ° C冷凍干燥24 48 h)制成干藻粉，20 ° C保存。B、 固相萃取(SPE)小柱制備在SPE柱(10 mL，內(nèi)徑15 mm)中，裝入0.5 3 g C18填料(15^35 μ m, ODS或Simchrom球形硅膠，北京金歐亞科技發(fā)展有限公司)，用墊片壓 緊后保存待用。SPE柱臨用前用3(T50 mL甲醇和3(T50 mL水進行活化。SPE柱的串連采 用不銹鋼針頭穿孔橡皮塞進行連接。第一個SPE小柱的填料重量(0.5 2 g)與待處理的藻 粉重量的比例為1:10 1:40。
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C、藻毒素提取稱取干藻粉，按20 50 ml/g的比例加入75% (ν/ν)甲醇水溶液， 室溫(20-25 °(以下相同)下置于搖床上振蕩4(T120 min或在攪拌器上連續(xù)攪拌4(Γ120 min，取出后以3000 4500 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 30 min，取出上清液。D、雜質(zhì)初步去除將所得的上清液與有機萃取劑按10:廣1:2的比例加入分液漏 斗，混合搖勻，靜置15飛0 min，分層后棄去有機萃取劑，再次加入上述比例的萃取劑重復(fù)萃 取一次，棄去有機萃取劑；剩余溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸發(fā)除去有機溶劑，過0. 45Mffl的濾 膜用高效液相色譜(HPLC)測定其毒素含量后，進入后續(xù)的藻毒素分離純化步驟。所述的有 機萃取劑為三氯甲烷與二氯甲烷的混合液(比例10 廣1 5)。E、藻毒素分離純化預(yù)處理后，試樣溶液通過預(yù)先活化的2、個串聯(lián)組合的SPE 小柱進行富集。通過調(diào)節(jié)上樣量，使第一個SPE小柱因富積大量色素雜質(zhì)而不能保留MC， MC被吸附固定于后續(xù)的小柱。富集完畢，用100 300 mL 5 20% (ν/ν)的甲醇水溶液淋洗小 柱，淋洗后棄去第一個SPE柱；繼續(xù)用20% 50% (ν/ν)的甲醇水溶液洗脫剩余SPE小柱中 吸附的微囊藻毒素。上樣、淋洗及洗脫的速度控制在纊5 mL/min。通過實時監(jiān)測毒素含量 的變化，確定分段收集的洗脫液中含MC的組分及純度。純度達85、0%的含目標(biāo)MC的組分 于3(Γ40 °(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用70% (ν/ν)甲醇水溶液定容，保存于 20 °(冰箱中。F、 MC 檢測采用如下色譜條件，Phenomenex Synergi 4Mm Hydro-RP 80A, 4.6X250 mm，流動相甲醇0.05%三氟乙酸=62 38等度洗脫，流速1 mL/min，檢測波長 238 nm,進樣量10 μ 。根據(jù)MC-LR和MC-RR標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖對純化的MCs進行定性定量。其特征在于，所述的C18填料的特點是富集毒素后，采用較低濃度(3(Γ50%，ν/ν) 的甲醇水溶液洗脫即可實現(xiàn)微囊藻毒素的快速分離和純化。其中2(Γ30% ( ν/ν)的甲醇水 溶液可實現(xiàn)MC-LR與未知毒素的完全分離，30 50% (ν/ν)的甲醇水溶液可實現(xiàn)MC-LR與 MC-RR的完全分離。其特征在于，上樣時使第一個SPE小柱因富積大量色素雜質(zhì)而不能保留MC，經(jīng)淋 洗后棄去該小柱。其特征在于，采用2、個小柱串聯(lián)組合，可一次性實現(xiàn)大批量(> 10 mg)的微囊藻 毒素的富集與純化。其特征在于，通過實時監(jiān)測毒素含量的變化，確定分段收集的洗脫液中含MC的組 分及純度。本發(fā)明與現(xiàn)有的分離技術(shù)相比，有以下的優(yōu)點和效果
a)解決了 MC-LR與未知毒素、MC-LR與MC-RR分離難的問題，利用優(yōu)選的C18填料組裝 的串聯(lián)固相萃取小柱，采用低濃度的甲醇水溶液可實現(xiàn)毒素的完全分離，節(jié)省了成本。b)第一個固相萃取小柱富集了大量色素和其它雜質(zhì)，導(dǎo)致負載量較大且不能保留 MC，MC被吸附固定于后續(xù)的小柱。利用這一特性，將第一個小柱在洗脫前棄去，極大地避免 了這些色素和雜質(zhì)對后續(xù)洗脫程序的影響，這是以往分離純化毒素過程中從未使用的關(guān)鍵 技術(shù)。c)毒素的上樣量較大(> 10 mg)，操作簡便，用多個固相萃取小柱代替大體積的反 相色譜柱，可從微囊藻中一次性獲得10 mg以上較高純度(85 90%)MC-LR、MC-RR。d)成本低，固相萃取小柱串聯(lián)組合后，可節(jié)省大量有機溶劑。同時，固相萃取小柱 成本低，除必須棄用的第一個小柱外，其它小柱用100%甲醇(含0. 05%TFA)再生后還可重復(fù)利用。


圖1為一種野外收集的藍藻粗提物中MC-RR、MC-LR的HPLC色譜示意圖。主要含有MCRR和MCLR 二個毒素峰，雜質(zhì)峰的干擾較大。圖2為一種室內(nèi)培養(yǎng)微囊藻粗提物中MC-LR及多種未知MC毒素的HPLC色譜示意 圖。MC-LR后面含有至少3個未知的毒素峰。圖3為一種經(jīng)串聯(lián)小柱純化后的MC-RR的HPLC色譜示意圖。最大紫外特征吸收峰為238 nm,與MC-RR標(biāo)準(zhǔn)品一致。圖4為一種經(jīng)串聯(lián)小柱純化后的MCLR的HPLC色譜示意圖。最大紫外特征吸收峰為238 nm,與MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品一致。
具體實施例方式一種利用串聯(lián)固相萃取小柱分離純化微囊藻毒素的方法，其步驟如下
1.藻粉材料收獲野外水華藍藻或室內(nèi)培養(yǎng)的銅綠微^Microcystis ae/7^i/70>sa)，冷凍干燥后制成干藻粉，保存于 20 0C02.固相萃取(SPE)小柱制備在SPE柱(10 mL，內(nèi)徑15 mm)中，裝入1 g C18填 料(15 35 ym, ODS或Simchrom球形硅膠，北京金歐亞科技發(fā)展有限公司)，用墊片壓緊后 保存待用。SPE柱臨用前用30 mL甲醇和30 mL水進行活化。SPE柱的串連采用不銹鋼針 頭穿孔橡皮塞進行連接。第一個SPE小柱的填料重量(0.5或1.0或1.5或2 g)與待處 理的藻粉重量的比例為1:10 1:40。3.藻毒素提取稱取20 g干藻粉(約含MC 20 mg)，加入500 ml 75% ( ν/ν)甲醇 水溶液，室溫下置于搖床上振蕩90 min或在攪拌器上連續(xù)攪拌90 min，取出后以4000 r/ min的轉(zhuǎn)速離心20 min，取出上清液；按此步驟重復(fù)提取兩次，將三次提取的上清液合并， 進行下一步處理。4.雜質(zhì)去除將所得的上清液與有機萃取劑按3 1的比例加入分液漏斗，混合搖 勻，靜置30 min，分層后棄去有機萃取劑，再次加入上述比例的萃取劑重復(fù)萃取一次，棄去 有機萃取劑。剩余溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸發(fā)除去有機溶劑，過0. 45Mffl的濾膜用HPLC測 定其毒素含量后，進入后續(xù)的藻毒素分離純化步驟。所述的有機萃取劑為三氯甲烷與二氯 甲烷的混合液(比例2:1)。5.藻毒素的分離純化預(yù)處理后，使試樣溶液通過串聯(lián)的3個SPE小柱進行富集。 為克服淋洗過程中毒素的流失，SPE串連小柱后再連接一個新的SPE小柱。用200mL 10% (ν/ν)甲醇水溶液淋洗，棄去第一個SPE小柱，余下的3個SPE小柱繼續(xù)依次用25%和40% (ν/ν)的甲醇水溶液洗脫，通過實時監(jiān)測毒素含量的變化，確定分段收集的洗脫液中含MC 的組分及純度。純度達85 90%的含目標(biāo)MC的組分于32°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用70%( ν/ ν)甲醇水溶液定容。6. MC檢測用HPLC進行實時監(jiān)測各個組分里MC含量的變化情況，采用如下色譜 條件，Phenomenex Synergi 4Mm Hydro-RP 80Α，4. 6X250 mm,流動相甲醇0.05% 三氟乙
6酸=62:38等度洗脫，流速1 mL/min，檢測波長238 nm，進樣量10 μ ，根據(jù)MC-LR和MC-RR 標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖對純化的MCs進行定性定量。其特征在于，所述的C18填料的特點是富集毒素后，采用較低濃度(30或35或40 或45或50%，ν/ν)的甲醇水溶液洗脫即可實現(xiàn)微囊藻毒素的快速分離和純化。其中20或 24或27或30% (ν/ν)的甲醇水溶液可實現(xiàn)MC-LR與未知毒素的完全分離，30或37或44 或50% (ν/ν)的甲醇水溶液可實現(xiàn)MC-LR與MC-RR的完全分離。其特征在于，上樣時使第一個SPE小柱因富積大量色素雜質(zhì)而不能保留MC，經(jīng)淋 洗后棄去該小柱。其特征在于，采用2、個小柱串聯(lián)組合，可一次性實現(xiàn)大批量(> 10 mg)的微囊藻 毒素的富集與純化。其特征在于，通過實時監(jiān)測毒素含量的變化，確定分段收集的洗脫液中含MC的組 分及純度。
權(quán)利要求
一種利用串聯(lián)固相萃取小柱分離純化微囊藻毒素的方法，其步驟如下A、藻粉材料收獲野外水華藍藻或室內(nèi)培養(yǎng)的銅綠微囊藻冷凍干燥制成干藻粉， 20 oC保存；固相萃取小柱制備在SPE柱中裝入0.5~3 g C18填料或Sunchrom球形硅膠，用墊片壓緊后保存待用；SPE柱臨用前用30~50 mL甲醇和30~50 mL水進行活化，SPE柱的串連采用不銹鋼針頭穿孔橡皮塞進行連接，第一個SPE小柱的填料重量0.5~2 g與待處理的藻粉重量的比例為1:10 ~ 1:40；藻毒素提取稱取干藻粉，按20~50 ml/g的比例加入75%v/v甲醇水溶液，室溫置于搖床上振蕩40~120 min或在攪拌器上連續(xù)攪拌40~120 min，取出后以3000~4500 r/min的轉(zhuǎn)速離心10~30 min，取出上清液；雜質(zhì)去除將所得的上清液與有機萃取劑按10:1~1:2的比例加入分液漏斗，混合搖勻，靜置15~60 min，分層后棄去有機萃取劑，再次加入上述比例的萃取劑重復(fù)萃取一次，棄去有機萃取劑；剩余溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸發(fā)除去有機溶劑，過0.45μm的濾膜用高效液相色譜測定其毒素含量后，進入后續(xù)的藻毒素分離純化步驟；藻毒素分離純化預(yù)處理后，試樣溶液通過預(yù)先活化的2~4個串聯(lián)組合的SPE小柱進行富集，通過調(diào)節(jié)上樣量，使第一個SPE小柱因富積大量色素雜質(zhì)不能保留MC，MC被吸附固定于后續(xù)的小柱，富集完畢，用100~300 mL 5~20% v/v的甲醇水溶液淋洗小柱，淋洗后棄去第一個SPE柱；繼續(xù)用20~50% v/v的甲醇水溶液洗脫剩余SPE小柱中吸附的微囊藻毒素，上樣、淋洗及洗脫的速度控制在2~5 mL/min，通過實時監(jiān)測毒素含量的變化，確定分段收集的洗脫液中含MC的組分及純度，純度達85~90%的含目標(biāo)MC的組分于30~40 oC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用70% v/v甲醇水溶液定容，保存于 20 oC冰箱中；MC檢測采用色譜條件，Phenomenex Synergi 4μm Hydro RP 80A，4.6×250 mm，流動相甲醇:0.05%三氟乙酸 = 62:38等度洗脫，流速1 mL/min，檢測波長238 nm，進樣量10 μL，根據(jù)MC LR和MC RR標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖對純化的MCs進行定性定量；所述的C18填料是富集毒素后，采用低濃度30~50%，v/v的甲醇水溶液洗脫，其中20~30% v/v的甲醇水溶液實現(xiàn)MC LR與未知毒素的完全分離，30~50% v/v的甲醇水溶液實現(xiàn)MC LR與MC RR的完全分離。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用串聯(lián)固相萃取小柱分離純化微囊藻毒素的方法，其 特征在于所述的有機萃取劑為三氯甲烷與二氯甲烷的混合液，比例10:廣1:5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用串聯(lián)固相萃取小柱分離純化微囊藻毒素的方法，其 特征在于所述的第一個SPE小柱因富積色素雜質(zhì)不能保留MC，采用2、個小柱串聯(lián)組合。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種利用串聯(lián)固相萃取小柱分離純化微囊藻毒素的方法，其步驟A、藻粉材料收獲野外水華藍藻或室內(nèi)培養(yǎng)的銅綠微囊藻冷凍干燥后制成干藻粉；B、固相萃取小柱制備在SPE柱中裝入C18填料；C、藻毒素提取稱取干藻粉，按比例加入甲醇，室溫下置于搖床上振蕩；D、雜質(zhì)去除將上清液與有機萃取劑按比例加入分液漏斗，混合搖勻，靜置，分層后棄去有機萃取劑；E、藻毒素分離純化預(yù)處理后，試樣溶液通過預(yù)先活化的串聯(lián)組合的SPE小柱進行富集，用20~50%甲醇水溶液洗脫毒素；F、MC檢測。方法分離效果好，上樣量大，操作簡便，成本低，一次性可得到不小于10mg、純度較高的二種微囊藻毒素，HPLC-UV/DAD檢測達到85~90%。
文檔編號C07K1/16GK101974080SQ20101055375
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月22日
發(fā)明者吳幸強, 李仁輝, 肖邦定 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所