維生素a、e的測定方法和相應(yīng)的在線固相萃取分析系統(tǒng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種對動物源食品中的維生素 A、E進(jìn)行測定的方法。具體而言，本發(fā) 明采用固相萃取與高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)，建立了一種在線固相萃取-高效液相色譜同時 測定動物源食品中維生素 A、E的分析方法。此外，本發(fā)明還提供了用于對維生素 A、E進(jìn)行 檢測的在線固相萃取分析系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002] 維生素 A和維生素 E是機體維持正常生理功能和物質(zhì)能量代謝必需的微量營養(yǎng)成 分，具有調(diào)節(jié)生長、維持視覺、促進(jìn)生殖和延緩衰老等生物效應(yīng)，但是它們在體內(nèi)不能合成 或合成量不足以滿足身體需要，必須通過食物進(jìn)行補充。肝臟、蛋類和乳品等動物源食品含 有豐富的維生素 A、E，是人體所需脂溶性維生素的重要來源。由于脂溶性維生素化學(xué)性質(zhì) 不穩(wěn)定，易受光照、空氣和溫度影響導(dǎo)致氧化分解，而且動物源食品蛋白脂肪含量高，干擾 因素多，高效提取和測定復(fù)雜基質(zhì)食品中維生素 A、E仍然是維生素分析技術(shù)的難點。目前 維生素 A和維生素 E的分析方法主要有層析法、比色法、熒光法、電化學(xué)法、氣相色譜法和高 效液相色譜法，其中以高效液相色譜法最為常用。
[0003] 現(xiàn)行食品檢驗標(biāo)準(zhǔn)在內(nèi)的大多數(shù)脂溶性維生素分析方法的樣品前處理主要包括 皂化、萃取、濃縮、凈化等步驟。對于萃取步驟而言，目前動物源食品中脂溶性維生素的測定 方法大多采用液液萃取凈化樣品，并被維生素 A、E國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法所采用。雖然該方法 凈化效果好，雜質(zhì)干擾少，但是存在操作耗時，有機溶劑消耗量大，待測組分易損失等不足。 由于涉及多次萃取、濃縮和溶解等步驟，操作繁瑣、費時，容易造成待測組分損失，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確 性與操作人員實驗技能密切相關(guān)，樣品測定結(jié)果誤差較大且重現(xiàn)性不好。
[0004] 因此，本領(lǐng)域中迫切需要新的技術(shù)手段來提高復(fù)雜基質(zhì)樣品的分析效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述課題，本研究利用在線固相萃取凈化技術(shù)結(jié)合高效液相色譜，建立了 一種簡便、快捷測定動物源食品中維生素 A、E的分析方法，實現(xiàn)了復(fù)雜基質(zhì)樣品的萃取凈 化與濃縮全程自動化，顯著縮短了樣品處理時間，改善了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。
[0006] 本發(fā)明提供了一種對維生素 A、E進(jìn)行測定的方法，該方法包括將經(jīng)過預(yù)處理的待 測樣品進(jìn)行在線固相萃取分析，其中，該預(yù)處理包括在堿的存在下對樣品進(jìn)行皂化，該在線 固相萃取分析包括如下步驟：
[0007] (a)將該經(jīng)過預(yù)處理的待測樣品泵入固相萃取柱，通過洗脫除去雜質(zhì)，將待測的維 生素 A、E保留在該固相萃取柱上；
[0008] (b)通過切換六通閥，將該固相萃取柱與分析柱在流路上串聯(lián)，進(jìn)行維生素 A、E的 分離；
[0009] (c)使該分析柱的流出液進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測。
[0010] 此外，本發(fā)明還提供了用于對維生素 A、E進(jìn)行檢測的在線固相萃取分析系統(tǒng)，該 系統(tǒng)包含第一泵、進(jìn)樣器、六通閥、固相萃取柱、第二泵、分析柱和檢測器，該進(jìn)樣器在流路 上串聯(lián)于該第一泵的下游，該檢測器在流路上串聯(lián)于該分析柱的下游，該六通閥用于切換 該系統(tǒng)的兩種工作狀態(tài)：在第一工作狀態(tài)下，該固相萃取柱在流路上串聯(lián)于該進(jìn)樣器的下 游，該分析柱在流路上串聯(lián)于該第二泵的下游；在第二工作狀態(tài)下，該固相萃取柱在流路上 串聯(lián)于該第二泵的下游，該分析柱在流路上串聯(lián)于該固相萃取柱的下游。
[0011] 本研究利用固相萃取柱配合切換閥取代傳統(tǒng)的前處理過程，建立了一種在線固相 萃取與高效液相色譜聯(lián)用方法用于同時測定動物源食品中的維生素 A和維生素 E。皂化處 理的樣品經(jīng)固相萃取柱凈化濃縮后在線轉(zhuǎn)移至分析柱進(jìn)行檢測，極大減少了前處理過程中 維生素 A、E的損失。該方法可實現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)樣品的自動在線凈化，具有分析效率高，溶劑消 耗少，測定結(jié)果準(zhǔn)確且重現(xiàn)性好等特點，為動物源食品中維生素 A、E的測定提供了更為簡 便、靈敏、可靠的分析方法。
【附圖說明】
[0012] 圖1為本發(fā)明一個實施方式所述在線固相萃取分析工作流程示意圖，圖1A和圖1B 分別示出通過六通閥進(jìn)行切換的兩種流路工作狀態(tài)。
[0013] 圖2為示出萃取溶劑在不同的柱上對維生素 A、E回收率的影響的柱狀圖。
[0014] 圖3為示出不同的固相萃取柱對配方乳粉樣品雜質(zhì)凈化的影響的曲線圖。
[0015] 圖4示出了配方乳粉樣品未使用在線固相萃取凈化（色譜條件采用國標(biāo)方法）和 使用在線固相萃取凈化（本發(fā)明的方法）的色譜圖比較，其中圖4A為未使用在線固相萃取 凈化方法的結(jié)果，圖4B為采用本發(fā)明所述方法的結(jié)果。
[0016] 圖5示出了采用本發(fā)明的方法對不同樣品進(jìn)行測定的色譜圖，其中a對應(yīng)豬肝樣 品，b對應(yīng)雞蛋樣品，c對應(yīng)配方乳粉樣品。
【具體實施方式】
[0017] 圖1為本發(fā)明一個實施方式所述的在線固相萃取分析工作流程示意圖，其中采用 了包含第一泵和第二泵的雙梯度泵。具體而言，在圖1A所示的工作狀態(tài)下，將六通閥按照 1- 2、3-4、5_6的方式連通，利用第一泵的驅(qū)動使得待測樣品由自動進(jìn)樣器進(jìn)入固相萃取柱 (優(yōu)選采用C8作為填料），用洗脫溶液（例如甲醇-水溶液、特別是體積比為60:40的甲 醇-水溶液）去除雜質(zhì)，并使得維生素 A、E富集在固相萃取柱上。隨后切換六通閥按照1-6、 2- 3、4-5的方式連通，使其進(jìn)入圖1B所示的工作狀態(tài)。利用第二泵的驅(qū)動，采用合適的流動 相（例如體積比為98:2的甲醇-水溶液）使得富集于固相萃取柱上的維生素 A、E轉(zhuǎn)移至 分析柱（優(yōu)選采用C18作為填料），隨后直接在圖1B所示的工作狀態(tài)下使用同樣的流動相 進(jìn)行分離和檢測。
[0018] 在一個替代的實施方式中，通過設(shè)置合適的在線轉(zhuǎn)移時間，使得在完成在線轉(zhuǎn)移 后立即將六通閥切換回圖1A所示的工作狀態(tài)，從而保證在第二泵的驅(qū)動下進(jìn)行分離和檢 測的同時，在第一泵的驅(qū)動下進(jìn)行下一個周期的進(jìn)樣和固相萃取，如此循環(huán)往復(fù)。在需要 對多組樣品進(jìn)行測定的場合中，采用這種替代的實施方式可以更進(jìn)一步地節(jié)約總體測定時 間。
[0019] 在本發(fā)明中，采用雙梯度泵可以使得整套系統(tǒng)的布局更加緊湊。作為一個替代的 實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員同樣可以容易地采用兩個獨立的泵進(jìn)行工作。
[0020] 動物源性食品中的脂溶性維生素大多是以酯類形式存在，極少數(shù)為游離狀態(tài)，并 且共存的類脂化合物會干擾脂溶性維生素的測定，因此需要對樣品進(jìn)行皂化處理，將維生 素 A、E由結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)。在本發(fā)明中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可選用本領(lǐng)域中合適的皂化 條件對待測樣品者前處理。為了獲得更好的皂化效果，可以對皂化劑濃度、皂化溫度和時間 等參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)卣{(diào)整。優(yōu)選的皂化條件是使用50%氫氧化鉀溶液作為皂化劑，在80°C下 皂化反應(yīng)30min，從而使待測樣品盡可能皂化完全。此外，由于皂化后的維生素 A、E轉(zhuǎn)化為 不穩(wěn)定的醇類，對光照和氧氣敏感，因此優(yōu)選對預(yù)處理過程進(jìn)行避光處理和氮氣保護(hù)，從而 減少誤差。
[0021] 在本發(fā)明中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可選用本領(lǐng)域中合適的固定相填料作為固相萃取柱 填料，并相應(yīng)地選擇合適的流動相來洗脫雜質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施方式中，選取C8作為在 線固相萃取柱填料，體積比為60%的甲醇-水溶液作為洗脫溶液，既能實現(xiàn)維生素 A、E在 固相萃取柱上的有效富集，又能對樣品基質(zhì)起到良好的凈化作用。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方 式中，依次使用PH7. 5和pH3. 5的60%甲醇水溶液來洗脫萃取柱，從而實現(xiàn)更佳的樣品基質(zhì) 凈化效果。
[0022] 在本發(fā)明中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可選用本領(lǐng)域中合適的色譜分析條件。由于本發(fā)明 采用在線固相萃取方法凈化樣品，基本消除了基質(zhì)的干擾，因而在一個優(yōu)選的實施方式中， 選用較短的C18分析柱（例如柱長15cm)，從而在20min內(nèi)即可完成維生素 Α、α-維生素 E、 (β + Υ )-維生素 Ε和δ -維生素 Ε四組脂溶性維生素組分的分析，并且色譜柱分離度和檢 測靈敏度均能滿足實際樣品測定需要。
[0023] 在本發(fā)明中，檢測器可以是本領(lǐng)域中通常用于檢測維生素 A、Ε的任何檢測器，優(yōu) 選紫外檢測器。在一個優(yōu)選的實施方式中，檢測波長設(shè)定為325nm和300nm。
[0024] 實施例
[0025] 接下來，通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)地說明，但本發(fā)明不僅限于這些實 施例。
[0026] 實施例1
[0027] (1)儀器與試劑
[0028] Ultimate3000雙三元液相色譜系統(tǒng)（Thermo Scientific公司），配置雙三元梯度 泵，自動進(jìn)樣器，柱溫箱帶一個六通閥，二極管陣列檢測器，變色龍色譜管理軟件；Milli-Q 超純水機（Millipore公司）；臺式高速冷凍離心機（Thermo Scientific公司）。
[0029] 維生素 A (視黃醇）、α-維生素 Ε、β -維生素 Ε、γ -維生素 E和δ -維生素 E標(biāo) 準(zhǔn)品（Sigma公司）；氫氧化鉀、抗壞血酸（分析純，國藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑有限公司）；無水 乙醇、甲醇（色譜級，F(xiàn)isher公司）；其它試劑均為分析純；無水乙醇經(jīng)脫醛處理后使用；豬 肝、雞蛋和嬰幼兒配方乳粉購自本地超市。
[0030] (2)色譜條件
[0031] 分析柱為 Zorbax Extend_C18 (4. 6mmX 150mm，5 μ m);固相萃取柱為 Zorbax SB-C18 (4. 6mmX 12. 5mm，5 μ m);進(jìn)樣量為100 μ L ;柱溫為30°C;在線凈化流動相為甲醇-水 溶液（60:40, V/V)，洗脫條件為使用pH7. 5甲醇-水溶液，以lmL/min流速上樣并清洗萃 取柱5min，再使用pH3. 5甲醇-水溶液清洗萃取柱5min ;分析測定流動相為甲醇-水溶液 (98:2, V/V)，流速為1. 7mL/min ;紫外檢測波長設(shè)為325nm和300nm。流路設(shè)置和工作狀態(tài) 的切換參見圖1A和圖1B及前文的相應(yīng)說明。
[0032] (3)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
[0033] 準(zhǔn)確稱取維生素 A標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，α-維生素 Ε、β -維生素 Ε、γ -維生素 E和 S -維生素 Ε各50.0 mg，用脫醛乙醇溶解并定容于100mL棕色容量瓶中，配制成濃度分別為 100mg/L維生素 A和500mg/La、i3、Y和δ維生素 E標(biāo)準(zhǔn)儲備液，保存于-20°C冰箱。測定 前用紫外分光光度法標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)儲備液準(zhǔn)確濃度，再用脫醛乙醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成濃 度分別為〇. 2、2. 0、2. 5、5. 0、10.