專利名稱：鳥類集落刺激因子1受體結(jié)合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新鑒定的鳥類基因，其編碼結(jié)合鳥類集落刺激因子I受體(CSFlR)的蛋白。通過與CSFlR結(jié)合，這些蛋白展示出免疫調(diào)節(jié)特性，該特性可以用于調(diào)節(jié)鳥類免疫系統(tǒng)以及影響細(xì)胞生長、分化和/或增殖，器官/組織發(fā)育和疫苗功效。發(fā)明背景
單核吞噬細(xì)胞源自骨髓中的祖細(xì)胞，所述祖細(xì)胞分化為血單核細(xì)胞，并且然后進(jìn)入組織以占據(jù)特定的生態(tài)位(niche) (Hume等2002)。它們構(gòu)成針對(duì)病原體的第一道防線，保持內(nèi)穩(wěn)態(tài)，并具有從骨形態(tài)發(fā)生到性別發(fā)育中的神經(jīng)模式發(fā)生，從血管發(fā)生到脂肪生成的營養(yǎng)機(jī)能(Pollard 2009)。巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞的正常分化、增殖和存活需要巨噬細(xì)胞集落刺激因子(CSFl) (Sweet 和 Hume 2003 ;Chitu 和 Stanley 2006 ;Bonifer 和 Hume 2008)。攜帶CSFl基因突變的小鼠和大鼠(即ορ/ορ小鼠和tl/tl大鼠)顯示單核吞噬細(xì)胞缺乏，以及它們重要的發(fā)育異常，諸如減小的體生長、產(chǎn)期死亡率、骨硬化癥、神經(jīng)和生殖缺陷，這強(qiáng)調(diào)了上述許多巨噬細(xì)胞的營養(yǎng)作用(Marks等1992 ；Pollard 1997,2009 ;Ryan等2001)。盡管CSF-I以多種同種型存在，但是大多數(shù)生物化學(xué)研究集中于最小生物學(xué)活性片段，即所有同種型共有的154個(gè)N-端氨基酸。在全長CSFl分子中，該受體結(jié)合區(qū)之前為32個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，之后為可變間隔區(qū)、24個(gè)氨基酸的跨膜區(qū)和35個(gè)氨基酸的胞質(zhì)尾部。CSFl活性片段的三級(jí)結(jié)構(gòu)形成具有小β折疊區(qū)(I和2)的短鏈四螺旋束(Α，B, C和D)。該螺旋通過鏈內(nèi)二硫鍵配對(duì)為A-C和B-D，而一個(gè)鏈間二硫鍵產(chǎn)生具有兩路旋轉(zhuǎn)軸的成熟同型二聚體(Pandit等1992)。最近以2.4A的分辨率解析了與其受體CSFlR結(jié)合的小鼠CSFl的晶體結(jié)構(gòu)，其顯示受體結(jié)合涉及CSFlN-端區(qū)段(殘基6-15)、螺旋B (殘基55-66)和螺旋 C (殘基 79-85) (PDB 編碼 3EJJ) (Chen 等 2008)。所有CSFl作用通過與CSFl受體(CSFlR)(即由c_fms原致癌基因編碼的165kDa糖蛋白)的結(jié)合來介導(dǎo)(Dai等2002)。CSFIR，與PDGFRA，PDGFRB和c-kit 一起，都是III型酪氨酸激酶蛋白家族的成員，并與其他家族成員共享五個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(D1-D5)的特有胞外區(qū)、單跨膜螺旋和胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(Rosnet和Birnbaum 1993)。CSF-I以2 2化學(xué)計(jì)量與受體緊密締合(在37°C，Kd = O. 4nM) (Guilbert和Stanley 1986)。該結(jié)合包括D2的CD環(huán)(殘基141-151)和EF環(huán)(殘基168-173)，以及D3的BC和DE環(huán)(分別地為殘基 231-232 和 250-257) (Chen 等 2008)。在細(xì)胞表面上表達(dá)CSFlR屬于巨噬細(xì)胞譜系定型中的最早事件，并主要局限于遍及胚胎發(fā)育以及成年人中的這些細(xì)胞(Lichanska等1999)。如其他骨髓啟動(dòng)子，最近的CSFlR啟動(dòng)子缺少經(jīng)典TATA盒和富含GC序列，但是包含關(guān)于AMLl轉(zhuǎn)錄因子和C/EBP和Ets家族的轉(zhuǎn)錄因子(包括骨髓局限性轉(zhuǎn)錄因子PU. I)的識(shí)別位點(diǎn)(Reddy等1994 ；Himes等2005 ;Bonifer和Hume 2008)。CSFlR的表達(dá)還受FIRE (Fms內(nèi)含子調(diào)節(jié)元件)，即第一內(nèi)含子中的高度保守增強(qiáng)子元件的控制(Himes等2001 ；Sasmono等2003)。ορ/ορ小鼠中可見的大多數(shù)表型缺陷，包括生殖缺陷和器官發(fā)育中的混亂，在CSFlR敲除小鼠中甚至更嚴(yán)重(Dai等2002)。首先由于母體來源的CSFl的可用性，這些觀察結(jié)果現(xiàn)在可以通過近期命名為IL34的關(guān)于人CSFlR的第二配體的發(fā)現(xiàn)來解釋，所述IL34在單核細(xì)胞生存能力方面具有活性。IL34純化為由241個(gè)氨基酸的單體組成的同型二聚體，并顯示主要在腦中表達(dá)，但也表達(dá)在許多其他組織中，包括心臟、脾、肺、肝、腎和胸腺中(Lin 等 2008)。W02008/031172描述了 CSFl在溫血?jiǎng)游锖途唧w是未成熟的人胎兒/胚胎中促進(jìn)器官發(fā)育的用途。此外，W003028752描述了用于調(diào)節(jié)動(dòng)物中免疫反應(yīng)的方法和組合物，所述方法包括調(diào)節(jié)CSFl活性。雞已經(jīng)被廣泛用在早期胚胎成髓研究中(Lichanska等1999 ;Lichanska和Hume2000)，但是與我們關(guān)于哺乳動(dòng)物單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的知識(shí)相比，我們關(guān)于鳥類系統(tǒng)的知識(shí)相當(dāng)有限，且W02008/031172和W00302875 2均未描述鳥類CSFl基因的存在。事實(shí)上，雞中僅存在兩種特有的集落刺激因子。雞GM-CSF(CSF2)已經(jīng)被克隆并顯示出推動(dòng)雞骨髓細(xì)胞的增殖(Avery等2004)。其他描述的雞CSF，骨髓單核細(xì)胞生長因子，近期已經(jīng)顯示是G-CSF(CSF3)的雞直向同源物(Gibson等2009)。在雞基因組中標(biāo)注了與IL3受體共享的GM-CSF受體α鏈和β鏈的表觀直向同源物(Ensembl)。迄今為止，在鳥中尚未證明關(guān)于CSFlR的功能，認(rèn)為鳥類基因組中缺乏CSFl并且尚未識(shí)別IL34(Kaiser 2007)。據(jù)報(bào)道，人中的CSFl和IL34幾乎不具有明顯的同源物，且至少在哺乳動(dòng)物中，CSFl進(jìn)化相當(dāng)快。關(guān)于單個(gè)受體存在兩種配體難以在進(jìn)化過程中保持，如果它們彼此獨(dú)立并與受體獨(dú)立地進(jìn)化。發(fā)明概述本發(fā)明涉及鑒定編碼結(jié)合鳥類集落刺激因子I受體(CSFlR)的蛋白的新鳥類基因。具體地，本發(fā)明首次記述編碼集落刺激因子I(CSFl)和白介素34(IL34)的鳥類基因的存在。應(yīng)該注意，這些發(fā)現(xiàn)違背Kaiser (2007)關(guān)于鳥類基因組中不存在CSFl等價(jià)物的評(píng)述。此外，本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)鳥類CSFlR由巨噬細(xì)胞表達(dá)一這與其他物種相反，例如魚，其中CSFlR在其他細(xì)胞類型中表達(dá)。關(guān)于鳥類CSFlR表達(dá)特征，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過結(jié)合CSF1R，鳥類CSFl和IL34展示免疫調(diào)節(jié)特性，該特性可以用于調(diào)節(jié)鳥類免疫系統(tǒng)以及影響細(xì)胞生長、分化和/或增殖，器官/組織發(fā)育和疫苗功效。應(yīng)該理解，提及術(shù)語“鳥類”或“鳥類物種”應(yīng)該包括鳥綱(Aves)內(nèi)的所有物種，和具體地，被分類為屬于雞形目(Galliformes)和/或原雞屬(Gallus)的那些物種?，F(xiàn)在已知具有CSFl和IL34基因的鳥類物種可以包括，例如，原雞(Gallus gallus)(另外稱為家雞)和/或其他家禽或禽鳥物種。在其他實(shí)施方案中，術(shù)語“鳥類”可以解釋為包括分類在雀形目(Passeriformes)中的物種,諸如,例如,雀,具體地,斑胸草雀(zebra finch)。一般地，術(shù)語“鳥類CSFl基因”、“鳥類IL34基因”、“鳥類IL34蛋白”和“鳥類CSFl蛋白”包括本文中所述的鳥類物種的基因組中存在和/或由其編碼的CSFl和/或IL34基因、蛋白(及其片段)。本發(fā)明人已經(jīng)確定了 CSFl的某些鳥類形式的序列和原雞基因組中存在的示范性CSFl基因的cDNA序列，其作為SEQ ID NO. I在以下給出SEQ ID NOjI
ATAMGGGCAGCGCGGCGGCGACGGCGGACTCAGCCCGGCCCCGCTCCGCCGCCTTCTCCCGCACCGCCCGACCCGCCGCAGCCCCGGCCCCACGGCAGCCCCCATGCCCCGCCTCGGATCCCAGGTGTCCCTGTTCCGCTGCACCCTGCTCTCGTCCCTCCTCCTCGTCTGCAGCATCCATGAGACGGAGCAGMCAGCTACTGCCAGCAGATCATCACCGAGCGGCACCTGGACCACCTGCAGGAGCTGGCGGACACGCAGATGCAGCAGCCGGGCACAGTGTCCTTCAGATTCATCAGCMGATGCGGCTGAGCGACTCTGTCTGCTACGTGAMGCCGCCTTCCCTTTGCTGGGCACCATCCTGMCAGGACGA CGTTCMGGAGMCTCMCAMCGCCMCMGATGMGACGGTGCGCMGATGTACGAAMCATCGATGAGMCGTGGACCCCTGCATCAGGGACGAGGATGACMGGAGCACGCGCTGTCCGAMTGTGCTTTGAGGAGTTCACCACGTCCCCCTACGAGATGCTGGTGCTGGTGAGGCAGTTCTTCCAGGACATCAMCAGCTGCTGCAGMCMGGAGACCTTCGAGMGGACTGCAGCCAGGTGTACCGCAGTGCGTGCGCGGGGCCCCGGCAGCACAGCTCCTCCCCAGGTGTGGGGACAGATCCTGACTGCMTTGCCTGTCCCCTGCCCTCCCTTCTGCCACCCAGCCCTCCCTCTCCGCTGCCACCCGTGCCGGCAGGGACGTGGCGCCCGCTAGCACCAGGGTCCCTTACCGCCAGCTCGGTGGCATCCTGGCTGAGTTAGGCAGCAGTGCCCCGTCCGAGCCCCCCAGTAGCGTGGAGGGCAGCTCGGGGGCCGAGGMCTGCCAGGAGCCGGGCTCGGCGACGCGTCGGCGCCGTCCCCCACCATGCAGCAGACGCTTGGAGCCCTCCTGGATCCAGCCGCGAGCGCCGGCCCGMGGCTGAGGACGTATCCATCCCGTCCCACGGGATGCCGGAGGAGGGCGCCGGGACCCCCGCCCTCCCACATCGGCTCCCTTCGCCGCGAGGGATCAGCGCGGCGATGCCGGCGGCGGTCCCCAGCAGCGGCTCTGCGCAGCGCCGCGGGGTCGGGCGCCGTCCCACCGAGAGCCCCGAGCGGGTCACGCAGCTCCGCTTCCCCAGGATGGCTCCGCCGTTGCGGGGCCGGGCGGAGGGCGGCCCCGGGGACGGGGCGAGGGCGCGAGGCTGGGGGCTGAGCCGGCTGCGGGAGCCCGAGGACGGCGGGGCCGGACCCAGCTTTGATTCGAGCTTTGTTCTGAGCGCAGAGCAGCGCAGGMGGAGCCGCCAGCCGCCAGCGGGGGGCACCGGGAGCTCCTGGTGTACGTCACGGTGGCCAGCGTGGTGGCCGTGCTGCTGGCCATGGGCGGGCTGCTCTTCTACMGTATMGTCCMGGTCCTGCAGCGGGGAGCAGCGCTAAMGAGGGGGGCTGCGACCCCGAGGAGCCGGAGAGCAGGGCGCTGCAGGGAGCGCAGGGCTGCGCGGAGCTGGAGACGCAGGAGCTGTGAGGGCCCCCTGCGGGACGTGATGCTGCTCGGGGGGACGGACGGGGACGCTCCTCGCTGGGCGACGGACGGCTGCTGCTCGGCCTCCCCCCGCCGCGATGACCCCCAGGCCCTGTCCTGCAGCTGCMCCCACGGGTGAGGATGGCAGGACGGGGCGGTGCAGCCCTGCAGGACCCCGGCGATGGGGCGGATGGCACCGAGGGGCTCCACGGGGACGGCATTGGGTGCCGCGAGTGGMCATCTCCCCCCACCCATCCACGGTTCCCGTTGCTCCTCTCCCACCCCTGGCACGGGGGGACCCCCGGCGCCCCATGGGGGGACCCCTCCCGCATCCCACCGGTGCCGAGGACCCMCGCCCGGCCTGCAMGGGGGAMCCCTCACACTGTGMTATTTMGACCCGTGGTGCCGTCCCCATCCCGCGATCCCMGCTGGCCTTGGGAGCTGCCCGGCGCCGCTCTGCGCAGGMGGCTCTCCACGMCGCGGTGGATAMCGCTTTTATCCMCAMTGCACTTGGGGGGGGGGGTTCCCCCCTCCCTGCAGGGTTATTGCTGCGAGCTGGCCTCGCCCCAGACTGGATTTTGTTGCTGGAGCACAGCACGGCMTGGGGCCGTGGCTGCAGTGTGGGGTTTGGGGGCTCAGCGGTACCCGGACTGCGTCCCACCCCACACGGCATCCCTGCCCAGCGCCGCTCCCGGGGGGTCGGMGTGTTATTTTTATATTACATGAGATGCAMCGGGACGGAGCACATTGGGGTGTGGTGGGGTTTTGTTTTTTAMGCATTAGTATTGATTTTGGGGTTTTTTTTTCTATGCGTATTTATGGACTGCCAAAAAMGAGGCGTTTCCTGGGGGTGATGGGGGGGGGGGTGGMGTGGGGTGCAGAGCCGGGCTGGGGCCGGAGCTGGTGCTGGCTCAGTATGTGGGGTGTGGGTGAGGGGGGTTGGGGGGGGGGCAGCTTTTGGAGCTCTTTCTGCCTCTGTTGTCTCATTTTTTGTACAGTGAMTGGTGAMTATTTTATACAMGTCATTTAMGMGTCTATTTMGGAAMTMTAGAAMCAGCTTGTATATTTAATATTATTAATAAAGATGGACGTGCAAAAAAAAAAAAAAA
天然CSFl原雞序列，包含8個(gè)外顯子并生成兩種轉(zhuǎn)錄物，一種編碼490個(gè)氨基酸的蛋白，另一種編碼270個(gè)氨基酸的蛋白。編碼較長，即490個(gè)氨基酸的蛋白的轉(zhuǎn)錄物作為SEQ ID NO :2在下文中給出。SEQ ID NO 2ATGCCCCGCCTCGGATCCCAGGTGTCCCTGTTCCGCTGCACCCTGCTCTCGTCCCTCCTCCTCGTCTGCAGCATCCATGAGACGGAGCAGMCAGCTACTGCCAGCAGATCATCACCGAGCGGCACCTGGACCACCTGCAGGAGCTGGCGGACACGCAGATGCAGCAGCCGGGCACAGTGTCCTTCAGATTCATCAGCMGATGCGGCTGAGCGACTCTGTCTGCTACGTGAMGCCGCCTTC CCTTTGCTGGGCACCATCCTGMCAGGACGACGTTCAAGGAGMCTCMCAMCGCCMCMGATGMGACGGTGCGCMGATGTACGAAMCATCGATGAGMCGTGGACCCCTGCATCAGGGACGAGGATGACMGGAGCACGCGCTGTCCGAMTGTGCTTTGAGGAGTTCACCACGTCCCCCTACGAGATGCTGGTGCTGGTGAGGCAGTTCTTCCAGGACATCAMCAGCTGCTGCAGMCAAGGAGACCTTCGAGMGGACTGCAGCCAGGTGTACCGCAGTGCGTGCGCGGGGCCCCGGCAGCACAGCTCCTCCCCAGGTGTGGGGACAGATCCTGACTGCMTTGCCTGTCCCCTGCCCTCCCTTCTGCCACCCAGCCCTCCCTCTCCGCTGCCACCCGTGCCGGCAGGGACGTGGCGCCCGCTAGCACCAGGGTCCCTTACCGCCAGCTCGGTGGCATCCTGGCTGAGTTAGGCAGCAGTGCCCCGTCCGAGCCCCCCAGTAGCGTGGAGGGCAGCTCGGGGGCCGAGGMCTGCCAGGAGCCGGGCTCGGCGACGCGTCGGCGCCGTCCCCCACCATGCAGCAGACGCTTGGAGCCCTCCTGGATCCAGCCGCGAGCGCCGGCCCGMGGCTGAGGACGTATCCATCCCGTCCCACGGGATGCCGGAGGAGGGCGCCGGGACCCCCGCCCTCCCACATCGGCTCCCTTCGCCGCGAGGGATCAGCGCGGCGATGCCGGCGGCGGTCCCCAGCAGCGGCTCTGCGCAGCGCCGCGGGGTCGGGCGCCGTCCCACCGAGAGCCCCGAGCGGGTCACGCAGCTCCGCTTCCCCAGGATGGCTCCGCCGTTGCGGGGCCGGGCGGAGGGCGGCCCCGGGGACGGGGCGAGGGCGCGAGGCTGGGGGCTGAGCCGGCTGCGGGAGCCCGAGGACGGCGGGGCCGGACCCAGCTTTGATTCGAGCTTTGTTCTGAGCGCAGAGCAGCGCAGGMGGAGCCGCCAGCCGCCAGCGGGGGGCACCGGGAGCTCCTGGTGTACGTCACGGTGGCCAGCGTGGTGGCCGTGCTGCTGGCCATGGGCGGGCTGCTCTTCTACMGTATMGTCCMGGTCCTGCAGCGGGGAGCAGCGCTAAMGAGGGGGGCTGCGACCCCGAGGAGCCGGAGAGCAGGGCGCTGCAGGGAGCGCAGGGCTGCGCGGAGCTGGAGACGCAGGAGCTGTGA本發(fā)明人已經(jīng)確定SEQ ID NO 2編碼以下氨基酸序列(作為SEQ ID NO 3給出)。SEQ ID NO 3MPRLGSQVSLFRCTLLSSLLLVCSIHETEQNSYCQQIITERHLDHLQELADTQMQQPGTVSFRFISKMRLSDSVCYVKMFPLLGTILNRTTFKENSTNANKMKTVRKMYENIDENVDPCIRDEDDKEHALSEMCFEEFTTSPYEMLVLVRQFFQDIKQLLQNKETFEKDCSQVYRSACAGPRQHSSSPGVGTDPDCNCLSPALPSATQPSLSMTRAGRDVAPASTRVPYRQLGGILAELGSSAPSEPPSSVEGSSGAEELPGAGLGDASAPSPTMQQTLGALLDPMSAGPKAEDVSIPSHGMPEEGAGTPALPHRLPSPRGISAAMPMVPSSGSAQRRGVGRRPTESPERVTQLRFPRMAPPLRGRAEGGPGDGARARGWGLSRLREPEDGGAGPSFDSSFVLSAEQRRKEPPMSGGHRELLVYVTVASVVAVLLAMGGLLFYKYKSKVLQRGMLKEGGCDPEEPESRALQGAQGCAELETQEL編碼較短，即270個(gè)氨基酸的蛋白的第二轉(zhuǎn)錄物作為SEQ ID NO :4在下文中給出SEQ ID NO 4ATGCCCCGCCTCGGATCCCAGGTGTCCCTGTTCCGCTGCACCCTGCTCTCGTCCCTCCTCCTCGTCTGCAGCATCCATGAGACGGAGCAGMCAGCTACTGCCAGCAGATCATCACCGAGCGGCACCTGGACCACCTGCA
GGAGCTGGCGGACACGCAGATGCAGCAGCCGGGCACAGTGTCCTTCAGATTCATCAGCMGATGCGGCTGAGCGACTCTGTCTGCTACGTGAMGCCGCCTTCCCTTTGCTGGGCACCATCCTGMCAGGACGACGTTCAAGGAGMCTCMCAMCGCCMCMGATGMGACGGTGCGCMGATGTACGAAMCATCGATGAGGACGTGGACCCCTGCATCAGGGACGAGGATGACGAGGAGCACGCGCTGTCCGAMTGTGCTTTGAGGAGTTCACCACGTCCCCCTACGAGATGCTGGTGCTGGTGAGGCAGTTCTTCCAGGACATCAMCAGCTGCTGCAGMCAAGGAGACCTTCGAGMGGACTGCAGCCAGGTGTACCGCAGTGCGTGCGCGGGGCCCCGGCAGCACAGCTCCTCCCCAGAGCAGCGCAGGMGGAGCCGCCAGCCGC CAGCGGGGGGCACCGGGAGCTCCTGGTGTACGTC
ACGGTGGCCAGCGTGGTGGCCGTGCTGCTGGCCATGGGCGGGCTGCTCTTCTACMGTATMGTCCMGGTCCTGCAGCGGGGAGCAGCGCTAAMGAGGGGGGCTGCGACCCCGAGGAGCCGGAGAGCAGGGCGCTGCAGGGAGCGCAGGGCTGCGCGGAGCTGGAGACGCAGGAGCTGTGASEQ ID NO :4編碼以下氨基酸序列(作為SEQ ID NO :5給出)SEQ ID NO 5MPRLGSQVSLFRCTLLSSLLLVCSIHETEQNSYCQQIITERHLDHLQELADTQMQQPGTVSFRFISKMRLSDSVCYVKMFPLLGTILNRTTFKENSTNANKMKTVRKMYENIDEDVDPCIRDEDDEEHALSEMCFEEFTTSPYEMLVLVRQFFQDIKQLLQNKETFEKDCSQVYRSACAGPRQHSSSPEQRRKEPPMSGGHRELLVYVTVASVVAVLLAMGGLLFYKYKSKVLQRGAALKEGGCDPEEPESRALQGAQGCAELETQEL·除以上外，本發(fā)明人已經(jīng)確定了鳥類IL34基因的序列和原雞基因組中存在的示范性IL34基因的序列，其作為SEQ ID NO 6在下文中給出SEQ ID NO 6ATGCACCAGGGCTGCGCGGCTGTCCTCTGTGTCCTGGCCGTGCTGGGGCTGGAGGTGGCTGCGCTGGGGGAATGCGAGCTCGCCCGCCTGCTGCAGGACAAGCTGCGGTATGAGATGCGCCTGCAGTACATGAAGCACAACTTCCCCATTGACTACACTCTCCGGGTGCAGCACGAGGAGGTGCTGCGGACCGCCAACGTCACCCGCCTGCGTGATGGGAAGGTGTCGGAGGCGTCGCTGCGCTACCTGTGGTTCCACGCCTGCTCCCAGGCGGTGCTGCACATCCTCGAGGTGCTGCCGGAGAAGCACCCGTCCCGTGGGTACACGCAGGAGCTGAGCCAGCTTTTGGATGCCCTGGGCGTGGAGTACAGTGGGTACCGGCAGAGCGATGTGGACGCGGTGGTGGCCGACCTGGTGAAGCAGCTGCACAGCGGCGATAGCCGGCAGAAGGCCGTGCGCCCCAAAGCACTGCTGGACAACTGCCTCAAGGTCCTGCGGATGCTCTTCGGGGCACACTGTCGGTGGGACTCCGCTSEQ ID NO 6編碼以下氨基酸序列(作為SEQ ID NO :7給出)SEQ ID NO 7MHQGCAAVLCVLAVLGLEVAALGECELARLLQDKLRYEMRLQYMKHNFPIDYTLRVQHEEVLRTANVTRLRDGKVSEASLRYLWFHACSQAVLHILEVLPEKHPSRGYTQELSQLLDALGVEYSGYRQSDVDAVVADLVKQLHS⑶SRQKAVRPKALLDNCLKVLRMLFGAHCRWDSA因此，在第一方面，本發(fā)明涉及命名為SEQ ID NOS : 1_7的序列，其編碼鳥類CSFl基因(SEQ ID NOS : I，2 和 4)，鳥類 IL34 基因(SEQ ID NO 6),鳥類 CSFl 蛋白(SEQ ID NOS 3和5)和鳥類IL34蛋白(SEQ ID NO :7)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本文中所述任何序列的片段、類似物、部分、突變體、變體、衍生物和/或同源物/直向同源物。有利地，由本發(fā)明提供的片段、類似物、部分、突變體、變體、衍生物和/或同源物/直向同源物可以具有功能或活性——即，它們保留野生型鳥類CSFl和IL34基因/蛋白的功能。術(shù)語“突變體”可以包括天然存在的核酸或蛋白突變體或通過引入一個(gè)或多個(gè)核酸或氨基酸添加、缺失、置換或反轉(zhuǎn)而人工創(chuàng)建的那些。與以上詳述的鳥類CSFl和IL34核酸/蛋白序列同源的序列可以存在于許多不同的鳥類物種，包括屬于上述不同綱和目的那些物種的每ー種中。技術(shù)人員應(yīng)該理解同源序列可以展示低至約20或30%序列同源性或同一性，然而，在其他情形中，同源序列可以展示與以上給出的不同序列的至少 40，50，60，6570，75，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99%同源性或同一性。因此，其他鳥類物種的同源形式包括在本發(fā)明的范圍中。利用本文中所述的不同核酸和氨基酸序列，本領(lǐng)域中技術(shù)人員可以容易地在其他鳥類物種中鑒定相關(guān)的序列。例如，獲自特定物種的核酸可以利用本文中所述的序列的片段或部分來探測，以鑒定同源或密切相關(guān)的序列。在其他方法中，特異于本文中所述CSFl或IL34蛋白或關(guān)于本文中所述CSFl或IL34蛋白有選擇性的抗體可以用于探測或結(jié)合其他鳥類物種中的同源蛋白。這樣的抗體在下文中更加 詳細(xì)地描述。例如由于多態(tài)性導(dǎo)致的天然變異，可以存在于由任何給定物種分離的CSFl和IL34基因或蛋白序列之間；這些變體可以作為蛋白和/或基因出現(xiàn)，所述蛋白和/或基因相對(duì)于參考序列(例如任何上述序列)，展示一個(gè)或多個(gè)氨基酸/核酸置換、添加、缺失和/或反轉(zhuǎn)。應(yīng)該理解所有這樣的變體，尤其是具有功能和/或展示所需活性的那些，包括在本發(fā)明的范圍中。另外地，或備選地，本文中所述的不同氨基酸序列(即蛋白或肽)的類似物可以通過將ー個(gè)或多個(gè)保守的氨基酸置換引入至基本序列(primary sequence)而制備。本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)該理解術(shù)語“保守的置換”意欲包括將蛋白或肽的ー個(gè)或多個(gè)氨基酸取代為具有類似性質(zhì)的替換氨基酸的行為，并且該行為基本不改變天然(或野生型)蛋白的物理-化學(xué)性質(zhì)和/或結(jié)構(gòu)或功能。這種類型的類似物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如在本領(lǐng)域中眾所周知地，遺傳密碼的簡并性允許在不改變基本氨基酸序列的條件下置換密碼子中的ー個(gè)或多個(gè)堿基。結(jié)果，盡管已知本申請(qǐng)中所述的序列編碼鳥類CSFl和IL34蛋白，但是密碼的簡并性可以用于產(chǎn)生編碼相同的基本氨基酸序列的不同核酸序列。某些鳥類CSFl和IL34基因和/或蛋白序列的供應(yīng)致使本領(lǐng)域中技術(shù)人員可能表達(dá)和/或純化鳥類CSFl和IL34基因和/或蛋白。通過舉例，可以使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)來表達(dá)和/或純化重組的鳥類CSFl和IL34基因和/或蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將本文中所述的CSFl和IL34核酸序列(或?qū)嶋H上其任何片段或部分)引入至載體系統(tǒng)中，所述載體系統(tǒng)隨之可以引入至原核和/或真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)——這樣的載體可以稱為真核/原核表達(dá)載體?？梢杂糜谶@樣的技術(shù)中的方法和載體詳細(xì)記述在Sambrook等，(MolecularCloning A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)■), CSHL, 1989)中。通過舉例，本文中所述的鳥類CSFl和IL34基因(或其片段)可以克隆到多種載體中，包括，例如，質(zhì)粒、噬菌體、黏端質(zhì)粒、病毒載體、酵母人工染色體和/或細(xì)菌人工染色體。CSFl和IL34基因和/或蛋白可以在具有或不具有融合異源序列的條件下表達(dá)。CSFl或IL34融合蛋白可以利用pET和pGEX型載體產(chǎn)生和表達(dá)，所述載體在緊接克隆位點(diǎn)的下游包含編碼異源肽序列(諸如，例如，肽標(biāo)記物)的短核酸序列。這種類型的載體特別有效用于生成標(biāo)記的CSFl和IL34蛋白，所述CSFl和IL34蛋白可以通過例如，親和純化程序容易地由雜蛋白混合物中除去、分離或純化。分離標(biāo)記的(融合)蛋白，諸如，例如，與短肽(包括例如組氨酸或谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)部分)標(biāo)記或融合的那些的合適方法包括使用鎳柱或谷胱甘肽-瓊脂糖基底。其他技術(shù)詳細(xì)記述在SambiOOk等，(1989)中。其中已經(jīng)克隆了 CSFl或IL34基因(或其片段)的載體可以利用多種技術(shù)引入或轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中——這樣的技術(shù)可以另外稱為轉(zhuǎn)染方案。轉(zhuǎn)染方案利用這樣的條件，所述條件致使細(xì)胞膜對(duì)于化合物諸如核酸而言是可穿透的。通過舉例，可能利用電穿孔，熱激，化學(xué)化合物諸如，例如，磷酸鈣、磷酸鍶，顯微注射技術(shù)和/或基因槍來促進(jìn)載體(包括表達(dá)載體)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。因此，在第二方面，本發(fā)明提供包含鳥類CSFl和/或IL34基因或其片段的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體可以是包含用于驅(qū)動(dòng)宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的元件的表達(dá)載體。在第三方面，本發(fā)明提供使用根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。通過舉例，宿主細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞，諸如，例如細(xì)菌細(xì)胞， 諸如選自由大腸桿菌(E. coli)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)和芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)組成的組中的ー種,或者在另ー個(gè)實(shí)施方案中，是酵母、真菌、昆蟲、植物或動(dòng)物細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，由本發(fā)明提供的融合或未融合的重組鳥類CSFl和/或IL34蛋白可以用于產(chǎn)生抗體，所述抗體展示關(guān)于重組鳥類CSF1/IL34或其片段的親和性，或特異于重組鳥類CSF1/IL34或其片段，或關(guān)于重組鳥類CSF1/IL34或其片段具有選擇性。特別地，重組鳥類CSFl和IL34蛋白可以用于免疫動(dòng)物(例如嚙齒類動(dòng)物等)以產(chǎn)生多克隆血清，或與雜交瘤一起使用以生成單克隆抗體。因此，本發(fā)明的第四方面提供結(jié)合試劑，例如抗體，其特異性(或選擇性)結(jié)合鳥類CSFl或IL34蛋白(諸如，例如，本文中所述的那些)中存在的ー個(gè)或多個(gè)表位。本文中所述的鳥類CSF1/IL34基因/蛋白可以用于在鳥類宿主中執(zhí)行多種免疫學(xué)作用。例如，可以使用調(diào)節(jié)鳥類CSF1/IL34基因表達(dá)和/或蛋白水平的方法或化合物來調(diào)節(jié)鳥類細(xì)胞(例如單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞)，生產(chǎn)，増殖，存活和/或分化。另外，可以使用調(diào)節(jié)鳥類CSF1/IL34基因表達(dá)和/或蛋白水平的方法或化合物來調(diào)節(jié)組織和/或器官的生長、增殖和/或存活。調(diào)節(jié)CSF1/IL34基因/蛋白可以導(dǎo)致成熟鳥類巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。特別地，鳥類巨噬細(xì)胞吞噬活性和我們的殺腫瘤活性可以通過本文中所述的方法或化合物來提聞。在其他實(shí)施方案中，可以使用調(diào)節(jié)鳥類CSF1/IL34基因/蛋白表達(dá)/水平的方法或化合物來調(diào)節(jié)初次鳥類免疫反應(yīng)和/或致敏免疫系統(tǒng)細(xì)胞以進(jìn)行隨后的活化刺激。通過舉例，細(xì)胞因子，例如，促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生可以通過使用本文中所述的鳥類CSF1/IL34基因/蛋白的方法/用途或調(diào)節(jié)CSF1/IL34基因/蛋白表達(dá)或水平的化合物來調(diào)節(jié)。綜上所述，本發(fā)明的第五方面提供調(diào)節(jié)鳥類生長和/或器官發(fā)育的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)鳥類CSFl或IL34基因表達(dá)和/或CSFl或IL34蛋白水平的步驟。在第六方面，本發(fā)明提供鳥類CSFl或IL34基因和/或蛋白用于調(diào)節(jié)鳥類生長和/或器官發(fā)育的用途。在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中，由骨髓產(chǎn)生循環(huán)單核細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞取決于CSFl和IL34的活性。關(guān)于鳥類基因組也編碼CSFl和IL34基因的發(fā)現(xiàn)提供可以調(diào)節(jié)鳥類單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞發(fā)育的手段。
因此，在第七方面，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)鳥類免疫系統(tǒng)的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)鳥類CSFl和/或IL34基因表達(dá)和/或CSFl和/或IL34蛋白水平的步驟。在第八方面，本發(fā)明提供鳥類CSFl和/或IL34基于和/或鳥類CSFl和/或IL34蛋白用于調(diào)節(jié)鳥類免疫系統(tǒng)的用途。本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)該理解通過增加鳥類CSFl或IL34基因表達(dá)水平，可能增加巨噬細(xì)胞發(fā)育。類似地，通過增加體內(nèi)CSFl或IL34水平，可能調(diào)節(jié)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞發(fā)
育。
商業(yè)和家庭養(yǎng)殖業(yè)依賴于有效的疫苗，以確保鳥類家畜，例如家禽/禽鳥物種在養(yǎng)殖時(shí)保持健康。充分確定可以使用佐劑來提高或改善疫苗的功效?？梢耘c疫苗組合用于養(yǎng)殖業(yè)的佐劑是特別有效的，且在這一點(diǎn)上，鳥類CSFl和IL34蛋白，例如本文中所述的原雞CSFl和IL34蛋白(或其片段)，可以用作疫苗佐劑。因此，本發(fā)明的第九方面提供鳥類CSFl和IL34蛋白，或其片段，其用作疫苗佐劑。在第十方面，本發(fā)明提供免疫原性組合物，其潛在地有效用作鳥類疫苗，所述免疫原性組合物包含鳥類CSFl和/或IL34蛋白。CSFl或IL34蛋白促進(jìn)骨髓細(xì)胞發(fā)育的能力為本文中所述的鳥類CSFl和/或IL34蛋白提供作為可以用于體外誘導(dǎo)或促進(jìn)巨噬細(xì)胞和/或其他骨髓細(xì)胞生長的試劑的進(jìn)一步的用途。通過使用鳥類CSFl或IL34蛋白來促進(jìn)骨髓細(xì)胞群的產(chǎn)生，可能產(chǎn)生骨髓細(xì)胞群以用于研究。技術(shù)人員應(yīng)該理解基因表達(dá)水平可以通過向受試者施用一個(gè)或多個(gè)拷貝的基因來調(diào)節(jié)。通過舉例，多拷貝的鳥類CSFl和/或IL34基因(或其功能片段)可以以可表達(dá)載體(諸如本文中所述的那些)的形式施用于鳥類受試者。在其他實(shí)施方案中，純化的鳥類CSFl和/或IL34蛋白(可能是重組鳥類CSFl或IL34蛋白)可以施用于鳥類以增加循環(huán)CSFl和/或IL34的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，鳥類CSFl或IL34蛋白或基因(或其功能片段)可以直接加入或施用于特定的細(xì)胞類型、組織或器官。例如，鳥類CSFl或IL34蛋白或基因可以直接施用于鳥類骨髄。應(yīng)該理解,術(shù)語“調(diào)節(jié)(modulate或modulating) ”指相對(duì)于,例如，正常健康(野生型)鳥類受試者中觀察到的表達(dá)或蛋白水平，增高或降低CSFl或IL34基因表達(dá)水平和/或CSFl或IL34蛋白水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，CSFl或IL34基因表達(dá)水平或CSFl或IL34蛋白水平可以進(jìn)行體內(nèi)調(diào)節(jié)。在其他實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)鳥類CSFl和/或IL34基因表達(dá)和/或CSF1/IL34蛋白水平的化合物可以用于實(shí)現(xiàn)以上詳述的任何作用或用于任何所述方法。這樣的化合物可以包括，例如，有機(jī)小分子、核酸(包括有義和反義DNA/RNA序列)和抗體和/或其抗原結(jié)合片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠抑制乳鐵蛋白濃度和/或表達(dá)的化合物可以包括，例如，DNA或RNA寡核苷酸，優(yōu)選反義寡核苷酸。有效用作鳥類CSF1/IL34基因和/或蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)劑的寡核苷酸可以是作為小/短干擾和/或沉默RNA且以下稱為SiRNA而被本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的RNA分子。這樣的SiRNA寡核苷酸可以采取天然RNA雙鏈體或已經(jīng)以某種方式(例如通過化學(xué)修飾)修飾為具有核酸酶抗性的雙鏈體的形式。另外地，或備選地，SiRNA寡核苷酸可以采取短發(fā)夾RNA(shRNA)表達(dá)或質(zhì)粒構(gòu)建體的形式。技術(shù)人員應(yīng)該容易理解，反義寡核苷酸可以用于調(diào)節(jié)(例如，抑制、下調(diào)或基本消除)任何給定基因的表達(dá)。因此，由本發(fā)明提供的(反義)寡核苷酸可以設(shè)計(jì)為調(diào)節(jié)(即抑制或中和)鳥類CSF1/IL34基因和/或其蛋白產(chǎn)物的表達(dá)和/或功能。通過分析天然或野生型乳鐵蛋白序列和借助于運(yùn)算法則諸如BIOPREDsi，本領(lǐng)域中技術(shù)人員可以容易地確定或通過計(jì)算預(yù)測對(duì)這些基因具有最佳敲低作用的核酸序列(見例如:http://www. biopredsi. org/start, html)。因此,技術(shù)人員可以生成和測試不同寡核苷酸的陣列或文庫，從而確定它們是否能夠調(diào)節(jié)鳥類CSF1/IL34乳鐵蛋白基因和/或蛋白的表達(dá)或功能。結(jié)合鳥類CSFlR從而導(dǎo)致増加的骨髓細(xì)胞生成、増殖和/或分化的基因的鑒定可以用于篩選鳥類以獲得展示增高水平的CSFl和/或IL34基因表達(dá)或增高水平的CSFl和/或IL34蛋白的個(gè)體的方法中。具有這些表型 的鳥類可以特別有效用于，例如，育種程序。因此，本發(fā)明的第i^ 一方面提供篩選鳥類物種、特別是在農(nóng)業(yè)上對(duì)于潛在參與育種程序有意義或重要的鳥類物種(諸如，例如，分類為家禽或禽鳥的那些)的方法，所述方法包括以下步驟a)提供來自鳥類物種的核酸樣品；和b)將CSFl和/或IL34基因表達(dá)水平和參考核酸樣品或數(shù)值進(jìn)行比較；其中可以選擇相對(duì)于參考核酸樣品或數(shù)值中存在的水平展示出増加水平的CSFl和/或IL34基因表達(dá)的鳥類物種以參與育種程序。在一個(gè)實(shí)施方案中，參考核酸樣品可以源自展示正?；蛞吧虲SF1/IL34基因表達(dá)的鳥類個(gè)體。在其他實(shí)施方案中，參考核酸數(shù)值可以代表鳥類CSF1/IL34基因表達(dá)的平均值(mean)、平均數(shù)(average)或中值水平。在第十二方面，本發(fā)明提供能夠抑制CSF1/IL34基因表達(dá)或蛋白產(chǎn)生以治療病癥，諸如由異常CSF1/IL34基因/蛋白表達(dá)引起或與之有關(guān)的炎癥的化合物。本發(fā)明還可以擴(kuò)展到所述化合物用于制備治療由異常CSF1/IL34基因/蛋白表達(dá)導(dǎo)致或與之相關(guān)的鳥類疾病的藥物和用于治療由異常CSF1/IL34基因/蛋白表達(dá)導(dǎo)致或與之相關(guān)的鳥類疾病的方法的用途。術(shù)語“化合物”可以包括有機(jī)小分子，天然鳥類CSF1/IL34蛋白的片段，CSFl/IL34結(jié)合試劑(例如，抗體或其抗原結(jié)合片段)或核酸，例如設(shè)計(jì)用于抑制鳥類CSF1/IL34基因表達(dá)的反義序列。發(fā)明詳述現(xiàn)參考以下附圖更詳細(xì)地描述本發(fā)明，所述附圖顯示圖I 雞CSFl的基于結(jié)構(gòu)的序列分析。A.雞(左)和小鼠(右)CSFl結(jié)構(gòu)的帶狀表示法。雞CSFl的PDB文件利用3D-Jigsaw，以小鼠CSFl結(jié)構(gòu)作為模板(PDB 3ejj)來生成。該附圖在Polyview-3D中由PyMol表示。殘基根據(jù)親水性著色,其中黃色用于疏水性殘基(A，C，F(xiàn)，G，I，L，M，P，V)，深黃色用于兩性殘基(H，W Y)，橙色用于極性殘基(N, Q，S，T)，紅色用于帶負(fù)電荷的殘基(D，E)且褐色用于帶正電荷的殘基(R，K)。在小鼠結(jié)構(gòu)上標(biāo)記形成鏈間ニ硫鍵的半胱氨酸。通過在雞序列中存在另外的氨基酸形成的環(huán)由黑色箭頭標(biāo)記。紅色箭頭顯示針對(duì)CSFlR的結(jié)合位點(diǎn)I內(nèi)的非保守置換，如在小鼠中所述地(Chen等2008)。B.雞CSFl (左)和SCF(右)的ニ聚體界面。殘基如A中進(jìn)行著色。在同型ニ聚體界面處存在的氨基酸通過將它們的原子表示為球形來突出顯示。圖2 :雞IL34的基于結(jié)構(gòu)的序列分析。A.雞IL34(左)的帶狀表示法。顯示雞CSFl (中間)和雞SCF(右)的結(jié)構(gòu)以進(jìn)行比較。雞IL34的PDB文件利用3D-Jigsaw,以小鼠CSFl結(jié)構(gòu)作為模板(PDB 3ejj)來生成。雞SCF的PDB文件利用3D-Jigsaw，以人SCF結(jié)構(gòu)作為模板(PDB Iexz)來生成。該附圖在Polyview-3D中由PyMol表示。殘基如附圖IA中進(jìn)行著色。紅色箭頭突出顯示構(gòu)成CSFl中受體結(jié)合位點(diǎn)I的相應(yīng)殘基。B.雞IL34的ニ聚體界面。殘基如A中進(jìn)行著色。在同型ニ聚體界面處存在的氨基酸通過將它們的原子表示為球形來突出顯示。圖3 :鳥類CSFlR的表征。A.斑胸草雀(左)和雞(右)CSFlR的CSFl-結(jié)合位點(diǎn)I的帶狀表示法。雞和斑胸草雀CSFlR的PDB文件利用3D-Jigsaw，以小鼠CSFl結(jié)構(gòu)作為模板(PDB 3ejj)來生成。該附圖在PolyVieW-3D中由PyMol表示。殘基如附圖IA中進(jìn)行著色。箭頭指向ー些非保守氨基酸置換。B.斑胸草雀(左)和雞(右)CSFlR的D1-D3結(jié)構(gòu)域與其各自CSFl配體的疊置。兩種CSFlR結(jié)構(gòu)由與圖3A中相同的角度來觀察。來自圖IA的雞CSFl結(jié)構(gòu)在此處在Polyview-3D中表示 為表面。斑胸草雀CSFl結(jié)構(gòu)的PDB文件利用3D-Jigsaw，以小鼠CSFl結(jié)構(gòu)作為模板(PDB 3ejj)來生成并使用PolyvieW-3D表示。殘基如附圖IA中進(jìn)行著色。C.鳥類CSFlR基因5’末端的Pustell DNA矩陣比對(duì)。兩種基因排列多至2. 5kb上游并通過第一內(nèi)含子。D.斑胸草雀和雞CSFlR基因的啟動(dòng)子-外顯子I區(qū)的序列比對(duì)。比對(duì)利用MacVector進(jìn)行。確定關(guān)于PU. 1，C/ΕΒΡ和AMLl的結(jié)合位點(diǎn)。E.斑胸草雀和雞CSFlR基因的內(nèi)含子中高度保守區(qū)段的比對(duì)。比對(duì)如D中進(jìn)行。確定關(guān)于PU. 1，C/ΕΒΡ和AMLl的結(jié)合位點(diǎn)。F.通過原位整裝制片以20HH定位雞胚胎中的CSFlRmRNA。該附圖顯示反義(左)和有義對(duì)照ISH(右)。圖4 :雞CSFl和IL34的表達(dá)和活性。ん由使用pEF6-cCSFl、pEF6_cIL34或空pEF6載體轉(zhuǎn)染的HEK293T表達(dá)和分泌雞CSFl和IL34。細(xì)胞利用陽離子脂質(zhì)體(Lipofectamine)轉(zhuǎn)染并溫育72小時(shí)。細(xì)胞裂解產(chǎn)物和上清在非還原和還原條件下在SDS-page凝膠上跑電泳，并使用抗V5標(biāo)記物抗體探測。箭頭顯示關(guān)于雞CSFl (約60kD)和IL34(約25kDa)的雙條帶，其中上方條帶是這些蛋白的糖基化形式，而下方條帶構(gòu)成非糖基化形式。B.利用來自pEF6 (左)，pEF6-cCSFl (中間)和pEF6_cIL34 (右)轉(zhuǎn)染的HEK293T的20 %上清獲得分化第10天的雞骨髓來源的巨噬細(xì)胞。圖5 CSFU IL34和CSFlR的共同進(jìn)化。A.總結(jié)通過CAPS，即基于PERL的軟件(Fares和McNally 2006a)進(jìn)行共同進(jìn)化分析的主要結(jié)果的圖表。在IL34(左，粉色)和CSFlR胞外結(jié)構(gòu)域(右，藍(lán)色)之間共同進(jìn)化的殘基如通過CAPS (Fares和McNally 2006a)進(jìn)行鑒定來顯示。相關(guān)系數(shù)通過兩種共同進(jìn)化氨基酸之間的線的顔色來表示，且測量這些位點(diǎn)處的相關(guān)進(jìn)化變化。殘基數(shù)參考人序列。B.基于共同進(jìn)化分析推測的CSFlR的IL34結(jié)合模式。雞CSFlR D1-D5的帶狀表示法通過疊置關(guān)于圖3生成的雞CSFlR D1-D3模型和在3D-Jigsaw中利用人KIT D1-D5(PDB 2e9w)作為模板制備的雞CSFlR D4-D5模型來創(chuàng)建。雞IL34模型與圖2中的相同，僅處于稍微不同的角度。所有模型在PolyVieW-3D中表示。殘基如圖IA中著色，雞中共同進(jìn)化的同源殘基以藍(lán)色突出顯示。圖6 :IPTG誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)的Bis-Tris NuPAGE分析。圖7 :濃縮的單體雞CSF-I蛋白的SDS-PAGE分析。圖8 :關(guān)于親本BaF/3細(xì)胞系的全部三種CSFl制劑的劑量-反應(yīng)數(shù)據(jù)。圖9 :關(guān)于表達(dá)雞CSFlR的BaF/3細(xì)胞的全部三種CSFl制劑的劑量-反應(yīng)數(shù)據(jù)。


圖10 :關(guān)于表達(dá)豬CSFlR的BaF/3細(xì)胞的全部三種CSFl制劑的劑量-反應(yīng)數(shù)據(jù)。方法生物信息學(xué)分析序列利用NCBI數(shù)據(jù)庫和來自Santa Cruz大學(xué)和Ensemble的基因組資源來確定http://www.ncbi.nlm.nih.gov/index.html, http://genome.ucsc.eau/ 和 http://www.ensembl. org/index, html。斑胸草雀 CSFlR 基因的翻譯利用 GeneWise 程序(http://www.ebi. ac. uk/Tools/ffise2/index, html)來預(yù)測，并且雞 IL34EST 利用 ESTscan (http: //www.ch. emonet. org/software/ESTScan2. html)來分析?？寺‰u和斑胸草雀cDNA基因 如制造商所述(Invitrogen,Paisley,英國)，利用TRIzol試劑提取來自雞階段20胚胎和斑胸草雀腦的RNA。cDNA利用Superscript III反轉(zhuǎn)錄酶和TOPO TA克隆試劑盒通過RT-PCR來克隆，以進(jìn)行測序(Invitrogen, Paisley,英國)。雞和斑胸草雀CSFl以及斑胸草雀IL34的5’ cDNA末端快速擴(kuò)增(5 ’ RACE)利用第一選擇RLM-RACE試劑盒(Ambion，Warrington,英國)進(jìn)行。利用Τ0Ρ0 TA克隆試劑盒克隆PCR產(chǎn)物，以測序(Invitrogen,Paisley，英國)。雞CSFl的3’末端利用改良的3’cDNA末端快速擴(kuò)增(3' RACE)技術(shù)，即3' RACE LaNe (Park 2004)來克隆。分離包含CSFl的雞BACs關(guān)于CSFl 的雞探針利用 Prime-a-gene 試劑盒(Promega, Southampton,英國)制備，并與雞CH0RI-261BAC文庫(http://bacpac. chori. org/chicken261. htm)在65°C, 10%PEG8000 ；7% SDS ；1. 5X SSC中雜交過夜。然后在65°C，將濾器在2X SSC ;0. I % SDS中洗滌兩次并在O. 5X SSC ；0. 1% SDS中洗滌一次，并在室溫下暴露于放射自顯影膠片I周。鑒定了 6 個(gè)陽性克隆44-116，68-D10，22-M13，171-K3，171-N10 和 172-023。44-116，68-D10和171-N10通過PCR驗(yàn)證。這些克隆是全部末端-測序的并且通過Blat顯示定位在Chr26上。序列分析克隆利用BigDye終止子v3. I循環(huán)測序試劑盒(Applied Biosystems (應(yīng)用生物系統(tǒng))，F(xiàn)oster City, CA.美國)，在ABI 3730x1測序儀上進(jìn)行測序。遺傳定位雞CSFl雞CSFl的437bp基因組片段通過以下引物擴(kuò)增ckcsfex4-forl GCGACTCTGTCTGCTACGTG 和 ckcsfex5_revl CGAAGGTCTCCTTGTTCTGC 測序來自東蘭辛(EastLansing)參考群(Crittenden等1993)的親本DNA確定外顯子4中的SNP (雄性紅色叢林禽鳥(Red Jungle Fowl)中為G/A ;雌性白色來亨雞(Leghorn)中為A/A)，并且測序來自確認(rèn)定位于Chr26的CSFl的52種回交DNA。連鎖分析利用定位管理程序(Map managerprogram)來進(jìn)行(Manly 和 Olsen, 1999)。系統(tǒng)發(fā)生分析來自不同分類單位的注釋的CSFl、IL34和CSFlR基因的氨基酸序列利用ClustalW軟件來比對(duì)(Thompson等1994) (Gonnet蛋白重量矩陣，無末端間隙失活，系統(tǒng)設(shè)定參數(shù))。利用PSIPRED預(yù)測基于結(jié)構(gòu)的比對(duì)的ニ級(jí)結(jié)構(gòu)(Jones 1999)，并且比對(duì)通過DomainFishing 進(jìn)行(Contreras-Moreira 和 Bates 2002)。整裝制片原位雜交
每周收集受精的白色來亨雞卵，并在38°C溫育發(fā)育3-6天。將胚胎切割到冰冷的DEPC-PBS中，按照(Hamburger和Hamilton 1992)進(jìn)行階段分級(jí)，并立即在4% PFA/DEPC-PBS中固定過夜，通過分級(jí)甲醇/PBS步驟脫水到100%甲醇中，并保存在-20°C。按照(Nieto等1996)進(jìn)行胚胎的整裝制片ISH。CSFlR探針利用Ark-Genomics (Roslin,英國)克隆654作為模板來制備。雞CSFl 和 IL34 表達(dá)HEK293T細(xì)胞(ATCC)在增補(bǔ)有10%熱失活(HI)_FCS，2mM L-谷氨酰胺，O. ImM非必需氨基酸和抗生素(100ug/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素)的DMEM(Sigma)中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天，將8xl05個(gè)HEK293T細(xì)胞涂布在6孔板中的2ml不含抗生素的生長培養(yǎng)基中。按照產(chǎn)品說明書，使用陽離子脂質(zhì)體(Lipofectam oine) 2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞。細(xì)胞然后在37°C,C02溫育箱中溫育24hr并轉(zhuǎn)移至各含7ml生長培養(yǎng)基(無抗生素)的25cm2培養(yǎng)皿中再培養(yǎng)48hr，隨后收獲上清并在2% SDS-IOmM Tris緩沖液中裂解細(xì)胞。細(xì)胞提取物和上清然后與含有或不含DTT (5mM最終)或B-巰基こ醇(5%最終)的Laemli緩沖液混合，在4-12%梯度SDS-PAGE凝膠上跑電泳，并按照Bio-Rad儀器說明書轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。該膜利用小鼠抗_v5標(biāo)記物抗體(AbD Serotec)和抗小鼠IgG HRP-綴合的抗體(Cell SignalingTechnology (細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)技術(shù)))來印跡。骨髓分化通過使用注射器和鈍針用PBS沖洗來自2個(gè)股骨和2個(gè)脛骨的骨髓獲得雞骨髓細(xì)胞。對(duì)于各種條件，沉淀總細(xì)胞的1/250并重新混懸在4ml完全RPMI (增補(bǔ)有10%熱失活(HI)-FCS，2mM L-谷氨酰胺，100ug/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素)中，其中含有來自空pEF6-, pEF6-cCSFl-或 pEF6_cIL34_ 轉(zhuǎn)染的 HEK293T 的 20%上清。細(xì)胞涂布在 60mm 細(xì)菌學(xué)平板中并在37°C，CO2溫育箱中溫育12天。分子內(nèi)和分子間共同進(jìn)化分析為了確定共同進(jìn)化模式，我們使用基于以前公開的氨基酸位點(diǎn)間相關(guān)共同進(jìn)化模式的參數(shù)方法(Fares和Travers 2006b)。為了進(jìn)行分析，我們使用執(zhí)行該方法的軟件CAPS版本I. O (Fares和McNally 2006b)。該方法被證實(shí)在若干個(gè)案研究中成功產(chǎn)生很有意義的結(jié)果，所述個(gè)案研究包括目標(biāo)為確定膜蛋白(Fuchs等2007)，HIV gpl20和gp41蛋白(Travers 等 2007)以及 Hsp70_Hop-Hsp90 系統(tǒng)(Travers 和 Fares 2007)的共同進(jìn)化。為了評(píng)估氨基酸位點(diǎn)間相關(guān)進(jìn)化模式的概率和顯著性，我們使用大量隨機(jī)取樣(I百萬和I千萬份隨機(jī)樣品)和小α值(0.001)以最小化假陽性率(I型誤差)。CAPS還如前所述執(zhí)行逐步減低的排列程序(Westfall和Young 1993 ；Travers和Fares 2007),從而校正多重測試。氨基酸置換的分?jǐn)?shù)使用合適的區(qū)段置換矩陣(blocks substitution matrix)(BL0SUM80) (Henikoff和Henikoff 1992)，依賴于我們的蛋白序列的相似性來獲得。共同進(jìn)化分析中報(bào)告的所有氨基酸位點(diǎn)顯示來自參考序列(人)的蛋白中的位置。共同進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)的顯現(xiàn)我們使用軟件Cytoscape (版本2. 6. I) (Shannon等2003)來顯現(xiàn)由CAPS確定的共同進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape最初設(shè)計(jì)用于顯現(xiàn)雙分子相互作用網(wǎng)絡(luò)。然而，該方案可以用于顯現(xiàn)描述物體間相互作用的任何數(shù)據(jù)。CAPS可以產(chǎn)生四個(gè)文件，其中含有共同進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)和補(bǔ)償性突變的信息。我們使用該程序產(chǎn)生共同進(jìn)化氨基酸之間相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)并使用CAPS中產(chǎn)生的相關(guān)系數(shù)確定節(jié)點(diǎn)(氨基酸殘基)間連接線的著色模式。克隆雞CSF-I基因?qū)?yīng)于雞CSF-I活性片段的序列(NSYCQQIITERHLDHLQELADTQMQQPGTVSFRFISKMRLSDSVCYVKAAFPLLGTILNRTTFKENSTNANKMKTVRKMYENIDENVDPCIRDEDDKEHALSEMCFEEFTTSPYEMLVLVRQFFQDIKQLLQNKETFEKDCSQVYRSACAGPRQHSSSP)為在大腸桿菌中表達(dá)進(jìn)行密碼子最優(yōu)化并通過Blue Heron生物技術(shù)(WA，美國)來合成。改造該序列在5’末端具有BspHI限制性位點(diǎn)和在3’末端具有EcoRI限制性位點(diǎn)，并利用互補(bǔ)限制性位點(diǎn)NcoI和E coRI克隆到表達(dá)質(zhì)粒pET-28 (b)中。根據(jù)制造商方案(Invitrogen，CA，美國)，將由此生成的質(zhì)粒pTLW54轉(zhuǎn)化到MAX Efficiency DH5 α 化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌中。選擇卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測序以驗(yàn)證無誤差的ORF。pTLW54質(zhì)粒通過QIAprep spin miniprep試劑盒(Qiagen, CA,美國)按照制造商的建議分離并轉(zhuǎn)化到One Shot BL21 StarTM化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌(Invitrogen, CA,美國)中。再次測序PTLW54中的雞CSF-I基因，以驗(yàn)證無誤差的0RF。表達(dá)雞CSF-I蛋白將在37°C，225rpm搖動(dòng)下培育的pTLW54/0ne Shot BL21Star 大腸桿菌的過夜LB/Kan5°肉湯以I : 10更新到IL LB/Kan5°肉湯中。更新的培養(yǎng)物在225rpm搖動(dòng)下，37°C溫育2小時(shí)，以確保對(duì)數(shù)中期生長。蛋白表達(dá)使用終濃度為ImM的IPTG來誘導(dǎo)，其培育條件持續(xù)在37°C和225rpm搖動(dòng)。2小時(shí)誘導(dǎo)后，離心培養(yǎng)物并將大腸桿菌沉淀物保存在_80°C。在離心前，與非誘導(dǎo)對(duì)照相比，分析等分試樣的蛋白表達(dá)?？扇苄曰虿豢扇苄缘鞍准?jí)分在MES緩沖液中4-12% Bis-Tris NuPAGE凝膠上跑電泳分析。如圖6中所示，如預(yù)期地，誘導(dǎo)的培養(yǎng)物在不可溶性蛋白中產(chǎn)生約18. 7kDa的條帶。 純化并處理雞CSF-I蛋白破碎冷凍細(xì)胞沉淀物并洗滌內(nèi)含體至接近均質(zhì)。單體雞CSF-I蛋白利用2. 6x60cmSuperose 12尺寸排阻色譜柱(SEC)，在50mM Tris, pH8. 5,5mm EDTA，7M胍中純化。將洗脫的雞CSF-I以10倍稀釋在7M胍緩沖液中并容許通過添加50mM Tris, pH 8. 5，IOOmMNaCl，5mM EDTA, ImM氧化的谷胱甘肽，2mM還原的谷胱甘肽緩沖液，經(jīng)由8步，導(dǎo)致最終胍濃度為O. 15M的連續(xù)透析來重折疊。濃縮重折疊的雞CSF-I并且利用PBS中運(yùn)行的1x30cmSuperose SEC柱純化單體種類。將單體蛋白濃縮至O. 58mg/ml并通過具有和不具有BME的16% SDS-PAGE分析，如圖7中所示。純化雞CSF-I的等分試樣保存在_80°C。結(jié)果鑒定鳥類CSFl基因目前雞基因組中不存在注釋的CSFl基因，但是包含小鼠CSFl基因的區(qū)域展示與雞同線性，這提示雞基因組集合中存在間隙?；趯?duì)斑胸草雀基因組序列的特許訪問，可能鑒定清楚的CSFl直向同源物(在外顯子3中開始)[Chr26 =24187-27419, 2008年7月集合](GQ249405)。這隨之導(dǎo)致在Roslin研究所的雞EST群中鑒定部分CSFl序列。完整ORF通過5'和3' RACE來獲得，以確定完整⑶S。還鑒定了含有CSFl的BACs，并進(jìn)行末端測序以確認(rèn)定位于Chr. 26。實(shí)際上預(yù)測CSFl基因座位于雞基因組結(jié)合的間隙中，因?yàn)樵诎咝夭萑钢?，旁?cè)基因順序與哺乳動(dòng)物中相同。新鑒定的鳥類CSFl基因各包含8個(gè)外顯子。斑胸草雀基因編碼489個(gè)氨基酸的蛋白。在雞中已經(jīng)鑒定了兩種轉(zhuǎn)錄物——一種編碼490個(gè)氨基酸的蛋白，另ー種包含270個(gè)氨基酸(GQ249403和GQ249404)。較短的轉(zhuǎn)錄物缺少外顯子6的實(shí)質(zhì)部分。在哺乳動(dòng)物中，該外顯子編碼包含蛋白水解裂解位點(diǎn)的大結(jié)構(gòu)域，所述蛋白水解裂解位點(diǎn)允許由膜錨定的前體釋放CSFl。較短的轉(zhuǎn)錄物應(yīng)該編碼CSFl的膜錨定細(xì)胞表面形式，其不能裂解。雞CSFl的外顯子6還包含哺乳動(dòng)物基因中存在的獨(dú)特的葡胺聚糖(硫酸軟骨素)添加位點(diǎn)(SGXG/A)。因此，CSFl的基礎(chǔ)生物學(xué)，包括具有可變翻譯后修飾和不同功能的分泌形式和膜錨定形式(Dai等2004 Jang等2006 ；Nandi等2006)，在雞中似乎是保守的。鳥類CSFl的保守結(jié)構(gòu)為了評(píng)估鑒定的鳥類CSFl序列是否是 哺乳動(dòng)物CSFl的功能性直向同源物，利用Clustalff 軟件 http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/index, html (Thompson 等 1994)進(jìn)行物種間的推斷的氨基酸序列的多重比對(duì)(表I)。負(fù)責(zé)形成三個(gè)分子內(nèi)ニ硫鍵的6個(gè)半胱氨酸殘基(Pandit等1992)在鳥類中是保守的，但是形成位于ニ聚體界面處的鏈間ニ硫鍵并在包括斑馬魚和金魚的所有物種間保守的(Hanington等2007)半胱氨酸在鳥類中不保守。半胱氨酸和預(yù)測的螺旋的比對(duì)突出了與由小鼠中的共晶體推斷的CSFlR結(jié)合的CSFl的接觸殘基(Chen等2008)，其中ー些在鳥類中明顯具有趨異性。特別地，Asp91和94，Glnll3，Glull4，和Asnll7(位置編號(hào)參考表I中的小鼠序列)不是保守的或具有半保守置換。緊接著這些結(jié)合位點(diǎn)的下游，鳥類序列具有在哺乳動(dòng)物序列中不存在的另外的氨基酸。該比對(duì)還突出了小鼠中的Rlll置換為人中的Q，這可以解釋為什么人配體對(duì)小鼠細(xì)胞起作用，但反之卻不行(Bonifer和Hume 2008)。為了驗(yàn)證鳥類CSFl結(jié)構(gòu)預(yù)測，利用基于結(jié)構(gòu)的比對(duì)(通過Domain Fishing進(jìn)行)，使用 3D-Jigsaw http://bmm. cancerresearchuk. org/ 3djigsaw/ 產(chǎn)生 PDB 形式的3D 模型(Bates 等 2001)。獲得的 PDB 文件在 Jmol http://firstglance. jmol. org 中的FirstGlance 中觀察并利用 Polyview_3Dhttp://polyview, cchmc. org/polyview3d. html通過PyMol表示該模型(Porollo和Meller 2007)。預(yù)測鳥類CSFl具有與充分描述的哺乳動(dòng)物CSFl相同的四-螺旋束結(jié)構(gòu)(Pandit等1992)。在圖IA中，雞CSFl模型與公開的小鼠結(jié)構(gòu)比較(Chen等2008)。雖然總拓?fù)鋵W(xué)由哺乳動(dòng)物到鳥類是保守的，但是序列比對(duì)中存在的所有差別轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)變化。因此，雞CSFl的CSFlR結(jié)合位點(diǎn)I包括與小鼠結(jié)合位點(diǎn)I不同的電荷，因?yàn)榉潜Ｊ匕被嶂脫Q精確定位與受體(紅色箭頭)接觸。而且，預(yù)測雞序列中存在的額外殘基形成凸起，使得帶正電荷的Argl22在結(jié)合位點(diǎn)I和2之間伸出(黒色箭頭)。如以前提及地，在哺乳動(dòng)物中形成鏈間ニ硫鍵的半胱氨酸(在小鼠結(jié)構(gòu)上的標(biāo)記Cys)在雞CSFl中不存在，導(dǎo)致非共價(jià)締合的同型ニ聚體。這也是哺乳動(dòng)物中以及鳥類中密切相關(guān)的干細(xì)胞因子(SCF)的情形(Arakawa等1991)。這些蛋白可以形成穩(wěn)定的ニ聚體并誘導(dǎo)受體ニ聚化，這歸因于單ニ聚體(monodimer)之間的大接觸表面積(Jiang等2000)。有趣地，雞CSFl ニ聚體之間的接觸表面非常類似于雞SCF的接觸表面。它們均包含暴露的疏水性殘基，如圖IB中所示，其中二聚體界面上存在的氨基酸表示為間隔填充。鑒定鳥類IL34基因雞基因組中存在人IL34的明顯雞直向同源物，并且我們已經(jīng)在Ark-Genomics (Rosl in, UK)群中鑒定了一個(gè)雞cDNA,其定位于染色體11并包含全長1し34^5(661*&1^編號(hào)BX931154)。該雞序列容許在基因組序列中識(shí)別直向同源斑胸草雀基因[Chrll 5, 575，502-5，577，560 ；2008 年 7 月集合](GQ249406)。鳥類基因各包含 6 個(gè)
外顯子，雞基因編碼178個(gè)氨基酸的蛋白，并且斑胸草雀基因編碼180個(gè)氨基酸。IL34的保守結(jié)構(gòu)在氨基酸序列水平，IL34具有比CSFl好得多的物種間保守性(表2)。雖然描述人IL34的論文主張它在結(jié)構(gòu)上是新穎的(Lin等2008)，但是我們的分析提示IL34是正如充分描述的CSFl 一樣的四螺旋束蛋白(Pandit等1992 ；Taylor等1994 ；Chen等2008)。IL34和CSFl確實(shí)可以僅以微弱的ー級(jí)同源性進(jìn)行彼此比對(duì)，但是它們具有非常類似的預(yù)測的拓?fù)鋵W(xué)。雞IL34的3D模型利用基于結(jié)構(gòu)的比對(duì)(通過Domain Fishing進(jìn)行)(Bates 等 2OOl)使用 3D_Jigsaw http://bmm. cancerresearchuk. org/ 3djigsaw/ 來產(chǎn)生。獲得的 PDB 文件在 Jmol http://firstglance. jmol. org 中的 FirstGlance 中觀察并利用 Polyview_3D http://polyview· cchmc. org/polyview3d. html 通過PyMol 表不該模型(Porollo和Meller 2007)(圖2A)。為了結(jié)構(gòu)比較，遵從相同的程序創(chuàng)建雞SCF模型，并且如圖I中所示的雞CSFl模型也包括在該附圖中。這種關(guān)于衍生蛋白的結(jié)構(gòu)分析預(yù)測缺乏 全部7個(gè)策略定位的半胱氨酸的分子。IL34包含ー些通常保守的半胱氨酸殘基，但是這些沒有為了形成鏈內(nèi)ニ硫鍵而定位和匹配在一起。形成鏈間ニ硫鍵所需的半胱氨酸不像哺乳動(dòng)物CSFl中那樣存在于ニ聚體界面上，但是該區(qū)域包含暴露的疏水性殘基(圖2B)。構(gòu)成CSFl上受體-結(jié)合位點(diǎn)I的相應(yīng)氨基酸由紅色箭頭指出。這些殘基與IL34中的那些完全不同，直接提示與CSFl蛋白不同的結(jié)合機(jī)制。鑒定斑胸草雀CSFlR基因在雞基因組中染色體13上，存在注釋的CSFlR基因(Ensembl ID ENSGALG00000005725)，其占據(jù)與哺乳動(dòng)物中相同的位置，緊接著密切相關(guān)的TOGFRB基因(Ensembl ID ENSGALG00000021313)的3’。雞序列的可用性容許我們鑒定斑胸草雀基因組中的直向同源序列[Chr 13 :6，954，381-6，972，446 ;2008年7月集合](GQ249407)。該基因包含21個(gè)外顯子，如雞CSF1R，并編碼967個(gè)氨基酸的蛋白，其還與雞CSFlR長度相同。CSFlR的進(jìn)化保守性利用ClustalW軟件進(jìn)行新的物種間氨基酸序列多重比對(duì)，以檢查鳥CSFlR和哺乳動(dòng)物直向同源物之間的同源性(表3)。如預(yù)期地，受體的細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(aa540至977)在所有物種(包括鳥類)間極端保守。然而，半胱氨酸665 (由表3中的箭頭表示)是在不保守的殘基中，其僅在鳥類中置換精氨酸。該置換可以解釋我們的發(fā)現(xiàn)，即雞CSFl-誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞生長不被抑制哺乳動(dòng)物CSFlR活性的激酶抑制劑GW580 (V Garceau,未發(fā)表)阻斷(Irvine等2006)。大多數(shù)構(gòu)成由小鼠CSF1R/CSF1共晶體推斷的CSFl-結(jié)合位點(diǎn)I和2(在表3中分別用"+"和"° "符號(hào)標(biāo)記)的殘基在兩種鳥類之間不保守。在兩種鳥類之間觀察到的一些氨基酸置換圖示在圖3A中，其中顯示斑胸草雀(左)和雞(右)CSFlR的D2結(jié)構(gòu)域上的CSFl-結(jié)合位點(diǎn)I的3D模型。如關(guān)于配體，該模型利用3D-Jigsaw和Polyview-3D創(chuàng)建。具有其各自CSFl分子的疊置結(jié)構(gòu)的這些相同受體的D1-D3結(jié)構(gòu)域的更一般視圖顯示在圖3B中。受體從與圖3A中相同的角度顯示，并且雞CSFl結(jié)構(gòu)是與圖IA中相同的模型，其表示為表面而非卡通，其中標(biāo)記ニ聚體界面用于定向。斑胸草雀CSFl結(jié)構(gòu)利用相同的設(shè)置生成，并且疊置角度基于小鼠CSF1:CSF1R復(fù)合物的共同結(jié)構(gòu)(Chen等2008)。在該附圖中，將斑胸草雀(左)和雞(右)受體中的氨基酸置換置于與它們各自CSFl配體中存在的那些相互聯(lián)系。這種高水平的趨異性不是意外的，因?yàn)榘咝夭萑负碗u不是相同分類學(xué)順序的一部分。如關(guān)于靈長類動(dòng)物和嚙齒類動(dòng)物CSF1，我們預(yù)測斑胸草雀CSFl將不激活雞受體，或反之亦然，這歸因于結(jié)合位點(diǎn)中電荷密度的實(shí)質(zhì)變化。鳥類CSFlR的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物CSFlR基因座包含保守的巨噬細(xì)胞-特異性啟動(dòng)子區(qū)，和在巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因所需的第一內(nèi)含子中的明顯保守的增強(qiáng)子(FIRE) (Sasmono等2003)。這些元件在鳥類中不是明顯保守的。然而，巨噬細(xì)胞基因表達(dá)所需的轉(zhuǎn)錄因子，諸如PU. 1，具有明顯的雞直向同源物。為了評(píng)估鳥類中CSF-IR成為巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)劑的可能性，我們首先評(píng)估雞和斑胸草雀基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。雀形目和雞形目進(jìn)化上相隔約IOOM年，大約與嚙齒類動(dòng)物和人相同(www.timetree.org)。由于這種距離，進(jìn)化保守、非編碼區(qū)提供功能性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子位置的強(qiáng)指示；在哺乳動(dòng)物中，F(xiàn)IRE(fms內(nèi)含子調(diào)節(jié)元件)比任何外顯子更保守(Himes等2001)。鳥類CSFlR的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物中相同(www. ensembl.org), ATG起始密碼子位于第一外顯子中。如哺乳動(dòng)物CSFlR啟動(dòng)子，兩個(gè)鳥類CSFlR近端啟動(dòng)子不是高度保守的，但是二者均多嘌呤并少TATA。在兩種鳥類物種中，存在兩個(gè)非 常高度保守的區(qū)域，在啟動(dòng)子的上游和下游。這顯示在圖3C的Pustell DNA矩陣比對(duì)中。下游元件處于第一內(nèi)含子內(nèi)與哺乳動(dòng)物FIRE相同的相對(duì)位置(Himes等2001)。候選鳥類FIRE序列不能與哺乳動(dòng)物FIRE比對(duì)，但是包含相同的基本元件。這些區(qū)域包含與哺乳動(dòng)物CSFlR和FIRE—樣的多重共有序列重復(fù)，包括關(guān)于PU. I和其他Ets因子，API，C/EBP, Spl和AMLl的候選結(jié)合位點(diǎn)(圖3D和3E)。這些轉(zhuǎn)錄因子的每ー種表達(dá)在雞中的造血細(xì)胞中(Faust等1999 ；Bakri等2005)。這些發(fā)現(xiàn)提示鳥類CSFlR以與哺乳動(dòng)物中基本相同的方式受控，盡管順式作用個(gè)體元件的重新分類。雞胚胎中CSFlR的表達(dá)模式保守區(qū)的分析鑒定了雞CSFlR基因座的候選增強(qiáng)子，并提示該基因可能特異性表達(dá)在巨噬細(xì)胞中。為了驗(yàn)證該預(yù)測，我們?cè)?0HH或發(fā)育的3. 5天，翅芽階段進(jìn)行雞胚胎的整裝制片原位雜交(圖3F)。該階段對(duì)應(yīng)于小鼠胚胎中的11. 5dpc。如在小鼠中(Lichanska等1999),并與爪蟾屬(Xenopus)中巨卩遼細(xì)胞分布相一致地(Tomlinson等2008),雞csflrmRNA遍及胚胎以斑點(diǎn)模式(speckled pattern)表達(dá),這與局限于身體各器官中的許多巨噬細(xì)胞相一致(左圖)。通過 CSFl 和 IL34 激活雞 CSFlR細(xì)胞表面上的CSFlR表達(dá)屬于巨噬細(xì)胞譜系定型中的最早事件(Tagoh等2002)，并且CSFl—般用于由小鼠骨髓生長純巨噬細(xì)胞群(Bonifer和Hume 2008)。因此，測試兩種配體的雞骨髓細(xì)胞的分化。在PEF6載體中克隆雞CSFl (前六個(gè)外顯子)和IL34基因，向它們提供C端標(biāo)記物以用于檢測，并轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。細(xì)胞和上清中表達(dá)的蛋白通過Western印跡來檢測(圖4)。在CSFl的情形中，在非還原上清中觀察到三個(gè)表觀分子實(shí)體，并且最低表觀MR(約60kD)主要存在于細(xì)胞中；提示分泌的蛋白在ER中加工并進(jìn)行糖基化，可能甚至作為蛋白聚糖。在IL34的情形中，蛋白在細(xì)胞和上清中檢測為雙聯(lián)體，最高表觀MR比較低的MR量更豐富，提示IL34在該系統(tǒng)中糖基化。在上清中檢測的表位標(biāo)記的clL34的量明顯低于細(xì)胞裂解產(chǎn)物。這可能歸因于由分泌途徑或培養(yǎng)基中的胰蛋白酶樣蛋白酶引起的ー些C端蛋白水解裂解作用，因?yàn)椹`串堿性氨基酸存在于IL34的C端，緊接v5標(biāo)記物的上游。將來自轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞或僅用載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清加入至通過沖洗來自雞股骨的骨髓獲得的骨髓細(xì)胞，并且溫育該細(xì)胞10天。在大約第3天，在存在雞CSFl或IL34條件下生長的細(xì)胞變得貼壁，并且到第12天時(shí)，培養(yǎng)皿匯合。在含有來自空pEF6-轉(zhuǎn)染的HEK的上清的對(duì)照培養(yǎng)皿中無骨髓細(xì)胞存活。因此，CSFl和IL34 二者均提供由雞骨髓生長巨噬細(xì)胞的可能性以進(jìn)行功能研究；骨髄來源的巨噬細(xì)胞已經(jīng)成為小鼠中巨噬細(xì)胞功能研究的支柱(Bonifer和Hume 2008)?？傊瑪?shù)據(jù)顯示CSFlR及其兩種配體的功能在鳥類中是保守的。CSF1R、CSFl 和 IL34 的共同進(jìn)化CSFlR的胞外結(jié)構(gòu)域在物種間相當(dāng)不同，CSFl也是如此。甚至在小鼠和大鼠之間，IL34具有相當(dāng)好的保守性，并仍與CSFI激活相同的受體。CSFI/CSFIR趨異性可以與這樣的事實(shí)相關(guān)，即(a)CSFl在循環(huán)中響應(yīng)先天免疫刺激諸如LPS可大量誘導(dǎo)，和(b)CSFlR胞外結(jié)構(gòu)域響應(yīng)一定范圍的TLR激動(dòng)劑，通過ADAM 14/TACE的作用，在細(xì)胞中由細(xì)胞表面裂解(Sester等1999 ；Rovida等2001)。因此，人們可能爭辯CSFl是有效先天免疫反應(yīng)所需要的并且因此進(jìn)行免疫選擇。實(shí)際上，埃巴病毒編碼可溶性CSFlR拮抗劑BARFl (Strockbine 等，1998)。這提出了有趣的進(jìn)化問題，即究竟兩種配體如何能夠與單ー受體一起進(jìn)化。理論上，并假設(shè)總結(jié)構(gòu)是保守的，配體中接觸殘基的變化應(yīng)該通過受體的變化來補(bǔ)償，從而保持結(jié)合親和性，并且在充分大的樣品中，配偶體上的氨基酸之間應(yīng)該存在相關(guān)矩陣。結(jié)合表1、2和3中顯示的比對(duì)和關(guān)于CSF1/CSF1R公開的PDB結(jié)構(gòu)，可能區(qū)分功能性共同進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)生或隨機(jī)共變，從而計(jì)算相關(guān)系數(shù)(Fares和Travers 2006a)。使用CAPS軟件來鑒定具有強(qiáng)相關(guān)系數(shù)的氨基酸位點(diǎn)(Fares和McNally 2006a)，并且這些共同進(jìn)化殘基的網(wǎng)絡(luò)顯示在圖5A中。關(guān)于特定位點(diǎn)對(duì)的相關(guān)系數(shù)強(qiáng)度通過連接它們的線的顏色來顯示，且氨基酸位置編碼遵從作為參考的人序列。意外地，僅有的顯著相關(guān)性存在于CSFlR和兩種配體中更保守的IL34之間。而且，這三種蛋白中任ー種中均不存在蛋白內(nèi)共同進(jìn)化跡象。CSFlR的IL34結(jié)合模式在CSFlR中通過CAPS鑒定的共同進(jìn)化氨基酸位置中沒有ー個(gè)位于處于D2和D3結(jié)構(gòu)域中的CSFl結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)(Chen等2008)。相反地，它們集中在D3和D4的接合處。以相似的方式，IL34中的共同進(jìn)化殘基位置位于CSFl的相應(yīng)CSFlR結(jié)合位點(diǎn)外。圖5A的網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)的所有共同進(jìn)化殘基在雞CSFlR和IL34結(jié)構(gòu)上定位(圖5B)。雞CSFlR D1-D5結(jié)構(gòu)作為通過3D-Jigsaw關(guān)于雞受體D1-D3利用小鼠CSFlR結(jié)構(gòu)作為模板(3ejj)和D1-D5利用人KIT結(jié)構(gòu)作為模板(2e9w)產(chǎn)生的兩個(gè)PDB文件的嵌合體來生成。然后將兩種模型疊置以創(chuàng)建雞CSFlR D1-D5結(jié)構(gòu)。雞IL34模型是與圖2中所述的相同的模型，其以稍微不同的角度觀察。雞中相應(yīng)的共同進(jìn)化殘基位置由表2中的比對(duì)來推斷，然后利用Polyview-3D以藍(lán)色突出顯示。CSFlR和IL34上特異性位點(diǎn)的共同進(jìn)化可以解釋為該未表征的新配體和受體之間的可能結(jié)合模式。因此，我們可以推測IL34 =CSFlR結(jié)合位點(diǎn)界面由IL34的⑶環(huán)和CSFlR的D3-D4接合處附近的區(qū)域組成。通過基于BaF/3細(xì)胞的測定評(píng)估生物活性重組雞CSFl具有可證明的特異性生物活性，如當(dāng)?shù)味ǖ揭蜃右蕾囆杂H本BaF/3細(xì)胞和表達(dá)雞CSFlR或豬CSFlR的BaF/3細(xì)胞上時(shí)所證明地。收集已經(jīng)在RPMI 1640培養(yǎng)基+10% HI FBS+GlutaMax+pen/strep (20U/mL 和 20 微克 /mL)和 10ng/mL 重組鼠 IL-3 中培養(yǎng)的親本BaF/3細(xì)胞、表達(dá)雞CSFlR的BaF/3細(xì)胞或表達(dá)豬CSFlR的BaF/3細(xì)胞，洗滌并涂布在96孔微滴定板中，20K細(xì)胞/孔，并培養(yǎng)過夜。次日，重組雞CSFl針對(duì)全部三種細(xì)胞系來滴定。作為對(duì)照，重組豬CSFl和重組人CSFl(Sigma6518)也針對(duì)全部三種細(xì)胞系來滴定。細(xì)胞測定然后溫育另外48小時(shí)，隨后利用TireGlo測定系統(tǒng)(Cell TiterGlo ；PromegaG7571)評(píng)估細(xì)胞存活/増殖。無CSFl制劑促進(jìn)BaF/3親本系中的存活或増殖(圖8)。盡管豬和人CSFl制劑不促進(jìn)表達(dá)雞CSFlR的BaF/3細(xì)胞的存活/増殖，雞CSFl制劑的確通過雞CSFlR顯示生物活性(EC50 =約20ng/mL)，如通過當(dāng)?shù)味ㄔ诒磉_(dá)雞CSFlR的BaF/3品系上時(shí)的強(qiáng)存活和増殖所證明的(圖9)。豬和人CSFl制劑二者具有生物活性，因?yàn)樗鼈冴P(guān)于表達(dá)豬CSFlR的BaF/3細(xì)胞系具有等摩爾生物活性(EC50 = 30ng/mL)，如圖10中證明地。討論CSF-UIL34和CSF-IR之間相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)表示來自進(jìn)化觀點(diǎn)的在科學(xué)上非常有趣的現(xiàn)象。目前的基因?qū)W成就現(xiàn)在關(guān)于兩種配體和受體提供來自超過15種物種的序列。由這些序列，明顯地，相互作用在進(jìn)化上回溯到魚是保守的。通過比對(duì)這些序列，和檢查 顯著位置處的不同殘基的耐受性，可能鑒定受體中的特殊氨基酸，它們與CSF-I或IL34的給定殘基協(xié)同變化。來自ー種物種的CSF-I誘導(dǎo)來自另ー種物種的巨噬細(xì)胞(或使用受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)生長和存活的能力為基于進(jìn)化保守性的預(yù)測增加影響。例如，小鼠CSF-I不能結(jié)合人CSF-1R，而人CSF-I可以結(jié)合并激活小鼠CSF-IR(Koths 1997)。實(shí)際上，人CSF-1可以激活來自己經(jīng)測試的全部物種(人、小鼠、貓、綿羊和狗)的CSF-1R，而小鼠CSF-I可以激活測試的所有非靈長類動(dòng)物CSF-1R(小鼠、貓、綿羊和豬)，但不激活人CSF-IR(Stanley和Guilbert 1981 ；ffoolford 等 1988 ；Tamura 等 1990 ；Francey 等 1992 ；Ramsoondar 等 1993 ；Yoshihara等1998 ;Abrams等2003)。在哺乳動(dòng)物中不保守的唯一接觸氨基酸是小鼠R111，其在人中是Q，并且在其他物種中變化。牛CSF-I導(dǎo)致鼠骨髄巨噬細(xì)胞的生長，其大概通過激活鼠CSF-IR而進(jìn)行(Yoshihara等1998)。雞(或雞細(xì)胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中的最終M-CSF生物活性)和貓CSF-1，相反地，不能激活人和小鼠CSF-1R，并且局限于激活它們自身物種的受體(Tamura 等 1990 ；Tamura 等 1991)。近期研究鑒定了若干魚物種的CSFl基因，并且提供這些物種中基因原始復(fù)制的證據(jù)(Wang等2008)。全部魚CSFl基因具有由小鼠CSF1/CSF1R共結(jié)晶結(jié)構(gòu)暗示的哺乳動(dòng)物接觸殘基的幾乎完全的趨異性。在目前的研究中，我們已經(jīng)鑒定并表達(dá)了雞CSFl和IL34基因，提供了 CSFlR在雞巨噬細(xì)胞中如同其在哺乳動(dòng)物中一樣表達(dá)并且最可能以相似的方式受控(圖3C-3F)，和重組因子可以由骨髄前體產(chǎn)生純巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物的證據(jù)。因此，CSF1/IL34/CSF1R三單元組合的生物學(xué)在另ー類脊椎動(dòng)物鳥類中也是保守的。分子建模提示CSFl在鳥和哺乳動(dòng)物中中具有保守結(jié)構(gòu)，而相反地，公開的研究(Lin等2008)提示IL34也共享以四螺旋束為特征的拓?fù)鋵W(xué)(Pandit等，1992)。雖然事實(shí)上IL34缺乏在CSFl中形成不同鏈內(nèi)ニ硫鍵的全部半胱氨酸，其他生長因子諸如SCF，GM-CSF和GH全部具有僅ー個(gè)或兩個(gè)鏈內(nèi)鍵，且具有相同的四螺旋拓?fù)鋵W(xué)(Pandit等1992)。已經(jīng)已知IL34結(jié)合CSFlR(Lin等2008)，且類似于CSFl的結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)可以導(dǎo)致這樣的結(jié)論，即它們二者均共享CSFlR上的相同結(jié)合位點(diǎn)。這與IL34的序列不一致，其中由CSF1/CSF1R共結(jié)晶結(jié)構(gòu)確定的接觸點(diǎn)完全不同。在此進(jìn)行的共同進(jìn)化研究掲示新的觀點(diǎn)。當(dāng)以蛋白的3D結(jié)構(gòu)鑒定時(shí)，不被CAPS掲示的共同進(jìn)化殘基位置一起分組在不同區(qū)域內(nèi)。在IL34上，它們中的大部分位于遠(yuǎn)離ニ聚體界面的末端，具體地在螺旋C和螺旋D之間的柔性環(huán)上。無共同進(jìn)化殘基位于CSFl上相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)中。在CSFlR上，它們中的大部分位于D3和D4的接合處。如果集合在一起,這兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)應(yīng)該天然地彼此適合。而且，已知CSFlR D4缺少連接β折疊的Ig樣結(jié)構(gòu)域的特有ニ硫鍵，并可能具有更高的柔性(Blechman等1995)。甚至近期公開的CSFlR ニ聚化和活化模型可以適應(yīng)關(guān)于IL34的這樣的備選結(jié)合模式(Chen等2008)。有趣的是，該結(jié)合模式令人回想其他4螺旋束因子(GH，GM-CSF, EPO)與它們受體的結(jié)合，其涉及螺旋間的位點(diǎn)，和比CSFlR的結(jié)構(gòu)域D2/3裂隙更靠近質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)域內(nèi)裂隙中的結(jié)合。CSF1/CSF1R的活化模型提示ニ聚化允許兩結(jié)構(gòu)域D4s之間的相互作用，由此導(dǎo)致產(chǎn)生信號(hào)傳導(dǎo)的構(gòu)象變化(Chen等2008)。IL34是否由此產(chǎn)生不同的信號(hào)？在GHR的情形中，改變構(gòu)象的胞外結(jié)構(gòu)域中的不同突變可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)染的FDCPl細(xì)胞中的特定信號(hào)傳導(dǎo)途徑的選擇性缺失(Rowlinson等2008)。與GHR的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域連接的CSFlR的胞外結(jié)構(gòu)域可以為相同的因子-依賴性細(xì)胞提供CSFl-依賴性生長促進(jìn)信號(hào)(MJ ffaters,DA Hume，未公開)。因此，可以想到兩種配體可以通過相同的受體進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，以產(chǎn)生僅部分重疊的信號(hào)。
CSFl和IL34的不同結(jié)合模式通過這樣的事實(shí)來暗示即使CSFl結(jié)合位點(diǎn)中電荷的變化通過受體結(jié)合位點(diǎn)中相反電荷的變化來匹配，但是它們之間不存在顯著的相關(guān)系數(shù)。CSFl與CSFlR的弱結(jié)合基于鹽橋，并僅要求該位點(diǎn)處存在相反的電荷而發(fā)生。這不必須包括匹配氨基酸的嚴(yán)格共同進(jìn)化。然而，IL34與CSFlR的結(jié)合可以基于迫使完美互補(bǔ)的氫鍵，因此共同進(jìn)化殘基。除提示關(guān)于IL34和CSFlR的備選結(jié)合位點(diǎn)外，共同進(jìn)化研究還為我們提供關(guān)于CSFl和IL34間功能差別的暗示。實(shí)際上，與CSFlR相關(guān)的進(jìn)化共變僅可以關(guān)于IL34檢測到的事實(shí)意味著后者經(jīng)歷比CSFl更強(qiáng)的選擇性約束。換言之，IL34遺傳組成的變化應(yīng)該必須包括受體中交互進(jìn)化變化，因?yàn)槿魏位钚匀笔У慕Y(jié)果應(yīng)該比關(guān)于CSFl的類似缺失更顯著。此外，還提示CSFl比IL34自由地進(jìn)化地更快，并且不具有與其共同進(jìn)化的受體。這些解釋以及與CSFl相比IL34的更好保守性和IL34相當(dāng)不同的表達(dá)模式(參見www. bioRps.org)提示IL34可能執(zhí)行更營養(yǎng)的角色。巨噬細(xì)胞在胚胎發(fā)育中具有許多明顯的作用(Lichanska和Hume 2000 ;Rae等2007)，但它們?cè)诓溉閯?dòng)物中的功能的研究已經(jīng)受到不易接近胚胎和CSFl通過母體產(chǎn)生并跨胎盤傳輸?shù)氖聦?shí)的限制。我們現(xiàn)在已經(jīng)鑒定了可能控制鳥類成髓作用并應(yīng)該能夠受益于易接近雞卵內(nèi)發(fā)育以操作這些基因的表達(dá)和功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。參考文獻(xiàn)Abrams K，Yunusov MY, Slichter S，Moore P，Nelp WB, Burstein SA,McDonough S，DuracK L，Storer B，Storb R % 2003. Recombinant human macrophagecolony-stimulating factor-induced thrombocytopenia in dogs (狗中直組人巨嚼細(xì)胞集落刺激因子-誘導(dǎo)的血小板減少).Br JHaematol (英國血液學(xué)雜志)121(4) :614-622.Arakawa T，Yphantis DA, Lary JW, Narhi L0, Lu HS，Prestrelski SJ, ClogstonCL， Zsebo KM, Mendiaz EA, Wypych J 等 1991.Glycosylated and unglycosylatedrecombmant-derivea numan stem cell factors are dimeric and have extensiveregular secondary structure (糖基化和非糖基化重組來源的人干細(xì)胞因子是ニ聚的并具有廣泛的規(guī)則的ニ級(jí)結(jié)構(gòu)).J Biol Chem (生物化學(xué)雜志)266(28) :18942-18948.Avery S，Rothwell L, Degen WD, Schijns VE, Young J，Kaufman J，KaiserP. 2004. Characterization of the nrst nonmammalian T2 cytokine gene cluster thecluster contains functional single-copy genes for IL一3，IL一4，IL一13，and GM-CSF,a gene for IL—5 that appears to be a pseudogene, and a gene encoding anothercytokinelike transcript，KK34 (第一非哺乳動(dòng)物T2細(xì)胞因子基因簇的特征該簇包含關(guān)于IL-3，IL-4，IL-13，和GM-CSF的功能性單拷貝基因，關(guān)于IL-5的似乎是假基因的基因，和編碼另一種細(xì)胞因子樣轉(zhuǎn)錄物KK34的基因).J Interferon Cytokine Res (干擾素細(xì)胞因子研究雜志)24(10) :600-610.Bakri Y， Sarrazin S， Mayer UP, Tillmanns S， Nerlov C， Boned A， SiewekeMH. 2005. Balance of MafB and PU. I specifies alternative macrophage or denariticcell fae (MafB和PU. I的平衡指定擇ー的巨噬細(xì)胞或樹突細(xì)胞命運(yùn)).Blood(血液)105 (7) :2707-2716.
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權(quán)利要求
1.鳥類CSFl基因，其包含與SEQID NOS :1，2或4的核酸序列至少60%同一或同源的核酸序列。
2.鳥類IL34基因，其包含與SEQID NO :6的核酸序列至少60%同一或同源的核酸序列。
3.基本上純化的鳥類CSFl蛋白，其包含與SEQID NOS :3或5的氨基酸序列至少60%同一或同源的氨基酸序列。
4.基本上純化的鳥類IL34蛋白，其包含與SEQID NO 6的氨基酸序列至少60%同一或同源的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求1-4的任一基因/蛋白的片段、類似物、部分、突變體、變體、衍生物和/或同源物/直向同源物。
6.表達(dá)載體，其包含鳥類CSFl基因序列或其片段或部分。
7.表達(dá)載體，其包含鳥類IL34基因序列或其片段或部分。
8.用權(quán)利要求6或7的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
9.鳥類CSFl或IL34基因和/或蛋白用于調(diào)節(jié)鳥類生長和/或器官發(fā)育的用途。
10.鳥類CSFl和/或IL34基因和/或鳥類CSFl和/或IL34蛋白用于調(diào)節(jié)鳥類免疫系統(tǒng)的用途。
11.鳥類CSFl和IL34蛋白、或其片段，其用作疫苗佐劑。
12.免疫原性組合物，其包含鳥類CSFl和/或IL34蛋白。
13.能夠抑制CSF1/IL34基因表達(dá)或蛋白產(chǎn)生的化合物，其用于治療由異常CSF1/IL34基因/蛋白表達(dá)引起或與其相關(guān)的病癥，諸如炎性病。
14.權(quán)利要求13的化合物，其中所述化合物選自由以下組成的組有義或反義核酸分子；鳥類CSF1/IL34基因的片段、部分或衍生物；和抗體。
15.篩選鳥類物種、特別是在農(nóng)業(yè)上對(duì)于潛在參與育種程序有意義或重要的鳥類物種的方法，所述方法包括以下步驟 a)提供來自鳥類物種的核酸樣品；和 b)將CSFl和/或IL34基因表達(dá)水平和參考核酸樣品或數(shù)值進(jìn)行比較； 其中可以選擇相對(duì)于參考核酸樣品或數(shù)值中存在的水平展示出増加水平的CSFl和/或IL34基因表達(dá)的鳥類物種以參與育種程序。
全文摘要
本發(fā)明提供鳥類CSF1基因，其編碼結(jié)合鳥類集落刺激因子1受體(CSF1R)和展示免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)的蛋白。
文檔編號(hào)C07K14/53GK102712689SQ201080034540
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2010年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月23日
發(fā)明者戴夫·伯特, 戴維·澤斯特, 戴維·阿瑟·休姆, 瓦萊里·加爾索, 雅克蘭·史密斯, 鮑勃·佩頓 申請(qǐng)人:愛丁堡大學(xué)董事會(huì)