轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽CPU-312-03及其應(yīng)用。CPU-312-03的結(jié)合肽序列為GLSRAHQ，核苷酸序列為GGGCTTTCTCGGGCTCATCAG。體外實(shí)驗(yàn)表明該結(jié)合肽能與高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR的細(xì)胞結(jié)合，并能將耦連的異硫氰酸熒光素(FITC)靶向轉(zhuǎn)入細(xì)胞，因此本發(fā)明所述的結(jié)合肽可用于以轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR為靶點(diǎn)的藥物靶向載體，對腫瘤靶向藥物的開發(fā)，腦源性疾病的靶向治療和以轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR為目標(biāo)的預(yù)測、診斷腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。
【專利說明】轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于一種轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR抗體，特別涉及一種轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]目前已知兩種不同類型的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體即轉(zhuǎn)鐵蛋白受體I(TfRl)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 2 (TfR2)。
[0003]TfRl在許多細(xì)胞中都表達(dá)，如紅血細(xì)胞、肝細(xì)胞、單核細(xì)胞和血腦屏障。TfRl是由同源二聚體通過兩條二硫鍵交聯(lián)而成。每個單體含760個氨基酸，分子量為90~95kDa，包含一個大的胞外C端區(qū)域(671個氨基酸)，一個單跨膜區(qū)域(28個氨基酸)及一個短的N端區(qū)域(61個氨基酸)。C端區(qū)域是一個外功能區(qū)，它包含轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)的結(jié)合位點(diǎn)，三個N連接糖基化位點(diǎn)及一個O連接糖基化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的糖基化作用是TfRl功能所必需的。TfRl能夠根據(jù)環(huán)境pH的變化而改變構(gòu)像，并把構(gòu)像變化結(jié)果轉(zhuǎn)換為對轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合力強(qiáng)弱的變化。
[0004]TfR2 是一種II型跨膜糖蛋白，是Kawa-bata從Tf細(xì)胞和HL-60細(xì)胞cDNA文庫中克隆出的TfRl同源基因，同TfRl有45%的相同序列，胞外區(qū)域同TfRl有66%的相似性，但TfR2與轉(zhuǎn)鐵蛋白的親和性較低，比TfRl低25倍。TfR2主要在肝臟表達(dá)，其mRNA編碼和非編碼區(qū)域缺乏調(diào)控鐵離子成分，這就表明TfR2的表達(dá)不是由鐵離子響應(yīng)蛋白反饋機(jī)制來調(diào)控的。
[0005]轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR的功能是通過與轉(zhuǎn)鐵蛋白的相互作用介導(dǎo)鐵的吸收。生理pH下，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR與帶兩個Fe3+的轉(zhuǎn)鐵蛋白親和力最高，與帶一個Fe3+的轉(zhuǎn)鐵蛋白親和力次之，與不帶Fe3+的轉(zhuǎn)鐵蛋白親和力最小，帶有兩個Fe3+的轉(zhuǎn)鐵蛋白對轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR的親和力是脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白的10~100倍。在內(nèi)含體中pH的下降促進(jìn)了轉(zhuǎn)鐵蛋白構(gòu)象的改變，隨后轉(zhuǎn)鐵蛋白釋放Fe3+，脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR的親和力降低。
[0006]研究顯示鼻咽癌、胃癌、肝癌、血液系統(tǒng)腫瘤等多種惡性腫瘤細(xì)胞與它們的正常組織相比，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體呈現(xiàn)高表達(dá)情況，并且轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR的表達(dá)常常與細(xì)胞增殖活動有關(guān)。胃癌患者血清轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR水平較良性胃病病人及正常人明顯增高，同時II1、IV期腫瘤病人的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR也明顯高于1、11期腫瘤病人。說明轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR的表達(dá)增加使腫瘤細(xì)胞獲得了異常的增殖活性。此外，轉(zhuǎn)鐵蛋白/轉(zhuǎn)鐵蛋白受體系統(tǒng)可通過胞吞作用提高生理屏障如腸道黏膜、血腦屏障對藥物的通透性。血腦屏障的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR被認(rèn)為幾乎完全被轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和，轉(zhuǎn)鐵蛋白作為藥物腦靶向載體受到限制。然而，由于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR抗體與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)鐵蛋白與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的結(jié)合位點(diǎn)不同，且不相互干擾，因而可采用轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR的抗體進(jìn)行藥物轉(zhuǎn)運(yùn)。偶聯(lián)有藥物的抗大鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的單克隆抗體(0X26)可由轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR介導(dǎo)內(nèi)吞，跨過血腦屏障進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，并且0X26顯示出較強(qiáng)的進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能力。
[0007]噬菌體展示技術(shù)由Smith于1985年創(chuàng)建，以改構(gòu)的噬菌體為載體，把待選基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白質(zhì)基因區(qū)，使外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)并展示于噬菌體表面，進(jìn)而通過親和富集法表達(dá)有特異肽或蛋白質(zhì)的噬菌體。其建立基于三點(diǎn):(I)在PlII和PVIII衣殼蛋白的N端插入外源基因，形成的融合蛋白表達(dá)在噬菌體顆粒的表面，不影響和干擾噬菌體的生活周期，同時保持外源基因天然構(gòu)象，也能被相應(yīng)的抗體或受體所識別；(2)利用固定與固相支持物的靶分子，采用適當(dāng)?shù)奶韵捶椒?，洗去非特異結(jié)合的噬菌體，篩選出目的噬菌體；(3)外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)在噬菌體的表面，而其編碼基因作為病毒基因組中的一部分可通過分泌型噬菌體的單鏈DNA測序推導(dǎo)出來。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了基因型和表型的轉(zhuǎn)換，已越來越廣泛地用于抗原表位分析、蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)分析、酶作用底物的分析、尋找具有生物功能的蛋白的模擬肽、先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)、分離與鑒定疾病特異性抗原模擬肽、篩選細(xì)胞和器官特異性結(jié)合肽、研究蛋白質(zhì)與核酸結(jié)合特性、定位信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等。
[0008]小分子多肽結(jié)構(gòu)簡單穿透腫瘤組織的能力強(qiáng)，且不易被免疫系統(tǒng)所排斥，因此有很大的潛力作為良好的藥物靶向載體。同時多肽長效化手段日益豐富，使得多肽在體內(nèi)穩(wěn)定性增加，半衰期延長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽。發(fā)明的另一目的在于提供所述轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽，其氨基酸序列為 Gly Leu Ser Arg Aal His Gln,即 GLSRAHQ ；
[0011]所述轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽的核苷酸序列如下:GGGCTTTCTCGGGCTCATCAG ;一種轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽，其特征在于:所述結(jié)合肽的氨基酸序列如Seq N0.1。
[0012]所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽在藥物靶向腫瘤的應(yīng)用。
[0013]所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽在藥物靶向腫瘤中的應(yīng)用，其特征在于腫瘤表面高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR。所選腫瘤為肝癌或乳腺癌。
[0014]所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽在透血腦屏障藥物中的應(yīng)用。
[0015]所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽在轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR檢測中的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:本發(fā)明所述轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽通過噬菌體展示技術(shù)獲得，是全新序列。易于通過生物及化學(xué)方法合成構(gòu)建。生物信息學(xué)技術(shù)表明該結(jié)合肽能與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR結(jié)合，體外實(shí)驗(yàn)表明該結(jié)合肽能與高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR的細(xì)胞結(jié)合，并能將耦連的異硫氰酸熒光素(FITC)轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，可用來作為藥物載體以及轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR的檢測。因此本發(fā)明所述的結(jié)合肽可用于以轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR為靶點(diǎn)的腫瘤靶向藥物的開發(fā)，腦源性疾病的靶向治療，并且對以轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR為目標(biāo)的腫瘤發(fā)生發(fā)展的預(yù)測、診斷具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR與結(jié)合肽形成的復(fù)合物模型
[0018]圖2是轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR與結(jié)合肽相互作用的氨基酸殘基[0019]圖3熒光酶標(biāo)儀檢測H印G2細(xì)胞對耦連FITC結(jié)合肽和FITC的攝取實(shí)驗(yàn)
[0020]圖4熒光酶標(biāo)儀檢測L02細(xì)胞對耦連FITC結(jié)合肽和FITC的攝取實(shí)驗(yàn)
[0021]圖5是熒光顯微鏡觀察HepG2細(xì)胞對耦連FITC結(jié)合肽的吞噬實(shí)驗(yàn)
[0022]圖6是熒光顯微鏡觀察IfepG2細(xì)胞對FITC的吞噬實(shí)驗(yàn)
[0023]圖7是熒光顯微鏡觀察L02細(xì)胞對耦連FITC結(jié)合肽的吞噬實(shí)驗(yàn)
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下實(shí)施例所用材料和 儀器設(shè)備為:
[0025]實(shí)施材料:大腸桿菌ER2738 (美國New England Biolabs公司)、噬菌體隨機(jī)7肽庫(美國New England Biolabs公司)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(德國CalBiochem公司)、HRP-M13抗體(GE Healthcare公司)、RPM1-1640 (Gibco公司)、小牛血清(Gibco公司)、膜蛋白酶(Gibco 公司。
[0026]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0027]實(shí)施例1
[0028]通過噬菌體展示的方法，得到轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽CPU-312-03:
[0029](1)通過噬菌體隨機(jī)肽庫的篩選，得到轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽CPU-312-03的核苷酸序列:
[0030]A.噬菌體隨機(jī)7肽庫的生物淘洗:用包被液(0.1M NaHC03，pH8.6)將轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR稀釋至100 μ g/ml,加入150ul至酶標(biāo)板的一個孔中，反復(fù)旋轉(zhuǎn)直到表面完全濕潤,保持濕潤狀態(tài)，4°C過夜。倒掉包被液，拍板除去殘液，加滿封閉液(0.1M NaHC03，pH8.6，5mg/ml BSA)，4°C 至少作用一個小時。倒出封閉液，用 0.1 % TBST [TBS+0.1% (v/v) Tween-20]洗
6次，每次拍板。用IOOyl TBST稀釋10 μ l原始噬菌體肽庫，加入用轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR包被的孔中，室溫溫育1小時，傾倒未結(jié)合的噬菌體，用0.1% TBST沖洗10次，每次拍板。然后加入 100 μ l 洗脫液[0.2Μ Glycine-HCl (ph2.2)，lmg/mLBSA]室溫輕微震蕩 15min,吸出洗脫液，再用15 μ l的IM Tris-HCL中和上述洗脫液。吸取I μ l已中和的洗脫液測定滴度，其余液體加入20mlLB培養(yǎng)基(含20 μ l四環(huán)素+200 μ I過夜培養(yǎng)的菌液)，37°C，225rpm培養(yǎng)5小時；離心擴(kuò)增噬菌體，40C，12000g離心10分鐘，將上清的80%轉(zhuǎn)入一新離心管中，加入1/6體積的PEG8000/NaCl，讓噬菌體4°C沉淀過夜；離心噬菌體，12000g, 15分鐘，4°C。倒掉上清，吸取殘余溶液。加Iml TBS重懸沉淀，轉(zhuǎn)入微量離心管中。4°C，14000rpm離心5分鐘使殘余細(xì)胞沉淀。上清轉(zhuǎn)入另一微量離心管中，加1/6體積的PEG8000/Nacl，冰浴lh。4°C，14000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀用200 μ ITBS重懸。離心Imin沉淀任何不能溶解的物質(zhì)，上清轉(zhuǎn)入一新的微量離心管中，此即擴(kuò)增噬菌體。按以上步驟進(jìn)行第2，3輪篩選，每篩選一輪減少轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR的包被濃度，改為50 μ g/ml和30 μ g/ml，結(jié)合時加2X1011的上一輪洗脫擴(kuò)增物，洗脫時用游離轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR分子(100gy g/ml溶于TBS)競爭洗脫結(jié)合噬菌體，改用5% TBST進(jìn)行洗滌，提高篩選的特異性。
[0031]B.噬菌體滴度測定:用LB培養(yǎng)基稀釋噬菌體，未擴(kuò)增噬菌體稀釋范圍JO1-1O4,擴(kuò)增后噬菌體稀釋范圍:IO8-1O11tj取10 μ I上述稀釋的噬菌體，加入200 μ I對數(shù)中期ER2738中，作用2分鐘，將得到的感染菌體加入3ml液體上層瓊脂中混勻，均勻鋪在預(yù)熱的IPTG/Xgal/Tet平板上，37°C倒置避光過夜，計算平板上的藍(lán)色噬菌斑數(shù)量，稀釋倍數(shù)乘以噬菌斑數(shù)量即為噬菌體滴度。
[0032]C.噬菌斑的擴(kuò)增:測定第三輪未擴(kuò)增的噬菌體滴度，300μ I過夜培養(yǎng)物，30μ ITet, 30mlLB液體培養(yǎng)基混勻后分成30個試管中，每個試管1ml，每個試管挑取一個藍(lán)斑加入，37°C搖床培養(yǎng)5小時，培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入微量離心管中，離心30秒，上清轉(zhuǎn)入新的離心管中再離心，將80 %上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，此即為擴(kuò)增的噬菌體貯液，4V貯存。
[0033]D.ELISA鑒定陽性噬菌體克隆:取5 μ I步驟C中所得的噬菌體貯液，加入20mlLB培養(yǎng)基(含20 μ I四環(huán)素，200 μ I過夜培養(yǎng)的菌液)中，37°C培養(yǎng)4.5小時，離心擴(kuò)增噬菌體，4°C 12000g離心10分鐘，將上清的80%轉(zhuǎn)入一新離心管中，加入1/6體積的PEG8000/NaCl，讓噬菌體4°C沉淀過夜；離心噬菌體，12000g, 15min，4°C。倒掉上清，吸取殘余溶液。加Iml TBS重懸沉淀,轉(zhuǎn)入微量離心管中。離心，4°C, 14000rpm, 5min使殘余細(xì)胞沉淀。上清轉(zhuǎn)入另一微量離心管中，加1/6體積的PEG8000/NaCl,冰浴lh。離心，4°C, 14000rpm, IOmin,棄上清，沉淀重懸于50μ I TBS中，此即為擴(kuò)增的噬菌體貯液，測定滴度，準(zhǔn)備進(jìn)行ELISA鑒定。 [0034]準(zhǔn)備100 μ g/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR分子(溶于0.1M NaHCO3, PH8.6)。對于30個待鑒定的噬菌體設(shè)置4個噬菌體梯度，每個梯度3個孔，并設(shè)置未包被空白孔為陰性對照，包被好的酶標(biāo)板放置4°C過夜。吸出多余靶分子溶液，加入封阻液，4°C作用I小時，陰性對照同樣封閉。甩出封阻液，用0.5% TBST洗板6次，取步驟C中擴(kuò)增的噬菌體，稀釋四個數(shù)量梯度(分別為109，101Q，10n，IO12Pfu),加入包被好的孔中，室溫作用I小時。用0.5%TBST洗板6次，加入I: 5000稀釋HRP-M13抗體，作用I小時。用0.5% TBST洗板6次，加入OPD顯色液，顯色30分鐘后加入2M H2SO4終止反應(yīng)。選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸收值，記錄結(jié)果。以O(shè)D值高于陰性對照2.1倍作為陽性克隆。
[0035]E.陽性噬菌體單鏈DNA的提取及測序:取500 μ I上述噬菌體貯液，加200 μ lPEG8000/NaCl放置10分鐘，HOOOrpm離心10分鐘，棄上清，沉淀重懸于100 μ I碘化物緩沖液中，加250 μ I乙醇，室溫作用10分鐘，HOOOrpm離心10分鐘，棄上清，用70%乙醇洗沉淀，短暫真空干燥。沉淀重懸于30μ1 TE(IOmMTris-HCl,ImMEDTA)中，取上述溶液測序。本次測序由金維智生物科技有限公司完成。
[0036](2)將得到的測序結(jié)果翻譯，選取Elisa陽性值高(0.834,0.717)且核苷酸序列一致的序列得到結(jié)合肽CPU-312-03，并送至寧波康貝生化有限公司合成并標(biāo)記熒光探針，其核苷酸序列為Seq N0.2，氨基酸序列為Seq N0.1。
[0037]實(shí)施例2
[0038]用計算機(jī)模擬轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR與結(jié)合肽的結(jié)合:
[0039]用zDock對接軟件建立出轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR與結(jié)合肽的模型,然后用discoverystudio2.5(DS2.5)軟件模擬轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR與結(jié)合肽的結(jié)合情況，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR與結(jié)合肽形成的復(fù)合物模型如圖1，其中條形部分表示轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR，球形部分表示結(jié)合肽。圖2為用軟件模擬出的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR與結(jié)合肽相互作用的氨基酸殘基。結(jié)果顯示結(jié)合肽包裹在與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR結(jié)合的結(jié)合區(qū)域，其中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR的533，559位谷氨酸(GLU533，GLU559)，538，560，562 位天冬氨酸(ASP538，ASP560，ASP562)，與結(jié)合肽的精氨酸(ARG4)，組氨酸(HIS6)之間緊密相互作用。[0040]實(shí)施例3
[0041]熒光酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞對耦連FITC結(jié)合肽和FITC的攝取實(shí)驗(yàn):
[0042]取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞(肝癌細(xì)胞)，用適量0.25%胰酶溶液消化，輕搖使消化液均勻作用于細(xì)胞，當(dāng)成片細(xì)胞圓縮、呈單個細(xì)胞狀態(tài)時，迅速加入適量含10%小牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打使成單細(xì)胞懸液；每孔加入8X IO4個細(xì)胞于24孔板中，并加500 μ I含10%血清的RPM1-1640培養(yǎng)基，于37°C、含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時至單層細(xì)胞狀態(tài)；于檢測前l(fā)h，2h，3h，4h分別加入500μ I含10%小牛血清、50um耦連FITC結(jié)合肽的RPM1-1640培養(yǎng)基，每個時間點(diǎn)3個復(fù)孔，置于37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；同時以FITC和L02細(xì)胞(正常肝細(xì)胞)作為陰性對照，用熒光酶標(biāo)儀檢測熒光(λ ex = 485nm, Aem = 528nm)。檢測熒光時吸出上述培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3和圖4所示，圖3中CPU-312-03-FITC系列為H印G2細(xì)胞攝取耦連FITC結(jié)合肽測得的時間(h)-熒光強(qiáng)度值(AU)曲線，F(xiàn)ITC系列為HepG2細(xì)胞攝取FITC測得的時間(h)_熒光強(qiáng)度值(AU)曲線。從圖3中可以看出前者的熒光強(qiáng)度高于后者，說明FITC和多肽耦連后，可通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)細(xì)胞對CPU-312-03-FITC的內(nèi)吞作用，與細(xì)胞對FITC的非特異性的內(nèi)吞作用相比，攝取量大大提高。圖4中HepG2系列為HepG2細(xì)胞攝取耦連FITC結(jié)合肽測得的時間(h)-熒光強(qiáng)度值(AU)曲線，L02系列為L02細(xì)胞攝取耦連FITC結(jié)合肽測得的時間(h)-熒光強(qiáng)度值(AU)曲線，2h之后，高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR的H印G2細(xì)胞熒光強(qiáng)度值明顯高于低表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR的L02細(xì)胞熒光強(qiáng)度值，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR表達(dá)水平提高可提高細(xì)胞對結(jié)合肽的攝取，說明該短肽具有與高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR腫瘤細(xì)胞的靶向結(jié)合力，并且能將異硫氰酸熒光素(FITC)靶向細(xì)胞。[0043]實(shí)施例4
[0044]熒光顯微鏡觀察細(xì)胞對耦連FITC結(jié)合肽和FITC的吞噬實(shí)驗(yàn):
[0045]取對數(shù)生長期的!fepG2細(xì)胞(肝癌細(xì)胞)，用適量0.25%胰酶溶液消化，輕搖使消化液均勻作用于細(xì)胞，當(dāng)成片細(xì)胞圓縮、呈單個細(xì)胞狀態(tài)時，迅速加入適量含10%小牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打使成單細(xì)胞懸液，每孔加入8 X IO4個細(xì)胞于24孔板中，并加500μ I含10%血清的RPM1-1640培養(yǎng)基，于37°C、含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時至單層細(xì)胞狀態(tài)，每孔加入500 μ I含10%小牛血清、50um耦連FITC結(jié)合肽的RPM1-1640培養(yǎng)基，3個復(fù)孔，置于37°C，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；同時以FITC和L02細(xì)胞(正常肝細(xì)胞)作為陰性對照。4h后吸出上述培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，用熒光顯微鏡觀察并拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5、圖6、圖7所示，圖5為HepG2細(xì)胞對耦連FITC結(jié)合肽的吞噬情況，圖6為H印G2細(xì)胞對FITC的吞噬情況，圖7為L02細(xì)胞對耦連FITC結(jié)合肽的吞噬情況，說明在相同時間相同濃度的情況下，耦連FITC結(jié)合肽更容易被H印G2細(xì)胞攝取，該結(jié)合肽能與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR相互作用而使細(xì)胞吞噬的FITC更多。
[0046]以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽CPU-312-03，能與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR及高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR的細(xì)胞結(jié)合，并且能將FITC靶向細(xì)胞，有轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)靶向細(xì)胞的能力。對以轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR為靶點(diǎn)的腫瘤靶向藥物的開發(fā)，腦源性疾病的靶向治療和以轉(zhuǎn)鐵蛋白受體為目標(biāo)的腫瘤發(fā)生發(fā)展的預(yù)測、診斷具有重要意義。
[0047]上述為示例性的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，本領(lǐng)域的研究及技術(shù)人員應(yīng)該理解其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的各種形式和細(xì)節(jié)的改變、 修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽，其特征在于:所述結(jié)合肽的氨基酸序列如SeqN0.1。
2.如權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽，其特征在于:所述結(jié)合肽的核苷酸序列如Seq N0.2。
3.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽在制備靶向腫瘤藥物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽在制備靶向腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR是腫瘤表面高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR。
5.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽在制備透血腦屏障藥物中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR特異性結(jié)合肽在轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR檢測中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/68GK103897033SQ201410123564
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】劉煜, 甘牡丹, 顧夢月, 邵明, 葉靖宇 申請人:中國藥科大學(xué)