專利名稱：EphA3抗體的制作方法
EphA3抗體相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2009年10月14日提交的美國臨時(shí)專利申請第61/251，668號的權(quán)益，通過引用將該臨時(shí)申請并入本文。
背景技術(shù)：
Eph受體酪氨酸激酶(Ephs)屬于使酪氨酸殘基上的蛋白磷酸化的激酶——受體酪氨酸激酶(RTKs)的大群體。Ephs與它們的膜結(jié)合ephrin配體(ephrins)控制著細(xì)胞定位和組織結(jié)構(gòu)((Poliakov, A.等，Dev Cell 7:465-80(2004))。與其他的受體酪氨酸激、酶相比，Eph受體活化不僅需要配體結(jié)合及ニ聚化而且還涉及預(yù)先形成的配體寡聚物。因此，Eph受體的酪氨酸磷酸化需要ephrin配體以它們聚合的或膜附著的形式呈遞(Davis等，Science266:816-819 (1994))。功能性和生物化學(xué)的Eph反應(yīng)都發(fā)生在較高的配體寡聚化狀態(tài)下(Stein 等，Genes Dev 12:667-678(1998))。除了其他的模式功能以外，已證實(shí)各種Ephs和ephrins在血管發(fā)育中發(fā)揮作用。也已觀察到下調(diào)ー些印hrins和它們的受體在成年人中的再出現(xiàn)可促進(jìn)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及血管新生。例如，顯性抑制的、可溶的EpbA2或A3蛋白顯現(xiàn)出在體外對ephrin誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用以及在體內(nèi)對腫瘤血管生成和進(jìn)展的作用(Nakamoto 等，Microsc Res Tech 59:58-67(2002);Brantley-Sieder 等，Curr PharmDes 10:3431-42(2004);Brantley 等，Oncogene 21:7011-26(2002);Cheng 等，Neoplasia5:445-56 (2003). Dobrzanski 等，Cancer Res 64:910-9 (2004))。而且已發(fā)現(xiàn) Eph 家族成員在來源于各種各樣的人實(shí)體腫瘤的腫瘤細(xì)胞上過表達(dá)(Brantley-Sieders等，Curr PharmDes 10:3431-42(2004) ; Marme, D. Ann Hematol 81 Suppl 2: S66 (2002) ; Booth, C 等，NatMed 8:1360-1(2002))。也已報(bào)道在慢性骨髓性白血病(CML)患者的加速期及急性轉(zhuǎn)化期Epha3在CD34+細(xì)胞上被活化并過表達(dá)(Cilloni 等，American Society ofHematology, Abstract1092，2008 (2008年11月14日網(wǎng)上可見))。Cilloni等報(bào)道了當(dāng)將原代CML細(xì)胞或EphA3轉(zhuǎn)染的正常細(xì)胞與特異性單克隆抗體孵育時(shí)，該抗體誘導(dǎo)原代細(xì)胞和轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖的顯著減少，減少集落生長并且誘導(dǎo)粘附特性的改變。該抗體在正常對照細(xì)胞或來源于慢性期CML患者的細(xì)胞中沒有誘導(dǎo)任何的顯著改變。本發(fā)明部分地基于新的抗EphA3抗體的發(fā)現(xiàn)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及有效的抗EphA3抗體以及使用此類抗體的方法，例如，用于治療涉及EphA3的疾病。本發(fā)明的抗體具有如本文所述的特征。因此，在一方面，本發(fā)明的抗體包含Vh區(qū)(重鏈可變區(qū))，所述Vh區(qū)包含⑶R3，所述⑶R3包含氨基酸序列X1GX2YEX3FDX4，其中X1為S或G，X2為Y或V，X3為E或D，以及X4為S、V或I，附加條件是當(dāng)氨基酸序列為SGYYEDFDS時(shí)，⑶Rl不是SYWIN，并且當(dāng)氨基酸序列為SGYYEEFDS時(shí)，⑶Rl不是TYWIS。在一些實(shí)施方案中，抗體具有包含氨基酸序列 GGYYEDFDS、SGYYEEFDS、SGVYEDFDS、SGYYEDFDV 或 SGYYEDFDI的CDR3。在一些實(shí)施方案中，抗體具有J區(qū)段，其包含與人生殖細(xì)胞系J區(qū)段氨基酸序列的至少80%、通常85%或至少90%同一性，或其與人生殖細(xì)胞系J區(qū)段在不超過兩個(gè)位置不同；以及V區(qū)段，其包含與人生殖細(xì)胞系V區(qū)段氨基酸序列的至少80%、通常至少85%和優(yōu)選90%或更高的同一性。在一些實(shí)施方案中，J區(qū)段包含與人JH6氨基酸序列的至少90%同一性并且V區(qū)段包含與人VHl 1-02氨基酸序列的至少90%同一性。在一些實(shí)施方案中，抗體具有包含WGQGTTVTVS的FR4或與WGQGTTVTVS不超過I個(gè)氨基酸不同的FR4。在ー些實(shí)施方案中，抗體包含如圖I中列出的Vh區(qū)所示的VHCDRl、_VfDR2、_ VfDRl與VfDR2 ニ 者。例如，本發(fā)明的抗體可具有Vh⑶Rl和/或⑶R2，所述Vh⑶Rl包含氨基酸序列GYWMN、TYffIS 或 SYWIN，所述 CDR2 包含氨基酸序列 DIYPGSGNTNYDEKFQG、DIYPGSGNTNYAQKFQG、DIYPGSGNTNYAQEFRG、DIYPGSGNTNYAQKFLG、DIYPGSGNTNYDEKFEG 或 DIYPGSGNTNYDEKFKR。在一些實(shí)施方案中，抗體具有VfDRl GYWMN和⑶R2DIYPGSGNTNYDEKFQG。在一些實(shí)施方案中，抗體具有Vh CDRl TYWIS和 Vh CDR2DIYPGSGNTNYAQ(Κ/E)F(Q/R/L)G。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體具有來自于如圖I中所示的V區(qū)的其中之一的VhCDRI XDR2和⑶R3。在ー些實(shí)施方案中，抗體具有圖I中所示的V區(qū)段序列的VhV區(qū)段氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，Vh具有圖I中所列出的Vh區(qū)的序列。本發(fā)明也提供了具有\(zhòng)區(qū)的抗體，所述\區(qū)包含具有序列X1X2YX3X4YPYT的⑶R3結(jié)合特異性決定簇，其中X1為G、V或A ;X2為Q、R或G ;X3為A、S或L ;以及X4為N或K。在一些實(shí)施方案中，CDR3 包含 GQYANYPYT、VQYAKYPYT、AQYANYPYT、VQYSNYPYT、VQYANYPYT、VGYANYPYT、VRYANYPYT 或 VQYLNYPYT。在一些實(shí)施方案中，當(dāng) CDR3 為 VQYANYPYT 時(shí)，CDRl 不是 RASQEISGYLG 或 RASQG11SYLA和/或 CDR2 不是 AASTLDS 或 AASSLQS。在一些實(shí)施方案中，Vl區(qū)包含J區(qū)段，其包含與人生殖細(xì)胞系J區(qū)段氨基酸序列的至少80%、通常85%或90%同一性，或其與人生殖細(xì)胞系區(qū)段在不超過兩個(gè)氨基酸不同；以及V區(qū)段，其包含與人生殖細(xì)胞系V區(qū)段氨基酸序列的至少80%、通常至少90%或更高的同一性。在一些實(shí)施方案中，J區(qū)段相對于來源于人生殖細(xì)胞系Jk 2氨基酸序列的序列FGQGKLEIK，具有不超過兩個(gè)氨基酸的改變，經(jīng)常不超過I個(gè)氨基酸的改變，并且V區(qū)段包含與人生殖細(xì)胞系J K I L15氨基酸序列的至少90%同一性。在一些實(shí)施方案中，抗體的FR4具有氨基酸序列FGQGKLEIK或相對于序列FGQGKLEIK有不超過I個(gè)氨基酸殘基的改變。在一些實(shí)施方案中，ん區(qū)包含圖I中所示的\區(qū)序列的CDR1、或CDR2、或CDRl與CDR2 二者。例如，CDRl可具有序列RASQGIISYLA、QASQDISTYLN、RASQEISGYLG 或 RASQSISSYLA ;和/或 CDR2 可具有序列 AASSLQS、GASSLQS、AASSLQR或AASTLDS序列。在一些實(shí)施方案中，CDRl具有序列RASQGIISYLA并且CDR2具有序列GASSLQS。在一些實(shí)施方案中，CDRl具有序列QASQDISTYLN并且CDR2具有序列AASSLQR或AASSLQS。在一些實(shí)施方案中，CDRl具有序列RASQSISSYLA并且CDR2具有序列AASSLQR。在一些實(shí)施方案中，\區(qū)包含圖I中所列出的\區(qū)其中之一的⑶R1、⑶R2和⑶R3。在一些實(shí)施方案中，ん區(qū)包含具有如圖I中所示的V區(qū)段序列的V區(qū)段。在一些實(shí)施方案中，ん區(qū)具有圖I中所列出的ん區(qū)的序列。在典型的實(shí)施方案中，抗體的Vh區(qū)包含任一以上段落中所述的Vh區(qū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含具有⑶R3的ん區(qū)的抗體，所述⑶R3包含GQYANYPYT、VQYAKYPYT、AQYANYPYT、VQYSNYPYT、VGYANYPYT、VRYANYPYT 或 VQYLNYPYT。在一些實(shí)施方案中，抗體包含含有氨基酸序列X1GX2YEX3FDX4的重鏈⑶R3，其中X1為S或G，X2為Y或V，X3為E或D以及X4為S、V或I。在一些實(shí)施方案中，重鏈⑶R3包含氨基酸序列 GGYYEDFDS、SGYYEEFDS、SGVYEDFDS、SGYYEDFDV 或 SGYYEDFDI。在一些實(shí)施方案中，抗體包含圖I中所列出的輕鏈⑶Rl或⑶R2，或圖I中所列出的重鏈⑶Rl或⑶R2。在一些實(shí)施方案中，抗體包含如圖I中所列出的輕鏈⑶Rl和⑶R2和/或圖I中所列出的重鏈⑶Rl與⑶R2。在一些實(shí)施方案中，抗體包含圖I中所列出的VJ區(qū)段。本發(fā)明還提供了包含Vh區(qū)和以上段落中所列出的\區(qū)⑶R3序列的抗體，所述Vh區(qū)包含具有序列SGYYE (E/D) FDS的CDR3，附加條件是\區(qū)CDR3序列不是VQYANYPYT或VQYMNYPYT。在一些實(shí)施方案中，抗體包含圖I中所列出的重鏈⑶Rl或⑶R2，或圖I中所列出的輕鏈⑶Rl或⑶R2。在一些實(shí)施方案中，抗體包含如圖I中所列出的重鏈⑶Rl與⑶R2和/或圖I中所列出的輕鏈⑶Rl與⑶R2。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗EphA3抗體包含來自于圖I中所列出的Vh區(qū)其中之一的VfDRl、⑶R2和⑶R3以及來自于圖I中所列出的\區(qū)其中之一的VfDRl、⑶R2和CDR3。本發(fā)明的抗體可包含如圖I中所列出的Vh區(qū)或如圖I中所列出的ん區(qū)?？贵w經(jīng)常 包含如圖I中所列出的Vh區(qū)和如圖I中所列出的ん區(qū)。在一些實(shí)施方案中，抗體包含Vh區(qū)與八區(qū)的組合，所述組合包括a) SEQ ID NO: I與SEQ ID NO: 20, b) SEQ ID NO: 2與SEQ IDNO:11， c)SEQ ID NO:2 與 SEQ ID NO:12， d)SEQ ID NO:2 與 SEQ ID NO:19， e)SEQ IDNO:2與 SEQ ID N0:21, f) SEQ ID N0:2 與 SEQ ID N0:22, g) SEQ ID N0:2 與 SEQ ID NO:23, h)SEQ ID NO:3 與 SEQ ID NO:11，i)SEQ ID NO:3 與 SEQ ID NO:12，j)SEQ ID NO:3 與 SEQ IDNO:21, k)SEQ ID N0:3 與 SEQ ID NO:22, I)SEQ ID N0:4 與 SEQ ID N0:ll,m)SEQ ID NO:4與 SEQ ID NO: 13，n) SEQ ID NO: 5 與 SEQ ID NO: 11，o) SEQ ID NO: 5 與 SEQ ID NO: 13, p)SEQ ID N0:5 與 SEQ ID N0:21,q)SEQ ID N0:6 與 SEQ ID N0:14,r)SEQ ID N0:6 與 SEQ IDNO: 15，s) SEQ ID NO: 7 與 SEQ ID NO: 14，t) SEQ ID NO: 7 與 SEQ ID NO: 15，u) SEQ ID NO: 8與 SEQ ID NO: 14，v) SEQ ID NO: 8 與 SEQ ID NO: 15, w) SEQ ID NO: 9 與 SEQ ID NO: 16, x)SEQ ID NO: 9 與 SEQ ID NO: 17, y) SEQ ID NO: 9 與 SEQ ID NO: 19，z) SEQ ID NO: 10 與 SEQID NO: 17，aa) SEQ ID NO: 10 與 SEQ ID NO: 18，或 bb) SEQ ID NO: 10 與 SEQ ID NO: 20。在一些實(shí)施方案中，例如，具有選自圖I中Vh區(qū)序列的Vh區(qū)序列和選自圖I中ん區(qū)序列的\區(qū)的本發(fā)明的抗體，具有通過37° C下進(jìn)行的質(zhì)子表面共振分析所測定的，優(yōu)于約IOnM的單價(jià)親和力，而且經(jīng)常優(yōu)于約5nM或InM。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體具有約ΙΟηΜ、約5nM、約2. 5Nm、約InM、約O. 5nM、約O. 25nM或約O. InM或更好的親和カ(使用質(zhì)子表面共振所測量的)。如本文所述的本發(fā)明的抗體可具有在N末端上含有蛋氨酸的Vh區(qū)和/或ん區(qū)。在一些實(shí)施方案中，抗體為IgG。在一些實(shí)施方案中，抗體為IgGl或IgG3。在一些實(shí)施方案中，抗體為IgG2或IgG4。在一些實(shí)施方案中，抗體包含具有SEQ ID NO: 24中所列出的氨基酸序列的重鏈恒定區(qū)和/或具有SEQ ID N0:25中所列出的氨基酸序列的κ輕鏈恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，抗體的重鏈恒定區(qū)為去巖藻糖基化的。在一些實(shí)施方案中，包含本發(fā)明抗體的抗體制劑為低巖藻糖基化的或去巖藻糖基化的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗EphA3抗體具有重鏈氨基酸序列和輕鏈氨基酸序列，所述重鏈氨基酸序列和輕鏈氨基酸序列各自包括SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27，SEQID N0:28和SEQ ID NO:29, SEQ ID N0:30和SEQ ID N0:31，SEQ ID N0:32和SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34 和 SEQ ID NO:35，或 SEQ ID NO:36 和 SEQ ID NO:27 ;而且，抗體為去巖藻糖
基化在一些實(shí)施方案中，抗體為(Fab’)2。在一些實(shí)施方案中，抗體為聚こニ醇化的。在一些實(shí)施方案中，抗體活化EphA3。在一些實(shí)施方案中，抗體不與諸如ephrin A5的天然配體競爭性結(jié)合EphA3。在另一方面，本發(fā)明提供了治療患有EphA3依賴性疾病的患者的方法，所述方法包括給予患者治療上有效量的本文所述的本發(fā)明的抗體。例如患者可能患有癌癥。在ー些實(shí)施方案中，給予患有實(shí)體腫瘤的患者抗體，所述實(shí)體腫瘤包含表達(dá)EphA3的腫瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中,給予患有腫瘤的患者抗體,所述腫瘤沒有表達(dá)EphA3的腫瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，給予患有骨髓增生性病癥的患者抗體。在一些實(shí)施方案中，給予患有急性骨髓性白血病或慢性骨髓性白血病的患者抗體。在一些實(shí)施方案中，給予患有淋巴瘤的患者抗體。在一些實(shí)施方案中，給予患有骨髄增生異常綜合征、脾大性紅細(xì)胞增多癥、特發(fā)性血小板增多癥或特發(fā)性骨髄纖維變性的患者抗體。附圖
簡要說明圖I提供了本發(fā)明抗EphA3抗體的示例性Vh和\序列。圖2提供了重鏈⑶R2/FR3盒式結(jié)構(gòu)的示意圖。圖3顯示了抗EphA3IgGs的抗原結(jié)合ELISA結(jié)果。將EphA3_Fc包被的ELISA平板用嵌合的IIIA4(圓圈)、本發(fā)明的示例性基因工程的抗體(方塊)或?qū)澱盏腎gG(三角形)處理，探針探測與HRP標(biāo)記的抗人K鏈的結(jié)合。圖4顯示了本發(fā)明基因工程的抗體對于EphA3的特異性。將各種Eph蛋白包被到ELISA平板上，用基因工程的抗體處理，探針探測與HRP標(biāo)記的抗人K鏈的結(jié)合。圖5顯示了評估示例性基因工程的本發(fā)明的抗EphA3抗體與表達(dá)EphA3的細(xì)胞表面結(jié)合的能力的實(shí)驗(yàn)中，對三種細(xì)胞系的流式細(xì)胞術(shù)分析的數(shù)據(jù)。用2%的牛血清白蛋白(BSA)和鼠IgG封閉B16、SKme128以及LnCAP細(xì)胞，用基因工程的抗EphA3IgG、嵌合的IIIA4或同型對照的IgG作探針探測。使用Facs Caliber流式細(xì)胞儀(BD)通過藻紅蛋白標(biāo)記的抗人IgG檢測結(jié)合抗體。通過碘化丙啶染色排除死細(xì)胞。對每幅圖表而言，對照抗體的圖譜為圖表中所示的最左邊的曲線。圖6提供了數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)顯示與巖藻糖基化的抗EphA3抗體相比，去巖藻糖基化的抗EphA3抗體增強(qiáng)抗AML細(xì)胞的ADCC活性。發(fā)明詳述本文所用的“EphA3”指的是Eph受體A3。這ー受體也被稱作“人胚胎激酶”、“hek”、“eph樣酪氨酸激酶l”、“etkl”_“tyro4”。EphA3屬于蛋白-酪氨酸激酶家族的ephrin受體亞家族。EPH和EPH相關(guān)的受體參與介導(dǎo)發(fā)育事件。EPH亞家族中的受體通常具有單個(gè)的激酶結(jié)構(gòu)域，和包含富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域及兩個(gè)III型粘連蛋白重復(fù)的細(xì)胞外區(qū)域?；趀phrin受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域序列的相似性和它們結(jié)合ephrin_A及ephrin_B配體的親合力，將ephrin受體分成兩組。EphA3結(jié)合ephrin_A配體。EphA3核酸和蛋白序列是已知的。通過登錄號(EAW68857)可獲得示例性的人EphA3氨基酸序列。
在本發(fā)明中，EphA3的“活化”引起EphA3的磷酸化。因此，在本發(fā)明語境中，活化EphA3,即引起EphA3磷酸化，的抗體被認(rèn)為是激動(dòng)劑?？赏ㄟ^ニ聚化活化EphA3。此類活化可導(dǎo)致磷酸化及凋亡，盡管對細(xì)胞變圓不是必需的。例如當(dāng)發(fā)生EphA3簇集時(shí)，活化可額外地導(dǎo)致形態(tài)學(xué)的改變，典型地就是細(xì)胞變圓。在本發(fā)明中，“EphA3抗體”或“抗EphA3抗體”可互換地使用，指的是特異性結(jié)合EphA3的抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體可使EphA3 ニ聚化。該術(shù)語包括在ephrin配體(例如ephrin A5)結(jié)合存在的情況下結(jié)合EphA3的抗體，以及結(jié)合配體結(jié)合位點(diǎn)并與配體競爭性結(jié)合EphA3的抗體?！霸趀phrin配體結(jié)合存在的情況下結(jié)合EphA3的EphA3抗體”指的是不能顯著阻止諸如ephrin A5的ephrin配體結(jié)合EphA3的抗體。在包含諸如ephrin A5的ephrin配體和EphA3的結(jié)合反應(yīng)中，此類抗體的存在減少了 ephrin配體結(jié)合EphA3小于約30%，通常 小于20%或10%ο術(shù)語“mAb IIIA4”指的是單克隆抗體IIIA4，其最初通過抗LK63人急性前B白血病細(xì)胞以親和カ分離EphA3而產(chǎn)生(Boyd等，J Biol Chem 267:3262-3267,1992)。mAb IIIA4與天然EphA3的球形ephrin結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合(例如Smith等，J. Biol. Chem279:9522-9531, 2004)。它以登錄號91061920被儲(chǔ)存在歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)協(xié)會(huì)(EuropeanCollection of Animal Cell Cultures)(參見例如歐洲專利第 EP0590030 號)。本文所用的“具有活性同型的抗體”指的是具有人Fe區(qū)的抗體，所述Fe區(qū)結(jié)合免疫效應(yīng)細(xì)胞上存在的Fe受體?！盎钚酝汀卑↖gGl、IgG3、IgM、IgA和IgE。該術(shù)語包括具有人Fe區(qū)的抗體，所述的Fe區(qū)包含調(diào)節(jié)Fe效應(yīng)功能的修飾，例如糖基組分和/或糖基化水平的突變或改變。“Fe區(qū)”指的是除了免疫球蛋白功能區(qū)第一恒定區(qū)以外抗體其余的恒定區(qū)。因此，F(xiàn)e指的是IgA、IgD和IgG的后兩個(gè)免疫球蛋白功能區(qū)的恒定區(qū)，IgE和IgM的后三個(gè)免疫球蛋白功能區(qū)的恒定區(qū)以及這些功能區(qū)的柔性鉸鏈區(qū)N末端。對IgA和IgM而言，F(xiàn)e可包括J鏈。對IgG而言，F(xiàn)e包含C Y I與C Y間的鉸鏈以及免疫球蛋白功能區(qū)C Y 2和C Y 3。本領(lǐng)域中應(yīng)理解的是Fe區(qū)的界限是可變的，然而，人IgG重鏈Fe區(qū)通常被定義為包含C226或P230位殘基至其羧基末端，如Kabat等使用根據(jù)EU索引的編號(1991，NIH Publication91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.)。術(shù)語“Fe 區(qū)，，可指分離的該區(qū)域或在抗體或抗體片段語境下的該區(qū)域。“Fe區(qū)”包含天然存在的Fe區(qū)等位基因變體以及調(diào)節(jié)效應(yīng)功能的修飾。Fe區(qū)也包括不導(dǎo)致生物學(xué)功能改變的變體。例如可從免疫球蛋白的Fe區(qū)的N末端或C末端刪除ー個(gè)或多個(gè)氨基酸而沒有實(shí)質(zhì)的生物學(xué)功能缺失。根據(jù)本領(lǐng)域中已知的通用規(guī)則選擇此類變體以使其對活性的影響最小(參見例如 Bowie 等，Science 247:306-1310，1990)。術(shù)語“平衡解離常數(shù)”或縮寫為(Kd)的“親和力”指的是解離速率常數(shù)(Kd，時(shí)間一1)除以結(jié)合速率常數(shù)(Ka，時(shí)間一1，M-1)?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何方法測量平衡解離常數(shù)。本發(fā)明的抗體為高親和力抗體。通過37° C下進(jìn)行的質(zhì)子表面共振分析所測定的，此類抗體具有優(yōu)于(小干)約50nM，并且經(jīng)常小于約IOnM的單價(jià)親和力。因此，在一些實(shí)施方案中，(如使用質(zhì)子表面共振所測量的)本發(fā)明的抗體具有的親和カ小于約50nM，通常小于約25nM或甚至小于10nM，例如約5nM或約InM。在本發(fā)明的背景下，如果親和カ較高，例如以較低的Kd數(shù)值為證，那么該親和力是“較好的”。短語“特異性(或選擇性)結(jié)合”抗體或“與……特異性(或選擇性)免疫反應(yīng)”，當(dāng)其關(guān)于蛋白或肽時(shí)，指的是其中抗體與目的蛋白結(jié)合的結(jié)合反應(yīng)。在本發(fā)明的背景下，抗體通常以至少大于它對其他抗原親和カ100倍的親和カ結(jié)合EphA3。本文所用的“抗體”指的是功能上被定義為結(jié)合蛋白而且結(jié)構(gòu)上被定義為包含本領(lǐng)域技術(shù)人員所識別的氨基酸序列的蛋白，所述的氨基酸序列就是衍生于編碼動(dòng)物產(chǎn)生抗體的基因的免疫球蛋白的骨架區(qū)。抗體可由ー個(gè)或多個(gè)多肽組成，所述的多肽基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段所編碼。所識別的免疫球蛋白基因包括K、λ、α、Υ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因，以及無數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分類為K或λ。重鏈分類為Y、μ、α、δ或ε，其各自依次定義了免疫球蛋白類別IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。已知的典型的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元包含一個(gè)四聚體。每個(gè)四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，每對具有一條“輕鏈”(約25KD)和一條“重鏈”(約50-70KD)。每條鏈的N末端定義為約100-110個(gè)或更多的氨基酸的可變區(qū)，主要負(fù)責(zé)抗原識別。術(shù)語可變的 輕鏈和可變的重鏈(Vh)各自指的是這些輕鏈和重鏈。本文所用的術(shù)語“抗體”包括保留結(jié)合特異性的抗體片段。例如，存在著許多很好特征化的抗體片段。因此，例如胃蛋白酶消化抗體C末端至鉸鏈區(qū)的ニ硫鍵而產(chǎn)生F(ab)’2，F(xiàn)ab的ニ聚體，其自身是通過ニ硫鍵連接到VH-CHl的輕鏈。溫和條件下，破壞鉸鏈區(qū)的ニ硫鍵，還原F(ab)’ 2，因此將F(ab)’2 ニ聚體轉(zhuǎn)化為F(ab)’單體。F(ab)’單體本質(zhì)上是帶有部分絞鏈區(qū)的 Fab (見基礎(chǔ)免疫學(xué)(Fundamental Immunology), ff. E. Paul, ed. , RavenPress, N. Y. (1993)，對其他的抗體片段更為詳細(xì)的描述)。雖然依據(jù)完整抗體的消化定義了各種抗體片段，但是技術(shù)人員應(yīng)理解片段可以化學(xué)方法地或通過利用重組DNA方法學(xué)重新合成。因此，本文所用的術(shù)語抗體也包括抗體片段，通過整個(gè)抗體的修飾產(chǎn)生或利用重組DNA方法學(xué)合成該片段?？贵w包括ニ聚體，其包括單鏈抗體(以單ー的多肽鏈存在的抗體)，諸如單鏈Fv抗體(sFv或scFv),其中可變的重鏈區(qū)與可變的輕鏈區(qū)連接在一起(直接地或通過肽連接體)以形成連續(xù)多肽。單鏈Fv抗體為共價(jià)連接的VH-\，其可表達(dá)于包括編碼序列的Vh-和的核酸，所述的序列直接連接或通過肽編碼連接體連接(例如Huston等，Proc.Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883，1988)。雖然Vh與Vl彼此連接成單ー的多肽鏈，但是Vh與ん功能區(qū)為非共價(jià)地聯(lián)合?？蛇x擇地，抗體可以是另一片段。例如利用重組技術(shù)也可以產(chǎn)生其他的片段，如可溶性蛋白或獲取于篩選方法的片段。抗體也可以包括雙抗體和微抗體。本發(fā)明的抗體也包括重鏈ニ聚體，諸如駱駝科(camelids)來源的抗體。本文所用的“V區(qū)”指的是抗體可變區(qū)功能區(qū)，其包含骨架I、⑶R1、骨架2、⑶R2和骨架3的區(qū)段，包括由于B細(xì)胞分化期間重鏈和輕鏈V區(qū)重排而將其區(qū)段添加到V區(qū)段的CDR3和骨架4。本文所用的“V區(qū)段”指的是V基因所編碼的V區(qū)的區(qū)域(重鏈或輕鏈)。重鏈可變區(qū)的V區(qū)段編碼FRl-⑶R1-FR2-⑶R2和FR3。出于本發(fā)明的目的，輕鏈可變區(qū)的V區(qū)段被定義為延伸通過FR3直至⑶R3。本文所用的術(shù)語“J區(qū)段”指的是編碼可變區(qū)的子序列，其包括CDR3和FR4的C末端部分。生殖細(xì)胞系J區(qū)段由免疫球蛋白J基因區(qū)段編碼。本文所用的“互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) ”指的是每條鏈中的3個(gè)超變區(qū)，其中斷了由輕鏈和重鏈可變區(qū)所建立的4個(gè)“骨架”區(qū)。⑶Rs主要負(fù)責(zé)結(jié)合抗原表位。每條鏈的⑶Rs通常被稱為⑶R1、⑶R2和⑶R3，從N末端開始按序編號，而且通常通過特定⑶R所處于其中的鏈以鑒定。因此，VHCDR3位于抗體重鏈的可變功能區(qū)，在其中可找到它，而VfDRl為來自于抗體輕鏈的可變功能區(qū)的CDRl，在其中可找到它。不同輕鏈或重鏈的骨架區(qū)的序列在一個(gè)物種內(nèi)是相對保守的?？贵w的骨架區(qū)，即構(gòu)成輕鏈和重鏈的合并的骨架區(qū)，用于在三維空間內(nèi)定位及排列CDRs。利用各種本領(lǐng)域中熟知的定義可確定CDRs和骨架區(qū)的氨基酸序列，例如 Kabat,Chothia, international ImMunoGeneTics database (IMGT),和 AbM(參JAL 例如 Johnson %= , supra;Chothia & Lesk, 1987, Canonical structures for thehypervariable regions of immunoglobulins. J. MoI.Biol. 196,901-917;ChothiaC 等,1989,Conformations of immunoglobulin hypervariable regions.Nature342, 877-883; Chothia C 等，1992，structural repertoire of the human VH segmentsJ.Mol. Biol. 227，799-817; Al-Lazikani 等，J. Mol. Biol 1997,273(4))?？乖Y(jié)合位點(diǎn)的定義也如以下所述Ruiz 等，IMGT, the international ImMunoGeneTics database.Nucleic Acids Res. , 28, 219-221(2000);以及 Lefranc, M. -P. IMGT, the internationalImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. Jan I;29(I):207-9(2001);MacCallum等,Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding sitetopography, J. Mol. Biol, 262 (5), 732-745 (1996);以及 Martin 等,Proc. Natl Acad. Sci.USA,86,9268-9272(1989);Martin 等，Methods Enzymol.，203，121-153，(1991);Pedersen 等,Immunomethods, I, 126, (1992);以及 Rees 等,In Sternberg M. J. E. (ed.), ProteinStructure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996)。“表位”或“抗原決定簇”指的是位于抗原上與抗體結(jié)合的位點(diǎn)。表位可由連續(xù)的氨基酸或非連續(xù)的由蛋白的三級折疊所并列的氨基酸組成。通常暴露于變性溶劑時(shí)由連續(xù)氨基酸組成的表位仍可保留而用變性溶劑處理時(shí)由三級折疊所形成的表位通常會(huì)喪失。表位通常包括獨(dú)特空間構(gòu)象中至少3個(gè)、更經(jīng)常至少5個(gè)或8-10個(gè)氨基酸。確定表位的空間構(gòu)象的方法包括，例如X射線結(jié)晶學(xué)及ニ維核磁共振。參見例如分子生物學(xué)方法中的表
位萬案(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biologyノ，M 66 卷(Vol. 66)，Glenn E. Morris, Ed(1996)。本文所用的“嵌合的抗體”指的是免疫球蛋白分子，其中(a)恒定區(qū)或其部分被改變、取代或交換從而使得抗原結(jié)合位點(diǎn)(可變區(qū))連接不同的或改變的類別、效應(yīng)功能和/或物種的恒定區(qū)，或賦予嵌合抗體新特性的完全不同的分子，例如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等；或(b)可變區(qū)或其部分，被改變、取代或與具有不同的或改變的抗原特異性的可變區(qū)或其部分交換；或與來源于其他的物種，或來自于其他的抗體類別或亞類相一致的序列。本文所用的“人源化抗體”指的是來自于供體抗體的CDRs中的免疫球蛋白分子被移植到人骨架序列。人源化抗體也可包含源于骨架序列的供體的殘基。人源化 抗體也可包含至少人免疫球蛋白恒定區(qū)的一部分。人源化抗體也可包含既在受體抗體中找不到也在輸入的CDR或骨架序列中也找不到的殘基。可利用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行人源化(例如 Jones 等，Nature 321:522-525; 1986; Riechmann 等，Nature332:323-327,1988;Verhoeyen 等，Science 239:1534-1536,1988);Presta, Curr.Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992;美國專利申請第4,816, 567號)，其包括諸如“超級人源化”抗體(Tan 等,J. Immunol. 169:1119, 2002)及“置換”(例如 Staelens 等,Mol.Immunol. 43:1243, 2006;和 Roguska 等,Proc. Natl. Acad. Sci USA91:969, 1994)的技術(shù)。本發(fā)明背景下“Humaneered ”抗體指的是具有參照抗體的結(jié)合特異性的基因工程的人抗體。本發(fā)明中所使用的“ Humaneered ”抗體具有免疫球蛋白分子，該分子包含衍生于供體免疫球蛋白的最小序列。通常，通過將DNA序列與人Vh區(qū)段序列連接，將來自于參照抗體的BSD⑶R3輕鏈與人\區(qū)段序列連接，抗體就是“Humaneered ”，所述的DNA序列編碼來自于參照抗體重鏈的CDR3區(qū)的結(jié)合特異性決定簇(BSD)。美國專利申請公開第20050255552號和美國專利申請公開第20060134098號中提供了人基因工程的(humaneering) Tj 法。本發(fā)明背景下所用的術(shù)語“結(jié)合特異性決定簇”或“BSD”指的是CDR區(qū)中決定抗 體結(jié)合特異性所必需的最小的連續(xù)的或非連續(xù)的氨基酸序列。在本發(fā)明中，最小的結(jié)合特異性決定簇存在于抗體的重鏈和輕鏈的CDR3序列的部分或全長中。本文所用的“人的”抗體包括人源化的和Humaneered 抗體，以及利用已知的技術(shù)獲得的人單克隆抗體。“低巖藻糖基化的”抗體制劑指的是其中小于50%的寡聚糖鏈包含α 1，6_巖藻糖的抗體制劑。在“低巖藻糖基化的”抗體制劑中，通常小于約40%，小于約30%，小于約20%，小于約10%或小于5%或小于1%的寡聚糖糖鏈包含α I, 6-巖藻糖?！叭r藻糖基化的”抗體在碳水化合物中缺乏α I, 6-巖藻糖，所述碳水化合物附著在IgG重鏈的CH2功能區(qū)。當(dāng)關(guān)于核酸的部分使用它時(shí)，術(shù)語“異源的”指的是核酸包含兩個(gè)或多個(gè)子序列，所述子序列通常找不到彼此在本質(zhì)上有相同的關(guān)系。例如，核酸通常是重組產(chǎn)生的，具有兩個(gè)或多個(gè)序列，例如來自于不相關(guān)的基因經(jīng)排列而成為新的功能性核酸。同樣地，異源性蛋白經(jīng)常指的是兩個(gè)或多個(gè)找不到彼此在本質(zhì)上有相同關(guān)系的子序列。當(dāng)關(guān)于例如細(xì)胞、核酸、蛋白或載體使用它時(shí)，術(shù)語“重組的”指的是通過異源性核酸或蛋白的引入，或天然核酸或蛋白的改變，或衍生于如此修飾的細(xì)胞的細(xì)胞，將細(xì)胞、核酸、蛋白或載體修飾。因此，例如重組細(xì)胞表達(dá)不能在細(xì)胞的天然形式(非重組的)中找到的基因或表達(dá)除非是異常表達(dá)的、低表達(dá)的或完全不表達(dá)的天然基因。本文的“重組核酸”意指最初形成于體外的核酸，一般來說通過對核酸的操作，例如使用聚合酶或內(nèi)切酶，以自然界中正常找不到的形式存在。如此可獲得不同序列的可操作地連接。因此，分離的核酸，線性形式或通過連接非正常連接的DNA分子而在體外形成的表達(dá)載體，出于本發(fā)明目的，都被認(rèn)為是重組。應(yīng)理解的是一旦將重組核酸制造并再引入到宿主細(xì)胞或生物體中，它將非重組地復(fù)制，即利用體內(nèi)宿主細(xì)胞的細(xì)胞器而不是體外的操作；然而此類核酸，一旦重組地產(chǎn)生，盡管隨后非重組地復(fù)制，出于本發(fā)明的目的，仍然認(rèn)為是重組。同樣地，“重組蛋白”是ー種利用重組技術(shù)制造的蛋白，即通過如上文所述的重組核酸的表達(dá)。本文所用的EphA3依賴性疾病指的是其中表達(dá)EphA3的細(xì)胞是待治療疾病的治療靶標(biāo)的疾病。術(shù)語“血管生成源性骨髄前體細(xì)胞”指的是骨髓來源的內(nèi)皮前體細(xì)胞和/或循環(huán)的內(nèi)皮細(xì)胞前體細(xì)胞。術(shù)語“癌細(xì)胞”或“腫瘤細(xì)胞”指的是瘤細(xì)胞。該術(shù)語包括良性以及惡性的癌細(xì)胞。相對于其所來源的細(xì)胞類型，致瘤性轉(zhuǎn)化與腫瘤細(xì)胞的表型改變有夫。改變可包括接觸抑制的喪失、形態(tài)學(xué)的改變和異常生長(見Freshney, Culture of Animal Cells a Manualof Basic Technique(3rd edition, 1994)。本發(fā)明背景下“癌癥的抑制生長”指的是減慢生長或減少患有癌癥的患者的癌細(xì)胞負(fù)荷量。因此“癌癥的抑制生長”包括殺死癌細(xì)胞以及減慢或阻止癌細(xì)胞的生長。本文所用的“治療制劑”指的是ー種制劑，當(dāng)將其以治療上有效的劑量給予患有疾病的患者時(shí)，將治愈或至少部分地阻止疾病的癥狀及疾病相關(guān)的并發(fā)癥。兩種或多種多肽(或核酸)序列背景下，術(shù)語“同一的”或“同一性”百分比指的是兩種或多種序列或子序列，其是相同的或具有特定百分比的氨基酸殘基(或核苷酸)，所述 的氨基酸殘基(或核苷酸)是相同的(即約60%同一性，優(yōu)選70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或在特定區(qū)域內(nèi)更高的同一性，當(dāng)在比較窗或指定區(qū)內(nèi)比較和比對最大相似性時(shí))，如利用帶有下文所述的缺省參數(shù)的BLAST或BLAST2. O序列比較算法，或通過手工算法和直觀檢查(參見例如NCBI網(wǎng)站)所測量的。然后據(jù)說此類序列是“實(shí)質(zhì)上同一的”。“實(shí)質(zhì)上同一的”序列也包括具有缺失和/或添加的序列以及那些具有取代及天然形成的，例如多態(tài)的或等位基因的變體和人工變體。如下文所述，優(yōu)選的算法可說明缺ロ等的原因。優(yōu)選地，蛋白序列同一性存在于至少約25個(gè)氨基酸長度的區(qū)域，或更優(yōu)選50-100個(gè)氨基酸長度的區(qū)域，或蛋白長度的區(qū)域。本文所用的“比較窗”包括參照連續(xù)位置的數(shù)目其中之一的區(qū)段，該連續(xù)位置通常20個(gè)-600個(gè)，經(jīng)常約50個(gè)-約200個(gè)，更經(jīng)常約100個(gè)-約150個(gè)，其中在將兩條序列進(jìn)行最佳比對后，可將序列可與相同數(shù)量連續(xù)位置的參照序列進(jìn)行比較。本領(lǐng)域中熟知用于比較的序列比對方法。可進(jìn)行最佳的用于比較的序列比對，例如通過Smith andWaterman(1981)Add. APL Math 2:482 的局部同一性算法、Needleman and Wunsch(1970)J. Mol. Biol. 48:443 的同一性比對算法、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 85:2444的相似性方法捜索、計(jì)算機(jī)執(zhí)行這些算法(威斯康辛遺傳學(xué)軟件包中的 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA 和 TFASTA, Genetics Computer Group (GCG), 575 ScienceDr. , Madison, WI)或通過手工算法和直觀檢查(參見例如Current Protocols inMolecular Biology (Ausube丄等,eds. 1995 supplement；。適用于測定百分比序列同一性和序列相似性的算法的優(yōu)選實(shí)例包括BLAST和BLAST 2. O 算法，其分別描述于 Altschul 等，Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)和Altschul 等，J.Mol· Biol. 215:403-410(1990)中。BLAST 和 BLAST 2. O 可與本文所述的參數(shù)一起使用，以測定本發(fā)明核酸和蛋白的百分比序列同一性。BLASTN程序(對于核酸序列而言)使用的缺省值為字長(W) 11，期望值(E) 10，M=5, N=-4和兩鏈比較。對氨基酸序列而言，BLASTP程序使用的缺省值為字長3，期望值(E) 10，以及BL0SUM62得分矩陣(參見Henikoff and Henikoff Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989))，比對(B) 50，期望值(E) 10，M=5, N=-4和兩鏈比較。兩個(gè)多肽為實(shí)質(zhì)上相同的指征是第一個(gè)多肽與抗第二個(gè)多肽所產(chǎn)生的抗體發(fā)生免疫交叉反應(yīng)。因此，通常多肽與另一個(gè)多肽為實(shí)質(zhì)上相同的，例如，其中兩個(gè)肽僅通過保守取代而不同。術(shù)語“分離的”、“純化的”或“生物學(xué)上提純”指的是實(shí)質(zhì)上或基本上游離于如在其天然狀態(tài)中所發(fā)現(xiàn)的正常伴隨它的組分的物質(zhì)。通常利用分析化學(xué)技木，諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法測定純度和均一性。制劑中存在的占優(yōu)勢的種類的蛋白就是實(shí)質(zhì)上純化的。在一些實(shí)施方案中術(shù)語“純化的”表示蛋白在凝膠電泳中基本上產(chǎn)生一條帯。優(yōu)選地它意味著蛋白為至少85%純化的，更優(yōu)選至少95%純化的，以及最優(yōu)選至少99%純化的。術(shù)語“多肽”、“肽”及“蛋白”可在本文中互換使用，指的是氨基酸殘基的聚合體。該術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為相應(yīng)天然形成的氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸聚合體以及包含修飾的殘基的那些天然形成的氨基酸聚合體和非天然形成的氨基酸聚合體。術(shù)語“氨基酸”指的是天然形成的和合成的氨基酸以及與天然形成的氨基酸功能相似的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然形成的氨基酸是由基因密碼編碼的那些氨基酸以及隨后被修飾的那些氨基酸，例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指的是具有與天然形成的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，例如與氫原子連接的碳原子、羧基、氨基以及R基，例如同型絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。此類類似物可具有修飾的R基(例如正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但是保留了與天然形成的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物指的是具有不同于氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)但是功能與天然形成的氨基酸相似的結(jié)構(gòu)的化合物。本文的氨基酸可通過俗稱的三個(gè)字母的符號或IUPAC-IUB生化命名委員會(huì)所推薦的I個(gè)字母的符號來提及。同樣地，核苷酸可通過他們公認(rèn)的單個(gè)字母的密碼來提及?！氨Ｊ匦揎椀淖凅w”適用于氨基酸和核酸序列。就特定的核酸序列而言，保守修飾變體指的是編碼相同的或基本相同的氨基酸序列或核酸在其中并不編碼氨基酸序列的那些核酸，基本相同或相關(guān)的，例如天然連續(xù)序列的那些核酸。由于基因密碼的簡并性，大量功能上相同的核酸編碼大多數(shù)的蛋白。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸的每個(gè)位置上都是指定的密碼子，密碼子可變成另一個(gè)所述的相應(yīng)密碼子而不改變所編碼的多肽。此類核酸變體為“沉默的變體”，其是ー類保守修飾變體。本文的編碼多肽的每個(gè)核酸序列也描述了核酸的沉默變體。技術(shù)人員應(yīng)理解在某些背景下核酸中的姆個(gè)密碼子(除了 AUG和TGG以外,對蛋氨酸而言AUG通常是唯一的密碼子而對色氨酸而言TGG通常是唯一的密碼子)都可被修飾以產(chǎn)生功能上相同的分子。因此，就表達(dá)產(chǎn)物而言，但不就實(shí)際的探針序列而言編碼多肽的核酸的沉默變體經(jīng)常隱含在所述的序列中。至于氨基酸序列，技術(shù)人員應(yīng)理解，單獨(dú)的核酸、肽、多肽或蛋白序列的取代、缺失或添加為“保守修飾的變體”，其可改變、增加或刪除所編碼序列中單ー的氨基酸或一小部分的氨基酸，其中改變是用化學(xué)上相似的氨基酸取代氨基酸。本領(lǐng)域中熟知提供功能相似氨基酸的保守取代表。除此之外而且并不排除，此類保守的修飾變體為本發(fā)明的多態(tài)變體、種間同系物和等位基因。典型地相互之間的保守取代1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G) ；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)，賴氨酸⑷； 5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，纈氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W) ；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸⑴；以及8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)(參見例如Creighton, Proteins(1984))。如本說明書和附加的權(quán)利要求中所使用的，単數(shù)形式的“一 (a)，，，“ー個(gè)(an) ”和“所述(the) ”包括了復(fù)數(shù)參照物，除非上下文另有明確指示。I.簡介本發(fā)明涉及以高親和カ結(jié)合EphA3而且通常活化EphA3的抗體。所述的抗體包含可變區(qū)，所述可變區(qū)與人生殖細(xì)胞系Vh和\序列有高度氨基酸序列同一性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體的CDRH3包含氨基酸序列X1GX2YE(X3)FDX4，其中X1為S或G，X2為Y或V，X3為E或D以及X4為S、V或I，附加條件是氨基酸序列不是SGYYEDFDS。在一些實(shí)施方 案中，本發(fā)明抗體的⑶RL3包含氨基酸序列X1X2YX3X4YPYT,其中X1*V_A，X2*Q、R_G，X3為A、S或L以及X4為N或K。通常，⑶R3除BSD之外的部分和完整的FR4是由人生殖細(xì)胞系序列組成。在ー些實(shí)施方案中，除BSD之外的CDR3-FR4序列與人生殖細(xì)胞系序列在每條鏈上有不超過兩個(gè)氨基酸的不同。在一些實(shí)施方案中，J區(qū)段包含人生殖細(xì)胞系J區(qū)段。例如人生殖細(xì)胞系序列可通過公開可獲得的國際免疫遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(international ImMunoGeneTics database)(IMGT)或 V-base (互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)址 vbase. mrc-cpe. cam. ac. uk)石角定。人生殖細(xì)胞系V區(qū)段庫由51個(gè)重鏈V區(qū)、40 K輕鏈V區(qū)段以及31 λ輕鏈V區(qū)段組成，形成了總數(shù)為3621個(gè)的生殖細(xì)胞系V區(qū)對。此外，這些V區(qū)段的大多數(shù)存在著穩(wěn)定的等位基因變體，但是這些變體對于生殖細(xì)胞系庫的結(jié)構(gòu)多樣性的貢獻(xiàn)是有限的。所有人生通細(xì)胞系V區(qū)段基因的序列是已知的而且可以在由MRC蛋白質(zhì)工程中心，劍橋，央國(MRCCentre for Protein Engineering, Cambridge, United Kingdom)所提供的 V~base 數(shù)據(jù)洋中獲取(也見于 Chothia 等，1992，J Mol Biol 227:776-798; Tomlinson 等，1995，EMBO J14:4628-4638;以及 Williams 等，1996，J Mol Biol 264:220-232)。本文所述的抗體或抗體片段可表達(dá)于原核或真核的微生物系統(tǒng)中或更高級的真核細(xì)胞諸如哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。本發(fā)明中應(yīng)用的抗體可為任何形式的。例如，在一些實(shí)施方案中，抗體可為包括恒定區(qū)，例如人恒定區(qū)，例如完整的Ig，F(xiàn)ab, Fab’，F(xiàn)(ab’)2，或完整的免疫球蛋白的片段，例如 scFv 或 Fv。II.重鏈本發(fā)明的抗EphA3抗體的重鏈包含重鏈V區(qū)，所述重鏈V區(qū)包含下列的成分I)包含 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 的人重鏈 V 區(qū)段序列；2)包含氨基酸序列X1GX2YE (X3)FDX4的CDRH3區(qū)，其中X1為S或G，X2為Y或V，X3為E或D以及X4為S、V或I，附加條件是氨基酸序列不是SGYYEDFDS ;和3)來源于人生殖細(xì)胞系J基因區(qū)段的FR4。在一些實(shí)施方案中，CDR3包含 GGYYEDFDS、SGYYEEFDS、SGVYEDFDS、SGYYEDFDV 或SGYYEDFDI。V區(qū)段通常具有與人生殖細(xì)胞系V區(qū)段，例如人VHl亞類，的至少80%同一性，或85%、90%、95%或更高的同一性。因此，在一些實(shí)施方案中，V區(qū)段為人VhI 1-02區(qū)段，其與生殖細(xì)胞系區(qū)段VHl 1-02至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的同一性。在一些實(shí)施方案中，V區(qū)段與VHl 1-02有不超過15個(gè)殘基而且優(yōu)選不超過10個(gè)殘基不同。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含V區(qū)段，其具有與生殖細(xì)胞系區(qū)段VH 1-02或圖I中所示的Vh區(qū)的V區(qū)段的其中之一至少90%同一性或至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 同一性。本發(fā)明的抗體的FR4序列由人JH1、JH3、JH4、JH5或JH6生殖細(xì)胞系基因區(qū)段或與人生殖細(xì)胞系JH區(qū)段相比具有高度的氨基酸序列同一性，例如至少90%或95%同一性，或不超過3個(gè)，通常不超過2個(gè)氨基酸殘基不同的序列所提供。在一些實(shí)施方案中，J區(qū)段來自于人生殖細(xì)胞系JH6序列而FR4具有序列WGQGTTVTSS。在一些實(shí)施方案中，Vh區(qū)的V區(qū)段具有如圖I中所示的⑶Rl和/或⑶R2。例如，本發(fā)明的抗體具有⑶R1，所述⑶Rl具有序列GYWMN、TYWIS或SYWIN。本發(fā)明的抗體可具有CDR2，所述 CDR2 具有序列 DIYPGSGNTNYDEKFQG、DIYPGSGNTNYAQKFQG、DIYPGSGNTNYAQEFRG、
DIYPGSGNTNYAQKFLG或DIYPGSGNTNYDEKFKR。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗EphA3抗體可具有 Vh 區(qū) CDR3，CDRl 序列 GYWMN、TYWIS 或 SYWIN 以及 CDR2 序列 DIYPGSGNTNYDEKFQG、DIYPGSGNTNYAQKFQG、DIYPGSGNTNYAQEFRG、DIYPGSGNTNYAQKFLG 或 DIYPGSGNTNYDEKFKR，所述 CDR3 具有序列 GGYYEDFDS、SGYYEEFDS、SGVYEDFDS、SGYYEDFDV、SGYYEDFDI。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗EphA3抗體可以具有Vh區(qū)⑶R3、圖I中所列出的Vh區(qū)的⑶Rl和/或⑶R2，所述⑶R3具有序列SGYYEDFDS。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的Vh區(qū)V區(qū)段具有如圖I中所示的V區(qū)段序列。在典型的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體具有圖I中所列出的Vh區(qū)序列。III.輕鏈本發(fā)明的抗EphA3抗體的輕鏈包含輕鏈V區(qū)，所述輕鏈V區(qū)包含以下成分I)包含 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 的人輕鏈 V 區(qū)段序列；2)具有序列CDR3的CDRL3區(qū)，所述CDR3包含序列X1X2YX3X4PYT,其中X1為V或A，X2為Q、R或G，X3為A、S或L以及X4為N或K ;和3)來源于人生殖細(xì)胞系J基因區(qū)段的FR4。在一些實(shí)施方案中，CDR3具有序列X1X2YX3X4YPYT,其中X1為V，X2為Q，X3為A以及 X4 為 N。在一些實(shí)施方案中，VfDR3 為 GQYANYPYT、VQYAKYPYT、AQYANYPYT、VQYSNYPYT、VQYANYPYT、VGYANYPYT、VRYANYPYT 或 VQYLNYPYT。^區(qū)包含V λ或Vk V區(qū)段。圖I中提供了支持與互補(bǔ)的Vh區(qū)一起結(jié)合的V κ序列的實(shí)例。Vk區(qū)段可為任何亞類，例如經(jīng)常為Vk I亞類。在一些實(shí)施方案中，區(qū)段具有與人生殖細(xì)胞系V κ I的至少80%序列同一性，例如與人生殖細(xì)胞系VkI L15序列的至少80%同一性。在一些實(shí)施方案中，V κ區(qū)段與V在Vk I L15序列在不超過5個(gè)殘基處不同。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的\區(qū)V區(qū)段具有與圖I中所示的人ん區(qū)的κ V區(qū)段序列的至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 同一性。本發(fā)明的抗體的\區(qū)的FR4序列由人生殖細(xì)胞系J區(qū)段所提供，例如或由與人生殖細(xì)胞系J區(qū)段氨基酸序列具有高度同一性的序列提供。在一些實(shí)施方案中，J區(qū)段為人生殖細(xì)胞系J κ 2序列而抗體的FR4具有序列FGQGKLEIK。在一些實(shí)施方案中，ん區(qū)的V區(qū)段具有如圖I所示的⑶Rl和/或⑶R2。因此，本發(fā)明的抗體可以具有 CDRl 序列 RASQGIISYLA、QASQDISTYLN、RASQEISGYLG 或 RASQSISSYLA和/或 CDR2 序列 AASSLQS、GASSLQS、AASSLQR 或 AASTLDS。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗EphA3抗體可具有\(zhòng)區(qū)CDR3序列以及如圖I中所列出的^區(qū)的V區(qū)段其中之一所示的\區(qū)⑶Rl和⑶R2的組合，所述\區(qū)⑶R3序列包含 GQYANYPYT、VQYAKYPYT、AQYANYPYT、VQYSNYPYT、VQYANYPYT、VGYANYPYT、VRYANYPYT 或VQYLNYPYT。在一些實(shí)施方案中，此類抗EphA3抗體可包含為FGQGKLEIK的ん區(qū)FR4區(qū)。因此，本發(fā)明的抗EphA3抗體的\區(qū)可以包括，例如CDR3GQYANYPYT、VQYAKYPYT、AQYANYPYT、VQYSNYPYT、VQYANYPYT、VGYANYPYT、VRYANYPYT、VQYLNYPYT ;CDR1 序列 RASQGIISYLA、QASQDISTYLN、RASQEISGYLG 或 RASQSISSYLA ；以及 CDR2 序列 AASSLQS、GASSLQS、AASSLQR 或AASTLDS。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的ん區(qū)V區(qū)段具有圖I中所示的V區(qū)段序列。在典型的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體具有圖I中所列出的\區(qū)序列。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含SEQ ID NO: 11-23中任一項(xiàng)所列出的ん區(qū)與SEQ ID NO: 1-10中任一項(xiàng)所列出的Vh區(qū)。IV. EphA3抗體的制備可利用熟知的測定法評估抗體的親和カ以確定結(jié)合活性和親和力。此類技術(shù)包括ELISA測定以及應(yīng)用質(zhì)子表面共振或干涉測量法的結(jié)合檢測。例如利用ForteBio (MountainView, CA)澳克太特(Octet)生物傳感器通過生物層干涉測量法測定親和力。本發(fā)明的抗體通常與ml IIA4競爭性結(jié)合EphA3。本文所述的抗體阻斷或與ml IIA4競爭性結(jié)合EphA3的能力表明抗體與用于結(jié)合EphA3的受mIIIA4約束的表位結(jié)合相同的表位或接近的，例如重疊的表位。在其他的實(shí)施方案中，本文所述的抗體，例如包含如圖I中所提供的圖表所示的Vh與ん組合的抗體，可以用作評估其他的抗體是否競爭性結(jié)合EphA3的參照抗體。如果在檢測抗體存在的情況下，參照抗體與抗原結(jié)合減少了至少30%，通常至少約40%、50%、60%或75%，甚至經(jīng)常減少了約90%，那么所述檢測抗體被認(rèn)為是競爭性抑制參照抗體的結(jié)合。許多測定法可用于評估結(jié)合，其包括ELISA以及諸如免疫印跡的其他的測定法。在典型的實(shí)施方案中，抗體為活化抗體。可檢測抗體以確定抗體保留了活化EphA3的活性。可以利用包括磷酸化測定的任何數(shù)量的終端，或諸如凋亡的間接終端檢測活性。早先已描述了具有接近于人生殖細(xì)胞系序列的V區(qū)序列的抗體的分離方法(美國專利申請公開第20050255552號和第20060134098號)?？贵w庫可表達(dá)于適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞或原核細(xì)胞。對ー些細(xì)胞系統(tǒng)中的表達(dá)而言，將信號肽引入到N末端以引導(dǎo)分泌到細(xì)胞外基質(zhì)?？贵w可從帶有或不帶有信號肽的細(xì)菌細(xì)胞，諸如大腸桿菌(E.coli)分泌。美國專利申請第20070020685號描述了抗體片段從大腸桿菌無信號分泌的方法。為生成EphA3結(jié)合抗體，例如如圖I中所示的本發(fā)明的Vh區(qū)的其中之一與例如圖I中所示的本發(fā)明的^區(qū)組合，并以任一數(shù)量形式表達(dá)于適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)中。因此抗體可表達(dá)為scFv，F(xiàn)ab, Fab’ (包含免疫球蛋白鉸鏈序列)，F(xiàn)(ab’)2 (通過兩個(gè)Fab’分子的鉸鏈序列間形成的ニ硫鍵而形成)，整個(gè)的免疫球蛋白或截短的免疫球蛋白，宿主細(xì)胞內(nèi)部或通過分泌的原核或真核宿主細(xì)胞中的融合蛋白。蛋氨酸殘基可任選地存在于N末端，例如在無信號表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)所產(chǎn)生的多肽中。本文所述的每個(gè)Vh區(qū)可與每個(gè)ん區(qū)配對以生成抗EphA3抗體。利用任何數(shù)量的表達(dá)系統(tǒng)可用于產(chǎn)生抗體，其包括原核和真核表達(dá)系統(tǒng)。在ー些實(shí)施方案中，表達(dá)系統(tǒng)為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)，諸如CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。許多此類的系統(tǒng)普遍地購自商業(yè)供應(yīng)方。在其中抗體包含Vh與ん區(qū)的實(shí)施方案中，Vh與ん區(qū)可利用単一的載體表達(dá)，例如在雙順反子表達(dá)單元或在不同的啟動(dòng)子的控制下。在其他的實(shí)施方案中，Vh與Vl區(qū)可利用分開的載體表達(dá)。如本文所述的Vh與\區(qū)可任選地包含N末端的蛋氨酸。本發(fā)明的抗體可以任ー數(shù)量形式產(chǎn)生，其包括如Fab, Fab’, F(ab’ )2, scFv或dAB。本發(fā)明的抗體也可包括人恒定區(qū)。輕鏈的恒定區(qū)可為人κ或λ恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)經(jīng)常為Y鏈恒定區(qū)，例如Υ-1，Y-2, Υ-3或Υ-4恒定區(qū)。在其他的實(shí)施方案中,抗體可為IgA或 IgM。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，抗體的ん區(qū)，例如圖I中所列出的ん區(qū)與人κ恒定區(qū)(例如SEQ ID NO:25)組合以形成完整的輕鏈。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，Vh區(qū)與人Y-I恒定區(qū)組合。任一合適的Y-I同種異型都可以選擇。因此，在一些實(shí)施方案中，抗體為具有恒定區(qū)，例如SEQ ID N0:24的IgG，其具有選自圖I中所列出的Vh區(qū)序列的VH。在一些實(shí)施方案中，抗體具有選自圖I中所列出的ん區(qū)序列的ん。在具體的實(shí)施方案中，抗體具有如SEQ ID N0:25所列出的κ恒定區(qū)和如SEQ ID Ν0:24所列出的重鏈恒定區(qū)，其中重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含來自于圖I中所列出的序列的下列組合的其中ー個(gè)。在一些實(shí)施方案中，例如其中抗體為片段，所述抗體可與另ー個(gè)分子結(jié)合，例如聚こ烯こニ醇(聚こニ醇化)或血清白蛋白以提供在體內(nèi)延長的半衰期。抗體片段的聚こ ニ 醇化的實(shí)例提供于Knight 等,Platelets 15:409, 2004 (for abciximab) ;Pedley等,Br.J.Cancer 70:1126, 1994(for an anti-CEA antibody);Chapman 等,NatureBiotech. 17:780, 1999;以及 Humphreys 等,Protein Eng. Des. 20:227, 2007)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體呈現(xiàn)Fab’或F(ab’)2的形式。全長的輕鏈由\區(qū)與人κ或λ恒定區(qū)的融合所產(chǎn)生。任何一個(gè)恒定區(qū)都可以用于任ー輕鏈；然而，在典型的實(shí)施方案中，κ恒定區(qū)與Vk可變區(qū)組合使用而λ恒定區(qū)與VA可變區(qū)一起使用。Fab’的重鏈為由本發(fā)明的Vh區(qū)與人重鏈恒定區(qū)序列、第一恒定功能區(qū)(CHl)及鉸鏈區(qū)融合所產(chǎn)生的Fd’片段。重鏈恒定區(qū)序列可來自于任一免疫球蛋白類別，但是經(jīng)常來自于IgG,而且可來自于IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。本發(fā)明的Fab’抗體也可為雜合的序列，例如鉸鏈序列可來自于ー種免疫球蛋白亞類而CHl功能區(qū)可來自于不同的亞類。本發(fā)明中應(yīng)用的抗體可以呈現(xiàn)許多的形式。在一些實(shí)施方案中，抗體可以包括Fe區(qū)，例如人Fe區(qū)。例如此類抗體包括結(jié)合EphA3的IgG抗體和具有活性同種型的IgG抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體可以為活性片段(例如它可以使EphA3成為ニ聚體)或諸如Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv、scFv或單域抗體(“dAb”)的抗體衍生物。例如,在一些實(shí)施方 案中，抗體可以為F(ab’)2。本發(fā)明中應(yīng)用的抗體的其他的示例性實(shí)施方案包括活化的納米抗體或活化的駱駝抗體?？赏ㄟ^本領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知的方法額外地重組基因改造此類抗體。如上所述，可以利用已知的技術(shù)生產(chǎn)此類抗體。本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)理解，在ー些實(shí)施方案中，當(dāng)抗體以例如Fv或Fab格式的單價(jià)的形式存在時(shí)，所述抗體可用作多價(jià)的抗體，諸如三價(jià)的或四價(jià)的抗體。形成多價(jià)的抗體的方法是已知的(參見例如King等，CancerRes.54:6176-6185， 1994)。在許多的 實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的抗體具有Fe恒定區(qū)，所述Fe恒定區(qū)具有效應(yīng)功能，例如結(jié)合免疫效應(yīng)細(xì)胞上存在的Fe受體。示例性“效應(yīng)功能”包括Clq結(jié)合，補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性，F(xiàn)e受體結(jié)合，抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)，吞噬作用，細(xì)胞表面受體的下調(diào)(例如B細(xì)胞受體)等。此類效應(yīng)功能通常需要Fe區(qū)與結(jié)合功能區(qū)(例如抗體的可變功能區(qū))組合而且可以利用已知的測定法進(jìn)行評估(參見例如下文所引用的參考文獻(xiàn))。具有活性同種型而且與諸如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及NK細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞上的Fe受體結(jié)合的抗EphA3抗體可以通過ADCC誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。Fe區(qū)可來自于天然形成的IgGl或其他的活性同種型，包括IgG3、IgM、IgA和IgE0 “活性同種型”包括其中Fe區(qū)包含修飾以増加與Fe受體結(jié)合或相反改進(jìn)抗體效價(jià)的抗體。此類Fe恒定區(qū)可包含増加與Fe受體結(jié)合的修飾，諸如突變、糖基化水平的改變等。存在著許多本領(lǐng)域中已知的修飾Fe區(qū)的方法。例如美國專利申請公開第20060039904號描述了增強(qiáng)效應(yīng)功能的Fe受體的變體，其包括修飾與ー個(gè)或多個(gè)Fe配體(例如FcyR, Clq)的結(jié)合親和力。額外地，此類Fe變體改變了抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)活性。其他的Fe變體包括以下所公開的那些Ghetie 等，Nat Biotech. 15:637-40, 1997;Duncan 等，Nature 332:563-564，1988;Lund等，J. Immunol 147:2657-2662，1991;Lund 等，Mo I Immunol 29:53-59，1992;Alegre等,Transplantation 57:1537-1543，1994;Hutchins 等,Proc Natl. Acad Sci USA92:11980-11984,1995;Jefferis 等,Immunol Lett.44:111-117，1995;Lund 等,FASEBJ 9:115-119, 1995;Jefferis 等，Immunol Lett 54:101-104，1996;Lund 等，JImmunol157:4963-4969, 1996;Armour 等，Eur J Immunol 29:2613-2624，1999;Idusogie 等，JImmunol 164:4178-4184，200;Reddy 等，J Immunol 164:1925-1933，2000;Xu 等，CellInmunoI 200:16-26，2000;Idusogie 等，JImmunol 166:2571-2575，2001;Shields 等，JBiol Chem 276:6591-6604, 2001;Jefferis 等，Immunol Lett 82:57-65. 2002;Presta等，Biochem Soc Trans 30:487-490,2002;Lazar 等，Proc. Natl. Acad.Sci.USA103:4005-4010, 2006;美國專利申請第 5, 624, 821; 5, 885, 573; 5, 677, 425; 6, 165, 745; 6,277，375; 5, 869，046; 6, 121，022; 5, 624，821; 5，648，260; 6, 194，551; 6，737，056; 6, 821，505; 6，277，375; 7，335，742;和 7，317，091 號；以及 PCT 公開 WO 94/2935; WO 99/58572; WO00/42072;WO 02/060919 和 W004/029207。糖基化是翻譯后修飾的ー種形式，借助其碳水化合物(糖類)與大分子酶解地連接以產(chǎn)生聚糖。在本發(fā)明的背景下，碳水化合物通常經(jīng)由ー個(gè)或多個(gè)N-連接鍵(通過天冬酰胺或精氨酸側(cè)鏈的氮)連接到抗體Fe區(qū)。然而，O-連接鍵(經(jīng)由羥基氧或絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、羥賴氨酸或羥脯氨酸側(cè)鏈)也是可能的。通常IgG抗體具有位于CH2功能區(qū)Asn297殘基上的保守的N-連接的糖基化位點(diǎn)，而ー些類別和亞類也具有O-連接的糖類，經(jīng)常位于鉸鏈區(qū)，例如一些物種的IgD和IgA。糖類通常為復(fù)合的、高甘露糖的支鏈糖；在N-連接鍵的情況下，直接連接到氨基酸側(cè)鏈氮的糖通常為N-こ酰基葡萄糖胺。
在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)e區(qū)的糖基化可以是修飾的。例如，修飾可以是去糖基化，例如通過改變抗體序列內(nèi)一個(gè)或多個(gè)糖基化的位點(diǎn)。此類方法在美國專利申請第5，714，350和第6，350，861號中進(jìn)行了進(jìn)ー步詳細(xì)地描述。也可制造具有改變類型的糖基化的Fe區(qū)，諸如具有數(shù)量減少的巖藻糖殘基的低巖藻糖基化的Fe變體，或缺少巖藻糖殘基的去巖藻糖基化的Fe變體，或具有增加的二等分的GIcNAc結(jié)構(gòu)的Fe變體。例如可通過在帶有改變的糖基化細(xì)胞器的宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗體實(shí)現(xiàn)此類碳水化合物修飾。帶有改變的糖基化細(xì)胞器的細(xì)胞，其包括鼠骨髄瘤細(xì)胞以及酵母和植物，已在本領(lǐng)域中進(jìn)行了描述并可以用作宿 主細(xì)胞，在其中表達(dá)本發(fā)明的重組抗體并因此產(chǎn)生帶有改變的糖基化的抗體。Umana 等，Nat. Biotechnol 17:176-180，1999 描述了導(dǎo)致 10 倍 ADCC 的二等分的GlcNac0 Umana記錄了此類二等分的分子導(dǎo)致較少的巖藻糖基化。Davies等，Biotechnol.Bioeng. 74:288-294, 2001描述了導(dǎo)致增加的抗CD20抗體的ADCC的帶有插入酶β 1-4-Ν-こ酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶III (GnTIII)(其引起了二等分的GlcNac結(jié)構(gòu))的CHO細(xì)胞。美國專利申請第6，602，684號(Umana)描述了基因工程的細(xì)胞以產(chǎn)生二等分的GlcNac糖蛋白。Shields等，J Biol Chem 277:26733-26740，2002 提供了減少抗體制劑的巖藻糖的方法的實(shí)例，其描述了巖藻糖基化缺陷的CHO細(xì)胞(Led3)以產(chǎn)生IgGl并進(jìn)ー步描述了巖藻糖缺陷的IgGl與人Fe YRIIIA的結(jié)合被改進(jìn)達(dá)到50倍且增加了 ADCC。另外，Shinkawa等，J Biol Chem 278:3466-3473，2003 比較了 YB2/0 和 CHO 細(xì)胞所產(chǎn)生的 IgG。YB2/0 細(xì)胞具有減少的巖藻糖基化和增加的二等分的GlcNac含量。Niwa等，Cline. Cancer Res.1-:6248-6255, 2004比較了抗CD20抗體與YB2/0細(xì)胞中制造的抗體(低巖藻糖基化)并且在后者中觀察到增強(qiáng)的ADCC。例如在Kanda等，Glycobiology 17:104-118, 2006中提供了產(chǎn)生去巖藻糖基化的抗體的技術(shù)的實(shí)例。美國專利申請第6，946，292號(Kanda)描述了巖藻糖轉(zhuǎn)移酶敲除的細(xì)胞以產(chǎn)生去巖藻糖基化的抗體。美國專利申請第7，214，775號和WO 00/61739描述了其中100%抗體為去巖藻糖基化的抗體制劑。其他的修飾糖基化的技術(shù)也是已知的，參見例如美國專利申請公開第20070248600號；第20070178551號(應(yīng)用基因工程的較低級的真核細(xì)胞(酵母)以產(chǎn)生“人的”糖基化結(jié)構(gòu)的GlycoFi技術(shù)方法);第20080060092號(應(yīng)用基因工程的植物以產(chǎn)生“人的”糖基化結(jié)構(gòu)的Biolex技術(shù)方法)；第20060253928號(其也描述了植物的基因改造以產(chǎn)生“人的”抗體)。用于減少巖藻糖的額外的技術(shù)包括ProBioGen技術(shù)(von Horsten等，Glycobiology, (advance access publication July 23,2010) ；Potelligent 技術(shù)(Biowa, Inc. Princeton, N. J.);以及 GlycoMAb 糖基化基因改造技術(shù)(GLYCARTbiotechnology Ab, Zuricn, Switzerland)?？贵w的N-連接的寡糖含量可通過本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行分析。以下是此類方法的ー個(gè)實(shí)例抗體受到酶N-糖苷酶F (Roche; TaKaRa)的消化。通過帶有陽離子模式的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-T0F MS)分析釋放的碳水化合物(Papac等，Glycobiol. 8:445-454, 1998)。然后通過改性高效陰離子交換色譜法(HPAEC)表征單糖組合物(Shinkawa 等，J. Biol. Chem. 278:3466-3473，2003)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，額外地基因改造抗體以降低免疫原性，例如從而使得抗體適用于重復(fù)給藥。生成具有降低的免疫原性的抗體的方法包括人源化、人源基因改造程序以及修飾技木，諸如去免疫原性，其中抗體被進(jìn)ー步地基因改造，例如，在一個(gè)或多個(gè)骨架區(qū)內(nèi)，以去除T細(xì)胞表位。在一些實(shí)施方案中，抗體以可以活化存在于例如血管生成源性骨髓前體細(xì)胞的EphA3表達(dá)細(xì)胞表面上的EphA3或可以通過ADCC殺死此類細(xì)胞的形式呈現(xiàn)。因此，在ー些實(shí)施方案中，抗體是ニ聚化的。在其他的實(shí)施方案中，抗體可以具有活性同種型的単體形式呈現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，抗體以多價(jià)的形式，例如三價(jià)的或四價(jià)的形式呈現(xiàn)，其可以交聯(lián)EphA3。V.用于治療其中EphA3為靶標(biāo)的疾病的抗EphA3抗體的給予本發(fā)明也提供了治療患有期望殺死EphA3表達(dá)細(xì)胞疾病的患者的方法。在ー些實(shí)施方案中，此類疾病可能是腫瘤疾病。因此，在一方面，本發(fā)明提供了利用本發(fā)明的抗體治療腫瘤疾病的方法，其中該方法包括給予患者(其有腫瘤)本發(fā)明的抗EphA3抗體以抑制腫瘤生長?？梢灾委煹哪[瘤包括乳腺、肺、結(jié)腸、胃、肝臟、腎臟、卵巣、食管、前列腺以及其 他的腫瘤。因此用本發(fā)明的抗體治療的實(shí)體腫瘤可以使乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、食管癌、結(jié)腸直腸癌、肝癌、卵巣癌、外陰癌、腎癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、絨毛膜癌、頭頸癌、鼻咽癌、喉癌、肝母細(xì)胞癌、卡波濟(jì)氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、黑色素瘤、皮膚癌、血管瘤、海綿狀血管瘤、血管母細(xì)胞瘤、胰腺癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、許旺氏細(xì)胞瘤(Schwannoma)、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、髓母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤成骨性肉瘤、平滑肌肉瘤的肉瘤、泌尿道癌、甲狀腺癌以及腎母細(xì)胞瘤(Wilm’s tumor)。與瘢痣病和水腫(諸如其與腦腫瘤有夫)有關(guān)的異常的血管增生也可用本發(fā)明的抗體治療。在一些實(shí)施方案中，給予腫瘤細(xì)胞表面上表達(dá)EphA3的患者抗EphA3抗體。在ー些實(shí)施方案中，給予腫瘤中血管內(nèi)皮上表達(dá)EphA3的患者抗EphA3。在一些實(shí)施方案中，患者可在腫瘤細(xì)胞表面和內(nèi)皮上表達(dá)EphA3。在一些實(shí)施方案中，例如抗體以W0/2008/112192中所述的格式呈現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，利用本發(fā)明的抗體治療非腫瘤性狀態(tài)。非腫瘤性狀態(tài)選自以下組成不期望的或異常的肥大，關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，牛皮癬，牛皮癬斑塊，肉狀瘤病，動(dòng)脈粥樣硬化，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，來源于心肌梗塞的水腫，糖尿病和其他的增生性視網(wǎng)膜病變，晶狀體后纖維增生，新生血管性青光眼，年齡相關(guān)的黃斑變性，糖尿病引起的黃斑部水腫，角膜新生血管，角膜移植新生血管形成，角膜移植排斥，視網(wǎng)膜的/脈絡(luò)膜的新生血管形成，虹膜的新生血管形成，眼部新生血管性疾病，血管再狹窄，動(dòng)靜脈畸形(AVM)，腦膜瘤，血管瘤，血管纖維瘤，甲狀腺增生(包括Grave’s病)，角膜和其他組織的移植，慢性炎癥，肺炎，急性肺損傷/ARDS，敗血癥，原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓，惡性肺積液，腦水腫(例如與急性中風(fēng)/閉鎖性頭部外傷/創(chuàng)傷)，滑膜炎癥，RA中形成的血管翳，骨化性肌炎，肥大骨形成，骨關(guān)節(jié)炎(OA)，頑固性腹水，多囊卵巢疾病，子宮內(nèi)膜異位癥，流體疾病的第三間隔(胰腺炎，筋膜室綜合征，燒傷，腸道疾病)，子宮肌瘤，早產(chǎn)，諸如IBD (克隆氏疾病Crohn’s disease和潰瘍性結(jié)腸炎)的慢性炎癥，腎臟同種異體移植排斥，炎性腸道疾病，腎病綜合征，不期望的或異常的組織塊生長(非癌癥)，肥胖，脂肪組織塊生長，血友病性關(guān)節(jié)，化膿性肉芽腫晶狀體后纖維增生，硬皮病，沙眼，血管粘連，滑膜炎，皮炎，子癇前期，腹水,心包積液以及胸腔積液。在一些實(shí)施方案中，給予患有骨髓增生性疾病的患者本發(fā)明的抗體。在一些實(shí)施方案中，骨髓增生性疾病為急性骨髄性白血病，慢性骨髄性白血病，骨髓增生異常綜合征，真性紅細(xì)胞增多癥(PV)，原發(fā)性血小板增多癥(ET)或特發(fā)性骨髓纖維變性(頂)。在ー些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗EphA3抗體與ー個(gè)或多個(gè)額外的治療劑聯(lián)合使用以治療患有慢性骨髓性白血病的患者,其中白血病的干細(xì)胞來自患者表達(dá)EphA3。此類治療劑包括各種化學(xué)治療劑和甲擴(kuò)酸伊馬替尼(imatinib mesylate) (GLEEVEC )o抗體可単獨(dú)地或與其他的治療聯(lián)合給藥以治療感興趣的疾病。在一些實(shí)施方案中，抗EphA3抗體與Bv8拮抗劑，例如Bv8抗體拮抗劑聯(lián)合給藥。Bv8拮抗劑是已知的(參見例如WO 2009039337和本文所引用的涉及Bv8拮抗劑的參考文獻(xiàn))。例如，Bv8拮抗劑包括特異性結(jié)合天然序列Bv8多肽或天然序列Bv8受體(PKR-I/EG-VEGFR1或PKR-2/EG-VEGFR2)多肽的抗體和抗體片段。在一些實(shí)施方案中，也可用額外的治療劑治療患者，包 括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)拮抗劑，例如抗-VEGF抗體拮抗劑，以及其他的治療劑，其實(shí)例額外地描述于下文中。在一些實(shí)施方案中，給予早先已用VEGF拮抗劑，例如抗-VEGF抗體拮抗劑治療的患者抗EphA3抗體。在一些實(shí)施方案中，用VEGF拮抗劑治療腫瘤是難治的。在一些實(shí)施方案中，給予患有早期腫瘤，例如I期，II期或III期腫瘤的患者抗EphA3抗體。本文所用的用VEGF拮抗劑，例如VEGF抗體拮抗劑治療被認(rèn)為是難治的或者患有用VEGF拮抗劑治療難治的腫瘤的患者指的是患者響應(yīng)治療但有副作用，產(chǎn)生耐藥性，對治療不響應(yīng)，不能令人滿意地響應(yīng)治療等。因此，在此類患者或來自于此類患者的腫瘤中，腫瘤細(xì)胞的數(shù)量不能顯著地減少，或有所増加，或腫瘤的大小不能顯著地減小，或有所増大，或在尺寸大小或癌細(xì)胞數(shù)量方面沒有進(jìn)ー步的減少。在體內(nèi)或體外通過本領(lǐng)域中任何已知的用于測定癌細(xì)胞治療有效性的方法進(jìn)行對治療難治的的患者的檢測。同樣地，患有非腫瘤性狀態(tài)的患者，其對用VEGF拮抗劑，例如VEGF抗體治療難治的，在本發(fā)明的背景下指的是不能令人滿意地響應(yīng)用VEGF拮抗劑的治療，例如患者有副作用，產(chǎn)生耐藥性，或不能顯示出狀態(tài)治療指標(biāo)的降低。本發(fā)明的方法包含利用適用于疾病治療的劑量方案，以治療上有效的量給予患者作為藥物組合物的抗EphA3抗體。所述組合物可配制用于各種各樣的藥物遞送系統(tǒng)中使用。ー種或多種生理學(xué)上可接受的賦形劑或載體也包括在適當(dāng)制劑的組合物中。合適的用于在本發(fā)明中使用的制劑可在 Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 21stEdition, Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (雷明頓的藥物科學(xué)與實(shí)踐，21版，費(fèi)城，賓夕法尼亞州。利平科持.威廉斯&威爾金斯，2005)中找到?？笶phA3抗體可以適用于注射的溶液形式提供給患者，諸如用于注射的無菌的等滲的水溶液?？贵w以適當(dāng)?shù)臐舛热芙庥诨驊腋∮诳山邮艿妮d體中。在一些實(shí)施方案中，載體是水性的，例如水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水等。按接近于生理學(xué)狀態(tài)的要求，組合物可包含附加的藥物物質(zhì)，諸如PH調(diào)整劑、緩沖劑以及張カ調(diào)整劑等。以足夠治愈或至少部分地阻止疾病或疾病的癥狀及其并發(fā)癥的量給予患者，例如給予患有腫瘤或非腫瘤性狀態(tài)的患者本發(fā)明的藥物組合物。把足以實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)的量定義為“治療上有效的劑量”。通過監(jiān)測患者對治療的反應(yīng)來確定治療上有效的劑量。表明治療上有效的劑量的典型基準(zhǔn)包括患者疾病癥狀的改善。在該使用中有效的量將取決于疾病的嚴(yán)重程度和患者健康的一般狀態(tài)，其包括諸如年齡、體重、性別、給藥途徑等其他的因素。單一的或多重的抗體給藥可取決于劑量和頻率，這兩者需按照要求以及患者的耐受。無論如何，所述的方法提供了足夠數(shù)量的抗EphA3抗體以有效地治療患者。通過注射或輸液，憑借任一合適的途徑給予抗體，該途徑其包括但不限于靜脈內(nèi)的、皮下的、肌肉內(nèi)的或腹膜內(nèi)的途徑。在一些實(shí)施方案中，抗體可通過吹入法給藥。在一示例性實(shí)施方案中，抗體以10mg/ml儲(chǔ)存在無菌的等滲的鹽水溶液中以用于在4° C下注射并在給予患者之前于IOOml或200ml的O. 9%氯化鈉中稀釋以用于注射。通過靜脈內(nèi)輸液，在整個(gè)I小時(shí)的過程中，以O(shè). 2-10mg/kg的劑量給予抗體。在其他的實(shí)施方案中,通過靜脈內(nèi)輸液，在整個(gè)15分鐘至2個(gè)小時(shí)的過程中，給予抗體。仍然在其他的實(shí)施方案中，給藥程序?yàn)榻?jīng)由皮下弾丸注射。
為選擇抗體的劑量以便提供對患者有效的治療并且在小于O. lmg/kg體重-約25mg/kg體重的范圍內(nèi)或在lmg-2g/患者的范圍內(nèi)。優(yōu)選地劑量為在l-10mg/kg或大約50mg-1000mg/患者的范圍內(nèi)。劑量可以適當(dāng)?shù)念l率重復(fù)，其可在姆天一次至姆三個(gè)月一次的范圍內(nèi)，這取決于抗體的藥代動(dòng)力學(xué)(例如抗體在循環(huán)中的半衰期)和藥效反應(yīng)(例如抗體治療效果的持續(xù)時(shí)間)。在一些實(shí)施方案中，體內(nèi)半衰期為約7天-約25天，以每周I次-毎3個(gè)月一次的頻率重復(fù)抗體劑量。在其他的實(shí)施方案中，大約每月I次給予抗體。本發(fā)明的Vh區(qū)和/或\區(qū)也可用于診斷目的。例如，Vh區(qū)和/或\區(qū)可用于臨床分析，諸如檢測患者來源的細(xì)胞上EphA3水平。例如本發(fā)明的Vh區(qū)和/或\區(qū)也可用于產(chǎn)生抗Id抗體。
實(shí)施例方法學(xué)鼠V區(qū)的亞克隆來源于鼠單克隆的mIIIA4的V區(qū)DNA由馬丁.拉克曼博士(Dr. MartinLackmann)(Department of Biochemistry and Molecular Biology,MonashUniversity, Victoria, Australia)(生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，莫納什大學(xué),維多利亞州，澳大利亞)所提供。PCR用于擴(kuò)增V重鏈區(qū)和V κ區(qū)的V基因以及并入適用于克隆到期望的載體中的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。V區(qū)被克隆為Fab片段并表達(dá)于大腸桿菌中。這ー Fab用于探測EphA3-Fc抗原的結(jié)合，因此在這些實(shí)施例中被稱為參照序列FA4?？贵w純化Fab片段通過來自大腸桿菌的分泌而表達(dá)。細(xì)胞生長于2xYT介質(zhì)中直至OD6tltl為0. 6。利用IPTG在33° C下誘導(dǎo)表達(dá)3小吋。從細(xì)胞周質(zhì)部分獲得組裝的Fabs并利用鏈球菌G蛋白(Streptococcal Protein G),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方法,通過親和色譜法純化(HiTrapProtein G HP柱；通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GE Healthcare))。在ρΗ2· O緩沖液中洗脫Fabs后，就將PH調(diào)至7. O并用pH7. 4磷酸鹽緩沖液(PBS)透析(PBS沒有鈣和鎂)。ELISA通常將50ng抗原結(jié)合到96孔微量滴定平板并在4° C下過夜孵育。33° C下用含5%乳的PBS溶液封閉平板I小吋。將來自大腸桿菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50 μ I)表達(dá)的每個(gè)人基因工程的Fab或最佳化的參照Fab FA106添加至每個(gè)孔。33° C下孵育I小時(shí)后，用PBS+0. 1%吐溫20 (Tween 20) (PBST)洗滌平板3次，將50 μ I HRP標(biāo)記的抗人κ鏈(Sigma;在I3BST中稀釋至O. lng/ml)添加至每個(gè)孔，而且在33° C下孵育平板40分鐘。用PBST洗滌平板3次，用PBS洗滌平板I次。將100 μ I底物3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB) (Sigma)添加至每個(gè)孔并在室溫下孵育平板約5分鐘。將100μ 10. 2Ν硫酸添加至每個(gè)孔以停止反應(yīng)。通過分光光度測定法在450nm處讀取反應(yīng)。為檢測與Eph家族成員的結(jié)合,從研發(fā)系統(tǒng)有限公司(R&D Systems Inc)獲取重組的人Eph細(xì)胞外的(ec)結(jié)構(gòu)域EphAl-Fc融合蛋白，EphA2 ec結(jié)構(gòu)域,EphA5 ec結(jié)構(gòu)域，EphB4 ec結(jié)構(gòu)域以及EphB6 Fe融合蛋白。在37° C下用IOOng Eph蛋白包被ELISA孔I小時(shí)。用PBST洗滌I次后，在37° C下用含5%乳的PBST封閉孔I小時(shí)。洗滌孔I次并將兩倍梯度稀釋的候選人基因工程的抗體添加至每組包被的Eph蛋白。I小時(shí)后，在PBST中、洗滌孔3次并將50 μ I HRP標(biāo)記的抗人κ鏈(Sigma;在PBST中稀釋至O. lng/ml)添加至每個(gè)孔。孵育平板45分鐘，用PBST洗滌3次，用PBS洗滌I次，并將100 μ I TMB添加至每個(gè)孔。通過添加O. 2Ν硫酸停止反應(yīng)并通過450nm處吸光度測量結(jié)合。集落轉(zhuǎn)移結(jié)合測定(CLBA)利用硝酸纖維素濾膜包被的抗原如(美國專利申請公開第20050255552號和第20060134098號)所述的進(jìn)行Fab片段的人源改造庫的篩選。親和カ測量利用質(zhì)子表面共振分析(spr;Biacore T100)在生物傳感器工具有限公司(Biosensor Tools Inc)分析Fab片段的親和カ動(dòng)力學(xué)。以三個(gè)不同F(xiàn)ab濃度測定的結(jié)合常數(shù)和離散常數(shù)計(jì)算親和力。IgGs 的構(gòu)建構(gòu)建嵌合的IIIA4 IgG以包含人IgGl恒定區(qū)和來自最初的鼠IIIA4抗體的可變區(qū)。利用PCR擴(kuò)增來源于由Martin Lackmann提供的鼠IIIA4DNA的重鏈和輕鏈并引入用于克隆的限制性位點(diǎn)。將重鏈可變區(qū)克隆至到位于UCOE序列下游的CMV啟動(dòng)子所表達(dá)的表達(dá)完整的IgGl重鏈的載體中。質(zhì)粒包含在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用于選擇的Neo基因和在大腸桿菌中用于質(zhì)粒產(chǎn)生的Amp基因。同樣地，將輕鏈可變區(qū)克隆至UCOE序列下游的CMV啟動(dòng)子所表達(dá)的表達(dá)人κ輕鏈恒定區(qū)的載體中。質(zhì)粒包含在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用干潮霉素選擇的基因和在大腸桿菌中用于產(chǎn)生的Amp基因。類似地構(gòu)建基因工程的抗體IgG重鏈和輕鏈的載體，除了用于可變區(qū)的DNA獲自上文所述的大腸桿菌表達(dá)載體并且重鏈表達(dá)載體包含嘌呤霉素抗性基因而不是新霉素。通過利用Fugene 6試劑(Promega)共轉(zhuǎn)染重鏈和輕鏈構(gòu)建體，將人基因工程的抗體IgG和嵌合的IIIA4 IgG表達(dá)于修飾的CHO細(xì)胞系中，。流式細(xì)胞術(shù)通常通過以3000每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)(rpm)離心3分鐘采集3X IO6個(gè)SKmel28、LnCAP和B16-F10細(xì)胞。去除介質(zhì)并在4° C下用含2%BSA的PBS封閉細(xì)胞30分鐘，隨后用10 μ g/ml鼠IgG在4° C下再封閉30分鐘。細(xì)胞團(tuán)成丸狀，再懸浮于1.5ml PBS中，將其分成500 μ I等分試樣。在4° C下，每個(gè)等分試樣單獨(dú)地用5 μ g/ml対照的IgG、人基因工程的IgG或嵌合的IIIA4 IgG做探針探測45分鐘。樣品用PBS洗滌I次，并添加藻紅蛋白標(biāo)記的抗人IgG。45分鐘后，洗滌細(xì)胞I次，再懸浮于PBS中，利用FACSCaliber流式細(xì)胞儀，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。就在分析前添加碘化丙啶以除外死細(xì)胞。實(shí)施例I.基因工程的人抗EphA3抗體的鑒定鼠的和參照的V區(qū)氨基酸序列鼠的(mIIIA4)和參照(FA4) V區(qū)序列顯示如下。⑶R序列是下劃線的。mIIIA4 和 FA4Vh:EVKLEESGAELVKPGSSVKLSCKASGYNFTSYfflNffVRLRPGQGLEfflGDIYPGSGNTNYDEKFKRKATLTVDTSSSTAYMQLSSLASEDSALYYCTRSGYYEDFDSffGQGTTLIVSSmIIIA4 和 FA4Vk:DIVLTQTPSSLSASLEERVSLTCRASQEISGYLGffLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKKFSGNRSGS EYSLTISSLESEDFADYYCVOYANYPYTFGGGTKLEIKFabA4具有來自于與人恒定區(qū)融合的mIIIA4的完整鼠V區(qū)并從大腸桿菌中純化。與抗原結(jié)合的Fab片段的稀釋ELISA產(chǎn)生取決于抗體濃度結(jié)合曲線。除了參照Fab(FA4)以外，構(gòu)建佳化的參照Fab (FA106)。將FA4中幾個(gè)骨架氨基酸殘基變成佳化的參照Fab FA106中的人生殖細(xì)胞系。以下提供了佳化的參照Fab的V區(qū)序列。改變成人生殖細(xì)胞系的殘基顯示為粗體字。CDR序列是下劃線的。FA106 Vh:EVKLEESGAELVKPGSSVKLSCKASGYNFTSYWINVVRLRPGQGLEWI⑶IYPGSGNTNYDEKFKRKATLTVDTSSSTAYMQLSSLASED X A V YYC A RSGYYEDFDSffGQGTT VT VSSFA106 Vk: DIVLTQTPSSLSASLEERVSLTCRASQEISGYLGffLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKKFSGNRSGSEYSLTISSLESEDFA T YYCVQYANYPYTFG Q GTKLEI文庫構(gòu)建和V區(qū)盒式結(jié)構(gòu)從連接到含有BSD和人生殖細(xì)胞系J區(qū)段序列的獨(dú)特的⑶R3-FR4區(qū)的人V區(qū)段庫序列構(gòu)建抗原表位集中的文庫。將“全長的"Vh(Vhl和Vh5)和VK (Vk I)文庫用作構(gòu)建“盒式結(jié)構(gòu)的”文庫的基礎(chǔ)，其中只有部分的鼠V區(qū)段首先被人序列文庫取代。構(gòu)建針對Vh和Vk鏈的幾種類型的盒式結(jié)構(gòu)的“文庫”。通過與骨架區(qū)2內(nèi)重疊共同的序列的橋式PCR制備針對V重鏈和V κ鏈的盒式結(jié)構(gòu)。用這種方法構(gòu)建針對人Vhl和Vh5亞類的“前端的”人盒式結(jié)構(gòu)文庫以及針對人Vhl的“中間的”人盒式文庫。構(gòu)建針對Vk I亞類的“前端的”和“中間的”盒式結(jié)構(gòu)文庫。額外地，構(gòu)建由Vh⑶R2-FR3組成的盒式結(jié)構(gòu)文庫。示意圖顯示于圖2中。參照的⑶R2的前4個(gè)殘基(方框的)由5’ PCR引物所編碼。而且mIIIA4⑶R2和人生殖細(xì)胞系Vhl-58⑶R2中下劃線的氨基酸殘基在正向引物的配對組合中是不同的(通過劃線以上和以下的氨基酸殘基所顯示)。3’PCR引物與人生殖細(xì)胞系VhlFR3是互補(bǔ)的。引物用于擴(kuò)增及添加Hu Vhl FR3文庫(來源于脾臟mRNA)至基因工程的⑶R2文庫。連續(xù)的橋式PCR反應(yīng)用于附加“前端”及⑶R3-FR4盒式結(jié)構(gòu)以構(gòu)建功能性V區(qū)。通過集落轉(zhuǎn)移結(jié)合測定鑒定支持結(jié)合抗原的人Vh或Vk盒式結(jié)構(gòu)并根據(jù)ELISA所測定的親和カ確定等級次序。Vh篩選鑒定支持EphA3-Fc重組融合蛋白抗原結(jié)合的“前端”、“中間”和CDR2/FR3盒式結(jié)構(gòu)。Vk篩選鑒定支持抗原結(jié)合的“前端”和“中間”盒式結(jié)構(gòu)。每條鏈的功能性盒式結(jié)構(gòu)重新結(jié)合以構(gòu)建完整地基因工程的、高親和カ的結(jié)合抗原的Fab。鑒定高親和力，基因工程的Fab庫后，建立⑶R3親和カ成熟文庫。利用簡并PCR引物使ー組基因工程的Fab克隆的通用⑶R3 BSD序列突變以生成文庫。利用集落轉(zhuǎn)移和ELISA測定篩選這些突變的文庫。用ELISA針對親和力對選擇的Fabs排序。鑒定支持相似的抗原親和カ或當(dāng)與FA106Fab比較時(shí)改進(jìn)的抗原親和カ的突變。支持或改進(jìn)抗原結(jié)合的重鏈和輕鏈⑶R3突變輔助明確每個(gè)CDR的BSD區(qū)。參照的Fab序列與人基因工程的Fab序列比對將比對的鼠參照V區(qū)段和兩個(gè)基因工程的Fabs氨基酸序列與最靠近的単一的人生殖細(xì)胞系V基因、Vhl-02或Vk I L15比較。針對人基因工程的Fab Vh區(qū)的FR4來自于人生殖細(xì)胞系JH6并且具有序列WGQGTTVTVSS。針對人基因工程的Fab Vk區(qū)的FR4來自于人生殖細(xì)胞系Jk 2并且具有序列FGQGKLEIK。 基因工程的Fabs的Vh區(qū)和V κ區(qū)都與人生殖細(xì)胞系氨基酸序列具有高度的同源性。示例性同源性顯示于表I中。表I.針對兩個(gè)基因工程的V區(qū)的人生殖細(xì)胞系序列的同一性的百分比所有的百分比代表與貫穿V區(qū)的単一的人生殖細(xì)胞系序列(除⑶R3BSD序列之外)的同一性。
人基因工程的Fab |_ Vh對Vh-02Γ Vk對Vk1L15
193%95%
291%95%實(shí)施例2.基因工程的抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)基因工程的Fabs分離于集落轉(zhuǎn)移結(jié)合測定并通過結(jié)合抗原的ELISA確認(rèn)親和力。純化結(jié)合抗原的ELISA中帶有強(qiáng)陽性信號的基因工程的Fab克隆并通過動(dòng)力學(xué)與最佳化的參照Fab FA106比較而進(jìn)ー步地表征。利用Biacore分析兩個(gè)基因工程的Fabs和參照的FabFA106的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。將這三個(gè)Fabs從初始的濃度500nM稀釋至IOOnM并進(jìn)ー步地利用O. 005%Tween-20的PBS(pH7. 4)和O. lmg/ml BSA 3倍梯度稀釋進(jìn)行檢測。五種濃度的每ー個(gè)在三個(gè)不同的密度表面上檢測三次。在25° C下進(jìn)行測定。來自每ー表面的反應(yīng)數(shù)據(jù)適于1:1相互作用模式。計(jì)算的結(jié)合常數(shù)和離散常數(shù)顯示于表2中。基因工程的Fab克隆I和2以及參照的克隆FA106都顯示出對抗原的低納米分子的親和力。表2. 25° C下檢測的人基因工程的Fab結(jié)合常數(shù)
權(quán)利要求
1.抗EphA3抗體，其包含 具有⑶R3的Vh區(qū)，所述⑶R3包含氨基酸序列X1GX2YEX3FDX4，其中X1為S或G，X2為Y或V，X3為E或D以及X4為S、V或I，附加條件是當(dāng)所述氨基酸序列是SGYYEDFDS吋，⑶Rl不是SYWIN并且當(dāng)所述氨基酸序列是SGYYEEFDS時(shí)，CDRl不是TYWIS ； J區(qū)段，其具有相對于人生殖細(xì)胞系J區(qū)段氨基酸序列的不超過兩個(gè)氨基酸的改變；和 V區(qū)段，其包含與人生殖細(xì)胞系V區(qū)段氨基酸序列的至少90%同一性。
2.如權(quán)利要求I所述的抗體，其中所述J區(qū)段具有相對于人JH6氨基酸序列的不超過兩個(gè)氨基酸的改變，并且所述V區(qū)段包含與人VHl 1-02氨基酸序列的至少90%同一性。
3.如權(quán)利要求I或2所述的抗體，其中FR4包含WGQGTTVTVSS。
4.如權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述⑶R3包含GGYYEDFDS、SGYYEEFDS、SGVYEDFDS、SGYYEDFDV 或 SGYYEDFDI。
5.如權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體包含如圖I中列出的Vh區(qū)所顯示的 VhCDRU或 VHCDR2、或 VhCDRI 與 VHCDR2 二者。
6.如權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的抗體，其中Vh區(qū)⑶Rl具有序列GYWMN、TYffIS或SYffINo
7.如權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的抗體，其中Vh區(qū)⑶R2具有序列DIYPGSGNTNYDEKFQG、DIYPGSGNTNYAQKFQG、DIYPGSGNTNYAQEFRG、DIYPGSGNTNYAQKFLG、DIYPGSGNTNYDEKFEG 或 DIYPGSGNTNYDEKFKR。
8.如權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的抗體，其中Vh區(qū)⑶Rl具有序列GYWMN、TYffIS 或 SYWIN 并且 Vh 區(qū) CDR2 具有序列 DIYPGSGNTNYDEKFQG、DIYPGSGNTNYAQKFQG、DIYPGSGNTNYAQEFRG、DIYPGSGNTNYAQKFLG、DIYPGSGNTNYDEKFEG 或 DIYPGSGNTNYDEKFKR。
9.如權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述V區(qū)段序列具有如圖I中所示的VhV區(qū)段。
10.如權(quán)利要求I所述的抗體，其中所述Vh具有圖I中列出的Vh區(qū)序列。
11.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體具有 具有 CDR3 的 \ 區(qū)，所述 CDR3 包含序列 X1X2YX3X4YPTT,其中 X1*G、V_A;X2*Q、R_G;X3*A、S_L;W1X4*N_K; J區(qū)段，其包含與人生殖細(xì)胞系J區(qū)段氨基酸序列的至少90%同一性；和 V區(qū)段，其包含與人生殖細(xì)胞系V區(qū)段氨基酸序列的至少90%同一性。
12.如權(quán)利要求11所述的抗體，其中ん區(qū)J區(qū)段具有與人生殖細(xì)胞系Jk2氨基酸序列FGQGKLEIK比較不超過兩個(gè)氨基酸的改變并且所述V區(qū)段包含與人生殖細(xì)胞系J K I L15氨基酸序列的至少90%同一性。
13.如權(quán)利要求11或12所述的抗體，其中FR4包含氨基酸序列FGQGKLEIK。
14.如權(quán)利要求11、12或13中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述\區(qū)⑶R3包含GQYANYPYT、VQYAKYPYT、AQYANYPYT、VQYSNYPYT、VQYANYPYT、VGYANYPYT、VRYANYPYT 或 VQYLNYPYT。
15.如權(quán)利要求11、12、13或14中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述ん區(qū)包含圖I中所示的\區(qū)序列的⑶R1、或⑶R2、或⑶Rl與⑶R2 二者。
16.如權(quán)利要求11、12、13或14中任一項(xiàng)所述的抗體，其中\(zhòng)區(qū)⑶Rl具有序列RASQGIISYLA, QASQDISTYLN、RASQEISGYLG 或 RASQSISSYLA。
17.如權(quán)利要求11、12、13或14中任一項(xiàng)所述的抗體，其中ん區(qū)⑶R2具有序列AASSLQS、GASSLQS、AASSLQR 或 AASTLDS。
18.如權(quán)利要求11、12、13或14中任一項(xiàng)所述的抗體，其中\(zhòng)區(qū)⑶Rl具有序列RASQGIISYLA, QASQDISTYLN、RASQEISGYLG 或 RASQSISSYLA ;并且八區(qū) CDR2 具有序列AASSLQS、GASSLQS、AASSLQR 或 AASTLDS。
19.如權(quán)利要求11、12、13或14中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述ん區(qū)包含具有如圖I中所示的V區(qū)段序列的V區(qū)段。
20.如權(quán)利要求11所述的抗體，其中所述ん區(qū)具有圖I中列出的ん區(qū)的序列。
21.包含具有CDR3 的 \ 區(qū)的抗體，所述 CDR3 包含 GQYANYPYT、VQYAKYPYT、AQYANYPYT、VQYSNYPYT、VGYANYPYT、VRYANYPYT 或 VQYLNYPYT。
22.如權(quán)利要求21所述的抗體，其中所述抗體包含含有氨基酸序列X1GX2YEX3FDX4的重鏈CDR3，其中X1為S或G，X2為Y或V，X3為E或D，以及X4為S、V或I。
23.如權(quán)利要求22所述的抗體，其中所述重鏈⑶R3包含氨基酸序列GGYYEDFDS、SGYYEEFDS、SGVYEDFDS、SGYYEDFDV 或 SGYYEDFDI。
24.如權(quán)利要求21、22或23中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述ん區(qū)包含圖I中所示的\區(qū)序列的⑶R1、或⑶R2、或⑶Rl與⑶R2 二者。
25.如權(quán)利要求21、22或23中任ー項(xiàng)所述的抗體，其中ん區(qū)⑶Rl具有序列RASQGIISYLA,QASQDISTYLN、RASQEISGYLG 或 RASQSISSYLA。
26.如權(quán)利要求21、22或23中任一項(xiàng)所述的抗體，其中\(zhòng)區(qū)⑶R2具有序列AASSLQS、GASSLQS、AASSLQR 或 AASTLDS。
27.如權(quán)利要求21、22或23中任ー項(xiàng)所述的抗體，其中ん區(qū)⑶Rl具有序列RASQGIISYLA, QASQDISTYLN、RASQEISGYLG 或 RASQSISSYLA ;并且所述 \ 區(qū) CDR2 具有序列AASSLQS、GASSLQS、AASSLQR 或 AASTLDS。
28.如權(quán)利要求21、22或23中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述ん區(qū)包含具有如圖I中所示的V區(qū)段序列的V區(qū)段。
29.抗體，其包含如圖I中列出的Vh區(qū)或如圖I中列出的ん區(qū)。
30.抗體，其包含如圖I中列出的Vh區(qū)與如圖I中列出的ん區(qū)的組合。
31.如權(quán)利要求30所述的抗體，其中所述Vh區(qū)與\區(qū)的組合包括a)SEQID NO:I 與 SEQ ID NO:20，b)SEQID NO:2 與 SEQ ID NO: 11，c)SEQID NO:2 與 SEQ ID NO:12，d)SEQID NO:2 與 SEQ ID NO:19，e)SEQID NO:2 與 SEQ ID NO:21,f)SEQID NO:2 與 SEQ ID NO:22，g)SEQID NO:2 與 SEQ ID NO:23，h)SEQID NO:3 與 SEQ ID NO:11，i)SEQID NO:3 與 SEQ ID NO:12，j)SEQ ID NO:3 與 SEQ ID NO:21，k)SEQ ID NO:3 與 SEQ ID NO:22,I)SEQ ID N0:4 與 SEQ ID NO:11，m)SEQ ID NO:4 與 SEQ ID NO:13，n)SEQ ID NO:5 與 SEQ ID NO:11，o)SEQ ID NO:5 與 SEQ ID NO:13，p)SEQ ID N0:5 與 SEQ ID N0:21,q)SEQ ID NO:6 與 SEQ ID NO:14，r)SEQ ID NO:6 與 SEQ ID NO:15，s)SEQ ID NO:7 與 SEQ ID NO:14，t)SEQ ID NO:7 與 SEQ ID NO:15，u)SEQ ID NO:8 與 SEQ ID NO:14，v)SEQ ID NO:8 與 SEQ ID NO:15，w)SEQ ID NO:9 與 SEQ ID NO:16，x)SEQ ID NO:9 與 SEQ ID NO:17，y)SEQ ID NO:9 與 SEQ ID NO:19，z)SEQ ID NO:10 與 SEQ ID NO:17，aa)SEQ ID NO:10 與 SEQ ID NO:18 或bb)SEQ ID NO:10 與 SEQ ID NO:20。
32.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述Vh區(qū)、或所述ん區(qū)、或所述Vh區(qū)與所述\區(qū)二者的氨基酸序列包含位于N末端的蛋氨酸。
33.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體為IgG。
34.如權(quán)利要求33所述的抗體，其中所述抗體為IgGl或IgG3。
35.如權(quán)利要求33所述的抗體，其中所述抗體為IgG2或IgG4。
36.如權(quán)利要求33所述的抗體，其中所述抗體包含具有SEQID NO: 24列出的氨基酸序列的重鏈恒定區(qū)。
37.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體包含具有SEQID NO:25列出的氨基酸序列的K輕鏈恒定區(qū)。
38.具有重鏈氨基酸序列和輕鏈氨基酸序列的抗體，所述重鏈氨基酸序列和輕鏈氨基酸序列包含 SEQ ID NO: 26 和 SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28 和 SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30和 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32 和 SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34 和 SEQ ID NO: 35、或 SEQID NO:36 和 SEQ ID NO:27。
39.包含權(quán)利要求33至38中任一項(xiàng)所述的抗體的抗體制劑，其中所述重鏈恒定區(qū)為低巖藻糖基化的或去巖藻糖基化的。
40.如權(quán)利要求I至32中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體為(Fab’)2。
41.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體為聚こニ醇化的。
42.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體活化EphA3。
43.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體具有優(yōu)于IOnM的親和力。
44.如權(quán)利要求43所述的抗體，其中所述抗體具有優(yōu)于InM的親和力。
45.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體,其中所述抗體不與ephrinA5競爭性結(jié)合EphA3。
46.具有重鏈氨基酸序列和輕鏈氨基酸序列的抗EphA3抗體，所述重鏈氨基酸序列和輕鏈氨基酸序列包含SEQ ID N0:26 和 SEQ ID NO: 27, SEQ ID N0:28 和 SEQ ID NO: 29,SEQ ID NO:30 和 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO:32 和 SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34 和 SEQ IDNO:35、或SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:27，其中所述抗體為去巖藻糖基化的。
47.包含權(quán)利要求46的抗體的抗體制劑，其中所述抗體制劑為低巖藻糖基化的。
48.治療患有EphA3依賴性疾病的患者的方法,所述方法包括以治療上有效的量給予患者前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述疾病為癌癥。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其中患者已經(jīng)接受或正在接受用血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)拮抗劑的治療。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述VEGF拮抗劑為抗VEGF抗體。
52.如權(quán)利要求49所述的方法,還包括給予患者抗Bv8抗體拮抗劑。
53.如權(quán)利要求49至51中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者患有腫瘤細(xì)胞不表達(dá)EphA3的實(shí)體腫瘤。
54.如權(quán)利要求49至51中任一項(xiàng)所述的方法，其中患者患有腫瘤細(xì)胞表達(dá)EphA3的實(shí)體腫瘤。
55.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述EphA3依賴性疾病為急性骨髄性白血病或慢性骨髓性白血病。
56.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述EphA3依賴性疾病為脊髓發(fā)育不良綜合征、真性紅細(xì)胞增多癥、原發(fā)性血小板增多癥或特發(fā)性骨髓纖維化。
全文摘要
本公開內(nèi)容涉及高親和力的EphA3抗體以及使用此類抗體的方法，當(dāng)將其給予人體時(shí)可減少免疫原性以治療疾病。
文檔編號C07K16/46GK102666589SQ201080056618
公開日2012年9月12日 申請日期2010年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月14日
發(fā)明者克里斯托弗·R·貝炳東, 克里斯蒂娜·伊, 大衛(wèi)·馬迪尼茲, 杰弗里·T·亞蘭東, 肯尼思·魯爾森 申請人:卡羅拜奧斯制藥公司