專利名稱：表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
表達(dá)系統(tǒng)說(shuō)明書
本發(fā)明涉及細(xì)菌毒素尤其是白喉毒素(包括白喉毒素的突變體形式，例如CRM197)的表達(dá)領(lǐng)域，并包括適合于表達(dá)和制備這樣的毒素的大批培養(yǎng)物的方法。本發(fā)明還提供可在本發(fā)明的方法期間使用或產(chǎn)生的新的多核苷酸和多肽。白喉毒素是由白喉棒狀桿菌t/i_M從eria)產(chǎn)生的蛋白外毒素。它作為包含信號(hào)序列(tox信號(hào)序列)的單一多肽產(chǎn)生，該信號(hào)序列在蛋白分泌時(shí)由細(xì)菌移除。由于在殘基190、192或193處的切割，白喉毒素易于被剪接而形成由二硫鍵連接的兩個(gè)亞基，片段A和片段B (Moskaug 等 Biol. Chem. 264: 15709-15713，1989)。片段A是催化活性部分并為依賴NAD的ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶，其特異性靶向蛋白合成因子EF-2，從而使EF-2失活并在細(xì)胞中關(guān)閉蛋白合成。對(duì)細(xì)菌毒素(例如白喉毒素)的免疫性可在感染期間天然獲得，或通過(guò)注射解毒形式的毒素(類毒素)人工獲得(Germanier, Bacterial Vaccines, Academic Press,Orlando, Fl. , 1984)。傳統(tǒng)上通過(guò)化學(xué)修飾天然毒素制備類毒素(Lingood等Brit. J.Exp. Path. 44; 177，1963)，使其無(wú)毒同時(shí)保留抗原性，保護(hù)接種動(dòng)物免受天然毒素的隨后攻擊。備選地，一些具有減少毒性的突變白喉毒素已被描述(US4709017，US4950740)。CRM197是一種無(wú)毒形式的白喉毒素，但與白喉毒素免疫學(xué)上無(wú)法區(qū)分。通過(guò)不產(chǎn)毒的卩遼菌體P 197tox-(通過(guò)亞硝基胍誘變產(chǎn)毒carynephage b而產(chǎn)生)感染白喉棒狀桿菌產(chǎn)生 CRM197 (Uchida 等 Nature New Biology (1971) 233; 8-11)。CRM197蛋白與白喉毒素具有相同的分子量，但與它的不同在于結(jié)構(gòu)基因中的單堿基改變。這導(dǎo)致在位置52上的氨基酸從甘氨酸變成谷氨酰胺，其使得片段A不能與NAD結(jié)合，并因此無(wú)毒(Pappenheimer 1977, Ann Rev, Biochem. 46; 69-94，Rappuoli Applied andEnvironmental Microbiology 1983 年 9 月第 560-564 頁(yè))。白喉類毒素和具有減少毒性的突變體形式CRM197是許多提供抗白喉棒狀桿菌免疫性的疫苗中的組分。一些聯(lián)合疫苗是已知的，其可預(yù)防百日咳桿菌{Bordetellapertussis)、破傷風(fēng)梭菌{Clostridium tetani)、白喉棒狀桿菌，并任選預(yù)防乙肝病毒和/或乙型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae type b)(參見,例如WO 93/24148和WO97/00697, WO 02/055105)。白喉毒素和包括CRM197在內(nèi)的突變體形式也作為對(duì)糖安全和有效的T細(xì)胞依賴載體用于疫苗中。CRM197目前用于乙型流感嗜血桿菌寡糖CRM197綴合物疫苗(HibTitre ;Lederle Praxis Biologicals, Rochester, N. Y.)中。用于制備白喉類毒素(DT)的方法在本領(lǐng)域是公知的。例如，DT可通過(guò)從白喉棒狀桿菌的培養(yǎng)物中純化毒素后化學(xué)解毒而產(chǎn)生，或者可通過(guò)純化毒素的重組體或遺傳學(xué)上解毒的類似物來(lái)制備(例如，如 US4，709，017、US 5,843, 71UUS 5，601，827 和 US 5，917，017 中所述的CRM197或其他突變體)。由于低蛋白豐度，阻礙了產(chǎn)生顯著量的用于疫苗中的白喉毒素(例如CRM197)。之前通過(guò)在大腸桿菌中表達(dá)CRM197時(shí)已發(fā)現(xiàn)該問(wèn)題(Bishai等J Bacteriol.169:5140-5151),Bishai等描述含有白喉毒素(包含tox信號(hào)序列)的重組融合蛋白的表達(dá)，這導(dǎo)致降解蛋白的產(chǎn)生。克隆含有tox信號(hào)序列的白喉片段并將這些序列在大腸桿菌中表達(dá)牽涉某些困難。表達(dá)的蛋白被分泌到周質(zhì)間隙中，而該分泌與宿主細(xì)胞的降低的生存力(O’Keefe等Proc. Natl. Acad. Sci. 86:343-346)和重組蛋白增加的蛋白酶解(Bishai等JBacteriol. 169: 5140-5151)相關(guān)。因?yàn)檫@些原因，已建議移除tox信號(hào)序列以便不再周質(zhì)表達(dá)，這可增加白喉類毒素的表達(dá)(Bishai等)。因此，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N用于通過(guò)周質(zhì)表達(dá)制備細(xì)菌毒素的改進(jìn)方法，其包括以下步驟a)培養(yǎng)包含其中特定信號(hào)序列與細(xì)菌毒素的序列連接的表達(dá)載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物，和b)誘導(dǎo)包含與細(xì)菌毒素連接的特定信號(hào)序列的多肽表達(dá)，使得周質(zhì)表達(dá)細(xì)菌毒素。本申請(qǐng)還提供在本發(fā)明的方法中使用的多核苷酸。在周質(zhì)中產(chǎn)生細(xì)菌毒素比胞質(zhì)產(chǎn)生可具有一種或多種優(yōu)勢(shì)。(I)在切割信號(hào)肽后，蛋白以其成熟形式產(chǎn)生，和/或
(2)大腸桿菌的周質(zhì)是氧化環(huán)境，其允許形成二硫鍵，這可幫助產(chǎn)生可溶性、正確折疊的蛋白，和/或；
(3)大腸桿菌的周質(zhì)與胞質(zhì)相比含有更少的蛋白酶，這可幫助避免蛋白酶剪切表達(dá)的蛋白，和/或；
(4)周質(zhì)還含有較少的蛋白，這允許獲得更純的重組蛋白。發(fā)明概述
在本發(fā)明的第一方面，提供一種包含5’信號(hào)序列部分和3’毒素部分的多核苷酸，其
中；
(a)5’信號(hào)序列部分編碼具有能夠指導(dǎo)異源蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)菌周質(zhì)的氨基酸序列的異源多肽；和
(b)3’毒素部分編碼具有與編碼至少15個(gè)氨基酸和/或至少一個(gè)B或T細(xì)胞表位的SEQ ID NO: 32或其片段有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽。在本發(fā)明的第二方面，提供一種包含5’信號(hào)序列部分和3’毒素部分的多核苷酸，其中
(a)5’信號(hào)序列部分編碼具有能夠指導(dǎo)異源蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)菌周質(zhì)的氨基酸序列的異源多肽，且其中5’信號(hào)序列部分不是來(lái)源于白喉棒狀桿菌；和
(b)3’毒素部分編碼具有與編碼至少15個(gè)氨基酸和/或至少一個(gè)B或T細(xì)胞表位的SEQ ID NO: 32或其片段有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽。在本發(fā)明的第三方面，提供一種包含5’信號(hào)序列部分和3’毒素部分的多核苷酸，其中5’信號(hào)部分序列編碼具有以下的氨基酸序列的信號(hào)肽
(a)SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 或 26 ;
(b)SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26 的變體，該變體與相應(yīng)的序
列的不同在于1、2或3個(gè)點(diǎn)突變、氨基酸插入或氨基酸缺失，該變體能夠?qū)⒈磉_(dá)的蛋白導(dǎo)向周質(zhì)；或
(c)SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 或 26 的至少 10 個(gè)氨基酸的片段，其能夠?qū)⒈磉_(dá)的蛋白導(dǎo)向周質(zhì)。且3’毒素部分編碼細(xì)菌毒素或者其片段或變體。在本發(fā)明的第四方面，提供一種包含與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子連接的本發(fā)明的多核苷酸的載體。在本發(fā)明的第五方面,提供一種包含本發(fā)明的多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的第六方面，提供由本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽。在本發(fā)明的第七方面，提供一種用于制備細(xì)菌毒素的方法，其包括以下步驟a)培養(yǎng)本發(fā)明細(xì)菌宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物，和b)誘導(dǎo)多肽的表達(dá)使得周質(zhì)表達(dá)細(xì)菌類毒素。在本發(fā)明的第八方面，提供一種用于制備綴合物的方法，其包括以下步驟a)使用本發(fā)明的方法制備細(xì)菌毒素，和b)將步驟a)的細(xì)菌毒素與抗原綴合。在本發(fā)明的第九方面，提供一種用于制造疫苗的方法，其包括以下步驟a)使用本發(fā)明的方法制備細(xì)菌毒素或綴合物，和b)將細(xì)菌毒素或其綴合物與藥學(xué)上可接受的賦形劑混合。


圖I -產(chǎn)生CRM197-信號(hào)序列構(gòu)建體的克隆方法概述。通過(guò)NdeI和SacI消化，將編碼與CRM197的N端融合的信號(hào)序列的DNA部分從質(zhì)粒A上切下。通過(guò)AatII和XhoI消化，將CRM197 SEQ ID NO: 31的C端序列從質(zhì)粒B上切下。通過(guò)NdeI、SacI、AatII和XhoI消化并使用DNA連接酶連接，將這兩條序列剪接到pET26b載體中。通過(guò)用AgeI和NdeI消化包含信號(hào)序列的質(zhì)粒和PRIT16668載體并使用DNA連接酶將它們剪接在一起，將所產(chǎn)生的載體(PRIT16668)用于產(chǎn)生其他信號(hào)序列-CRM197構(gòu)建體。圖2 -產(chǎn)生含有無(wú)N端信號(hào)序列的CRM197序列的構(gòu)建體(pRIT16669)的克隆方法概述。這是通過(guò)使用NdeI和AatII消化后連接，將編碼CRM197的PCR片段插入到PRIT16668中而完成。圖3 -產(chǎn)生包含F(xiàn)lgI信號(hào)序列的構(gòu)建體的克隆方法概述。這是通過(guò)使用NdeI和AatII消化后連接，將編碼CRM197的PCR片段和FlgI信號(hào)序列(SEQ ID NO: 23)插入到PRIT16669中而完成。這產(chǎn)生了質(zhì)粒pRIT16681。圖4 -顯示在30°C在三種不同菌株中用IPTG處理后誘導(dǎo)DsbA_CRM197 3小時(shí)的凝膠。使用Novex TG 10_20%凝膠。圖A凝膠是蛋白質(zhì)印記，使用抗-DTPa和抗-小鼠NBT-BCIP染色。圖B凝膠使用考馬斯藍(lán)染色。泳道I包含分子量標(biāo)志物，泳道2包含未被誘導(dǎo)的BLR (DE3)菌株，泳道3包含已被誘導(dǎo)的BLR (DE3)菌株，泳道4包含未被誘導(dǎo)的B834(DE3)菌株，泳道5包含已被誘導(dǎo)的B384 (DE3)菌株和泳道6包含已被誘導(dǎo)的HMS174(DE3)菌株。
圖5 -顯示CRM-197在細(xì)菌細(xì)胞中和在培養(yǎng)基中表達(dá)的凝膠。圖B凝膠顯示蛋白質(zhì)印跡，使用抗-DTPa和抗-小鼠NBT-BCIP染色。圖A使用考馬斯藍(lán)染色。各泳道的內(nèi)容物述于下表
權(quán)利要求
1.一種包含5’信號(hào)序列部分和3’毒素部分的多核苷酸,其中 (a)5’信號(hào)序列部分編碼具有能夠指導(dǎo)異源蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)菌周質(zhì)的氨基酸序列的異源多肽；和 (b)3’毒素部分編碼具有與編碼至少15個(gè)氨基酸和/或至少一個(gè)B或T細(xì)胞表位的SEQ ID NO: 32或其片段有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽。
2.—種包含5’信號(hào)序列部分和3’毒素部分的多核苷酸,其中 (a)5’信號(hào)序列部分編碼具有能夠指導(dǎo)異源蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)菌周質(zhì)的氨基酸序列的多肽，且其中5’信號(hào)序列部分不是來(lái)源于白喉棒狀桿菌；和 (b)3’毒素部分編碼具有與編碼至少15個(gè)氨基酸和/或至少一個(gè)B或T細(xì)胞表位的SEQ ID NO: 32或其片段有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽。
3.權(quán)利要求I或2的多核苷酸，其中5’信號(hào)序列部分編碼具有能夠指導(dǎo)異源蛋白共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)菌周質(zhì)的氨基酸序列的多肽。
4.權(quán)利要求1-3的多核苷酸，其中3’毒素部分編碼SEQID NO: 32。
5.權(quán)利要求1-4的多核苷酸，其中3’毒素部分包含SEQID NO: 31。
6.權(quán)利要求1-5的多核苷酸,其中5’信號(hào)序列部分編碼 a.SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 或 26 中的任一種； b.SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 或 26 的變體，所述變體包含 1、2或3個(gè)點(diǎn)突變、插入或缺失；或c.SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 或26 的至少 10個(gè)氨基酸的片段。
7.權(quán)利要求1-5的多核苷酸,其中5’信號(hào)序列部分編碼 a.SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24 或 26 中的任一種； b.SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24 或 26 的變體，所述變體包含 1、2 或 3個(gè)點(diǎn)突變、插入或缺失；或c.SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24 或 26 的至少 10 個(gè)氨基酸的片段。
8.權(quán)利要求1-5的多核苷酸,其中5’信號(hào)序列部分編碼 a.SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22 或 24 中的任一種； b.SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22 或 24 的變體，所述變體包含 1、2 或3 個(gè)點(diǎn)突變、插入或缺失；或 c.SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22 或 24 的至少 10 個(gè)氨基酸的片段。
9.權(quán)利要求1-5的多核苷酸,其中5’信號(hào)序列部分編碼a.SEQ ID NO: 24 ； b.SEQ ID NO:24的變體，所述變體包含1、2或3個(gè)點(diǎn)突變、插入或缺失；或 c.SEQ ID NO:24的至少10個(gè)氨基酸的片段。
10.一種包含5’信號(hào)序列部分和3’毒素部分的多核苷酸,其中5’信號(hào)部分序列編碼具有以下的氨基酸序列的信號(hào)肽(a)SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 或 26 ;(b)SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26 的變體，所述變體與相應(yīng)的序列的不同在于I、2或3個(gè)點(diǎn)突變、氨基酸插入或氨基酸缺失，所述變體能夠?qū)⒈磉_(dá)的蛋白導(dǎo)向周質(zhì)；或(C) SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 或 26 的至少 10 個(gè)氨基酸的片段，所述片段能夠?qū)⒈磉_(dá)的蛋白導(dǎo)向周質(zhì)； 且3’毒素部分編碼細(xì)菌毒素或者其片段或變體。
11.權(quán)利要求10的多核苷酸，其中5’信號(hào)部分序列編碼具有以下的氨基酸序列的信號(hào)肽(a)SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24 或 26 ;(b)SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26的變體，所述變體與相應(yīng)的序列的不同在于1、2或3個(gè)點(diǎn)突變、氨基酸插入或氨基酸缺失，所述變體能夠?qū)⒈磉_(dá)的蛋白導(dǎo)向周質(zhì)；或(c)SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24 或 26 的至少 10 個(gè)氨基酸的片段，所述片段能夠指導(dǎo)表達(dá)的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)。
12.權(quán)利要求10或11的多核苷酸，其中5’信號(hào)部分序列編碼具有以下的氨基酸序列的信號(hào)肽(a)SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22 或 24 ;(b)SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22或24的變體，所述變體與相應(yīng)的序列的不同在于1、2或3個(gè)點(diǎn)突變、氨基酸插入或氨基酸缺失，所述變體能夠?qū)⒈磉_(dá)的蛋白導(dǎo)向周質(zhì)；或(c)SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22或24的至少10個(gè)氨基酸的片段，所述片段能夠指導(dǎo)表達(dá)的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)。
13.權(quán)利要求10-12的多核苷酸，其中5’信號(hào)部分序列編碼具有以下的氨基酸序列的信號(hào)肽(a)SEQ ID NO: 24 ； (b)SEQ ID NO: 24的變體，所述變體與相應(yīng)的序列的不同在于1、2或3個(gè)點(diǎn)突變、氨基酸插入或氨基酸缺失，所述變體能夠?qū)⒈磉_(dá)的蛋白導(dǎo)向周質(zhì)；或 (c)SEQ ID NO: 24的至少10個(gè)氨基酸的片段，所述片段能夠指導(dǎo)表達(dá)的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)。
14.權(quán)利要求10的多核苷酸，其中5’信號(hào)序列部分編碼SEQID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 或 26 中的至少一種。
15.權(quán)利要求10-11的多核苷酸，其中5’信號(hào)序列部分編碼SEQID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22、24 或 26 中的至少一種。
16.權(quán)利要求10-12的多核苷酸，其中5’信號(hào)序列部分編碼SEQID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22或24中的至少一種。
17.權(quán)利要求10-13的多核苷酸，其中5’信號(hào)序列部分編碼SEQID NO: 24。
18.權(quán)利要求10或14的多核苷酸，其中5’信號(hào)序列部分包含SEQID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23 或 25 中的至少一種。
19.權(quán)利要求11或15的多核苷酸，其中5’信號(hào)序列部分包含SEQID NO: 1、3、9、11、.13、15、17、19、21、23 或 25 中的至少一種。
20.權(quán)利要求12或16的多核苷酸，其中5’信號(hào)序列部分包含SEQID NO: 1、3、9、11、.13、15、17、19、21或23中的至少一種。
21.權(quán)利要求13或17的多核苷酸，其中5’信號(hào)序列部分包含SEQID NO: 23。
22.權(quán)利要求10-21的多核苷酸，其中細(xì)菌毒素是白喉毒素或者其片段或變體。
23.權(quán)利要求10-22的多核苷酸，其中細(xì)菌毒素是CRM197或者其片段或變體。
24.權(quán)利要求10-23的多核苷酸，其中3’毒素部分編碼與SEQID NO: 32有至少90%或至少95%序列同一性的多肽。
25.權(quán)利要求10-24的多核苷酸，其中3’毒素部分編碼具有SEQID NO: 32或其片段的氨基酸序列的多肽。
26.權(quán)利要求10-25的多核苷酸，其中3’毒素部分包含SEQID NO: 31。
27.權(quán)利要求1-26的多核苷酸，其編碼包含SEQID NO: 33-45的多肽。
28.權(quán)利要求10-21的多核苷酸，其中細(xì)菌毒素是破傷風(fēng)毒素或者其片段或變體。
29.權(quán)利要求1-28的多核苷酸,其中5’信號(hào)序列部分直接是3’毒素部分的5’。
30.一種載體，其包含與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子連接的權(quán)利要求1-29的多核苷酸。
31.權(quán)利要求30的載體，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子通過(guò)加入足夠量的IPTG而激活。
32.—種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求30或31的表達(dá)載體或者權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)的多核苷酸。
33.權(quán)利要求32的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是革蘭氏陰性細(xì)菌。
34.權(quán)利要求32或33的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞選自大腸桿菌、不動(dòng)桿菌屬、放線桿菌屬、博德特氏菌屬、布魯氏菌屬、彎曲桿菌屬、藍(lán)細(xì)菌屬、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、弗朗西斯氏菌屬、螺桿菌屬、嗜血桿菌屬、克雷伯氏菌屬、軍團(tuán)菌屬、莫拉氏菌屬、奈瑟氏球菌屬、巴斯德氏菌屬、變形菌屬、沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬、志賀氏桿菌屬、密螺旋體屬、弧菌屬和耶爾森氏菌屬。
35.權(quán)利要求32-34的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
36.一種多肽,其由權(quán)利要求1-29的多核苷酸編碼。
37.一種用于制備細(xì)菌毒素的方法，其包括以下步驟a)培養(yǎng)權(quán)利要求32-35的細(xì)菌宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物，和b)誘導(dǎo)多肽表達(dá)使得周質(zhì)表達(dá)細(xì)菌類毒素。
38.一種用于周質(zhì)表達(dá)重組多肽的方法，所述方法是通過(guò) A.培養(yǎng)革蘭氏陰性宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物；和 B.誘導(dǎo)多肽表達(dá)使得周質(zhì)表達(dá)蛋白； 其中在表達(dá)期間進(jìn)行一種或多種下述步驟 i.步驟a)的pH低于步驟b)的pH ； .步驟a)的溫度高于步驟b)的溫度；或 iii.步驟a)的基質(zhì)補(bǔ)料速度高于步驟b)的基質(zhì)補(bǔ)料速度。
39.權(quán)利要求38的方法，其中進(jìn)行步驟i、步驟ii、步驟iii、步驟i和步驟ii、步驟i和步驟iii、步驟ii和步驟iii，或步驟i、步驟ii和步驟iii。
40.權(quán)利要求38-39的方法，其中表達(dá)權(quán)利要求1-15的多核苷酸。
41.權(quán)利要求37-40的方法，其中步驟a)的pH和步驟b)的pH相同。
42.權(quán)利要求37-40的方法，其中步驟a)的pH低于步驟b)的pH。
43.權(quán)利要求37-42的方法，其中步驟a)中的pH在6.0-7. O或6. 5-7. O的范圍內(nèi)。
44.權(quán)利要求37-43的方法，其中步驟b)中的pH在6.5-10. 0、7. 0-8. 0、6. 5-9. O或.7.0-8. 5的范圍內(nèi)。
45.權(quán)利要求44的方法，其中在步驟b)期間維持pH。
46.權(quán)利要求44或45的方法，其中使用選自磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液和組氨酸緩沖液的緩沖液維持pH。
47.權(quán)利要求46的方法，其中緩沖液的濃度是10-200mM、50-100mM、10_50mM、.100-200mM 或 50-150mM。
48.權(quán)利要求37-47的方法，其中緩沖液是80-100mM的磷酸鹽緩沖液。
49.權(quán)利要求37-48的方法，其中所述方法在發(fā)酵罐中進(jìn)行。
50.權(quán)利要求42-49的方法，其中步驟b)中pH的增加是通過(guò)加入堿例如氫氧化鈉或氨而實(shí)現(xiàn)。
51.權(quán)利要求41-50的方法，其中通過(guò)在步驟b)期間加入氫氧化鈉或氨維持pH在.6.5-10. 0,7. 0-8. 0,6. 5-9. O 或 7. 0-8. 5 之間。
52.權(quán)利要求37-51的方法，其包括步驟a)中的第一基質(zhì)補(bǔ)料速度和步驟b)中的第二基質(zhì)補(bǔ)料速度，且其中第二基質(zhì)補(bǔ)料速度低于第一基質(zhì)補(bǔ)料速度。
53.權(quán)利要求52的方法，其中第二基質(zhì)補(bǔ)料速度維持在第一基質(zhì)補(bǔ)料速度的5%-90%、.20%-80% 或 20%-30% 之間。
54.權(quán)利要求37-53中任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)菌毒素是白喉毒素或其點(diǎn)突變的變體。
55.權(quán)利要求54的方法，其中細(xì)菌毒素是CRM197。
56.權(quán)利要求37-53中任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)菌毒素是破傷風(fēng)毒素。
57.權(quán)利要求37-56中任一項(xiàng)的方法，其中步驟a)的溫度高于步驟b)的溫度。
58.權(quán)利要求37-57中任一項(xiàng)的方法，其中步驟a)在20_40°C的溫度下進(jìn)行。
59.權(quán)利要求37-57中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)在20-28°C、21-27°C、21-24°C或.22-23 °C的溫度下進(jìn)行。
60.權(quán)利要求37-59中任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)加入足夠量的IPTG在步驟b)中誘導(dǎo)表達(dá)。
61.權(quán)利要求60的方法，其中加入IPTG至終濃度為O.1-lOmM。
62.權(quán)利要求37-61中任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞在誘導(dǎo)時(shí)具有0-2.5或.O.4-1. 5 的光密度(OD650)。
63.權(quán)利要求49-62的方法，其中發(fā)酵罐包含10-2000升的培養(yǎng)物。
64.權(quán)利要求49-63的方法，其中發(fā)酵罐包含100-200L或約150L的培養(yǎng)物。
65.權(quán)利要求49-64的方法，其中溶氧水平超過(guò)5%。
66.權(quán)利要求65的方法，其中溶氧水平是15-25%。
67.權(quán)利要求37-66中任一項(xiàng)的方法，其中從在細(xì)菌宿主細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌毒素中移除信號(hào)肽以獲得成熟細(xì)菌毒素。
68.權(quán)利要求37-67中任一項(xiàng)的方法，其包括從培養(yǎng)物中收獲細(xì)胞漿的另外步驟c)。
69.權(quán)利要求37-68中任一項(xiàng)的方法，其包括純化細(xì)菌毒素例如成熟細(xì)菌毒素的另外步驟。
70.一種用于制備綴合物的方法，其包括以下步驟i)使用權(quán)利要求37-64中任一項(xiàng)的方法制備細(xì)菌毒素，和ii)將步驟a)的細(xì)菌毒素與抗原綴合。
71.權(quán)利要求70的方法，其中抗原是細(xì)菌糖。
72.權(quán)利要求71的方法，其中細(xì)菌糖是來(lái)自肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟氏球菌或金黃色葡萄球菌的莢膜糖。
73.一種用于制造疫苗的方法，其包括以下步驟 A.使用權(quán)利要求37-72的方法制備細(xì)菌毒素或綴合物和； B.將細(xì)菌毒素或其綴合物與藥學(xué)上可接受的賦形劑混合。
74.權(quán)利要求73的方法，其中細(xì)菌毒素在步驟b)中與另外的抗原混合。
75.權(quán)利要求73-74的方法，其中細(xì)菌毒素在步驟b)中與佐劑混合。
全文摘要
本文提供與毒素的周質(zhì)表達(dá)相關(guān)的組合物和方法，所述毒素包括白喉毒素或CRM197。
文檔編號(hào)C07K14/34GK102639558SQ201080055871
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2010年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月8日
發(fā)明者D.馬丁, M.德韋爾欽, N.布萊斯, P.M.H.德霍泰, P.戈芬 申請(qǐng)人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司