專利名稱：金黃色葡萄球菌的菌血癥相關(guān)抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的免疫接種組合物。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌(S. aureus)是革蘭氏陽(yáng)性球菌。其在美國(guó)的年死亡率超過(guò)包括HIV/AIDS的任何其他傳染病，且金黃色葡萄球菌是血流、下呼吸道、皮膚和軟組織感染的主要原因。特別關(guān)注對(duì)大多數(shù)抗生素有抗性的MRSA (甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌)。
目前沒(méi)有批準(zhǔn)的金黃色葡萄球菌疫苗。參考文獻(xiàn)I報(bào)道了默克公司(Merck)和因特塞爾公司(Intercell)的“V710”疫苗正在接受心胸手術(shù)的患者中進(jìn)行2/3期實(shí)驗(yàn)。V710疫苗基于單一抗原IsdB[2]，其為螯合鐵的細(xì)胞表面蛋白。仍需要進(jìn)一步鑒定和改良用于金黃色葡萄球菌疫苗的抗原，特別是用于抵抗MRSA株系的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
MRSA的“TW”株系在ST-239中，其附著血管的能力增強(qiáng)并導(dǎo)致人菌血癥[3]。相比其他地方性和相關(guān)株系，其與包括纖連蛋白在內(nèi)的一些胞外基質(zhì)蛋白的體外結(jié)合也增強(qiáng)。其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的入侵優(yōu)于地方性或相關(guān)株系。本發(fā)明人鑒定到TW中的菌血癥相關(guān)抗原"BAA"。BAA是噬菌體編碼的表面表達(dá)粘附素，顯示體外結(jié)合纖連蛋白并因此可能使MRSA株系的導(dǎo)管相關(guān)的菌血癥表型增強(qiáng)。因此其用作疫苗靶標(biāo)例如阻止MRSA引起的菌血癥，包括針對(duì)ST239型株系。本發(fā)明提供用于針對(duì)金黃色葡萄球菌疾病和/或感染免疫接種的BAA抗原。本發(fā)明還提供包括BAA抗原多肽序列和至少一種其他金黃色葡萄球菌抗原多肽序列的融合蛋白。所述融合蛋白在針對(duì)金黃色葡萄球菌疾病免疫接種的免疫原性組合物中用作活性成分。本發(fā)明還提供包括BAA抗原和至少一種其他金黃色葡萄球菌抗原的免疫原性組合物。所述組合物用于針對(duì)金黃色葡萄球菌疾病免疫接種。本發(fā)明還提供包括BAA抗原和至少一種非金黃色葡萄球菌抗原的免疫原性組合物。所述組合物用于針對(duì)一定范圍的疾病免疫接種。本發(fā)明還提供一種包含以下組合的免疫原性組合物(I)BAA抗原；和⑵佐劑。本發(fā)明還提供抗BAA抗體。所述抗體用于例如單獨(dú)或與另一治療如抗生素聯(lián)用來(lái)治療和/或阻止金黃色葡萄球菌疾病。本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中是否存在金黃色葡萄球菌的方法，所述方法包括檢測(cè)樣品中的BAA抗原或編碼BAA抗原的核酸。
BAA 抗原所述BAA抗原之前在表皮葡萄球菌(S^pidermidis)中觀察到，稱為Sesl [4，5]、SE1654[6]或SesD [7]。然而先前報(bào)道在金黃色葡萄球菌株系中沒(méi)有BAA抗原[6]。對(duì)表皮葡萄球菌抗原的研究已證實(shí)該抗原是侵入能力的標(biāo)記物(且很可能是毒力因子)、有免疫原性且可引發(fā)針對(duì)細(xì)菌的調(diào)理素吞噬活性。預(yù)期在金黃色葡萄球菌的相同抗原中也有同一特性。此外，已證實(shí)金黃色葡萄球菌中的BAA抗原具有纖連蛋白結(jié)合活性，證實(shí)了其表面暴露和功能性表達(dá)，因此再次支持了金黃色葡萄球菌蛋白應(yīng)具有表皮葡萄球菌蛋白所見(jiàn)特性的觀點(diǎn)。本發(fā)明的BAA抗原可包括氨基酸序列(a)與SEQ ID NO 1具有50%或更高的相同性(如 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO: I的至少’n’個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中’ n’是7或更多(如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。
這些BAA序列包括SEQ ID NO :1的變體。(b)的優(yōu)選片段包括SEQ ID NO :1的表位。其他優(yōu)選片段缺少SEQ ID NO: IC末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、
20、25或更多個(gè))和/或SEQ ID NO: IN末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、15、20、25或更多個(gè))，而保留5￡0 ID NO: I的至少一個(gè)表位。因此，例如，與SEQ ID NO: I相比，本發(fā)明所用多肽可包括一個(gè)或多個(gè)(如1、2、3、
4、5、6、7、8、9個(gè)等)氨基酸取代，如保守取代(即用具有相關(guān)側(cè)鏈的另一氨基酸取代某氨基酸)。遺傳編碼的氨基酸通常分為四類⑴酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；⑵堿性，即賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性，即丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)極性不帶電，即甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。有時(shí)將苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起稱為芳族氨基酸。通常，這些家族中的單個(gè)氨基酸的替換不會(huì)對(duì)生物活性產(chǎn)生重要影響。相對(duì)于SEQ ID NO: 1，該多肽也可包含一個(gè)或多個(gè)(如1、2、3、4、5、6、7、8、9等)單個(gè)氨基酸的缺失。相對(duì)于SEQ ID NO: 1，該多肽也可包含一個(gè)或多個(gè)(如1、2、3、4、5、6、7、8、9個(gè)等)插入(如各1、2、3、4或5個(gè)氨基酸)。類似地，BAA抗原可包含某氨基酸序列，該序列(a)與 SEQ ID NO: I 相同(即 100% 相同性);(b)與 SEQ ID NO: I 共有序列相同性(例如 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5% 或以上)；(c)與SEQ ID NO: I相比，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)(或更多個(gè))單氨基酸改變(缺失、插入、取代)的序列，這些改變可以位于不同位置或可連續(xù)；和/或(d)用逐對(duì)比對(duì)算法與SEQ ID NO: I比對(duì)時(shí)，每個(gè)從N-末端向C-末端移動(dòng)的x個(gè)氨基酸的窗口(從而對(duì)于延伸至P(P>x)個(gè)氨基酸的比對(duì)，存在p-x+1個(gè)這種窗口 )具有至少 x-y 個(gè)相同的比對(duì)氨基酸，其中:x 選自 20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200 ；y 選自 0. 50,0. 60,0. 70,0. 75,0. 80,0. 85,0. 90,0. 91,0. 92,0. 93,0. 94,0. 95,0. 96、0. 97,0. 98,0. 99 ;且如果x y不是整數(shù)，則四舍五入至最接近的整數(shù)。優(yōu)選的逐對(duì)比對(duì)算法是Needleman-Wunsch全局比對(duì)算法[8],使用默認(rèn)參數(shù)(如缺口開(kāi)放罰分=10. 0,缺口延伸罰分=0. 5，使用EBL0SUM62積分矩陣)。用EMBOSS軟件包中的needle工具能方便地實(shí)施這種算法[9]。
在(c)組內(nèi)，缺失或取代可發(fā)生在N末端和/或C末端，或者可以出現(xiàn)在兩末端之間。因此，截短是缺失的一個(gè)例子。截短可包括在N末端和/或C末端缺失多達(dá)40個(gè)(或更多個(gè))氨基酸。N末端截短可移除前導(dǎo)肽例如有利于在異源宿主中重組表達(dá)。C末端截短可移除錨定序列例如有利于在異源宿主中重組表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包括BAA抗原多肽序列和至少一種其他抗原(優(yōu)選金黃色葡萄球菌抗原)多肽序列的融合蛋白。因此單一多肽鏈可提供兩種不同抗原功能?？墒褂糜葿AA和兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或十種其他抗原的氨基酸序列組成的融合蛋白。所述融合蛋白可與下述偶聯(lián)物或非金黃色葡萄球菌抗原組合。融合多肽可以式NH2-A-{-X-L-}n-B-C00H表示，其中X是上述抗原的氨基酸序列山是任選接頭的氨基酸序列；A是任選的N末端氨基酸序列；B是任選的C末端氨基酸序列；n是2或更大的整數(shù)(如
2、3、4、5、6等)。至少一種-X-部分是BAA抗原。n通常是2或3。n為2時(shí)，所述BAA序列 可為X1或X2,即N-末端或C-末端抗原。如果-X-部分具有野生型形式中的前導(dǎo)肽序列，則其在融合蛋白中可以包含或者略去。在一些實(shí)施方式中，前導(dǎo)肽可缺失，除非-X-部分位于融合蛋白的N-末端，即保留X1的前導(dǎo)肽，但略去X^Xn的前導(dǎo)肽。這相當(dāng)于刪除所有前導(dǎo)肽并使用X1的前導(dǎo)肽作為-A-部分。在{-X-L-}的各個(gè)n值的情況下，接頭氨基酸序列-L-可存在或不存在。例如，當(dāng) n=2 時(shí)，融合蛋白可以是 NH2-X1-L1-X2-L2-COOl NH2-X1-X2-COOH, NH2-X1-L1-X2-COOH,NH2-X1-X2-L2-COOH等。接頭氨基酸序列-L- 一般較短(如20個(gè)或更少的氨基酸，即20、19、
18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括有利于克隆的短肽序列，聚-甘氨酸接頭(即包含Glyn，其中n=2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高)，組氨酸標(biāo)簽(即Hisn,其中n=3、4、5、6、7、8、9、10或更高)。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然了解其它合適的接頭氨基酸序列。有用的接頭是GSGGGG(SEQ ID NO 2)或GSGSGGGG(SEQ ID NO: 3)，Gly-Ser 二肽由 BamHI 限制位點(diǎn)形成，因而有助于克隆和操作，(Gly)4四肽是常用的多聚甘氨酸接頭。其他合適接頭，尤其用作最后一個(gè)Ln的接頭是ASGGGS (SEQ ID NO:4)或Leu-Glu 二肽。-A-是任選的N末端氨基酸序列。其一般較短(如40個(gè)或更少的氨基酸，即40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、
14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個(gè))。示例包括指導(dǎo)蛋白運(yùn)輸?shù)那皩?dǎo)序列，或有利于克隆或純化的短肽序列(如組氨酸標(biāo)簽，即Hisn，其中11=3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。其它合適的N末端氨基酸序列對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)。如果X1缺少其自身的N-末端甲硫氨酸，-A-優(yōu)選是提供N-末端甲硫氨酸的寡肽(例如，具有1、2、3、4、5、6、7或8個(gè)氨基酸)，如Met-Ala-Ser或單個(gè)Met殘基。-B-是任選的C末端氨基酸序列。其一般較短(如40個(gè)或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、
13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個(gè))。示例包括指導(dǎo)蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)男蛄校欣诳寺』蚣兓亩屉男蛄?如包含組氨酸標(biāo)簽即Hisn，其中n=3、4、5、6、7、8、9、10或更多，如SEQ IDN0:5)，或能提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列。其它合適的C末端氨基酸序列對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。通常，多肽包括與SEQ ID NO: I不同的序列時(shí)(例如當(dāng)包括其中序列相同性〈100%的序列時(shí)，或包括其片段時(shí))，或除了 BAA序列之外多肽還包括抗原時(shí)，優(yōu)選所述多肽能引發(fā)識(shí)別具有氨基酸序列SEQ ID NO: I的金黃色葡萄球菌蛋白的抗體。因此本發(fā)明的BAA抗原或融合蛋白可(例如在給予人時(shí))引起識(shí)別金黃色葡萄球菌基因組中如SEQ ID NO: I所編碼野生型蛋白的抗體。其他金黃色葡萄球菌抗原在一些實(shí)施方式中，免疫原性組合物包括BAA抗原和至少一種其他金黃色葡萄球菌抗原的組合。所述其他抗原可為多肽和/或糖抗原。
合適的多肽抗原可選自下列抗原(如參考文獻(xiàn)10-17所述和定義)免疫顯性ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、層連蛋白受體、SsaA、SitC(還稱為MntC)、IsaA(還稱為PisA或IssA)、EbhA>EbhB, Aap, RAP (RNA III 激活蛋白)、FIG、EbpS、EFB、a 毒素(溶血素)、SBI、IsdA、IsdB、SdrC、Cl fA、FnbA、Cl fB、凝固酶、FnbB、MAP、HarA、自溶素氨基葡糖苷酶、自溶素酰胺酶、Ebh、自溶素 Ant、MRPII, SdrG, SdrE, SdrD, SasF, AhpC, AhpF、膠原結(jié)合蛋白 CAN、GehD 脂酶、肝素結(jié)合蛋白 HBP(17kDa)、NP 酶(Npase)、0RF0594、0RF0657n、0RF0826、PBP4、Sai-U SasK、SBI、SdrH, SSP-I、SSP-2、連蛋白結(jié)合蛋白。合適的糖抗原包括金黃色葡萄球菌莢膜糖和/或金黃色葡萄球菌表多糖。糖抗原可偶聯(lián)載體蛋白。金黃色葡萄球菌的表多糖是聚N乙?；咸前?PNAG)。所述糖可以是具有細(xì)菌表多糖純化過(guò)程中所產(chǎn)生尺寸的多糖，或者其可以是這類多糖片段化產(chǎn)生的寡糖，尺寸可以是例如從400kDa以上到75-400kDa，或者10_75kDa，或者多至30個(gè)重復(fù)單位。所述糖可具有各種N乙?；潭惹胰鐓⒖嘉墨I(xiàn)18所述，PNAG可小于40%N乙酰化(如小于35、30、20、
15、10或5%N-乙酰化；脫乙?；疨NAG也稱為dPNAG)。PNAG的脫乙酰化表位可引發(fā)能夠介導(dǎo)調(diào)理殺傷作用的抗體。PNAG可以進(jìn)行或不進(jìn)行0-琥珀酰化，例如在少于25、20、15、10、
5、2、1或0. 1%殘基上。金黃色葡萄球菌的莢膜糖可以是多糖，其大小是在從細(xì)菌純化該糖時(shí)形成，或者其可以是這種多糖片段化時(shí)產(chǎn)生的寡糖?？蓮娜魏魏线m的金黃色葡萄球菌株系(或任何具有相似或相同糖的細(xì)菌)如5型和/或8型金黃色葡萄球菌和/或336型金黃色葡萄球菌株系中獲得莢膜糖。大多數(shù)感染性金黃色葡萄球菌株系含有5型或8型莢膜糖。二者在其重復(fù)單元中具有FucNAcp以及ManNAcA，其可用于引入巰基以連接。5型糖的重復(fù)單元是is—4)-D-ManNAcA- (I — 4) - a -L-FucNAc (30Ac) - (I — 3) - P -D-FucNAc-(I —，而 8 型糖的重復(fù)單元是一3)- P -D-ManNAcA (40Ac) - (I — 3) _ a -L-FucNAc (I — 3) _ a -D-FucNAc (I-—。336型糖是具有0-乙?；摹?連接己糖胺[19，20]，其與針對(duì)336菌株(ATCC 55804)產(chǎn)生的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)。通常用5型和8型糖的組合，且336型糖可加入該配對(duì)[21]。因此，例如，組合物可包括BAA抗原和(a) 5型莢膜糖的偶聯(lián)物和/或(b) 8型莢膜糖的偶聯(lián)物。偶聯(lián)物中的載體部分通常為蛋白。典型的載體蛋白是細(xì)菌毒素，如白喉或破傷風(fēng)毒素，或者其類毒素或突變體或片段。CRM197白喉毒素突變體有用[22]。其他合適的載體蛋白包括腦膜炎奈瑟球菌(N. meningitidis)外膜蛋白復(fù)合物[23]、合成肽[24. 25]、熱激蛋白[26，27]、百日咳蛋白[28. 29]、細(xì)胞因子[30]、淋巴因子[30]、激素[30]、生長(zhǎng)因子、包含來(lái)自各種病原體衍生抗原的多種人CD4+T細(xì)胞表位的人工蛋白[31]如N19[32]、來(lái)自流感嗜血桿菌(H influenzae)的蛋白D[33_35]、肺炎球菌溶素[36]或其無(wú)毒衍生物、肺炎球菌表面蛋白PspA[38]、攝鐵蛋白[39]、來(lái)自艱難梭菌(C. difficile)的毒素A或B[40]、重組銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)胞外蛋白A (rEPA) [41]等。在一些實(shí)施方式中，所述載體蛋白為金黃色葡萄球菌蛋白例如BAA。當(dāng)組合物包含一種以上偶聯(lián)物時(shí)，每種偶聯(lián)物可使用相同的載體蛋白或不同的載體蛋白。偶聯(lián)物可包含過(guò)量載體(w/w)或過(guò)量糖(w/w)。在一些實(shí)施方式中，偶聯(lián)物可包含基本相同重量的載體和糖。載體分子可直接與載體共價(jià)偶聯(lián)，或通過(guò)接頭偶聯(lián)。可通過(guò)(例如)糖和載體之間的還原性胺化(如參考文獻(xiàn)42和43所述)，實(shí)現(xiàn)與蛋白質(zhì)的直接連接。首先需要通過(guò)，例如氧化來(lái)激活糖?？捎萌魏我阎椒ǎ鐓⒖嘉墨I(xiàn)44和45所述的方法通過(guò)接頭基團(tuán)進(jìn)行連接。優(yōu)選的連接類型是己二酸接頭，這種連接可通過(guò)以下方式形成將游離-NH2基團(tuán) 與己二酸偶聯(lián)(如通過(guò)胺化引入葡聚糖中)(例如，利用二酰亞胺活化)，然后將蛋白質(zhì)偶聯(lián)于所得的糖-己二酸中間體[46，47]。另一種優(yōu)選連接形式是羰基接頭，這種連接可通過(guò)以下方式形成使糖CDI的游離羥基發(fā)生反應(yīng)[48，49]，然后與蛋白質(zhì)反應(yīng)形成氨基甲酸酯連接。其它接頭包括P -丙酰胺基[50]、硝基苯基-乙胺[51]、鹵代?；u化物[52]、糖苷鍵、6_氨基己酸[54]、ADH[55]、C4-C12部分[56]等。也可采用碳二亞胺縮合反應(yīng)[57]。PNAG偶聯(lián)物可用各種方法制備，例如通過(guò)包括下述的過(guò)程a)通過(guò)添加含馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)的接頭來(lái)激活PNAG以形成活化的PNAG;b)通過(guò)添加含巰基基團(tuán)的接頭來(lái)激活載體蛋白以形成活化的載體蛋白；和c)將活化的PNAG與活化的載體蛋白反應(yīng)，形成PNAG-載體蛋白偶聯(lián)物；或通過(guò)包括下述的過(guò)程a)通過(guò)添加含巰基基團(tuán)的接頭來(lái)激活PNAG以形成活化的PNAG;b)通過(guò)添加含馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)的接頭來(lái)激活載體蛋白以形成活化的載體蛋白；和c)將活化的PNAG與活化的載體蛋白反應(yīng)，形成PNAG-載體蛋白偶聯(lián)物；通過(guò)包括下述的過(guò)程a)通過(guò)添加含巰基基團(tuán)的接頭來(lái)激活PNAG以形成活化的PNAG;b)通過(guò)添加含巰基基團(tuán)的接頭來(lái)激活載體蛋白以形成活化的載體蛋白；和c)將活化的PNAG與活化的載體蛋白反應(yīng)，形成PNAG-載體蛋白偶聯(lián)物。非金黃色葡萄球菌抗原在一些實(shí)施方式中，免疫原性組合物包括BAA抗原與至少一種非金黃色葡萄球菌抗原的組合。合適的非葡萄球菌抗原包括但不限于與醫(yī)院感染相關(guān)的細(xì)菌的抗原。例如，所述抗原可來(lái)自下述病原體之一表皮葡萄球菌；艱難梭菌(Clostridium difficile);綠胺假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa);白色念珠菌(Candida albicans);和/或腸外致病性大腸桿菌(Escherichia coli)。與BAA抗原聯(lián)用的其他合適抗原列于參考文獻(xiàn)58的33-46 頁(yè)。本發(fā)明所用多肽本發(fā)明所用多肽可采取各種形式(如天然多肽、融合多肽、糖基化多肽、非糖基化多肽、脂化多肽、非脂化多肽、磷酸化多肽、非磷酸化多肽、肉豆蘧?；嚯摹⒎侨舛罐觉；嚯?、單體多肽、多聚體多肽、顆粒多肽、變性多肽等)。本發(fā)明所用多肽可通過(guò)各種方式(如重組表達(dá)、由細(xì)胞培養(yǎng)物純化、化學(xué)合成等)制備。優(yōu)選重組表達(dá)的蛋白質(zhì)，特別是融合蛋白。
本發(fā)明所用多肽優(yōu)選以純化或基本純化，即基本不含其它多肽(如不含天然存在的多肽)、特別是不含其它葡萄球菌或宿主細(xì)胞多肽的形式提供，本發(fā)明多肽通常為至少約50%純(重量)，通常至少約90%純，即少于約50%，更優(yōu)選少于約10%(如5%)的組合物由其它表達(dá)多肽構(gòu)成。因此，組合物中的抗原與表達(dá)該分子的完整生物體分離。術(shù)語(yǔ)“多肽”指任何長(zhǎng)度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是直鏈或支鏈聚合物，可以包含經(jīng)修飾的氨基酸，可以被非氨基酸打斷。該術(shù)語(yǔ)也包括天然修飾或通過(guò)人工介入修飾的氨基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙?；?、磷酸化或任何其它操作或修飾，如與標(biāo)記組分偶聯(lián)。例如，還包括含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本領(lǐng)域已知其它修飾的多肽。多肽可以以單鏈或結(jié)合鏈的形式產(chǎn)生。本發(fā)明提供含有序列-P-Q-或-Q-P-的多肽，其中-P-是上述氨基酸序列，-Q-不是上述序列，即本發(fā)明提供融合蛋白。-P-的N-末端密碼子不是ATG且此密碼子未出現(xiàn)在多肽的N末端時(shí)，它將被翻譯成該密碼子的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，而不是Met。然而，當(dāng)該密碼子位于多肽N末端時(shí)，它將被翻譯成Met。-Q-部分的例子包括但不限于組氨酸標(biāo)簽(即Hisn，其中n=3、4、5、6、7、8、9、10或更高)、麥芽糖結(jié)合蛋白或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。 本發(fā)明還提供產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，該方法包括在誘導(dǎo)多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)用本發(fā)明核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的步驟。雖然可以在葡萄球菌(Staphylococcus)中表達(dá)本發(fā)明多肽,但本發(fā)明通常使用異源宿主進(jìn)行表達(dá)(重組表達(dá))。異源宿主可以是原核(例如細(xì)菌)或真核生物。其可以是大腸桿菌(E. coli),但其他合適的宿主包括枯草桿菌(Bacillus subtilis)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、傷寒沙門菌(Salmonella typhi)、鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)、乳酉先胺奈瑟菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)、分枝桿菌(Mycobacteria)(例如結(jié)核分支桿菌(M. tuberculosis))、酵母等。與編碼本發(fā)明多肽的野生型金黃色葡萄球菌基因相比，改變密碼子以優(yōu)化這類宿主中的表達(dá)效率而不影響編碼氨基酸是有幫助的。本發(fā)明提供一種產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，所述方法包括通過(guò)化學(xué)方式合成至少部分所述多肽的步驟?？贵w抗BAA抗體可用于被動(dòng)免疫或免疫治療。因此，本發(fā)明提供用于治療的抗BAA抗體。本發(fā)明還提供此類抗體在藥物制造中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種治療哺乳動(dòng)物的方法，包括給予有效量的本發(fā)明抗BAA抗體的步驟。如上就免疫原性組合物所述，這些方法和應(yīng)用能夠保護(hù)哺乳動(dòng)物抵御金黃色葡萄球菌感染和/或疾病。術(shù)語(yǔ)“抗體”包括完整的免疫球蛋白分子及其能結(jié)合抗原的片段。它們包括雜交(嵌合)抗體分子[59，60] ；F{ah' )2和F(ab)片段和Fv分子；非共價(jià)異源二聚體[61，62]；單鏈Fv分子(sFv) [63] ;二聚和三聚抗體片段構(gòu)建物；微型抗體[64,65];人源化抗體分子[66-68];任何獲自此類分子的功能片段，以及通過(guò)非常規(guī)工藝，如噬菌體展示獲得的抗體。優(yōu)選所述抗體為單克隆抗體。獲取單克隆抗體的方法為本領(lǐng)域熟知。優(yōu)選人源化或完全人抗體。單克隆抗體特別可用于鑒定和純化它們指向的單個(gè)多肽。本發(fā)明單克隆抗體也可用作免疫實(shí)驗(yàn)、放射性免疫實(shí)驗(yàn)(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)等的試劑。在這些應(yīng)用中，能用可分析檢測(cè)的試劑，如放射性同位素、熒光分子或酶來(lái)標(biāo)記抗體。通過(guò)上述方法產(chǎn)生的單克隆抗體也可用于本發(fā)明多肽的分子鑒定和表征(表位作圖)。優(yōu)選以純化或基本純化的形式提供本發(fā)明抗體。通常，抗體所在組合物中基本不含其它多肽，例如，小于90% (重量)，通常小于60%，更通常小于50%的組合物由其它多肽組成。本發(fā)明抗體可以是任何同種型(如IgA、IgG、IgM，S卩a、Y或U重鏈)，但通常是IgG。在IgG同種型中，抗體可以是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞類。本發(fā)明抗體可具有K或入輕鏈?？蓪⒖笲AA抗體和抗生素聯(lián)合給予患者。所述抗生素可與所述抗體混合給予(因此，本發(fā)明組合物可包括針對(duì)葡萄球菌有活性的抗生素)或單獨(dú)給予。因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌(或表皮葡萄球菌)株系攜帶所述抗體或可能結(jié)構(gòu)上相關(guān)的粘附素，抗BAA抗體特別適于輸注給有菌血癥短期風(fēng)險(xiǎn)的成人或新生兒，用于例如緊急情 況如爆發(fā)期的重癥監(jiān)護(hù)室中超出預(yù)期或出乎意料的給予或已知該類菌株為地方性時(shí)。所述抗體還可用作抗生素的輔助治療，用于治療涉及外來(lái)體或深層感染的金黃色葡萄球菌菌血癥。核酸本發(fā)明也提供編碼本發(fā)明多肽和融合多肽的核酸。還提供包含編碼一種或多種本發(fā)明多肽或融合多肽的核苷酸序列(如SEQ ID N0:8)的核酸。本發(fā)明也提供所含核苷酸序列與這些核苷酸序列有序列相同性的核酸。序列之間的相同性優(yōu)選通過(guò)上述史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法確定。這類核酸包括使用替代密碼子編碼相同氨基酸的核酸。本發(fā)明也提供可與這些核酸雜交的核酸?？梢栽诓煌皣?yán)謹(jǐn)性”的條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)。提高雜交反應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)性的條件是本領(lǐng)域眾所周知的，且已公開(kāi)(如參考文獻(xiàn)255的第
7.52頁(yè))。相關(guān)條件的例子包括(按嚴(yán)謹(jǐn)性提高的順序)孵育溫度為251、371、501、551和 68°C;緩沖液濃度為 10xSSC、6xSSC、lxSSC、0. IxSSC (其中 SSC 是 0. 15M NaCl 和 15mM 檸檬酸鹽緩沖液)和使用其它緩沖液體系的等同物；甲酰胺濃度為0%、25%、50%和75% ;孵育時(shí)間為5分鐘-24小時(shí)；1個(gè)、2個(gè)或多個(gè)洗滌步驟；洗滌孵育時(shí)間為1、2或15分鐘；洗滌溶液為6XSSC、1XSSC、0. IxSSC或去離子水。雜交技術(shù)和其優(yōu)化方法是本領(lǐng)域眾所周知的(例如，參見(jiàn)參考文獻(xiàn)69、255、257等)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明核酸與靶標(biāo)在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交；在其它實(shí)施方式中，其在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交；在優(yōu)選實(shí)施方式中，其在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。一組示范性的低嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是50°C和lOxSSC。一組示范性的中等嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是55°C和lxSSC。一組示范性的高嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是68°C和0. IxSSC0本發(fā)明包括含有這些序列的互補(bǔ)序列的核酸(例如，用于反義或檢測(cè)，或用作引物)。本發(fā)明核酸可用于雜交反應(yīng)(如Northern或Southern印跡,或核酸微陣列或‘基因芯片’)和擴(kuò)增反應(yīng)(如PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA, NASBA等)和其它核酸技術(shù)。本發(fā)明所述核酸可采取各種形式(如單鏈、雙鏈、載體、引物、探針、標(biāo)記等)。本發(fā)明核酸可以是環(huán)狀或分枝狀核酸，但通常是線性核酸。除非另有說(shuō)明或要求，利用核酸的本發(fā)明任何實(shí)施方式可采用雙鏈形式和構(gòu)成該雙鏈形式的兩條互補(bǔ)單鏈形式的每條鏈。引物、探針以及反義核酸通常是單鏈。本發(fā)明核酸優(yōu)選以純化或基本純化的形式提供，即基本不含其它核酸(如不含天然產(chǎn)生的核酸)，特別是不含其它葡萄球菌或宿主細(xì)胞核酸，通常其至少為約50%純(重量)，通常至少為約90%。本發(fā)明核酸優(yōu)選為葡萄球菌核酸?？梢远喾N方式制備本發(fā)明的核酸，例如，完全或部分化學(xué)合成(例如DNA的亞磷酰胺合成)、利用核酸酶(例如限制性酶)消化較長(zhǎng)核酸、連接較短核酸或核苷酸(例如使用連接酶或聚合酶)、由基因組或cDNA文庫(kù)制備等。本發(fā)明核酸可連接于固體支持物(如珠、平板、濾器、膜、玻片、微陣列支持物、樹(shù)脂等)?？捎美绶派湫曰驘晒鈽?biāo)記、或生物素標(biāo)記標(biāo)記本發(fā)明核酸。這在將核酸用于檢測(cè)技術(shù)時(shí)，例如核酸是引物或探針時(shí)特別有用。
術(shù)語(yǔ)“核酸”通常包括任何長(zhǎng)度的核苷酸聚合形式，其包含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其類似物。它包括DNA、RNA、DNA/RNA雜交體。它也包括DNA或RNA類似物，如含有經(jīng)修飾主鏈(如肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯)或經(jīng)修飾堿基的類似物。因此，本發(fā)明包括mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA, cDNA、重組核酸、分枝核酸、質(zhì)粒、載體、探針、引物等。本發(fā)明核酸采取RNA形式時(shí)，它可能具有或不具有5’帽。本發(fā)明核酸可以是載體的一部分，即設(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染一種或多種細(xì)胞類型的核酸構(gòu)建物的一部分。載體可以是，例如，設(shè)計(jì)用于分離、增殖和復(fù)制所插入核苷酸的“克隆載體”，設(shè)計(jì)用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)核苷酸序列的“表達(dá)載體”，設(shè)計(jì)用于產(chǎn)生重組病毒或病毒樣顆粒的“病毒載體”，或具有一種以上載體類型的屬性的“穿梭載體”。優(yōu)選的載體是質(zhì)粒?！八拗骷?xì)胞”包括單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，它可能是或已經(jīng)是外源核酸的受體。宿主細(xì)胞包括單個(gè)宿主細(xì)胞的后代，由于天然、偶然或有意的突變和/或改變，這些后代與原始親本細(xì)胞不一定完全相同(形態(tài)或總DNA互補(bǔ)物方面)。宿主細(xì)胞包括用本發(fā)明核酸體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞。應(yīng)理解，核酸是DNA時(shí)，RNA序列中的“U，，被DNA中的“T”所替代。相似地，應(yīng)理解，核酸是RNA時(shí)，DNA中的“ T ”被RNA序列中的“U”所替代。涉及核酸的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”或“互補(bǔ)的”指沃森克里克堿基配對(duì)。因此，C的互補(bǔ)物是G，G的互補(bǔ)物是C，A的互補(bǔ)物是T (或U)，T (或U)的互補(bǔ)物是A。也能使用如I (嘌呤肌苷)等堿基，例如與嘧啶(C或T)互補(bǔ)。本發(fā)明的核酸可用于例如產(chǎn)生多肽；作為檢測(cè)生物樣品中核酸的雜交探針；產(chǎn)生核酸的額外拷貝；產(chǎn)生核酶或反義寡核苷酸；作為單鏈DNA引物或探針；或作為形成三鏈的寡核苷酸。本發(fā)明提供產(chǎn)生本發(fā)明核酸的方法，其中所述核酸部分或完全用化學(xué)方式合成。本發(fā)明提供包含本發(fā)明核苷酸序列的載體(如克隆或表達(dá)載體)和用這種載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。本發(fā)明所述的核酸擴(kuò)增可以是定量擴(kuò)增和/或?qū)崟r(shí)擴(kuò)增。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，核酸的長(zhǎng)度優(yōu)選為至少7個(gè)核苷酸(如8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300 個(gè)核苷酸或更長(zhǎng))。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，核酸長(zhǎng)度優(yōu)選至多500個(gè)核苷酸(如450、400、350、300、250、200、150、140、130、120、110、100、90、80、75、70、65、60、55、50、45、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15 個(gè)核苷酸或更短)。本發(fā)明的引物和探針，以及用于雜交的其它核酸的長(zhǎng)度優(yōu)選為10-30個(gè)核苷酸(如 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個(gè)核苷酸)。突變細(xì)菌本發(fā)明還提供BAA抗原被敲除的金黃色葡萄球菌細(xì)菌。產(chǎn)生敲除細(xì)菌的技術(shù)為本 領(lǐng)域熟知，且曾報(bào)道過(guò)敲除的金黃色葡萄球菌。敲除突變可位于基因的編碼區(qū)，或者可位于轉(zhuǎn)錄控制區(qū)內(nèi)(如啟動(dòng)子內(nèi))。敲除突變會(huì)將編碼抗原的mRNA水平降低至〈1%的野生型細(xì)菌產(chǎn)量水平，優(yōu)選〈O. 5%，更優(yōu)選〈O. 1%，最優(yōu)選低至0%。本發(fā)明還提供其中BAA抗原發(fā)生突變使其活性受到抑制的金黃色葡萄球菌。編碼該抗原的基因?qū)⒕哂懈淖兯幋a氨基酸序列的突變。突變可包括缺失、取代和/或插入，其中任何一種均可涉及一個(gè)或多個(gè)氨基酸。本發(fā)明還提供過(guò)表達(dá)BAA抗原的細(xì)菌如金黃色葡萄球菌。本發(fā)明還提供組成型表達(dá)BAA抗原的細(xì)菌如金黃色葡萄球菌。本發(fā)明還提供包括BAA抗原編碼基因的葡萄球菌，其中所述基因在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。免疫原性組合物和藥物
本發(fā)明免疫原性組合物可用作疫苗。本發(fā)明疫苗可以是預(yù)防性(即預(yù)防感染)或治療性(即治療感染)疫苗，但一般是預(yù)防性疫苗。因此，組合物可以是藥學(xué)上可接受的。除抗原外，它們通常還包含其它組分，例如它們一般包含一種或多種藥物載體和/或賦形劑。對(duì)這類組分的充分討論參見(jiàn)參考文獻(xiàn)252。組合物通常以水性形式給予哺乳動(dòng)物。然而在給藥前，該組合物可以是非水性形式。例如，雖然一些疫苗制備成水性形式然后以水性形式填裝、分銷和給藥，但其他疫苗在制備過(guò)程中凍干，并在使用時(shí)重建成水性形式。因此，本發(fā)明組合物可干燥，例如凍干制劑。該組合物可含有防腐劑，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗優(yōu)選應(yīng)基本不含(即小于5g/ml)含汞物質(zhì)，如不含硫柳汞。更優(yōu)選無(wú)汞的疫苗。特別優(yōu)選不含防腐劑的疫苗。為了提高熱穩(wěn)定性，組合物可包含溫度保護(hù)劑。這種試劑的更多詳情如下所述。為了控制張度，優(yōu)選包含生理性鹽如鈉鹽。優(yōu)選氯化鈉(NaCl)，它的濃度可以是l-20mg/ml，例如約10±2mg/ml NaCl?？梢源嬖诘钠渌}包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、無(wú)水磷酸氫二鈉、氯化鎂、氯化鈣等。組合物的滲透壓通常為200m0sm/kg-400m0sm/kg,優(yōu)選為240-360m0sm/kg,更優(yōu)選為 290-310m0sm/kg。組合物可含有一種或多種緩沖劑。常用緩沖劑包括磷酸鹽緩沖劑；Tris緩沖劑；硼酸鹽緩沖劑；琥珀酸鹽緩沖劑；組氨酸緩沖劑(具體是有氫氧化鋁佐劑)；或檸檬酸鹽緩沖劑。包含的緩沖劑一般是5-20mM。
組合物的pH通常為5. 0-8. 1，更常為6. 0-8. 0，例如6. 5-7. 5，或者7. 0-7. 8。所述組合物優(yōu)選無(wú)菌。該組合物優(yōu)選無(wú)熱原，如每劑量含有<1EU(內(nèi)毒素單位，標(biāo)準(zhǔn)量度)，優(yōu)選每劑量〈O. IEU0該組合物優(yōu)選不含谷蛋白。所述組合物可含有一次免疫的物質(zhì)，或者可含有多次免疫的物質(zhì)(即‘多劑量’藥盒)。多劑量配置優(yōu)選含有防腐劑。作為多劑量組合物中包含防腐劑的替代方案(或補(bǔ)充方案)，所述組合物可包含在裝有無(wú)菌接頭以取出物質(zhì)的容器中。人疫苗的給藥劑量體積一般為約0. 5ml，但可將一半劑量(即約0. 25ml)給予兒里。本發(fā)明免疫原性組合物也可包含一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑。優(yōu)選地，一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑包括一種或多種佐劑。佐劑可包括THl佐劑和/或TH2佐劑，詳述見(jiàn)下。 因此，本發(fā)明提供一種包含以下組合的免疫原性組合物=(I)BAA抗原；和⑵佐劑如氫氧化鋁佐劑(例如，一種或多種抗原可被氫氧化鋁吸附)。可用于本發(fā)明組合物的佐劑包括但不限于A.含有礦物質(zhì)的組合物適用作本發(fā)明佐劑的含有礦物質(zhì)的組合物包括礦物鹽，例如鋁鹽和鈣鹽(或其混合物)。鈣鹽包括磷酸鈣(例如參考文獻(xiàn)70公開(kāi)的“CAP”顆粒)。鋁鹽包括氫氧化物、磷酸鹽、硫酸鹽等，所述鹽可采用任何合適形式(例如凝膠、結(jié)晶、無(wú)定形等)。優(yōu)選吸附于這些鹽(例如所有抗原可被吸附)。也可將含有礦物質(zhì)的組合物制成金屬鹽的顆粒[71]?？刹捎梅Q為氫氧化鋁和磷酸鋁的佐劑。這些名稱是常規(guī)名稱，但僅為使用方便，因?yàn)槠渚皇浅霈F(xiàn)的實(shí)際化合物的準(zhǔn)確描述(例如參見(jiàn)參考文獻(xiàn)76第9章)。本發(fā)明可采用通常用作佐劑的任何“氫氧化物”或“磷酸鹽”佐劑。稱為“氫氧化鋁”的佐劑通常是羥基氧化鋁鹽，其通常至少部分是晶體。稱為“磷酸鋁”的佐劑通常是羥基磷酸鋁，還常含有少量硫酸鹽(即羥基磷酸硫酸鋁)?？赏ㄟ^(guò)沉淀獲得這些佐劑，沉淀期間的反應(yīng)條件和濃度影響磷酸根取代所述鹽中羥基的程度。氫氧化鋁佐劑通常呈纖維形態(tài)(例如，如透射電子顯微圖中所見(jiàn))。氫氧化鋁佐劑的Pl —般約為11，即該佐劑本身在生理PH下表面帶正電荷。據(jù)報(bào)道，pH 7. 4時(shí)氫氧化鋁佐劑的吸附容量為I. 8-2. 6毫克蛋白質(zhì)/毫克Al+++。磷酸鋁佐劑的P04/A1摩爾比通常為0. 3-1. 2，優(yōu)選0. 8-1. 2，更優(yōu)選0. 95±0. I。磷酸鋁通常是無(wú)定形的，尤其是羥基磷酸鹽。典型的佐劑是P04/A1摩爾比為0. 84-0. 92的無(wú)定形羥基磷酸鋁，包含0.6mg Al3Vml0磷酸鋁通常是顆粒(如在透射電子顯微鏡照片上觀察到的板狀形態(tài))?？乖胶箢w粒直徑一般是0.5-20 (如約5-10 ym)。據(jù)報(bào)道，pH
7.4時(shí)磷酸鋁佐劑的吸附容量為0. 7-1. 5毫克蛋白質(zhì)/毫克Al+++。磷酸鋁的零電點(diǎn)(PZC)與磷酸根取代羥基的程度逆相關(guān)，且這種取代程度可根據(jù)用于通過(guò)沉淀制備鹽的反應(yīng)條件和反應(yīng)物濃度而變化。也通過(guò)改變?nèi)芤褐杏坞x磷酸根離子的濃度(更多磷酸根=更酸性PZC)或加入緩沖劑如組氨酸緩沖劑(使PZC堿性更強(qiáng))來(lái)改變PZco本發(fā)明所用的磷酸鋁的PZC通常為4. 0-7. 0，更優(yōu)選為5. 0-6. 5，例如約為5. 7。如下所示，金黃色葡萄球菌蛋白抗原(除了 IsdA、StaO 19和Sta073)吸附于氫氧化鋁佐劑具有優(yōu)勢(shì)，尤其是在多蛋白組合中(其中所有抗原可吸附)在所述佐劑化組合物中包括組氨酸緩沖液可能有用。
用于制備本發(fā)明組合物的鋁鹽懸浮液可以但不必定含有緩沖液(如磷酸鹽或組氨酸或Tris緩沖液)。該懸浮液優(yōu)選無(wú)菌且無(wú)熱原。懸浮液可含有游離的水性磷酸根離子，如存在濃度為I. 0-20mM，優(yōu)選5-15mM，更優(yōu)選約10mM。該懸浮液也可含有氯化鈉。本發(fā)明可使用氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物。在這種情況下，磷酸鋁多于氫氧化鋁，例如重量比為至少2:1，例如，>5: I、>6: I、>7: I、>8: I、>9:1等。給予患者的組合物中Al+++的濃度優(yōu)選小于10mg/ml,例如< 5mg/ml、< 4mg/ml、< 3mg/ml、< 2mg/ml、< lmg/ml 等。優(yōu)選范圍是 0. 3-lmg/ml。優(yōu)選 0. 85mg/劑的最大值。B.油乳劑適合用作本發(fā)明佐劑的油乳劑組合物包含鯊烯-水乳劑，如MF59 [參考文獻(xiàn)76的 第10章；也參見(jiàn)參考文獻(xiàn)72] (5%鯊烯、0. 5%吐溫80和0. 5%司盤85，用微流化床配制成亞微米顆粒)。也可以使用完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)。已知各種水包油乳劑，它們通常包括至少一種油和至少一種表面活性劑，所述油和表面活性劑是可生物降解(可代謝)和生物相容的。乳劑中的油滴直徑通常小于5 ym，理想情況下具有亞微米直徑，通過(guò)微流化床實(shí)現(xiàn)這種小尺寸以提供穩(wěn)定乳劑。優(yōu)選尺寸小于220nm的液滴，因?yàn)槠淇蛇M(jìn)行過(guò)濾滅菌。所述乳液可以包含如動(dòng)物(如魚(yú))或植物來(lái)源的油。植物油的來(lái)源包括堅(jiān)果、種籽和谷物。最常見(jiàn)的花生油、大豆油、椰子油和橄欖油是堅(jiān)果油的示例。也可使用獲自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。種籽油包括紅花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常見(jiàn)的是玉米油，但也可以使用其它谷類的油，如小麥、燕麥、黑麥、稻、畫眉草、黑小麥等。可從堅(jiān)果和種籽油開(kāi)始，通過(guò)水解、分離和酯化合適物質(zhì)制備甘油和1，2_丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，其不是種籽油中天然產(chǎn)生的。來(lái)自哺乳動(dòng)物乳汁的脂肪和油類是可代謝的，因此可以用于實(shí)施本發(fā)明。獲得動(dòng)物來(lái)源純油所必需的分離、純化、皂化和其它方法的過(guò)程為本領(lǐng)域熟知。大多數(shù)魚(yú)類含有容易回收的可代謝油。例如，鱈魚(yú)肝油、鯊魚(yú)肝油和諸如鯨蠟的鯨油是可以用于本發(fā)明的幾種魚(yú)油的示例。通過(guò)生化途徑用5-碳異戊二烯單位合成許多支鏈油，其總稱為萜類。鯊魚(yú)肝油含有稱為鯊烯的支鏈不飽和類萜，2,6, 10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯，本文特別優(yōu)選此類萜。角鯊烯的飽和類似物角鯊?fù)橐彩莾?yōu)選的油。包括角鯊烯和角鯊?fù)樵趦?nèi)的魚(yú)油，易于從商業(yè)來(lái)源獲得，或可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法獲得。其它優(yōu)選油是生育酚(見(jiàn)下)?？梢允褂糜偷幕旌衔??？赏ㄟ^(guò)’ HLB’ (親水/親脂平衡)對(duì)表面活性劑分類。本發(fā)明優(yōu)選的表面活性劑的HLB為至少10，優(yōu)選至少15，更優(yōu)選至少16?？梢耘c本發(fā)明一起使用的表面活性劑包括但不限于聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，特別是聚山梨酯20和聚山梨酯80 ;以商品名D0WFAX 出售的環(huán)氧乙烷(E0)、環(huán)氧丙烷(PO)和/或環(huán)氧丁烷(BO)的共聚物，如直鏈E0/P0嵌段共聚物；重復(fù)乙氧基(氧-1，2-乙二基)數(shù)量不同的辛苯聚醇，特別感興趣的是辛苯聚醇9 (曲通(Triton) X-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40);磷脂，如磷脂酰膽堿(卵磷脂)；壬酚乙醇酯，如Tergitol NP系列；衍生自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為芐澤(Brij)表面活性劑)，如三乙二醇單月桂基醚(芐澤30);以及脫水山梨糖醇酯(通常稱為司盤(SPAN))，如脫水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)和脫水山梨糖醇單月桂酸酯。優(yōu)選非離子型表面活性劑。乳液中包含的優(yōu)選表面活性劑是吐溫80 (聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)、司盤85 (脫水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100?？墒褂帽砻婊钚詣┑幕旌衔?，如吐溫80/司盤85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的組合也適合。另一種有用的組合包含月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。優(yōu)選的表面活性劑的含量(重量％)為聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐溫80)0. 01-1%，特別是約0. 1% ;辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如曲通x-100或曲通系列的其它去污劑)0. 001-0. 1%，特別是0. 005-0. 02% ;聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9) 0. 1_20%，優(yōu)選0. 1_10%，特別是 0. 1-1% 或約 0. 5%O優(yōu)選乳液佐劑的平均液滴大小為〈I U m，例如<750nm、<500nm、<400nm、<300nm、<250nm、；^ 220nm、<200nm或更小?？赏ㄟ^(guò)如微流化等技術(shù)方便地獲得這些液滴尺寸。

可用于本發(fā)明的特定水包油乳液佐劑包括但不限于 鯊烯、吐溫80和司盤85的亞微米乳液。所述乳液的體積組成可以是約5%角鯊烯、約0. 5%聚山梨酯80和約0. 5%司盤85。以重量計(jì)，這些比例為4. 3%角鯊烯、0. 5%聚山梨酯80和0. 48%司盤85。這種佐劑稱為‘MF59’ [73-75]，參考文獻(xiàn)76的第10章和參考文獻(xiàn)77的第12章更詳細(xì)地描述了該佐劑。MF59乳液宜包含檸檬酸根離子，如IOmM檸檬酸鈉緩沖液。鯊烯、生育酚和聚山梨酯80(吐溫80)的乳液。所述乳液可包含磷酸鹽緩沖鹽水。其還可包含司盤85(例如1%)和/或卵磷脂。這些乳液可含有2-10%角鯊烯、2-10%生育酚和0. 3-3%吐溫80，角鯊烯生育酚的重量比優(yōu)選彡1，因?yàn)檫@可提供更穩(wěn)定的乳液。角鯊烯和吐溫80的體積比可以約為5:2，或者重量比約為11:5?？赏ㄟ^(guò)下述方法制備一種這類乳液將吐溫80溶解于PBS得到2%溶液，然后將90ml該溶液與(5g DL- a -生育酚和5ml鯊烯)的混合物混合，然后使該混合物微流體化。得到的乳液可含有如平均直徑為100-250nm，優(yōu)選約ISOnm的亞微米油滴。該乳液也可含有3-脫-0-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A(3d-MPL)。此種類型的另一種有用乳液可包含(每個(gè)人用劑量)0. 5-10mg鯊烯、0. 5-1 Img生育酚和0. l_4mg聚山梨酯80 [78]。 鯊烯、生育酚和曲通去污劑(如曲通X-100)的乳液。所述乳液還可包含3d_MPL(見(jiàn)下)。所述乳液可包含磷酸鹽緩沖液。 含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污劑(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸a-生育酚)的乳液。該乳液可包含這三種組分，其質(zhì)量比約為75:11:10(如750i!g/ml聚山梨酯80、110ii g/ml曲通X-100和100iig/ml琥珀酸a -生育酚)，且這些濃度應(yīng)包括抗原中這些組分的貢獻(xiàn)。所述乳液還可包含鯊烯。所述乳液還可包含3d-MPL (見(jiàn)下)。所述水相可包含磷酸鹽緩沖液。 角鯊烯、聚山梨酯80和泊洛沙姆401( "Pluronic L121”)的乳液。所述乳液可用PH 7. 4的磷酸鹽緩沖鹽水配制。該乳液是一種有用的胞壁酰二肽遞送載體，已與蘇氨酰-MDP —起用于“SAF-I”佐劑[79] (0. 05_l%Thr_MDP、5%鯊烯、2. 5%普流羅尼克(Pluronic) L121和0. 2%聚山梨酸酯80)中。也可不與Thr-MDP —起使用，如“AF”佐劑中(5%鯊烯、I. 25%普流羅尼克L121和0.2%聚山梨酸酯80)。優(yōu)選微流體化。
含有鯊烯、水性溶劑、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子型表面活性劑(如聚氧乙烯
(12)十六十八醚)和疏水性非離子型表面活性劑(如去水山梨糖醇酯或二縮甘露醇酯，如去水山梨糖醇單油酸酯或‘司盤80’)的乳液。該乳液優(yōu)選為熱可逆的和/或其中至少90%油滴(以體積計(jì))的尺寸小于200nm[81]。該乳液也可含有以下一種或多種物質(zhì)糖醇；低溫保護(hù)劑(例如，糖，如十二烷基麥芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。該乳液可包含TLR4激動(dòng)劑[82]。這類乳液可凍干。 角鯊烯、泊洛沙姆-105和Abil-Care的乳液[83]。含佐劑化疫苗中這些組分的終濃度(重量)是5%鯊烯、4%泊洛沙姆-105(普流羅尼克多元醇)和2%Abil-Care85 (雙-PEG/PPG-16/16PEG/PPG-16/16 二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。 含有0. 5-50%油、0. 1-10%磷脂和0. 05-5%非離子型表面活性劑的乳液。如參考 文獻(xiàn)84所述，優(yōu)選的磷脂組分是磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。優(yōu)選亞微米液滴尺寸。
不可代謝油(如輕質(zhì)礦物油)和至少一種表面活性劑(如卵磷脂、吐溫80或司盤80)的亞微米水包油乳液?？砂砑觿鏠uilA皂苷、膽固醇、皂苷-親脂體偶聯(lián)物(如通過(guò)葡糖醛酸的羧基將脂族胺加到脫?；碥丈隙a(chǎn)生的GPI-0100，如參考文獻(xiàn)85所述)、二甲基雙十八烷基溴化銨和/或N，N-雙十八烷基-N，N-雙(2-羥乙基)丙二胺。 皂苷(例如QuilA或QS21)和固醇(例如膽固醇)結(jié)合成螺旋膠束的乳液[86]。 包含礦物油、非離子親脂性乙氧基化脂肪醇和非離子親水性表面活性劑(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[87]。 包含礦物油、非離子親水性乙氧基化脂肪醇和非離子親脂性表面活性劑(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[87]。在一些實(shí)施方式中，可在遞送時(shí)臨時(shí)將乳液與抗原混合，因此所述佐劑和抗原可單獨(dú)地保存在包裝或分銷的疫苗中，以便在使用時(shí)配制成最終制劑。在其它實(shí)施方式中，在生產(chǎn)過(guò)程中將乳液與抗原混合，因此所述組合物以液體佐劑形式包裝。所述抗原通常是水性形式,從而最終通過(guò)混合兩種液體制備疫苗。所述兩種液體的混合體積比可變(例如5:1-1:5)，但通常約為1:1。組分濃度在上述具體乳液說(shuō)明中給出時(shí)，這些濃度通常用于非稀釋組合物，因此所述濃度在混合抗原溶液后會(huì)降低。當(dāng)組合物包含生育酚時(shí)，可采用a、0、Y、S、e或^生育酚中的任何一種，但優(yōu)選a-生育酚。生育酚可采用多種形式，例如不同的鹽和/或異構(gòu)體。鹽包括有機(jī)鹽，例如琥珀酸鹽、乙酸鹽、煙酸鹽等。可同時(shí)采用D-a-生育酚和DL-a-生育酚。用于老年患者(如年齡大于60歲或更大)的疫苗中宜包含生育酚，因?yàn)閾?jù)報(bào)道維生素E在此患者群體中對(duì)免疫應(yīng)答有正面作用[88]。它們也具有協(xié)助穩(wěn)定該乳液的抗氧化特性[89]。優(yōu)選的a -生育酚是DL-a -生育酚，此種生育酚的優(yōu)選鹽是琥珀酸鹽。發(fā)現(xiàn)琥珀酸鹽在體內(nèi)能與TNF相關(guān)配體協(xié)作。C.皂苷制劑[參考文獻(xiàn)76的第22章]皂苷制劑也可以用作本發(fā)明的佐劑。皂苷是在許多種類植物的樹(shù)皮、葉、莖干、根甚至花中發(fā)現(xiàn)的留醇糖苷和三萜糖苷的異質(zhì)群體。已廣泛研究了作為佐劑的得自皂皮樹(shù)(Quillaia saponaria Molina)樹(shù)皮的阜苷。阜苷也可市售獲自麗花菝葜(Smilaxornata)(墨西哥菝葜)、滿天星(Gypsophilla paniculata)(婚紗花)和肥阜草(Saponariaofficianalis)(皂根)。皂苷佐劑制劑包括純化制劑如QS21，以及脂質(zhì)制劑如ISCOM。QS21以商標(biāo)Stimulon 出售。已采用HPLC和RP-HPLC純化皂苷組合物。已鑒定了用這些技術(shù)專門純化的組分，包括037、0517、0518、0521、011-4、011-8和職-(。優(yōu)選的皂苷是QS21。制備QS21的方法參見(jiàn)參考文獻(xiàn)90。皂苷制劑也可包含留醇，如膽固醇[91]。皂苷和膽固醇的組合可用于形成稱為免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)的獨(dú)特顆粒[參考文獻(xiàn)76第23章]。ISCOM通常還包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。任何已知的皂苷均可用于ISCOM。ISCOM優(yōu)選包含Qui 1A、QHA和QHC中的一種或多種。參考文獻(xiàn)91-93中進(jìn)一步描述了 ISC0M。任選地，ISCOM可不含其它去污劑[94]。開(kāi)發(fā)基于皂苷的佐劑的綜述可參見(jiàn)參考文獻(xiàn)95和96。D.病毒體和病毒樣顆粒
病毒體和病毒樣顆粒(VLP)也可用作本發(fā)明的佐劑。這些結(jié)構(gòu)通常包含一種或多種任選與磷脂組合或一起配制的病毒蛋白質(zhì)。其通常無(wú)病原性，不能復(fù)制，且通常不含任何天然病毒基因組。所述病毒蛋白可重組生成或分離自全病毒。這些適用于病毒體或VLP的病毒蛋白包括源自流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心蛋白或衣殼蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、諾沃克病毒、人乳頭狀瘤病毒、HIV、RNA-噬菌體、QP -噬菌體(如外殼蛋白)、GA-噬菌體、噬菌體、AP205噬菌體和Ty (如反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白pi)的蛋白。VLP在參考文獻(xiàn)97-102中有進(jìn)一步描述。病毒體在(例如)參考文獻(xiàn)103中進(jìn)一步描述。E.細(xì)菌或微生物衍生物適用于本發(fā)明的佐劑包括細(xì)菌或微生物衍生物，例如腸細(xì)菌脂多糖(LPS)的無(wú)毒衍生物、脂質(zhì)A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物。LPS的無(wú)毒衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A (MPL)和3_0_脫酰基MPL (3dMPL)。3dMPL是3脫-0-?；鶈瘟柞Ｖ|(zhì)A與4、5或6條酰化鏈的混合物。3脫-0-酰基單磷酰脂質(zhì)A的優(yōu)選“小顆?！毙问揭?jiàn)參考文獻(xiàn)104中所述。3dMPL的這種“小顆?！毙〉阶阋酝ㄟ^(guò)0. 22 y m膜過(guò)濾除菌[104]。其它無(wú)毒LPS衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A模擬物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸鹽衍生物，例如RC-529[105，106]。脂質(zhì)A衍生物包括大腸桿菌的脂質(zhì)A衍生物，如0M-174。例如，參考文獻(xiàn)107和108 中描述了 0M-174。適用作本發(fā)明佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通過(guò)磷酸鍵與鳥(niǎo)苷連接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文結(jié)構(gòu)或聚(dG)序列的雙鏈RNA和寡核苷酸也顯示具有免疫刺激性。CpG可包含核苷酸修飾/類似物，如硫代磷酸酯修飾，可以是雙鏈或單鏈。參考文獻(xiàn)109、110和111公開(kāi)了可能的類似物取代，例如用2’ -脫氧-7-脫氮鳥(niǎo)苷取代鳥(niǎo)苷。參考文獻(xiàn)112-117中進(jìn)一步討論了 CpG寡核苷酸的佐劑作用。CpG序列可導(dǎo)向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[118]。CpG序列可特異性誘導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答，例如CpG-A 0DN，或更特異地誘導(dǎo)B細(xì)胞應(yīng)答，例如CpG-B ODN0參考文獻(xiàn)119-121 中討論了 CpG-A 和 CpG-B 0DN。優(yōu)選 CpG 為 CpG-A 0DN。CpG寡核苷酸優(yōu)選構(gòu)建成5’末端可被受體識(shí)別。任選使兩個(gè)CpG寡核苷酸序列在3’末端連接以形成“免疫聚體(immunomer)”。參見(jiàn)例如，參考文獻(xiàn)118和122-124。有用的CpG佐劑是CpG7909，也稱為ProMune (科雷制藥集團(tuán)公司(ColeyPharmaceutical Group, Inc.))。另一個(gè)是CpG1826?；蛘呋虼送?，為了使用CpG序列,可使用TpG序列[125]，這些寡核苷酸可不含非甲基化CpG基序。所述免疫刺激性寡核苷酸可富含嘧啶。例如，它可能含有一個(gè)以上的連續(xù)胸腺嘧啶核苷酸(例如，參考文獻(xiàn)125所公開(kāi)的TTTT)，和/或它的核苷酸組成中可能含有>25%胸腺嘧啶(例如>35%、>40%、>50%、>60%、>80%等)。例如，它可能含有一個(gè)以上的連續(xù)胞嘧啶核苷酸(例如，參考文獻(xiàn)125所公開(kāi)的CCCC)，和/或它的核苷酸組成中可能含有>25%胞嘧啶(例如>35%、>40%、>50%、>60%、>80%等)。這些寡核苷酸可不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核 苷酸通常包含至少20個(gè)核苷酸。其可包含少于100個(gè)核苷酸?；诿庖叽碳ば怨押塑账岬奶貏e有用的佐劑被稱為IC_31 [126]。因此，本發(fā)明使用的佐劑可以包含⑴和(ii)的混合物(i)含有至少一個(gè)(優(yōu)選多個(gè))CpI基序(即胞嘧啶與肌苷相連形成二核苷酸)的寡核苷酸(例如15-40個(gè)核苷酸)，和(ii)聚陽(yáng)離子聚合物，如含有至少一個(gè)(優(yōu)選多個(gè))Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(如5_20個(gè)氨基酸)。所述寡核苷酸可以是包含26-聚體序列5’-(IC) 13-3’ (SEQ ID N0:6)的脫氧核苷酸。所述聚陽(yáng)離子聚合物可以是含有11-聚體氨基酸序列KLKLLLLLKLK (SEQ ID N0:7)的肽。寡核苷酸和聚合物可形成復(fù)合物，如參考文獻(xiàn)127和128所述。細(xì)菌ADP-核糖基化毒素及其去毒衍生物可以用作本發(fā)明的佐劑。優(yōu)選所述蛋白衍生自大腸桿菌(大腸桿菌不耐熱腸毒素“LT”)、霍亂菌(“CT”)或百日咳菌(“PT”)。參考文獻(xiàn)129中描述了將脫毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐劑，參考文獻(xiàn)130中描述了將其用作胃腸外佐劑。所述毒素或類毒素優(yōu)選全毒素形式，包含A和B亞單位。A亞單位優(yōu)選含有脫毒突變亞單位優(yōu)選不突變。所述佐劑優(yōu)選脫毒的LT突變體，如LT-K63、LT-R72和LT-G192。參考文獻(xiàn)131-138中描述了將ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物，特定是LT-K63和LT-R72用作佐劑。一種有用的CT突變體是CT-E29H[139]。優(yōu)選根據(jù)參考文獻(xiàn)140中所提出ADP-核糖基化毒素的A和B亞單位的排列對(duì)氨基酸取代編號(hào)，該參考文獻(xiàn)通過(guò)引用全文特別納入本文。F.人免疫調(diào)節(jié)劑適用作本發(fā)明佐劑的人免疫調(diào)節(jié)劑包括細(xì)胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[141]等)[142]、干擾素(如干擾素I )、巨噬細(xì)胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子。優(yōu)選的免疫調(diào)節(jié)劑是IL-12。G.生物粘著劑和粘膜粘著劑生物粘著劑和粘膜粘著劑也可以用作本發(fā)明的佐劑。合適的生物粘著劑包括酯化透明質(zhì)酸微球[143]或粘膜粘著劑如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纖維素的交聯(lián)衍生物。殼聚糖及其衍生物也可用作本發(fā)明的佐劑[144]。H.微粒微粒也可以用作本發(fā)明的佐劑。微粒(即直徑為 IOOnm至 150 iim，更優(yōu)選直徑^200nm至 30 V- m,最優(yōu)選直徑 500nm至 10 V- m的顆粒)由生物可降解的無(wú)毒材料(例如，聚(a -羥酸)、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己內(nèi)酯等)形成，優(yōu)選聚丙交酯乙交酯共聚物，并任選經(jīng)處理而具有帶負(fù)電表面(例如用SDS處理)或帶正電表面(例如用陽(yáng)離子去污劑如CTAB處理)。I.脂質(zhì)體(參考文獻(xiàn)76第13和14章)適用作佐劑的脂質(zhì)體制劑的例子見(jiàn)參考文獻(xiàn)145-147所述。J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制劑適用于本發(fā)明的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[148]。這種制劑還包括聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性劑和辛苯糖醇[149]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑和至少一種其它非離子表面活性劑如辛苯糖醇[150]的組合。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自下組聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧乙烯-8-硬脂醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
K.磷腈可使用磷腈，如參考文獻(xiàn)151和152中所述的聚[二(羧基苯氧基)磷腈](poly [di (carboxylatophenoxy) phosphazene], “PCPP，，)。L.胞壁酰肽適作本發(fā)明佐劑的胞壁酰肽的例子包括N-乙?；?胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷酰胺(thr-MDP)、N-乙?；?正胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷酰胺(正-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(I’ -2’ - 二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)_乙胺MTP-PE )。M.咪唑并喹諾酮(Imidazoquinolone)化合物適合用作本發(fā)明佐劑的咪唑并喹諾酮化合物的例子包括咪喹莫特("R-837")[153，154]、瑞喹莫德(“R-848”)[155]，以及它們的類似物和鹽(如鹽酸鹽)。有關(guān)免疫刺激性咪唑喹啉的其它細(xì)節(jié)可參見(jiàn)參考文獻(xiàn)156-160。N.取代的脲用作佐劑的取代的脲包括式I、II或III的化合物，或其鹽
IIIIII
r*' I*，x. \
士 krT Vt
IL Si.Tt I
M H如參考文獻(xiàn)161 所定義，如 ‘ER 803058’、‘ER 803732’、‘ER 804053’、‘ER804058’、 ‘ER 804059’、 ‘ER 804442’、 ‘ER 804680’、 ‘ER 804764’、 ‘ER 803022’ 或 ‘ER804057’，例如
權(quán)利要求
1.一種用于針對(duì)金黃色葡萄球菌疾病和/或感染免疫接種的BAA抗原。
2.一種融合蛋白，所述融合蛋白包括BAA抗原多肽序列和至少一種其他金黃色葡萄球菌抗原多肽序列。
3.一種免疫原性組合物,所述免疫原性組合物包括BAA抗原和至少一種其他金黃色葡萄球菌抗原。
4.一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包括BAA抗原和至少一種非金黃色葡萄球菌抗原。
5.一種免疫原性組合物，其包含以下組合= (I)BAA抗原；和⑵佐劑。
6.—種檢測(cè)樣品中是否存在金黃色葡萄球菌的方法，所述方法包括檢測(cè)樣品中的BAA抗原或編碼BAA抗原的核酸。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的抗原、融合蛋白、組合物或方法，其特征在于，所述BAA抗原可引發(fā)抗體，所述抗體能識(shí)別具有SEQ ID NO: I氨基酸序列的金黃色葡萄球菌蛋白。
8.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的抗原、融合蛋白、組合物或方法，其特征在于，所述BAA抗原包括以下氨基酸序列(a)與SEQ ID NO: I有80%或更高相同性；和/或(b)包含SEQ ID NO: I 的表位。
9.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的抗原、融合蛋白、組合物或方法，其特征在于，所述BAA抗原包括以下氨基酸序列(a)與SEQ ID NO: I有50%或更高相同性；和/或(b)包含SEQ ID NO: I的至少7個(gè)連續(xù)氨基酸片段。
10.一種抗BAA抗體。
11.如權(quán)利要求10所述的抗體，其特征在于，所述抗體是能識(shí)別具有SEQID NO:l氨基酸序列的金黃色葡萄球菌蛋白的單克隆抗體。
12.如權(quán)利要求10或11所述的抗體，其特征在于，所述抗體用于抵御或治療金黃色葡萄球菌感染和/或疾病。
全文摘要
在高度菌血癥的MRSA株系中鑒定到金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的BAA抗原，其相比其他地方性和相關(guān)株系與纖連蛋白和其他胞外基質(zhì)蛋白的體外結(jié)合增強(qiáng)。BAA是噬菌體編碼的表面表達(dá)粘附素，體外結(jié)合纖連蛋白。其可能使MRSA株系的導(dǎo)管相關(guān)菌血癥表型增強(qiáng)并因此用作疫苗靶標(biāo)防止MRSA菌血癥。
文檔編號(hào)C07K14/31GK102811733SQ201080060972
公開(kāi)日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2010年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日
發(fā)明者J·埃奇沃思 申請(qǐng)人:蓋和圣托馬斯的Nhs信托基金會(huì)