專利名稱：編碼靶相關(guān)抗原表位的表達(dá)載體及其設(shè)計(jì)方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明此處公開的是涉及用于組合物的表位編碼載體的設(shè)計(jì)方法，所述組合物包括，例如能夠在施用了該組合物的受試者中誘發(fā)免疫應(yīng)答的藥物組合物。本發(fā)明還涉及載體自身。使用這些載體表達(dá)的表位能夠激發(fā)針對(duì)展示這些表位的靶細(xì)胞的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
相關(guān)領(lǐng)域的描述免疫系統(tǒng)可以分成兩個(gè)不同的效應(yīng)分支。一個(gè)是先天性免疫，包括應(yīng)答所有感染刺激的許多細(xì)胞成分和可溶因子。另一個(gè)是適應(yīng)性免疫應(yīng)答，它專門的特異應(yīng)答來自感染劑的精確表位。適應(yīng)性免疫應(yīng)答還可分成兩個(gè)效應(yīng)分支，稱為體液和細(xì)胞免疫系統(tǒng)。體液分支集中于由B淋巴細(xì)胞生成抗體，而細(xì)胞分支涉及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的殺傷細(xì)胞活性。
細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)自身不能識(shí)別感染劑上的表位。然而，CTL能夠檢測(cè)受感染細(xì)胞表面展示的由感染劑衍生的抗原片段。因此，抗原只有在經(jīng)過受感染細(xì)胞加工并因此展示于細(xì)胞表面之后才能得到CTL的識(shí)別。
細(xì)胞表面上的抗原加工和展示系統(tǒng)已經(jīng)得到了建立。CTL識(shí)別通過與I類主要組織相容性復(fù)合物分子(MHC)的非共價(jià)關(guān)聯(lián)而展示在表面上的短肽抗原。這些I類肽是由胞質(zhì)蛋白的降解依次衍生的。
發(fā)明概述本發(fā)明的實(shí)施方案提供了例如用于免疫載體的表達(dá)盒以及用于設(shè)計(jì)和測(cè)試這些表達(dá)盒的方法，所述表達(dá)盒編碼一種或多種嵌入的管家表位?？梢酝ㄟ^消化性抗原呈遞細(xì)胞(pAPC)的免疫蛋白酶體的蛋白酶解加工這些盒的翻譯產(chǎn)物釋放管家表位。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以改變管家表位的側(cè)翼序列以促進(jìn)免疫蛋白酶體在預(yù)定部位的切割。于2000年4月28日提交的題目分別為EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGENPRESENTING CELLS和METHOD OF EPITOPE DISCOVERY的美國專利申請(qǐng)編號(hào)09/560,465和09/561,074描述了管家表位及其用途和鑒定。
于2001年4月6日提交的題為EPITOPE SEQUENCE，編號(hào)60/282,211；于2001年11月7日提交的編號(hào)60/337,017；于3/7/02提交的編號(hào)60/363,210和于2002年9月5日提交的編號(hào)60/409,123的臨時(shí)美國專利申請(qǐng)；和于2002年4月4日提交的題目同樣為EPITOPE SEQUENCE的美國申請(qǐng)編號(hào)10/117,937公開了管家表位的實(shí)例。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，管家表位的側(cè)翼可以是已知有助于免疫蛋白酶體切割位點(diǎn)的任意序列或序列摻入殘基。在用于本文時(shí)，術(shù)語“任意序列”指不涉及表位的天然序列環(huán)境(context)，促進(jìn)加工的能力，或免疫學(xué)功能而選擇的序列。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，可以以頭尾相連的方式排列多個(gè)表位。這些排列可以完全由管家表位組成。同樣，這些排列可以包括交替的管家和免疫表位?；蛘撸@些排列可以包括側(cè)翼為完整或末端截短的免疫表位的管家表位。另外，這些排列可以是任何其它類似排列。對(duì)于將管家表位置于排列的末端位置沒有任何限制。載體還可以包含真實(shí)蛋白質(zhì)編碼序列或其片段，它們包含表位簇作為免疫表位源。術(shù)語“真實(shí)”指天然蛋白質(zhì)序列。
于2000年4月28日提交的題為EPITOPE CLUSTERS的美國專利申請(qǐng)?zhí)?9/561,571，于2001年11月7日提交的題為EPITOPESYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS的美國專利申請(qǐng)?zhí)?0/005,905，和于2001年12月7日提交的標(biāo)題同樣為EPITOPESYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS的美國專利申請(qǐng)?zhí)?0/026,066描述了表位簇及其用途。
本發(fā)明的實(shí)施方案可以包括篩選構(gòu)建體以測(cè)定是否釋放了管家表位。在包含多個(gè)管家表位的構(gòu)建體中，實(shí)施方案可以包括篩選以測(cè)定釋放了哪個(gè)表位。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含嵌入表位的載體可以用于免疫HLA轉(zhuǎn)基因小鼠，而且可以對(duì)由此產(chǎn)生的CTL測(cè)試它們識(shí)別呈遞成熟表位的靶細(xì)胞的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以用載體轉(zhuǎn)化表達(dá)免疫蛋白酶體的靶細(xì)胞。例如，可以通過干擾素(IFN)處理或基因操作而使靶細(xì)胞組成性表達(dá)免疫蛋白酶體?？梢詫?duì)識(shí)別成熟表位的CTL測(cè)試它們識(shí)別這些靶細(xì)胞的能力。在還有一個(gè)實(shí)施方案中，可以作為合成肽來制備嵌入的表位。然后可以在體外用免疫蛋白酶體制劑對(duì)合成肽進(jìn)行消化，并分析由此產(chǎn)生的片段以測(cè)定切割位點(diǎn)。還可以將能夠成功釋放嵌入表位的這些重組或合成多肽摻入免疫原性組合物。
本文公開的發(fā)明涉及適用于表位釋放的多肽的鑒定。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及適用于表位釋放的多肽鑒定方法，包括例如下列步驟鑒定目的表位；提供包含表位的底物多肽序列，其中底物多肽容許蛋白酶體的加工；在支持蛋白酶體加工底物多肽的條件下將底物多肽接觸包含蛋白酶體的組合物；和測(cè)定表位釋放。
可以將表位嵌入底物多肽，而且在有些方面底物多肽可以包含例如超過一個(gè)表位。還有，表位可以是管家表位。
一方面，底物多肽可以是合成肽。任選的是，可以在促進(jìn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的制劑中包含底物多肽?；蛘?，底物多肽可以是融合蛋白。融合蛋白還可以包含具有蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移活性的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。另外，接觸步驟可以包括使用底物多肽進(jìn)行免疫。
另一方面，可以由多核苷酸編碼底物多肽。例如，接觸步驟可以包括使用包含多核苷酸的載體進(jìn)行免疫。例如，可以對(duì)HLA轉(zhuǎn)基因小鼠或任何其它合適動(dòng)物進(jìn)行免疫?；蛘撸佑|步驟可以包括用包含多核苷酸的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在有些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以是為了測(cè)定正確表位釋放而由CTL靶向的靶細(xì)胞。
蛋白酶體加工可以發(fā)生于細(xì)胞內(nèi)，或體外或體內(nèi)。另外，蛋白酶體加工可以發(fā)生于非細(xì)胞體系。
測(cè)定步驟可以包括選自但不限于下組的技術(shù)質(zhì)譜，N端混合測(cè)序，HPLC，等等。同樣，測(cè)定步驟可以包括T細(xì)胞靶識(shí)別測(cè)定。T細(xì)胞靶識(shí)別測(cè)定可以選自但不限于下組溶細(xì)胞活性測(cè)定，鉻釋放測(cè)定，細(xì)胞因子測(cè)定，ELISPOT測(cè)定，四聚物分析，等等。
還有一個(gè)方面，包含表位的底物多肽的氨基酸序列可以是任意的。同樣，嵌入了表位的底物多肽可以衍生自靶相關(guān)抗原的真實(shí)序列。另外，可以使嵌入了表位的底物多肽符合優(yōu)選的免疫蛋白酶體切割位點(diǎn)側(cè)翼序列。
另一方面，底物多肽可以包含額外表位的排列。排列成員可以以例如頭尾相連的方式排列。排列可以包含超過一個(gè)管家表位。超過一個(gè)管家表位可以包括相同表位的拷貝。例如，排列可以包含一個(gè)管家表位和一個(gè)免疫表位，或者交替的管家和免疫表位。同樣，在一個(gè)表位組中排列可以包括位于兩個(gè)免疫表位之間的一個(gè)管家表位。排列可以包括多表位組，使得排列內(nèi)部每個(gè)管家表位之間有兩個(gè)免疫表位。任選的是，至少一個(gè)表位可以在與相鄰表位接合的末端截短。例如，截短的表位可以是免疫表位。截短的表位可以具有選自但不限于下組的長(zhǎng)度9，8，7，6，5，4個(gè)氨基酸等。
還有一個(gè)方面，底物多肽可以包含表位排列和表位簇。排列成員可以以例如頭尾相連的方式排列。
還有一個(gè)方面，蛋白酶體可以是免疫蛋白酶體。
公開的本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及包含管家表位表達(dá)盒的載體。管家表位可以衍生自靶相關(guān)抗原，而且管家表位是通過免疫蛋白酶體加工可以由盒的翻譯產(chǎn)物可釋放的，即能夠釋放的。
在本發(fā)明的一個(gè)方面中，表達(dá)盒可以編碼兩個(gè)或多個(gè)表位的排列，或者至少一個(gè)表位和至少一個(gè)表位簇。排列成員可以以例如頭尾相連的方式排列。還有，例如，排列成員可以以由間隔序列相隔的頭尾相連的方式排列。另外，排列可以包含多個(gè)管家表位。例如，多個(gè)管家表位可以包括超過一個(gè)拷貝的相同表位或單個(gè)拷貝的不同表位。排列可以包含至少一個(gè)管家表位和至少一個(gè)免疫表位。還有，排列可以包括交替的管家和免疫表位。另外，排列包括夾在兩個(gè)免疫表位中間的管家表位，使得排列內(nèi)部的每個(gè)管家表位之間有兩個(gè)免疫表位。免疫表位可以在與相鄰管家表位接合的末端截短。
另一方面，表達(dá)盒還編碼包含至少一個(gè)免疫表位的真實(shí)蛋白質(zhì)序列或其片段。任選的是，片段可以包含至少一個(gè)表位簇。例如，包含至少一個(gè)免疫表位的管家表位表達(dá)盒和真實(shí)序列可以在單一讀碼框中編碼或者轉(zhuǎn)錄成單一mRNA種類。同樣，包含至少一個(gè)免疫表位的管家表位表達(dá)盒和真實(shí)序列可能不轉(zhuǎn)錄成單一mRNA種類。
在另一個(gè)方面，載體可以包括DNA分子或RNA分子。載體可以編碼例如SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.17，SEQ ID NO.20，SEQ ID NO.26，SEQ ID NO.27，SEQ ID NO.29，SEQ ID NO.33，等等。同樣，載體可以包含SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.19，SEQ ID NO.21，SEQ ID NO.30，SEQ ID NO.34，等等。同樣，載體可以編碼例如SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.18。
在另一個(gè)方面，靶相關(guān)抗原可以是由腫瘤或胞內(nèi)寄生物衍生或與其相關(guān)的抗原，而胞內(nèi)寄生物可以是例如病毒，細(xì)菌，原生動(dòng)物等。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及包含依照本文公開的任何方法鑒定，要求或其它方面的管家表位的載體。例如，實(shí)施方案可以涉及編碼底物多肽的載體，所述底物多肽包含通過本文描述的任何方法得到的管家表位。
一方面，可以通過免疫蛋白酶體加工由表達(dá)盒的翻譯產(chǎn)物釋放管家表位。
公開的本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及激活T細(xì)胞的方法。所述方法包括例如將包含管家表位表達(dá)盒的載體接觸APC的步驟。管家表位可以衍生自例如靶相關(guān)抗原，而且管家表位可以通過免疫蛋白酶體加工由盒的翻譯產(chǎn)物釋放。所述方法還可以包括將APC接觸T細(xì)胞。載體與APC的接觸可以發(fā)生于體外或體內(nèi)。
公開的本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及包含管家表位的底物多肽，其中管家表位可以在pAPC中通過免疫蛋白酶體加工而釋放。
公開的本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及激活T細(xì)胞的方法，包括將包含管家表位的底物多肽接觸APC，其中管家表位可以通過免疫蛋白酶體加工而釋放，和將APC接觸T細(xì)胞。
附圖簡(jiǎn)述

圖1.描述pMA2M的圖解。
圖2.顯示通過模擬免疫的CTL對(duì)經(jīng)過或未經(jīng)ELAGIGILTV脈沖的T2靶細(xì)胞的特異溶解百分比的測(cè)定結(jié)果。
圖3.顯示通過pVAXM3免疫的CTL對(duì)經(jīng)過或未經(jīng)ELAGIGILTV脈沖的T2靶細(xì)胞的特異溶解百分比的測(cè)定結(jié)果。
圖4.顯示通過pVAXM2免疫的CTL對(duì)經(jīng)過或未經(jīng)ELAGIGILTV脈沖的T2靶細(xì)胞的特異溶解百分比的測(cè)定結(jié)果。
圖5.顯示通過pVAXM1免疫的CTL對(duì)經(jīng)過或未經(jīng)ELAGIGILTV脈沖的T2靶細(xì)胞的特異溶解百分比的測(cè)定結(jié)果。
圖6.例示了通過免疫蛋白酶體加工而釋放NY-ESO-I157-165表位的SEQ ID NO.22的序列。
圖7.顯示了免疫蛋白酶體和管家蛋白酶體對(duì)SLLMWITQC表位(SEQ ID NO.12)在其天然環(huán)境中的不同加工，其中由管家蛋白酶體產(chǎn)生的C后面的切割比免疫蛋白酶體更有效。
圖8.8A顯示了SEQ ID NO.31的人免疫蛋白酶體消化結(jié)果。8B顯示了SEQ ID NO.31的小鼠與人免疫蛋白酶體消化的比較結(jié)果。
圖9.顯示了管家和免疫蛋白酶體對(duì)SSX-231-68的不同加工。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳述定義除非另外不同于本文使用術(shù)語的內(nèi)容，下列術(shù)語在用于本文描述時(shí)一般具有指定的含義。
消化性抗原呈遞細(xì)胞(pAPC)-具有T細(xì)胞共刺激分子且能夠誘發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答的細(xì)胞。充分表征的pAPC包括樹突細(xì)胞，B細(xì)胞，和巨噬細(xì)胞。
外周細(xì)胞-pAPC以外的細(xì)胞。
管家蛋白酶體-在外周細(xì)胞中通常有活性，而在pAPC中通常不存在或活性不強(qiáng)的蛋白酶體。
免疫蛋白酶體-在pAPC中通常有活性的蛋白酶體；免疫蛋白酶體在受感染組織中或在暴露于干擾素后在有些外周細(xì)胞中也有活性。
表位-能夠激發(fā)免疫應(yīng)答的分子或物質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照此定義的表位包括但不必限于多肽和編碼多肽的核酸，其中多肽能夠激發(fā)免疫應(yīng)答。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照此定義的表位包括但不必限于展示在細(xì)胞表面的肽，所述肽非共價(jià)結(jié)合I類MHC結(jié)合縫從而能夠與T細(xì)胞受體(TCR)相互作用。由I類MHC展示的表位可以是未成熟或成熟形式?！俺墒臁敝概c可能包含或基本由管家表位組成，而且在初級(jí)翻譯產(chǎn)物中還包含通過加工消除的其它序列的任何前體(未成熟)不同的MHC表位，所述加工包括但不限于下列單項(xiàng)或任意組合蛋白酶體消化，N端修剪，或外源酶活性的作用。因此，可以分別通過嵌入稍長(zhǎng)多肽來提供成熟表位，所述多肽的免疫學(xué)潛力至少部分歸咎于嵌入的表位；或者處于能夠在MHC結(jié)合縫中結(jié)合從而得到TCR識(shí)別的最終形式。
MHC表位-對(duì)哺乳動(dòng)物I類或II類主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子具有已知或預(yù)測(cè)結(jié)合親和力的多肽。
管家表位-在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，管家表位定義為作為MHC表位且展示在細(xì)胞上的多肽片段，在所述細(xì)胞中管家蛋白酶體有顯著活性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，管家表位定義為包含依照上述定義的管家表位且側(cè)翼為一個(gè)至幾個(gè)額外氨基酸的多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，管家表位定義為編碼依照上述定義的管家表位的核酸。于2002年4月4日提交的美國申請(qǐng)?zhí)?0/117,937；以及于2001年4月6日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/282,211；于2001年11月7日提交的60/337,017；于3/7/02提交的60/363,210；和于2002年9月5日提交的60/409,123，均題為EPITOPESEQUENCES中提供了例示性管家表位。
免疫表位-在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫表位定義為作為MHC表位且展示在細(xì)胞上的多肽片段，在所述細(xì)胞中免疫蛋白酶體有顯著活性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫表位定義為包含依照上述定義的免疫表位且側(cè)翼為一個(gè)至幾個(gè)額外氨基酸的多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫表位定義為包含表位簇序列的多肽，所述序列具有的至少兩個(gè)多肽序列對(duì)I類MHC具有已知或預(yù)測(cè)的親和力。在還有一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫表位定義為編碼依照任何上述定義的免疫表位的核酸。
靶細(xì)胞-由本發(fā)明的疫苗和方法靶向的細(xì)胞。依照此定義的靶細(xì)胞的實(shí)例包括但不必限于腫瘤細(xì)胞和具有胞內(nèi)寄生物諸如例如病毒，細(xì)菌，或原生動(dòng)物的細(xì)胞。靶細(xì)胞還可以包括作為測(cè)定的一部分以測(cè)定或確認(rèn)正確表位釋放的由CTL靶向并由表達(dá)免疫蛋白酶體的細(xì)胞加工以對(duì)預(yù)期表位測(cè)定T細(xì)胞特異性或免疫原性的細(xì)胞?？梢赞D(zhuǎn)化這些細(xì)胞以表達(dá)底物或釋放序列，或者可以僅僅用肽/表位對(duì)細(xì)胞進(jìn)行脈沖。
靶相關(guān)抗原(TAA)-靶細(xì)胞中存在的蛋白質(zhì)或多肽。
腫瘤相關(guān)抗原(TuAA)-靶細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞時(shí)的TAA。
HLA表位-對(duì)人I類或II類HLA復(fù)合物分子具有已知或預(yù)測(cè)結(jié)合親和力的多肽。
抗體-天然免疫球蛋白(Ig)，多克隆或單克隆，或者完全或部分由Ig結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的任何分子，無論是通過生化方法或是使用重組DNA衍生的。實(shí)例包括尤其是F(ab)，單鏈Fv，和Ig可變區(qū)-噬菌體外殼蛋白融合體等。
編碼-一個(gè)不受限制的術(shù)語，使得編碼獨(dú)特氨基酸序列的核酸可以是由指定該(多)肽的密碼子組成的，但也可以包含額外序列，或是可翻譯的，或是用于控制轉(zhuǎn)錄，翻譯，或復(fù)制，或是促進(jìn)某些宿主核酸構(gòu)建體的操作。
實(shí)質(zhì)相似性-此術(shù)語用于指通過檢查序列而判斷得出在無關(guān)緊要的方面與參考序列不同的序列。編碼相同氨基酸序列的核酸序列是實(shí)質(zhì)相似的，盡管簡(jiǎn)并位置有差異，或者任何非編碼區(qū)的長(zhǎng)度或組成有適度差異。只是因保守替代或較少長(zhǎng)度變化而不同的氨基酸序列是實(shí)質(zhì)相似的。另外，包含N端側(cè)翼殘基數(shù)目不同的管家表位，或者兩端側(cè)翼殘基數(shù)目不同的免疫表位或表位簇的氨基酸序列是實(shí)質(zhì)相似的。編碼實(shí)質(zhì)相似的氨基酸序列的核酸自身也是實(shí)質(zhì)相似的。
功能相似性-該術(shù)語用于指通過檢查生物學(xué)或生化特性而判斷得出在無關(guān)緊要的方面與參考序列不同的序列，盡管序列可能不是實(shí)質(zhì)相似的。例如，兩種核酸都可用作相同序列的雜交探針，但是編碼不同的氨基酸序列。誘發(fā)交叉反應(yīng)的CTL應(yīng)答的兩種肽是功能相似的，即使它們因非保守氨基酸替代而不同(并因而未滿足實(shí)質(zhì)相似性定義)。識(shí)別相同表位的成對(duì)抗體或TCR可以彼此是功能相似的，即使存在任何結(jié)構(gòu)差異。在測(cè)試免疫原性的功能相似性時(shí)，通常用“改變后的”抗原進(jìn)行免疫并測(cè)試由此引起的應(yīng)答(Ab，CTL，細(xì)胞因子生成，等)識(shí)別靶抗原的能力。因此，可以設(shè)計(jì)在某些方面不同但保留相同功能的兩種序列。這些設(shè)計(jì)序列變體就是本發(fā)明實(shí)施方案之一。
表達(dá)盒-編碼多肽，可操作連接啟動(dòng)子和其它轉(zhuǎn)錄和翻譯控制元件包括但不限于增強(qiáng)子，終止密碼子，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，和多腺苷酸化位點(diǎn)的多核苷酸序列。盒還可包含有助于將其由一個(gè)宿主分子移至另一個(gè)的序列。
嵌入的表位-包含于較長(zhǎng)多肽中的表位，還可包括嵌入N端或C端使得表位不位于內(nèi)部位置的表位。
成熟表位-除了當(dāng)表位結(jié)合MHC肽結(jié)合縫時(shí)所存在的序列不含額外序列的肽。
表位簇-作為包含兩個(gè)或多個(gè)已知或預(yù)測(cè)表位的天然蛋白質(zhì)序列的片段的多肽或編碼它的核酸序列，所述已知或預(yù)測(cè)表位對(duì)共享的MHC限制元件具有結(jié)合親和力，其中簇內(nèi)的表位密度超過完整蛋白質(zhì)序列內(nèi)所有對(duì)共享的MHC限制元件具有結(jié)合親和力的已知或預(yù)測(cè)表位的密度，正如題為EPITOPE CLUSTERS的美國專利申請(qǐng)?zhí)?9/561,571中所公開的。
底物或釋放序列-包含或編碼在較長(zhǎng)序列中嵌入的管家表位(依照上文提供的第一項(xiàng)定義)從而提供環(huán)境使得直接通過免疫蛋白酶體加工或聯(lián)合N端修剪或其它加工而釋放管家表位的設(shè)計(jì)或改造后的序列。
胞質(zhì)蛋白的降解是通過稱為蛋白酶體的依賴遍在蛋白質(zhì)的多重催化，多亞基蛋白酶系統(tǒng)發(fā)生的。蛋白酶體降解胞質(zhì)蛋白，然后生成的片段可以由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)并加載到I類MHC上。這些蛋白質(zhì)片段將稱為I類肽。加載了肽的MHC隨后轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面并可在此受到CTL的檢測(cè)。
蛋白酶體的多重催化活性是其多亞基結(jié)構(gòu)的結(jié)果。亞基是由不同基因表達(dá)的，并在翻譯后裝配成蛋白酶體復(fù)合物。蛋白酶體的重要特點(diǎn)是其雙峰活性，使其能夠以兩種不同的切割模式發(fā)揮其蛋白酶或切割功能。蛋白酶體的這種雙峰作用對(duì)于理解CTL如何靶向識(shí)別體內(nèi)的外周細(xì)胞和這種靶向如何要求免疫系統(tǒng)與靶細(xì)胞之間的同步是極端重要的。
管家蛋白酶體在身體所有外周細(xì)胞和組織中是組成型有活性的。管家蛋白酶體的第一種作用模式是降解細(xì)胞蛋白質(zhì)，將它再循環(huán)成氨基酸。因此蛋白酶體功能是細(xì)胞生命的必需活性。然而，作為其管家蛋白酶活性的必然結(jié)果，由管家蛋白酶體生成的I類肽展示在身體所有外周細(xì)胞上。
蛋白酶體的第二種功能模式是高度獨(dú)特的，而且專一發(fā)生于pAPC中，或者作為干擾素(IFN)細(xì)胞應(yīng)答的后果。在其第二種活性模式中，蛋白酶體中摻入了獨(dú)特亞基，取代組成型管家蛋白酶體的催化亞基。“修飾后的”蛋白酶體已經(jīng)稱為免疫蛋白酶體，因?yàn)樗趐APC中表達(dá)而且是體細(xì)胞中IFN誘導(dǎo)的后果。
APC定義全身循環(huán)且作為殺傷細(xì)胞有潛在活性的CTL集合。CTL是通過與展示于pAPC表面的I類肽的相互作用而激活的。在患病細(xì)胞的研究中，激活后的CTL經(jīng)誘導(dǎo)而增殖并引起全身循環(huán)。這就是體內(nèi)CTL應(yīng)答被由pAPC生成的I類肽特異確定的原因。重要的是要記住pAPC表達(dá)免疫蛋白酶體，而且作為蛋白酶體雙峰活性模式的結(jié)果，蛋白質(zhì)的切割模式(及由此生成的I類肽)與表達(dá)管家蛋白酶體的外周體細(xì)胞中的那些模式不同。因此，在天然感染過程中和治療性CTL接種策略時(shí)考慮pAPC和外周體細(xì)胞中的不同蛋白酶體活性是重要的。
體內(nèi)所有細(xì)胞都能夠在受到病原體諸如病毒感染的事件中生成IFN。IFN生成繼而導(dǎo)致在受感染細(xì)胞中免疫蛋白酶體的表達(dá)。從而由受感染細(xì)胞的免疫蛋白酶體加工病毒抗原，并將由此生成的肽與I類MHC一起展示在細(xì)胞表面。同時(shí)，pAPC匯集病毒抗原并用它們的免疫蛋白酶體活性加工I類肽，這對(duì)于pAPC細(xì)胞類型是常規(guī)的。由pAPC生成的I類肽特異激發(fā)體內(nèi)CTL應(yīng)答。幸運(yùn)的是，受感染細(xì)胞同樣由免疫蛋白酶體而非常規(guī)的管家蛋白酶體生成I類肽。因此，由此生成病毒相關(guān)的I類肽，它能夠通過確認(rèn)CTL應(yīng)答來檢測(cè)。CTL免疫應(yīng)答是由pAPC誘發(fā)的，與外周體細(xì)胞相比，它通常因不同蛋白酶體活性而生成不同I類肽。因此，在感染過程中，在受感染細(xì)胞和免疫系統(tǒng)之間發(fā)生表位同步化。
在阻斷干擾素系統(tǒng)的腫瘤和慢性病毒中情況并非如此。對(duì)于腫瘤，腫瘤細(xì)胞中沒有感染來誘導(dǎo)免疫蛋白酶體表達(dá)，而慢性病毒感染或直接或間接阻斷免疫蛋白酶體表達(dá)。在這兩種情況中，患病細(xì)胞仍然展示由管家蛋白酶體活性衍生的I類肽，并避免CTL的有效監(jiān)督。
在通過治療性接種來根除腫瘤或慢性感染的情況中，蛋白酶體的雙峰功能及其在身體APC和外周細(xì)胞中的不同活性是顯著的。在接種蛋白質(zhì)抗原之后，CTL應(yīng)答發(fā)生之前，必須獲得抗原并將其加工成隨后展示于pAPC表面I類MHC上的肽。激活后的CTL進(jìn)行再循環(huán)，搜索表面具有相似I類肽的細(xì)胞。具有這種肽的細(xì)胞將通過CTL的溶細(xì)胞活性進(jìn)行摧毀。
如果所針對(duì)的患病細(xì)胞不表達(dá)pAPC中存在的免疫蛋白酶體，那么表位未能同步而CTL不能在患病細(xì)胞表面找到預(yù)期的肽靶目標(biāo)。
優(yōu)選的是，治療性疫苗設(shè)計(jì)考慮靶組織上實(shí)際存在的I類肽。即用于刺激CTL攻擊患病組織的有效抗原是天然加工并展示在患病組織表面的那些抗原。對(duì)于腫瘤和慢性感染，這通常意味著CTL表位是已經(jīng)受到管家蛋白酶體加工的那些表位。為了生成有效的治療性疫苗，根據(jù)這些表位事實(shí)上是由管家蛋白酶體系統(tǒng)生成的知識(shí)來鑒定CTL表位。一旦得到鑒定，表現(xiàn)為肽的這些表位可用于在宿主體內(nèi)成功免疫或誘發(fā)針對(duì)表達(dá)管家蛋白酶體的靶細(xì)胞的治療性CTL應(yīng)答。
然而，在DNA疫苗的情況中，存在另一種考慮。用DNA免疫要求APC攝取DNA并表達(dá)所編碼的蛋白質(zhì)或肽。有可能在DNA上編碼不同的I類肽。通過用這種構(gòu)建體免疫，能夠引發(fā)APC表達(dá)管家表位，隨后展示在細(xì)胞表面I類MHC上以激發(fā)適當(dāng)?shù)腃TL應(yīng)答。于2000年4月28日提交的題為EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OFTARGET-ASSOCIATED ANTIGENS的美國專利申請(qǐng)?zhí)?9/561,572已經(jīng)描述了用于生成管家表位正確末端的構(gòu)建體。
本發(fā)明的實(shí)施方案提供了編碼一個(gè)或多個(gè)嵌入的管家表位的表達(dá)盒以及用于設(shè)計(jì)和測(cè)試該表達(dá)盒的方法。表達(dá)盒和構(gòu)建體可以編碼表位，包括由靶相關(guān)抗原衍生的管家表位?？梢杂珊械姆g產(chǎn)物釋放管家表位。例如，在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，管家表位的側(cè)翼可以是已知有助于免疫蛋白酶體切割位點(diǎn)的任意序列或序列摻入殘基。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，可以以頭尾相連的方式排列多個(gè)表位。在有些實(shí)施方案中，這些排列可以完全由管家表位組成。同樣，這些排列可以包括交替的管家和免疫表位?；蛘撸帕锌梢园▊?cè)翼為完整或末端截短的免疫表位的管家表位。在有些優(yōu)選的實(shí)施方案中，每個(gè)管家表位的側(cè)翼可以一邊是免疫表位，使得這種排列在每個(gè)管家表位之間有兩個(gè)免疫表位。另外，排列可以是任何其它類似的排列。對(duì)于將管家表位置于排列的末端位置沒有限制。載體還可以包含真實(shí)蛋白質(zhì)編碼序列或其片段，它們包含表位簇作為免疫表位源。
多份公開書提及了多表位或珠串排列。參閱例如，2001年3月22日的WO0119408A1；1999年11月4日的WO9955730A2；2000年7月13日的WO0040261A2；1996年2月8日的WO9603144A1；2002年2月27日的EP1181314A1；4月5日的WO0123577A3；2000年6月13日的US6074817；1999年10月12日的US5965381；1997年11月6日的WO9741440A1；2000年10月10日的US6130066；1999年12月21日的US6004777；1999年11月23日的US5990091；1998年9月17日的WO9840501A1；1998年9月17日的WO9840500A1；2001年3月15日的WO0118035A2；2002年9月6日的WO02068654A2；2001年11月29日的WO0189281A2；2001年8月16日的WO0158478A；2001年7月25日的EP1118860A1；2001年2月15日的WO0111040A1；2000年12月7日的WO0073438A1；2000年11月30日的WO0071158A1；2000年11月9日的WO0066727A1；2000年9月8日的WO0052451A1；2000年9月8日的WO0052157A1；2000年5月25日的WO0029008A2；2000年2月10日的WO0006723A1。其它公開書包括Palmowski MJ等，J Immunol，2002，168(9)4391-8；Fang ZY等，Virology，2001，291(2)272-84；FiratH等人，J Gene Med，2002，4(1)38-45；Smith SG等人，Clin Cancer Res，2001，7(12)4253-61；Vonderheide RH等人，Clin Cancer Res，2001，7(11)3343-8；Firat H等人，Eur J Immunol，2001，31(10)3064-74；Le TT等人，Vaccine，2001，19(32)4669-75；Fayolle C等人，J Virol，2001，75(16)7330-8；Smith SG，Curr Opin Mol Ther，1999，1(1)10-5；Firat H等人，Eur JImmunol，1999，29(10)3112-21；Mateo L等人，J Immunol，1999，163(7)4058-63；Heemskerk MH等人，Cell Immunol，1999，195(1)10-7；Woodberry T等人，J Virol，1999，73(7)5320-5；Hanke T等人，Vaccine，1998，16(4)426-35；Thomson SA等人，J Immunol，1998，160(4)1717-23；Toes RE等人，Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(26)14660-5；Thomson SA等人，J Immunol，1996，157(2)822-6；ThomsonSA等人，Proc Natl Acad Sci USA，1995，92(13)5845-9；Street MD等人，Immunology，2002，106(4)526-36；Hirano K等人，Histochem Cell Biol，2002，117(1)41-53；Ward SM等人，Virus Genes，2001，23(1)97-104；Liu WJ等人，Virology，2000，273(2)374-82；Gariglio P等人，Arch MedRes，1998，29(4)279-84；Suhrbier A，Immunol Cell Biol，1997，75(4)402-8；Fomsgaard A等人，Vaccine，1999，18(7-8)681-91；An LL等人，J Virol，1997，71(3)2292-302；Whitton JL等人，J Virol，1993，67(1)348-52；RipaltiA等人，J Clin Microbiol，1994，32(2)358-63；和Gilbert SC等人，NatBiotech，1997，151280-1284。
上文所有公開書共有的一個(gè)重要特色是它們不看重在pAPC中表達(dá)構(gòu)建體時(shí)再生管家表位的愿望。這種理解在本發(fā)明之前是不明朗的。本發(fā)明的實(shí)施方案包括在受到免疫蛋白酶體加工后釋放或生成管家表位的序列。本發(fā)明的實(shí)施方案還可以以免疫原性有效量來釋放或生成這些表位。因此，盡管上述參考文獻(xiàn)包括涉及多表位排列的公開書，然而都不能獲得在pAPC中通過免疫蛋白酶體作用提供或選擇能夠釋放管家表位的多表位所必需的技術(shù)。相反，本發(fā)明的實(shí)施方案基于希望達(dá)到此目的的認(rèn)識(shí)。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案包括編碼包含至少一個(gè)管家表位的多肽的任何核酸構(gòu)建體，所述管家表位是在促進(jìn)其通過免疫蛋白酶體活性而生成的環(huán)境中提供的，無論管家表位是以珠串排列或其它排列的方式嵌入。本發(fā)明的有些實(shí)施方案包括上述任何一篇或多篇陳列的參考文獻(xiàn)中專門公開的一種或多種核酸構(gòu)建體或其產(chǎn)物的用途。這些用途包括例如，篩選用于管家表位和/或免疫表位的正確釋放環(huán)境的多表位，設(shè)計(jì)能夠引發(fā)管家表位和/或免疫表位展示在pAPC上的有效免疫原，給患者免疫等等。備選的實(shí)施方案包括僅為這些核酸構(gòu)建體的子集或一個(gè)這種構(gòu)建體的用途，同時(shí)出于本文公開的任何目的特別排斥其它這些構(gòu)建體之一種或多種。有些優(yōu)選的實(shí)施方案采用單獨(dú)或組合編碼多表位排列的這些和/或其它核酸序列。例如，有些實(shí)施方案排斥一篇或多篇上述參考文獻(xiàn)中的多表位排列的使用。其它實(shí)施方案可能共同排斥上述參考文獻(xiàn)中的所有多表位排列或其任意組合。有些實(shí)施方案包括編碼多表位排列的病毒和/或細(xì)菌載體，而其它實(shí)施方案特別排斥這些載體。這些載體可以編碼可能具有一些免疫刺激效應(yīng)的載體蛋白。有些實(shí)施方案包括具有這些免疫刺激/免疫加強(qiáng)效應(yīng)而非免疫原性效應(yīng)的這些載體，而其它實(shí)施方案可能包括這類載體。另外，在有些情況中，病毒和細(xì)菌載體編碼預(yù)期表位，作為與靶細(xì)胞無關(guān)的實(shí)質(zhì)完整蛋白質(zhì)的一部分。有些實(shí)施方案包括這些載體和產(chǎn)物，而被其它實(shí)施方案排斥。有些實(shí)施方案涉及重復(fù)施用載體。在那些實(shí)施方案中，有些包括非病毒和非細(xì)菌載體。同樣，有些實(shí)施方案包括在表位之間包含額外氨基酸的排列，在有些實(shí)施方案中是例如1-6個(gè)氨基酸或更多，而其它實(shí)施方案特別排斥這些排列。
本發(fā)明的實(shí)施方案還包括針對(duì)各種類型靶目標(biāo)的方法，用途，療法和組合物。這些靶目標(biāo)可以包括例如諸如下表所列腫瘤細(xì)胞和受到任何病毒，細(xì)菌，原生動(dòng)物，真菌或其它試劑感染的細(xì)胞，它們的實(shí)例如下文表1-5所列或上文所列任何參考文獻(xiàn)中所公開的。備選實(shí)施方案包括僅為下文表1-5或本文公開的任何參考文獻(xiàn)中所列的這些腫瘤細(xì)胞和受感染細(xì)胞子集的或腫瘤細(xì)胞和受感染細(xì)胞的單個(gè)一種，同時(shí)出于本文公開的任何目的特別排斥其它這些腫瘤細(xì)胞或受感染細(xì)胞之一種或多種。下面是可以靶向的腫瘤細(xì)胞的實(shí)例人肉瘤和癌，如纖維肉瘤，粘液肉瘤，脂質(zhì)肉瘤，軟骨肉瘤，成骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，內(nèi)皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管內(nèi)皮肉瘤，滑膜瘤，間皮瘤，尤因瘤，平滑肌肉瘤，橫紋肌肉瘤，結(jié)腸癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鱗狀細(xì)胞癌，基底細(xì)胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳頭狀癌，乳頭狀腺癌，囊腺癌，髓樣癌，支氣管癌，腎細(xì)胞癌，肝癌，膽管癌，絨毛膜癌，精原細(xì)胞瘤，胚胎癌，維爾姆斯瘤，子宮頸癌，睪丸腫瘤，肺癌，小細(xì)胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，星形細(xì)胞瘤，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，顱咽管瘤，室管膜瘤，松果體瘤，成血管細(xì)胞瘤，聽神經(jīng)瘤，少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤，腦膜瘤，黑素瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤；白血病，如急性淋巴細(xì)胞白血病和急性髓細(xì)胞白血病(成髓細(xì)胞，前髓細(xì)胞，髓單核細(xì)胞，單核細(xì)胞和紅白血病)；慢性白血病(慢性髓細(xì)胞(粒細(xì)胞)白血病和慢性淋巴細(xì)胞白血病)；和脾大性紅細(xì)胞增多，淋巴瘤(何杰金病和非何杰金病)，多發(fā)性骨髓瘤，瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥，重鏈病，肝細(xì)胞癌，腦癌，胃癌，肝癌，等等。感染靶細(xì)胞的感染劑的實(shí)例可以包括腺病毒，巨細(xì)胞病毒，EB病毒，單純皰疹病毒1，單純皰疹病毒2，人皰疹病毒6，水痘帶狀皰疹病毒，乙肝病毒，丁肝病毒，乳頭瘤病毒，細(xì)小病毒B19，多瘤病毒BK，多瘤病毒JC，丙肝病毒，麻疹病毒，風(fēng)疹病毒，人免疫缺陷性病毒(HIV)，人T細(xì)胞白血病病毒I，人T細(xì)胞白血病病毒II，衣原體(Chlamydia)，利斯特氏菌屬(Listeria)，沙門氏菌屬(Salmonella)，軍團(tuán)菌屬(Legionella)，布魯氏桿菌屬(Brucella)，考克斯氏體屬(Coxiella)，立克次氏體屬(Rickettsia)，分枝桿菌屬(Mycobacterium)，利什曼原蟲屬(Leishmania)，Trypanasoma，弓形蟲(Toxoplasma)，瘧原蟲屬(Plasmodium)等。示例性感染劑和腫瘤細(xì)胞也包括在下表1-5中。
另外，靶目標(biāo)可以包括任何下列參考文獻(xiàn)中描述的腫瘤細(xì)胞或受到任何下列參考文獻(xiàn)中描述的試劑感染的細(xì)胞Jger，E.等人，“Granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor enhances immuneresponses to melanoma-associated peptides in vivo”，Int.J Cancer，6754-62，1996；Kündig，T.M.，Althage，A.，Hengartner，H.&Zinkernagel，R.M.，A skintest to assess CD8+cytotoxic T cell activity，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，897757-76，1992；Bachmann，M.F.&Kundig，T.M.，“In vitro vs.in vivo assaysfor the assessment of T-and B-cell function”，Curr.Opin.Immunol.，6320-326，1994；Kundig等人，“On the role of antigen in maintainingcytotoxic T cell memory”，Proceedings.National.Academy.Scicences of theUnited States of America，939716-23，(1996)；Steinmann，R.M.，“Thedendritic cells system and its role in immunogenicity”，Annual Review ofImmunology，9271-96，(1991)；Inaba，K.等人，“Identification of proliferatingdendritic cell precursors in mouse blood”，Journal of Experimental Medicine，1751157-67，(1992)；Young，J.W.&Inaba，K.，“Dendritic cells as adjuvantsfor class I major histocompatibility 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本發(fā)明的其它實(shí)施方案包括涉及特定抗原的方法，用途，療法和組合物，無論抗原是衍生自例如諸如上文所述的靶細(xì)胞或感染劑。有些優(yōu)選的實(shí)施方案采用本文表1-5或下表中所列抗原之一種，子集或任意組合。例如，有些實(shí)施方案排斥使用那些抗原中的一種或多種。其它實(shí)施方案可能排斥任意組合或所有那些抗原。這些抗原的幾個(gè)實(shí)例包括MelanA(MART-I)，gp100(Pmel 17)，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，BAGE，GAGE-1，GAGE-2，CEA，RAGE，NY-ESO，SCP-1，Hom/Mel-40，PRAME，p53，H-Ras，HER-2/neu，BCR-ABL，E2A-PRL，H4-RET，IGH-IGK，MYL-RAR，EB病毒抗原，EBNA，人乳頭瘤病毒(HPV)抗原E6和E7，TSP-180，MAGE-4，MAGE-5，MAGE-6，p185erbB2，p180erbB-3，c-met，nm-23H1，PSA，TAG-72-4，CAM 17.1，NuMa，K-ras，β-連環(huán)蛋白，CDK4，Mum-1，p16，以及上文所述參考文獻(xiàn)中提及之任一種。其它抗原包括于下文表1-4。
其它實(shí)施方案包括涉及包括例如表1-5所列那些表位在內(nèi)的表位的方法，用途，組合物和療法。這些表位可用于例如在篩選載體中側(cè)翼管家表位。有些實(shí)施方案包含表1-5的一種和多種表位，而其它實(shí)施方案特別排斥這些表位之一種或多種或其組合。
表1
表2
表3列出了可用于本發(fā)明且可由路德維格癌癥學(xué)會(huì)(Ludwig CancerInstitute)獲得的其它抗原。該表提到了可以找到經(jīng)鑒定抗原的專利。TRA指腫瘤相關(guān)抗原，LUD編號(hào)指路德維格學(xué)會(huì)編號(hào)。
表3
表4
表5
其它實(shí)施方案致力于涉及對(duì)MHC具有特異性的表位的方法，用途，療法和組合物，包括例如表6-10中所列。其它實(shí)施方案包括表6-10中所列一種或多種MHC，包括它們的組合，而其它實(shí)施方案特別排斥任何一種或多種MHC或其組合。表8-10包括所列HLA抗原的頻率。
I類 I類MHC分子人HLA-A1HLAA*0101HLA-A*0201HLA-A*0202HLA-A*0203HLA-A*0204HLA-A*0205HLA-A*0206HLA-A*0207HLA-A*0209HLA-A*0214HLA-A3HLA-A*0301HLA-A*1101HLA-A23HLA-A24HLA-A25HLA-A*2902HLA-A*3101HLA-A*3302HLA-A*6801HLA-A*6901HLA-B7HLA-B*0702HLA-B*0703HLA-B*0704HLA-B*0705HLA-B8HLA-B13HLA-B14HLA-B*1501(B62)HLA-B17HLA-B18HLA-B22HLA-B27HLA-B*2702HLA-B*2704HLA-B*2705HLA-B*2709HLA-B35HLA-B*3501HLA-B*3502HLA-B*3701HLA-B*3801HLA-B*39011HLA-B*3902
HLA-B40HLA-B*40012(B60)HLA-B*4006(B61)HLA-B44HLA-B*4402HLA-B*4403HLA-B*4501HLA-B*4601HLA-B51HLA-B*5101HLA-B*5102HLA-B*5103HLA-B*5201HLA-B*5301HLA-B*5401HLA-B*5501HLA-B*5502HLA-B*5601HLA-B*5801HLA-B*6701HLA-B*7301HLA-B*7801HLA-Cw*0102HLA-Cw*0301HLA-Cw*0304HLA-Cw*0401HLA-Cw*0601HLA-Cw*0602HLA-Cw*0702HLA-Cw8HLA-Cw*1601 MHLA-G鼠H2-KdH2-DdH2-LdH2-KbH2-DbH2-KkH2-Kkm1Qa-1aQa-2H2-M3大鼠RT1.AaRT1.A1
牛Bota-A11Bota-A20雞B-F4B-F12B-F15B-F19黑猩猩Patr-A*04Patr-A*11Patr-B*01Patr-B*13Patr-B*16狒狒Papa-A*06短尾猿Mamu-A*01豬SLA(haplotype d/d)病毒同系物hCMV class I homolog UL18表7I類MHC分子I類人HLA-A1HLA-A*0101HLA-A*0201HLA-A*0202HLA-A*0204HLA-A*0205HLA-A*0206HLA-A*0207HLA-A*0214HLA-A3HLA-A*1101HLA-A24HLA-A*2902HLA-A*3101HLA-A*3302HLA-A*6801HLA-A*6901
HLA-B7HLA-B*0702HLA-B*0703HLA-B*0704HLA-B*0705HLA-B8HLA-B14HLA-B*1501(B62)HLA-B27HLA-B*2702HLA-B*2705HLA-B35HLA-B*3501HLA-B*3502HLA-B*3701HLA-B*3801HLA-B*39011HLA-B*3902HLA-B40HLA-B*40012(B60)HLA-B*4006(B61)HLA-B44HLA-B*4402HLA-B*4403HLA-B*4601HLA-B51HLA-B*5101HLA-B*5102HLA-B*5103HLA-B*5201HLA-B*5301HLA-B*5401HLA-B*5501HLA-B*5502HLA-B*5601HLA-B*5801HLA-B*6701HLA-B*7301HLA-B*7801HLA-Cw*0102HLA-Cw*0301HLA-Cw*0304HLA-Cw*0401HLA-Cw*0601HLA-Cw*0602HLA-Cw*0702HLA-G鼠H2-Kd
H2-DdH2-LdH2-KbH2-DbH2-KkH2-Kkm1Qa-2大鼠RT1.AaRT1.A1牛Bota-A11Bota-A20雞B-F4B-F12B-F15B-F19病毒同系物hCMV I類同系物UL18
表8評(píng)估的HLA-A抗原的基因頻率
a基因頻率b標(biāo)準(zhǔn)誤差表9評(píng)估的HLA-B抗原的基因頻率
a基因頻率b標(biāo)準(zhǔn)誤差c觀察到的基因計(jì)數(shù)是零表10評(píng)估的HLA-DR抗原的基因頻率
a基因頻率b標(biāo)準(zhǔn)誤差可能期望在較大蛋白質(zhì)的環(huán)境中表達(dá)管家肽。甚至在表位末端之外存在少量氨基酸時(shí)仍能檢測(cè)到加工。小肽激素常常是由長(zhǎng)度范圍常為大約60-120個(gè)氨基酸的較長(zhǎng)翻譯產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶解加工而成的。根據(jù)這一事實(shí)在一定程度上可以假設(shè)這就是能夠有效翻譯的最小長(zhǎng)度。例如，在有些實(shí)施方案中，可能將管家肽嵌入至少大約60個(gè)氨基酸的翻譯產(chǎn)物；在其它實(shí)施方案中是70，80，或90個(gè)氨基酸，在還有一些實(shí)施方案中是100，110，或120個(gè)氨基酸。在其它實(shí)施方案中，可能將管家肽嵌入至少大約50，30，或15個(gè)氨基酸的翻譯產(chǎn)物。
由于不同的蛋白酶體加工，由pAPC的免疫蛋白酶體生成的肽與由外周體細(xì)胞中的管家蛋白酶體生成的肽不同。因此，在較大蛋白質(zhì)的環(huán)境中表達(dá)管家表位時(shí)，優(yōu)選在pAPC中在其全長(zhǎng)天然序列以外的環(huán)境中進(jìn)行表達(dá)，因?yàn)楣芗冶砦煌ǔＶ荒芡ㄟ^管家蛋白酶體由天然蛋白質(zhì)有效加工而成，而管家蛋白酶體在pAPC中沒有活性。為了在編碼較大多肽的DNA序列中編碼管家表位，有用的是在編碼表位的序列兩端的發(fā)現(xiàn)側(cè)翼區(qū)域，其容許免疫蛋白酶體的適當(dāng)切割從而釋放該管家表位。促進(jìn)適當(dāng)切割的這種序列在下文中稱為具有底物或釋放序列功能。改變預(yù)期管家表位N端和C端的側(cè)翼氨基酸殘基可能有助于在pAPC中適當(dāng)切割和生成管家表位?？梢灾匦略O(shè)計(jì)嵌入管家表位的序列，并通過篩選來確定哪種能夠得到免疫蛋白酶體的成功加工而釋放管家表位。
或者，另一種策略對(duì)于鑒定能夠在APC中生成管家表位的序列很有效?？梢詫⒁环N或多種管家表位頭尾排列而生成連續(xù)氨基酸序列。將表達(dá)這種序列的構(gòu)建體用于免疫動(dòng)物，并評(píng)估由此產(chǎn)生的T細(xì)胞應(yīng)答以測(cè)定其對(duì)排列中一種或多種表位的特異性。這些免疫應(yīng)答指示在pAPC中得到有效加工的管家表位。由此定義該表位周圍的必需側(cè)翼區(qū)域。預(yù)期肽一側(cè)大約4-6個(gè)氨基酸的側(cè)翼區(qū)域的使用能夠提供有助于免疫蛋白酶體對(duì)管家表位的蛋白酶體加工的必需信息。因此，可以將大約16-22個(gè)氨基酸的底物或釋放序列有效插入或融合任何蛋白質(zhì)序列，從而能夠在APC中生成該管家表位。在有些實(shí)施方案中，更廣環(huán)境的底物序列也能夠影響加工。在這些實(shí)施方案中，多種環(huán)境中釋放序列的比較對(duì)于進(jìn)一步優(yōu)化特定底物序列可能是有用的。在備選實(shí)施方案中，可以類似的將表位的整個(gè)頭尾排列或僅僅與正確加工的管家表位直接相鄰的表位由測(cè)試構(gòu)建體轉(zhuǎn)移至疫苗載體。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以將管家表位嵌入已知免疫表位或其片段之間，從而為加工提供適當(dāng)環(huán)境。管家和免疫表位的鄰接能夠生成必需環(huán)境，使得免疫蛋白酶體釋放管家表位或較大片段，優(yōu)選包含正確C末端。篩選構(gòu)建體以確認(rèn)生成了預(yù)期表位可能是有用的。管家表位的鄰接能夠生成免疫蛋白酶體可切割的位點(diǎn)。本發(fā)明的有些實(shí)施方案在測(cè)試底物中管家表位的側(cè)翼采用已知表位；在其它實(shí)施方案中，無論側(cè)翼區(qū)是任意序列或是天然側(cè)翼序列的突變體，無論在設(shè)計(jì)底物時(shí)是否使用了蛋白酶體切割偏愛性的知識(shí)，進(jìn)行下文描述的篩選。
表位成熟N端的切割盡管有利但并不需要，因?yàn)榧?xì)胞中存在多種N端修剪活性，能夠在蛋白酶體加工后生成表位成熟N端。優(yōu)選的是這種N端延伸的長(zhǎng)度小于大約25個(gè)氨基酸，更優(yōu)選的是延伸具有少數(shù)或沒有脯氨酸殘基。優(yōu)選的是，在篩選時(shí)，不僅要考慮表位末端(至少是其C端)的切割，還可考慮確保表位內(nèi)部的有限切割。
鳥槍法可用于設(shè)計(jì)測(cè)試底物，而且能夠提高篩選效率。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以相繼裝配多個(gè)表位，個(gè)別表位可能出現(xiàn)超過一次?？梢院Y選底物以確定可以生成哪種表位。在關(guān)注一種特定表位時(shí)，可以設(shè)計(jì)它出現(xiàn)在多個(gè)不同環(huán)境中的底物。若底物釋放超過一個(gè)環(huán)境中出現(xiàn)的單一表位，可以使用額外的第二測(cè)試底物，其中表位的個(gè)別實(shí)例被移除，失效，或是唯一的，以確定釋放了哪一個(gè)并真正賦予底物或釋放序列功能。
存在幾種易于實(shí)踐的篩選。一種優(yōu)選的體外篩選利用蛋白酶體消化分析，使用純化后的免疫蛋白酶體，以測(cè)定是否能夠由包含待測(cè)序列的合成肽釋放預(yù)期管家表位。可以通過諸如質(zhì)譜，HPLC，和N端混合測(cè)序技術(shù)來確定所得到的切割位點(diǎn)；如美國專利申請(qǐng)?zhí)?9/561,074，09/560,465和10/117,937以及臨時(shí)美國專利申請(qǐng)?zhí)?0/282,211，60/337,017和60/363,210中有更為詳細(xì)的描述。
或者，可以采用體內(nèi)和基于細(xì)胞的篩選諸如免疫或靶敏化。對(duì)于免疫，使用能夠表達(dá)待測(cè)序列的核酸構(gòu)建體?？梢詫?duì)收獲的CTL測(cè)試它們識(shí)別展示待測(cè)管家表位的靶細(xì)胞的能力。這些靶細(xì)胞最容易通過用嵌入成熟管家表位的合成肽脈沖表達(dá)適當(dāng)MHC分子的細(xì)胞來獲得?；蛘撸梢允褂靡阎蚴莾?nèi)源或是通過遺傳工程而表達(dá)管家蛋白酶體和衍生管家表位的抗原的細(xì)胞進(jìn)行免疫。為了進(jìn)行靶敏化作為篩選，可以使用識(shí)別管家表位的CTL或優(yōu)選的是CTL克隆。在這種情況中，是靶細(xì)胞表達(dá)嵌入的管家表位(而非免疫過程中的pAPC)，而且它必須表達(dá)免疫蛋白酶體。通常，可以用適當(dāng)?shù)暮怂針?gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞或靶細(xì)胞以賦予嵌入的管家表位的表達(dá)。使用加載了肽的脂質(zhì)體裝載包含嵌入表位的合成肽，或者與陽離子脂蛋白轉(zhuǎn)移劑諸如BIOPORTERTM混合(基因療法系統(tǒng)，圣迭戈，加利福尼亞州)提供了候選方法。
一旦鑒定了具有底物或釋放序列功能的序列，可以在化學(xué)合成或重組生成的核酸載體中編碼它們。在任何一種的這些形式中，可以將它們摻入免疫原性組合物。在體外，這些組合物可用于疫苗開發(fā)，或者生成或擴(kuò)增將用于過繼性免疫療法的CTL。在體內(nèi)，它們可用于誘導(dǎo)，擴(kuò)大或維持和激活免疫應(yīng)答。在其它方法中，通過陽離子脂質(zhì)包裝，添加痕量的陽離子氨基酸諸如聚L-賴氨酸(Ryser，H.J.等人，J.Cell Physiol.，113167-178，1982；Shen，W.C.&Ryser，H.J.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，751872-1876，1978)，摻入具有輸入信號(hào)的分支結(jié)構(gòu)(Sheldon，K.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，922056-2060，1995)，或者混合或融合具有蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移功能的多肽包括肽載體諸如pep-1(Morris，M.C.等人，Nat.Biotech.，191173-1176，2001)，乙肝病毒表面抗原的PreS2轉(zhuǎn)位基序，皰疹病毒的VP22，和HIV-TAT蛋白質(zhì)(Oess，S.&Hildt，E.，Gene Ther.，7750-758，2000；Ford，K.G.等人，Gene Ther.，81-4，2001；Hung，C.F.等人，J.Virol.，762676-2682，2002；Oliveira，S.C.等人，Hum.Gene Ther.，121353-1359，2001；Normand，N.等人，J.Biol.Chem.，27615042-15050，2001；Schwartz，J.J.&Zhang，S.，Curr.Opin.Mol.Ther.，2162-167，2000；Elliot，G.，7 Hare，P.，Cell，88223-233，1997)等方法，可以大大增強(qiáng)多肽的攝取以進(jìn)行加工和呈遞。特別是對(duì)融合蛋白，可以通過培養(yǎng)生成免疫原并施用純化后的蛋白質(zhì)，或者可以施用核酸載體從而由經(jīng)體內(nèi)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生成并分泌免疫原。在這兩種情況中，融合蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能有助于pAPC的攝取。
實(shí)施例實(shí)施例1構(gòu)建了重組DNA質(zhì)粒疫苗pMA2M，它所編碼的一個(gè)多肽具有來自melan-A(26-35A27L)的HLA A2特異性CTL表位ELAGIGILTV(SEQ ID NO.1)以及melan-A(SEQ ID NO.2)的一部分(第31-96位氨基酸)，包括第31-48位和第56-69位氨基酸處的表位簇。這些簇以前曾公開于題為“EPITOPE CLUSTERS”的美國專利申請(qǐng)?zhí)?9/561,571。在限定的melan-ACTL表位的側(cè)翼是衍生自人酪氨酸酶的短氨基酸序列(SEQ IN NO.3)，從而有助于通過免疫蛋白酶體加工來釋放melan-A管家表位。另外，這些氨基酸序列自身展示潛在的CTL表位。質(zhì)粒中多肽的cDNA序列處于來自巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列(CMVp)的控制之下(見圖1)，從而能夠在被APC攝取后有效轉(zhuǎn)錄多肽的信使。位于編碼序列3’端的牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸信號(hào)(BGH polyA)為信使的聚腺苷酸化以增加其穩(wěn)定性以及由細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)以進(jìn)行翻譯提供了信號(hào)。為了便于在攝取后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，已經(jīng)將來自猿猴病毒40(SV40)的核輸入信號(hào)(NIS)插入質(zhì)粒骨架。質(zhì)粒攜帶兩個(gè)拷貝的CpG免疫刺激基序，一個(gè)位于NIS序列中，一個(gè)位于質(zhì)粒骨架中。最后，質(zhì)粒中的兩個(gè)原核遺傳元件負(fù)責(zé)大腸桿菌中的擴(kuò)增，卡那霉素抗性基因(Kan R)和pMB1細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)。
底物或釋放序列下文給出了所編碼的多肽(長(zhǎng)度為94個(gè)氨基酸殘基)(SEQ ID NO.4)的氨基酸序列，所述多肽在其N端包含28個(gè)氨基酸的底物或釋放序列(SEQID NO.5)MLLAVLYCL-ELAGIGILTV-YMDGTMSQV-GILTVILGVLLLIGCWYCRRRNGYRALMDKSLHVGTQCALTRRCPQEGFDHRDSKVSLQEKNCEPV前9個(gè)氨基酸殘基衍生自酪氨酸酶1-9(SEQ ID NO.6)，隨后的10個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成melan-A(26-35A27L)(SEQ ID NO.1)，而第20-29位氨基酸殘基衍生自酪氨酸酶369-377(SEQ ID NO.7)。這兩個(gè)酪氨酸酶九聚物序列都展示潛在的HLA A2特異性CTL表位。第10-19位氨基酸殘基構(gòu)成melan-A(26-35A27L)，來自melan-A的HLA A2特異性CTL表位的類似物，EAAGIGILTV(SEQ ID NO.8)，在人PBMC的體外免疫和小鼠的體內(nèi)免疫過程中誘發(fā)CTL應(yīng)答的能力提高。組成多肽剩余部分(第30-94位氨基酸殘基)的melan-A片段包含一些預(yù)測(cè)的HLA A2特異性表位，包括上文引用的表位簇，因而可用于產(chǎn)生針對(duì)免疫表位的應(yīng)答，正如專利申請(qǐng)“EpitopeSynchronization in Antigen Presenting Cells”和“Epitope Clusters”中所詳細(xì)描述的。包含該區(qū)域也是為了克服可能與表達(dá)較短序列有關(guān)的任何困難。圖1顯示了pMA2M示意圖。
質(zhì)粒構(gòu)建合成一對(duì)長(zhǎng)的互補(bǔ)寡核苷酸，它們編碼前30個(gè)氨基酸殘基。另外，這些寡核苷酸在退火后在5’端產(chǎn)生Afl II的粘端，在3’端產(chǎn)生EcoR I的粘端。使用攜帶限制性位點(diǎn)-5’端是EcoR I和3’端是Not I的寡核苷酸通過PCR擴(kuò)增melan-A31-96區(qū)域。用EcoR I和Not I消化PCR產(chǎn)物，并在三片段連接反應(yīng)中與編碼氨基端區(qū)域的退火寡核苷酸一起連接到已經(jīng)Afl II和Not I消化的實(shí)施例1中所述的載體骨架中。通過DNA測(cè)序確認(rèn)整個(gè)編碼序列。SEQ ID NO.9公開了整個(gè)插入片段的序列，由5’端的AflII位點(diǎn)至3’端的Not I位點(diǎn)。第12-293位核苷酸編碼多肽。
實(shí)施例2對(duì)包含melan-A(26-35A27L)(SEQ ID NO.1)作為嵌入的管家表位的三種載體測(cè)試它們?cè)贖LA-A2轉(zhuǎn)基因HHD小鼠中誘發(fā)針對(duì)該表位的CTL應(yīng)答的能力(Pascolo等人，J.Exp.Med.，1852043-2051，1997)。一種載體是上文所述的pMA2M(在圖3中稱為pVAXM3)。在pVAXM2中，三個(gè)表位的相同基群重復(fù)數(shù)次，而且排列的各個(gè)重復(fù)片段中側(cè)翼表位有不同程度的截短。盒的具體組成如下M-Tyr(5-9)-ELA-Tyr(369-373)-Tyr(4-9)-ELA-Tyr(369-374)-Tyr(3-9)-ELA-Tyr(369-375)-Tyr(2-9)-ELA(SEQ ID NO.10)其中ELA代表melan-A(26-35A27L)(SEQ ID NO.1)。將該盒插入與pVAXM3所用相同的質(zhì)粒骨架中。第三種載體pVAXM1除了表位排列之后是與編碼melan-A 31-70的讀碼框架相連的IRES(腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))之外與pVAXM2是相同的。
第0，3，和6天對(duì)四組(每組三只)HHD A2.1小鼠以節(jié)內(nèi)注射方式將25μl溶于PBS的1mg/ml質(zhì)粒DNA注入通過外科手術(shù)暴露的腹股溝淋巴結(jié)，每組接受三種載體之一或只是PBS。第14天收獲脾并用經(jīng)肽(melan-A(26-35A27L)(SEQ ID NO.1))脈沖的3天LPS胚細(xì)胞再次體外刺激一次。第3天用大鼠T-Stim(Collaborative Biomedical Products)補(bǔ)充體外培養(yǎng)物，并在第7天用標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放試驗(yàn)測(cè)試溶細(xì)胞活性。圖2-5顯示了T2靶細(xì)胞及經(jīng)melan-A(26-35A27L)(ELA)(SEQ ID NO.1)脈沖的T2靶細(xì)胞分別經(jīng)PBS，pVAXM1，pVAXM2，和pVAXM3免疫后獲得的特異溶解百分比。所有這三種載體都產(chǎn)生了強(qiáng)烈的CTL應(yīng)答。這些數(shù)據(jù)顯示質(zhì)粒已被APC攝取，所編碼的多肽已經(jīng)合成并經(jīng)蛋白酶解加工而產(chǎn)生討論中的十聚物(decamer)表位(即它具有底物或釋放序列功能)，而且表位變成了為呈遞而結(jié)合的HLA-A2。此外，終止于第55位氨基酸之后的pVAXM2分離變體的效果與全長(zhǎng)版本相似(數(shù)據(jù)未顯示)?？梢酝ㄟ^測(cè)試針對(duì)經(jīng)相應(yīng)合成肽脈沖的靶細(xì)胞的CTL活性來確定是否也能生成表達(dá)盒內(nèi)的其它潛在表位且對(duì)誘發(fā)CTL應(yīng)答有活性。
實(shí)施例3
NY-ESO-1(SEQ ID NO.11)底物/釋放序列通過其它6種表位排列的測(cè)試鑒定了管家表位NY-ESO-1157-165(SEQ IDNO.11)的底物/釋放序列。排列的組成表位如下SSX-241-49 KASEKIFYV (SEQ ID NO.13)排列元件ANY-ESO-1157-165 SLLMWITQC (SEQ ID NO.12)排列元件BNY-ESO-1163-171 TQCFLPVFL (SEQ ID NO.14)排列元件CPSMA288-297 GLPSIPVHPI (SEQ ID NO.15)排列元件DTYR4-9 AVLYCL (SEQ ID NO.16)排列元件E這6種排列在由起始子甲硫氨酸起始后具有如下元件排列pVAX-PC-A B-A-D-D-A-B-A-ApVAX-PC-B D-A-B-A-A-D-B-ApVAX-PC-C E-A-D-B-A-B-E-A-ApVAX-BC-A B-A-C-B-A-A-C-ApVAX-BC-B C-A-B-C-A-A-B-ApVAX-BC-C E-A-A-B-C-B-A-A將這些排列插入上文實(shí)施例中所述的相同載體骨架?；旧先鐚?shí)施例2所述，將質(zhì)粒載體用于免疫小鼠，并對(duì)由此產(chǎn)生的CTL測(cè)試它們特異溶解經(jīng)肽NY-ESO-1157-165(對(duì)應(yīng)于上文元件B)脈沖的靶細(xì)胞的能力。發(fā)現(xiàn)pVAX-PC-A和pVAX-BC-A都誘發(fā)了特異性溶解活性。比較多種排列中表位(元件B)的環(huán)境，尤其是pVAX-PC-A與pVAX-BC-A之間，pVAX-PC-A與pVAX-PC-B之間，以及pVAX-BC-A與pVAX-BC-C之間，得出如下結(jié)論，是pVAX-PC-A和pVAX-BC-A中表位的首次出現(xiàn)得到了正確加工和展示。換言之，起始子甲硫氨酸之后跟隨元件B-A構(gòu)成了元件B呈遞的底物/釋放序列。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了編碼以下元件的新表達(dá)盒用作疫苗起始子甲硫氨酸，NY-ESO-1157-165(粗體)-管家表位，SSX241-49(斜體)-為加工提供適當(dāng)環(huán)境，和NY-ESO-177-180-避免“短序列”問題并提供免疫表位。
因此構(gòu)建體編碼以下氨基酸序列M-SLLMWITQC-KASEKIFYV-RCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR(SEQ ID NO.17)，而MSLLMWITQCKASEKIFYV(SEQ ID NO.18)構(gòu)成了釋放或底物序列。將編碼SEQ ID NO.17的多核苷酸(SEQ ID NO.19核苷酸12-380)插入pMA2M所用相同質(zhì)粒骨架，產(chǎn)生質(zhì)粒pN157。
實(shí)施例4還制備了與pN157類似包含來自pVAX-PC-A的完整表位排列的構(gòu)建體，并命名為pBPL。因此pBPL中所編碼的氨基酸序列是M-SLLMWITQC-KASEKIFYV-GLPSIPVHPI-GLPSIPVHPI-KASEKIFYV-SLLMWITQC-KASEKIFYV-KASEKIFYV-RCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR(SEQ ID NO.20)。
SEQ ID NO.21是編碼pBPL中所使用的SEQ ID NO.20的多核苷酸。
作為合成肽制備SEQ ID NO.20的一部分-IKASEKIFYVSLLMWITQCKASEKIFYVK(SEQ ID NO.22)，并通過質(zhì)譜和N端混合測(cè)序用人免疫蛋白酶體進(jìn)行體外蛋白酶體消化分析。位于C殘基之后的切割的鑒別指示該構(gòu)建體片段可作為NY-ESO-1157-165(SEQ ID NO.12)表位的底物或釋放序列發(fā)揮功能(見圖6)。圖7顯示了SLLMWITQC表位(SEQID NO.12)在其天然環(huán)境中的不同加工，其中管家蛋白酶體比免疫蛋白酶體更有效的在C之后產(chǎn)生切割。免疫蛋白酶體還在表位內(nèi)部產(chǎn)生主要切割，當(dāng)表位處于其天然環(huán)境中時(shí)位于T與Q之間，但在SEQ ID NO.22的環(huán)境中并非如此(比較圖6和7)。
實(shí)施例5通過其它表位排列的篩選鑒定了促進(jìn)表位SSX-241-49(SEQ ID NO.13)表達(dá)的構(gòu)建體。除了實(shí)施例3中定義的一些排列元件，還使用了以下額外元件SSX-457-65 VMTKLGFKV (SEQ ID NO.23)排列元件FPSMA730-739RQIYVAAFTV (SEQ ID NO.24)排列元件G發(fā)現(xiàn)命名為CTLA02，編碼起始子甲硫氨酸和排列F-A-G-D-C-F-G-A的構(gòu)建體成功免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生識(shí)別肽SSX-241-49(SEQ ID NO.13)的CTL應(yīng)答。
如上所述，期望將具有底物或釋放序列功能的序列與可加工成免疫表位的序列相聯(lián)合。因此將SSX-215-183(SEQ ID NO.25)與全部或部分排列如下聯(lián)合CTLS1F-A-G-D-C-F-G-A-SSX-215-183(SEQ ID NO.26)CTLS2SSX-215-183-F-A-G-D-C-F-G-A (SEQ ID NO.27)CTLS3F-A-G-D-SSX-215-183(SEQ ID NO.28)CTLS4SSX-215-183-C-F-G-A (SEQ ID NO.29)除了CTLS3之外的所有構(gòu)建體都能誘發(fā)識(shí)別肽SSX-241-49(SEQ ID NO.13)的CTL。CTLS3是這四種構(gòu)建體中唯一不含來自CTLA02的第二元件A的一種，說明正是這一基元的第二次出現(xiàn)提供了底物或釋放序列功能。如同在CTLA02中，在CTLS2和CTLS4中A元件位于排列的C末端。在CTLS1中，A元件之后直接連接以丙氨酸開始的SSX-215-183片段，常常發(fā)現(xiàn)該殘基位于蛋白酶體切割位點(diǎn)之后(Toes，R.E.M.等人，J.Exp.Med.，1941-12，2001)。SEQ ID NO.30是編碼CTLS1中所使用的SEQ ID NO.26的多核苷酸序列，也稱為pCBP。
作為合成肽制備包含排列元件F-A-SSX-215-23的CTLS1一部分(SEQ IDNO.26)及序列RQIYVAAFTV-KASEKIFYV-AQIPEKIQK(SEQ ID NO.31)，并通過質(zhì)譜和N端混合測(cè)序用人免疫蛋白酶體進(jìn)行體外蛋白酶體消化分析。觀察到產(chǎn)生了SSX-241-49表位(SEQ ID NO.13)的C末端(見圖8)，這為支持底物或釋放序列功能提供了進(jìn)一步的證據(jù)。圖9的數(shù)據(jù)顯示了SSX-241-49表位KASEKIFYV(SEQ ID NO.13)在其天然環(huán)境中的不同加工，其中V之后的切割是由管家蛋白酶體產(chǎn)生的主要切割，而免疫蛋白酶體則在序列的其它位置具有數(shù)個(gè)主要切割位點(diǎn)。通過將該表位移入由SEQ ID NO.31提供的環(huán)境中，預(yù)期切割成為主要切割，而且它與其它免疫蛋白酶體切割相比的相對(duì)頻率得到提高(比較圖8和9)。圖8B的數(shù)據(jù)還顯示了小鼠和人蛋白酶體特異性的相似性，從而支持轉(zhuǎn)基因小鼠模型預(yù)測(cè)人抗原加工的有效性。
實(shí)施例6篩選還揭示了酪氨酸酶表位Tyr207-215(SEQ ID NO.32)的底物或釋放序列功能，該表位是由序列[Tyr1-17-Tyr207-215]4，[MLLAVLYCLLWSFQTSA-FLPWHRLFL]4(SEQ ID NO.33)組成的排列的一部分。將上文所述相同載體骨架用于表達(dá)該排列。該排列與其它實(shí)施例的排列不同，因?yàn)樽鳛槊庖弑砦辉炊腡yr1-17片段用作排列的重復(fù)元件。這與其它實(shí)施例中所顯示的模式相反，在其它實(shí)施例中，作為免疫表位源和/或長(zhǎng)度而包含的序列在排列的起點(diǎn)或終點(diǎn)只出現(xiàn)一次，排列的其余部分是由個(gè)別表位或較短序列組成的。
質(zhì)粒構(gòu)建通過退火合成寡核苷酸的裝配產(chǎn)生編碼SEQ ID NO.33的多核苷酸。合成了4對(duì)互補(bǔ)的寡核苷酸，其跨越整個(gè)編碼序列，兩端是Afl II和EcoRI限制性位點(diǎn)的粘端。首先將各對(duì)互補(bǔ)寡核苷酸退火，逐步連接由此產(chǎn)生的DNA片段，并將裝配好的DNA片段插入經(jīng)Afl II/EcoR I預(yù)先消化的上文所述相同載體骨架中。此構(gòu)建體稱為CTLT2/pMEL，而SEQ ID NO.34是用于編碼SEQ ID NO.33的多核苷酸序列。
實(shí)施例7對(duì)人施用針對(duì)黑素瘤的免疫治療性DNA質(zhì)粒制劑在1％苯甲醇，1％乙醇，0.5mM EDTA，檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液pH7.6中配制具有上文實(shí)施例1中所述序列的MA2M黑素瘤疫苗。制備200，400和600μg DNA/ml的等分試樣，裝載到MINIMED 407C灌輸泵中。將SILHOUETTE灌輸裝置的導(dǎo)管插入超聲成像顯現(xiàn)的腹股溝淋巴節(jié)中。泵和灌輸裝置的裝配最初是為了給糖尿病患者投遞胰島素而設(shè)計(jì)的。在此應(yīng)用中用31mm的導(dǎo)管取代了常用的17mm導(dǎo)管。灌輸裝置保持打開狀態(tài)4天(約96小時(shí))，灌輸速率為約25μl/小時(shí)，總灌輸體積為約2.4ml。因此對(duì)于上文所述三個(gè)濃度而言，每次灌輸?shù)目偨o予劑量分別為約500和1000μg；并且可以是1500μg。灌輸后，在開始下次灌輸前給予受試者10天的休息期?？紤]到施用后淋巴結(jié)中質(zhì)粒DNA的繼續(xù)滯留和抗原消失后CTL應(yīng)答的常規(guī)動(dòng)力學(xué)，該方案將足以維持免疫學(xué)CTL應(yīng)答。
實(shí)施例8作為合成肽制備SEQ ID NO.22并用陽離子脂蛋白轉(zhuǎn)移劑進(jìn)行包裝。將組合物直接注入腹股溝淋巴結(jié)(見實(shí)施例7)，灌輸速率為200-600μg肽/天，灌輸7天，然后休息7天。進(jìn)行3-8個(gè)循環(huán)的起始治療。
實(shí)施例9通過將SEQ ID NO.34添加到編碼單純皰疹病毒1 VP22(SEQ ID NO.42)的核苷酸序列的3’端，在適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物表達(dá)載體中制備融合蛋白，上文所用載體是合適的。將載體用于轉(zhuǎn)化HEK 293細(xì)胞，并于48-72小時(shí)后沉淀細(xì)胞，溶解細(xì)胞并制備可溶性提取物。使用抗VP22單克隆抗體通過親和層析純化融合蛋白。結(jié)內(nèi)施用純化后的融合蛋白，速率10-100μg/天，施用7天，然后休息7天。進(jìn)行3-8個(gè)循環(huán)的起始治療。
此外，本發(fā)明可利用如下多個(gè)方面于1999年9月1日提交的題為“A METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE”的美國專利申請(qǐng)?zhí)?9/380,534；于2001年2月2日提交的題為“METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE”的09/776,232；于2000年11月16日提交的題為“AVOIDANCE OFUNDESIRABLE REPLICATION INTERMEDIATES IN PLASMID PROPAGATION”的09/715,835；于2000年11月7日提交的題為“METHODS OF COMMERCIALIZINGAN ANTIGEN”的09/999,186；和于2001年3月7日提交的題為“ANTI-NEOVASCULAR VACCINES FOR CANCER”的臨時(shí)美國專利申請(qǐng)?zhí)?0/274,063。
表11SEQ ID NOS的部分列表
<p>-用冷水(大約15°TH)漂洗-漂洗時(shí)間5分鐘。
樣品在室溫下豎立干燥。
指定10位專家進(jìn)行毛巾織物棉布的洗滌樣品的柔軟度的手工試驗(yàn)，給予各試驗(yàn)樣品1-5的等級(jí)。
等級(jí)1給予非常粗糙的織物。
等級(jí)5給予非常柔軟的織物(新的狀態(tài))。
對(duì)于各試驗(yàn)樣品，計(jì)算所得值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值。
所得結(jié)果如下所示
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)施例3的嵌段共聚物特別適合于改進(jìn)作為乳液的硅油在棉布表面上的沉積，這通過提供了更高的柔軟度得到了真實(shí)的反映。
Melan-A mRNA序列基因座 NM_005511 1524bp mRNA PRI 14-OCT-2001定義人melan-A(MLANA)，mRNA.
編號(hào)NM_005511版本NM_005511.1 GI5031912(SEQ ID NO.2)/翻譯＝”MPREDAHFIYGYPKKGHGHSYTTAEEAAGIGILTVILGVLLLIGCWYCRRRNGYRALMDKSLHVGTQCALTRRCPQEGFDHRDSKVSLQEKNCEPVVPNAPPAYEKLSAEQSPPPYSP″(SEQ ID NO.35)起始1 agcagacaga ggactctcat taaggaaggt gtcctgtgcc ctgaccctac aagatgccaa61 gagaagatgc tcacttcatc tatggttacc ccaagaaggg gcacggccac tcttacacca121 cggctgaaga ggccgctggg atcggcatcc tgacagtgat cctgggagtc ttactgctca181 tcggctgttg gtattgtaga agacgaaatg gatacagagc cttgatggat aaaagtcttc241 atgttggcac tcaatgtgcc ttaacaagaa gatgcccaca agaagggttt gatcatcggg301 acagcaaagt gtctcttcaa gagaaaaact gtgaacctgt ggttcccaat gctccacctg361 cttatgagaa actctctgca gaacagtcac caccacctta ttcaccttaa gagccagcga421 gacacctgag acatgctgaa attatttctc tcacactttt gcttgaattt aatacagaca481 tctaatgttc tcctttggaa tggtgtagga aaaatgcaag ccatctctaa taataagtca541 gtgttaaaat tttagtaggt ccgctagcag tactaatcat gtgaggaaat gatgagaaat601 attaaattgg gaaaactcca tcaataaatg ttgcaatgca tgatactatc tgtgccagag661 gtaatgttag taaatccatg gtgttatttt ctgagagaca gaattcaagt gggtattctg721 gggccatcca atttctcttt acttgaaatt tggctaataa caaactagtc aggttttcga781 accttgaccg acatgaactg tacacagaat tgttccagta ctatggagtg ctcacaaagg841 atacttttac aggttaagac aaagggttga ctggcctatt tatctgatca agaacatgtc901 agcaatgtct ctttgtgctc taaaattcta ttatactaca ataatatatt gtaaagatcc961 tatagctctt tttttttgag atggagtttc gcttttgttg cccaggctgg agtgcaatgg1021 cgcgatcttg gctcaccata acctccgcct cccaggttca agcaattctc ctgccttagc1081 ctcctgagta gctgggatta caggcgtgcg ccactatgcc tgactaattt tgtagtttta1141 gtagagacgg ggtttctcca tgttggtcag gctggtctca aactcctgac ctcaggtgat
1201 ctgcccgcct cagcctccca aagtgctgga attacaggcg tgagccacca cgcctggctg1261 gatcctatat cttaggtaag acatataacg cagtctaatt acatttcact tcaaggctca1321 atgctattct aactaatgac aagtattttc tactaaacca gaaattggta gaaggattta1381 aataagtaaa agctactatg tactgcctta gtgctgatgc ctgtgtactg ccttaaatgt1441 acctatggca atttagctct cttgggttcc caaatccctc tcacaagaat gtgcagaaga1501 aatcataaag gatcagagat tctg酪氨酸酶mRNA序列基因座 NM_000372 1964bp mRNA PRI 31-OCT-2000定義 人酪氨酸酶(眼皮白化病IA)(TYR)，mRNA編號(hào) NM 000372版本 NM_000372.1 GI4507752(SEQ ID NO.3)/翻譯＝”MLLAVLYCLLWSFQTSAGHFPRACVSSKNLMEKECCPPWSGDRSPCGQLSGRGSCQNILLSNAPLGPQFPFTGVDDRESWPSVFYNRTCQCSGNFMGFNCGNCKFGFWGPNCTERRLLVRRNIFDLSAPEKDKFFAYLTLAKHTISSDYVIPIGTYGQMKNGSTPMFNDINIYDLFVWMHYYVSMDALLGGSEIWRDIDFAHEAPAFLPWHRLFLLRWEQEIQKLTGDENFTIPYWDWRDAEKCDICTDEYMGGQHPTNPNLLSPASFFSSWQIVCSRLEEYNSHQSLCNGTPEGPLRRNPGNHDKSRTPRLPSSADVEFCLSLTQYESGSMDKAANFSFRNTLEGFASPLTGIADASQSSMHNALHIYMNGTMSQVQGSANDPIFLLHHAFVDSIFEQWLRRHRPLQEVYPEANAPIGHNRESYMVPFIPLYRNGDFFISSKDLGYDYSYLQDSDPDSFQDYIKSYLEQASRIWSWLLGAAMVGAVLTALLAGLVSLLCRHKRKQLP EEKQPLLMEKEDYHSLYQSHL″(SEQ ID NO.36)起始1 atcactgtag tagtagctgg aaagagaaat ctgtgactcc aattagccag ttcctgcaga61 ccttgtgagg actagaggaa gaatgctcct ggctgttttg tactgcctgc tgtggagttt121 ccagacctcc gctggccatt tccctagagc ctgtgtctcc tctaagaacc tgatggagaa181 ggaatgctgt ccaccgtgga gcggggacag gagtccctgt ggccagcttt caggcagagg241 ttcctgtcag aatatccttc tgtccaatgc accacttggg cctcaatttc ccttcacagg301 ggtggatgac cgggagtcgt ggccttccgt cttttataat aggacctgcc agtgctctgg
361 caacttcatg ggattcaact gtggaaactg caagtttggc ttttggggac caaactgcac421 agagagacga ctcttggtga gaagaaacat cttcgatttg agtgccccag agaaggacaa481 attttttgcc tacctcactt tagcaaagca taccatcagc tcagactatg tcatccccat541 agggacctat ggccaaatga aaaatggatc aacacccatg tttaacgaca tcaatattta601 tgacctcttt gtctggatgc attattatgt gtcaatggat gcactgcttg ggggatctga661 aatctggaga gacattgatt ttgcccatga agcaccagct tttctgcctt ggcatagact721 cttcttgttg cggtgggaac aagaaatcca gaagctgaca ggagatgaaa acttcactat781 tccatattgg gactggcggg atgcagaaaa gtgtgacatt tgcacagatg agtacatggg841 aggtcagcac cccacaaatc ctaacttact cagcccagca tcattcttct cctcttggca901 gattgtctgt agccgattgg aggagtacaa cagccatcag tctttatgca atggaacgcc961 cgagggacct ttacggcgta atcctggaaa ccatgacaaa tccagaaccc caaggctccc1021 ctcttcagct gatgtagaat tttgcctgag tttgacccaa tatgaatctg gttccatgga1081 taaagctgcc aatttcagct ttagaaatac actggaagga tttgctagtc cacttactgg1141 gatagcggat gcctctcaaa gcagcatgca caatgccttg cacatctata tgaatggaac1201 aatgtcccag gtacagggat ctgccaacga tcctatcttc cttcttcacc atgcatttgt1261 tgacagtatt tttgagcagt ggctccgaag gcaccgtcct cttcaagaag tttatccaga1321 agccaatgca cccattggac ataaccgggt atcctacatg gttcctttta taccactgta1381 cagaaatggt gatttcttta tttcatccaa agatctgggc tatgactata gctatctaca1441 agattcagac ccagactctt ttcaagacta cattaagtcc tatttggaac aagcgagtcg1501 gatctggtca tggctccttg gggcggcgat ggtaggggcc gtcctcactg ccctgctggc1561 agggcttgtg agcttgctgt gtcgtcacaa gagaaagcag cttcctgaag aaaagcagcc1621 actcctcatg gagaaagagg attaccacag cttgtatcag agccatttat aaaaggctta1681 ggcaatagag tagggccaaa aagcctgacc tcactctaac tcaaagtaat gtccaggttc1741 ccagagaata tctgctggta tttttctgta aagaccattt gcaaaattgt aacctaatac1801 aaagtgtagc cttcttccaa ctcaggtaga acacacctgt ctttgtcttg ctgttttcac1861 tcagcccttt taacattttc ccctaagccc atatgtctaa ggaaaggatg ctatttggta1921 atgaggaact gttatttgta tgtgaattaa agtgctctta ttttNY-ESO-1 mRNA序列基因座 HSU87459 752bp mRNA PRI 22-DEC-1999定義 人自身免疫原性癌癥/睪丸抗原NY-ESO-1 mRNA，完整cds
編號(hào) U87459版本 U87459.1 GI1890098(SEQ ID NO.11)/翻譯＝”MQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAARASGPGGGAPRGPHGGAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR″(SEQ ID NO.37)起始1 atcctcgtgg gccctgacct tctctctgag agccgggcag aggctccgga gccatgcagg61 ccgaaggccg gggcacaggg ggttcgacgg gcgatgctga tggcccagga ggccctggca121 ttcctgatgg cccagggggc aatgctggcg gcccaggaga ggcgggtgcc acgggcggca181 gaggtccccg gggcgcaggg gcagcaaggg cctcggggcc gggaggaggc gccccgcggg241 gtccgcatgg cggcgcggct tcagggctga atggatgctg cagatgcggg gccagggggc301 cggagagccg cctgcttgag ttctacctcg ccatgccttt cgcgacaccc atggaagcag361 agctggcccg caggagcctg gcccaggatg ccccaccgct tcccgtgcca ggggtgcttc421 tgaaggagtt cactgtgtcc ggcaacatac tgactatccg actgactgct gcagaccacc481 gccaactgca gctctccatc agctcctgtc tccagcagct ttccctgttg atgtggatca541 cgcagtgctt tctgcccgtg tttttggctc agcctccctc agggcagagg cgctaagccc601 agcctggcgc cccttcctag gtcatgcctc ctcccctagg gaatggtccc agcacgagtg661 gccagttcat tgtgggggcc tgattgtttg tcgctggagg aggacggctt acatgtttgt721 ttctgtagaa aataaaactg agctacgaaa aaPSMA cDNA序列基因座 NM_004476 2653bp mRNA PRI 01-NOV-2000定義人葉酸水解酶(前列腺特異性膜抗原)1(FOLH1)，mRNA編號(hào)NM_004476版本NM_004476.1 GI4758397
(SEQ ID NO.38)/翻譯＝”MWNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADS SIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAOVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA″(SEQ ID NO.39)起始1 ctcaaaaggg gccggatttc cttctcctgg aggcagatgt tgcctctctc tctcgctcgg61 attggttcag tgcactctag aaacactgct gtggtggaga aactggaccc caggtctgga121 gcgaattcca gcctgcaggg ctgataagcg aggcattagt gagattgaga gagactttac181 cccgccgtgg tggttggagg gcgcgcagta gagcagcagc acaggcgcgg gtcccgggag241 gccggctctg ctcgcgccga gatgtggaat ctccttcacg aaaccgactc ggctgtggcc301 accgcgcgcc gcccgcgctg gctgtgcgct ggggcgctgg tgctggcggg tggcttcttt361 ctcctcggct tcctcttcgg gtggtttata aaatcctcca atgaagctac taacattact421 ccaaagcata atatgaaagc atttttggat gaattgaaag ctgagaacat caagaagttc481 ttatataatt ttacacagat accacattta gcaggaacag aacaaaactt tcagcttgca541 aagcaaattc aatcccagtg gaaagaattt ggcctggatt ctgttgagct agcacattat601 gatgtcctgt tgtcctaccc aaataagact catcccaact acatctcaat aattaatgaa661 gatggaaatg agattttcaa cacatcatta tttgaaccac ctcctccagg atatgaaaat721 gtttcggata ttgtaccacc tttcagtgct ttctctcctc aaggaatgcc agagggcgat781 ctagtgtatg ttaactatgc acgaactgaa gacttcttta aattggaacg ggacatgaaa
841 atcaattgct ctgggaaaat tgtaattgcc agatatggga aagttttcag aggaaataag901 gttaaaaatg cccagctggc aggggccaaa ggagtcattc tctactccga ccctgctgac961 tactttgctc ctggggtgaa gtcctatcca gatggttgga atcttcctgg aggtggtgtc1021 cagcgtggaa atatcctaaa tctgaatggt gcaggagacc ctctcacacc aggttaccca1081 gcaaatgaat atgcttatag gcgtggaatt gcagaggctg ttggtcttcc aagtattcct1141 gttcatccaa ttggatacta tgatgcacag aagctcctag aaaaaatggg tggctcagca1201 ccaccagata gcagctggag aggaagtctc aaagtgccct acaatgttgg acctggcttt1261 actggaaact tttctacaca aaaagtcaag atgcacatcc actctaccaa tgaagtgaca1321 agaatttaca atgtgatagg tactctcaga ggagcagtgg aaccagacag atatgtcatt1381 ctgggaggtc accgggactc atgggtgttt ggtggtattg accctcagag tggagcagct1441 gttgttcatg aaattgtgag gagctttgga acactgaaaa aggaagggtg gagacctaga1501 agaacaattt tgtttgcaag ctgggatgca gaagaatttg gtcttcttgg ttctactgag1561 tgggcagagg agaattcaag actccttcaa gagcgtggcg tggcttatat taatgctgac1621 tcatctatag aaggaaacta cactctgaga gttgattgta caccgctgat gtacagcttg1681 gtacacaacc taacaaaaga gctgaaaagc cctgatgaag gctttgaagg caaatctctt1741 tatgaaagtt ggactaaaaa aagtccttcc ccagagttca gtggcatgcc caggataagc1801 aaattgggat ctggaaatga ttttgaggtg ttcttccaac gacttggaat tgcttcaggc1861 agagcacggt atactaaaaa ttgggaaaca aacaaattca gcggctatcc actgtatcac1921 agtgtctatg aaacatatga gttggtggaa aagttttatg atccaatgtt taaatatcac1981 ctcactgtgg cccaggttcg aggagggatg gtgtttgagc tagccaattc catagtgctc2041 ccttttgatt gtcgagatta tgctgtagtt ttaagaaagt atgctgacaa aatctacagt2101 atttctatga aacatccaca ggaaatgaag acatacagtg tatcatttga ttcacttttt2161 tctgcagtaa agaattttac agaaattgct tccaagttca gtgagagact ccaggacttt2221 gacaaaagca acccaatagt attaagaatg atgaatgatc aactcatgtt tctggaaaga2281 gcatttattg atccattagg gttaccagac aggccttttt ataggcatgt catctatgct2341 ccaagcagcc acaacaagta tgcaggggag tcattcccag gaatttatga tgctctgttt2401 gatattgaaa gcaaagtgga cccttccaag gcctggggag aagtgaagag acagatttat2461 gttgcagcct tcacagtgca ggcagctgca gagactttga gtgaagtagc ctaagaggat2521 tctttagaga atccgtattg aatttgtgtg gtatgtcact cagaaagaat cgtaatgggt2581 atattgataa attttaaaat tggtatattt gaaataaagt tgaatattat atataaaaaa2641 aaaaaaaaaa aaa
NM 003147人滑膜肉瘤，X斷點(diǎn)2(SSX2)，mRNA基因座NM_003147 766bp mRNA PRI 14-MAR-2001定義 人滑膜肉瘤，X斷點(diǎn)2(SSX2)，mRNA編號(hào) NM_003147版本 NM_003147.1 GI10337582SEQ ID NO.40/翻譯＝”MNGDDAFARRPTVGAQIPEKIQKAFDDIAKYFSKEEWEKMKASEKIFYVYMKRKYEAMTKLGFKATLPPFMCNKRAEDFQGNDLDNDPNRGNQVERPQMTFGRLQGISPKIMPKKPAEEGNDSEEVPEASGPQNDGKELCPPGKPTTSEKIHERSGPKRGEHAWTHRLRERKQLVIYEEISDPEEDDE″SEQ ID NO 411 ctctctttcg attcttccat actcagagta cgcacggtct gattttctct ttggattctt61 ccaaaatcag agtcagactg ctcccggtgc catgaacgga gacgacgcct ttgcaaggag121 acccacggtt ggtgctcaaa taccagagaa gatccaaaag gccttcgatg atattgccaa181 atacttctct aaggaagagt gggaaaagat gaaagcctcg gagaaaatct tctatgtgta241 tatgaagaga aagtatgagg ctatgactaa actaggtttc aaggccaccc tcccaccttt301 catgtgtaat aaacgggccg aagacttcca ggggaatgat ttggataatg accctaaccg361 tgggaatcag gttgaacgtc ctcagatgac tttcggcagg ctccagggaa tctccccgaa421 gatcatgccc aagaagccag cagaggaagg aaatgattcg gaggaagtgc cagaagcatc481 tggcccacaa aatgatggga aagagctgtg ccccccggga aaaccaacta cctctgagaa541 gattcacgag agatctggac ccaaaagggg ggaacatgcc tggacccaca gactgcgtga601 gagaaaacag ctggtgattt atgaagagat cagcgaccct gaggaagatg acgagtaact661 cccctcaggg atacgacaca tgcccatgat gagaagcaga acgtggtgac ctttcacgaa721 catgggcatg gctgcggacc cctcgtcatc aggtgcatag caagtg
權(quán)利要求
1.一種鑒定適用于表位釋放的多肽的方法，所述方法包括下列步驟鑒定目的表位；提供包含所述表位的底物多肽序列，其中所述底物多肽容許蛋白酶體的加工；在支持所述蛋白酶體加工所述底物多肽的條件下使所述底物多肽接觸包含所述蛋白酶體的組合物；和測(cè)定所述表位釋放。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述表位被嵌入所述底物多肽。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述表位是管家表位。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述底物多肽是合成肽。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述底物多肽是融合蛋白。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述接觸步驟包含使用所述底物多肽進(jìn)行免疫。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述底物多肽是由多核苷酸編碼的。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述接觸步驟包含使用含所述多核苷酸的載體進(jìn)行免疫。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述接觸步驟包含使用含所述多核苷酸的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白酶體加工發(fā)生于體外。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述測(cè)定步驟由一種技術(shù)組成，所述技術(shù)選自由質(zhì)譜，N端混合測(cè)序，和HPLC組成的組。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述測(cè)定步驟包含T細(xì)胞靶識(shí)別測(cè)定。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述底物多肽還包含額外表位的排列。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述排列包含管家和免疫表位。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述底物多肽還包含表位排列和表位簇。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白酶體是免疫蛋白酶體。
17.一種包含管家表位表達(dá)盒的載體，其中所述管家表位是由靶相關(guān)抗原衍生的，其中所述管家表位是通過免疫蛋白酶體加工由盒的翻譯產(chǎn)物釋放的。
18.權(quán)利要求17的載體，其中所述表達(dá)盒編碼兩個(gè)或多個(gè)表位的排列或者至少一個(gè)表位和至少一個(gè)表位簇。
19.權(quán)利要求17的載體，其中所述靶相關(guān)抗原是由腫瘤或胞內(nèi)寄生物衍生或與腫瘤或胞內(nèi)寄生物相關(guān)的抗原。
20.一種激活T細(xì)胞的方法，其包含將權(quán)利要求17的載體接觸APC和將所述APC接觸T細(xì)胞。
21.一種包含管家表位的底物多肽，其中所述管家表位可以在pAPC中通過免疫蛋白酶體加工而釋放。
全文摘要
此處公開的本發(fā)明涉及鑒定適于表位釋放的多肽的方法，其包括例如，鑒定目的表位的步驟；提供包括表位的底物多肽序列，其中所述底物多肽允許被蛋白酶體加工；在支持底物多肽被蛋白酶體加工的條件下，將所述底物多肽與包括蛋白酶體的組合物接觸；測(cè)定表位的釋放。本發(fā)明還涉及包括管家表位表達(dá)盒的載體。管家表位可以衍生自靶相關(guān)抗原，并且管家表位可以是可釋放的，即通過免疫蛋白酶體加工能夠叢盒的翻譯產(chǎn)物釋放。本發(fā)明還涉及激活T細(xì)胞的方法，其包含將底物多肽與APC接觸和將APC與T細(xì)胞接觸。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1612935SQ02826856
公開日2005年5月4日 申請(qǐng)日期2002年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月7日
發(fā)明者約翰·J·L·西馬德, 戴維·C·戴蒙德, 裘志勇, 雷向東 申請(qǐng)人:曼康公司