專利名稱：對急性骨髓性白血病的三特異性療法的制作方法
對急性骨髓性白血病的三特異性療法本發(fā)明涉及對(a)⑶123 ;(b)⑶16和(C)⑶33具有結(jié)合特異性的分子。本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明的分子，其中所述分子包括第一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其包括與Vh結(jié)構(gòu)域連接的'結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域與CD123特異性結(jié)合；第二免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其包括與Vh結(jié)構(gòu)域連接的\結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域與CD16特異性結(jié)合；和第三免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其包括與Vh結(jié)構(gòu)域連接的\結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域與CD33特異性結(jié)合。本發(fā)明更進(jìn)一步涉及編碼本發(fā)明分子的核酸分子。另外，本發(fā)明涉及本發(fā)明所述分子或所述核酸分子的診斷和藥物組合物以及其在治療急性骨髓性白血病和/或骨髓增生異常綜合征中的應(yīng)用。、在該說明書中，引用了包括專利申請和制造商手冊在內(nèi)的許多文件。這些文件的公開內(nèi)容，盡管認(rèn)為不與本發(fā)明的專利性相關(guān)，但是通過引用以它們的整體并入這里。更具體而言，所有參考的文件通過引用被并入的程度如同具體且單個(gè)指明每個(gè)單個(gè)文件通過引用并入一樣。急性骨髓性白血病(AML)是第二最常見的急性白血病，在美國每年約13，300新發(fā)病例和8，800的年死亡數(shù)(Jemal等，2008)。白血病的通常應(yīng)用的療法包括放射和/或化學(xué)療法。此外，在某些情況下，骨髓移植的另外可能性被認(rèn)為是合適的。但是，這些療法對患者是相對有毒的并且通常不產(chǎn)生疾病的完全治愈。因此，雖然對于接受化學(xué)療法的所有患者的65-80%可實(shí)現(xiàn)完全緩解(Cros等,2004, Kern和Estey 2006),但是這些患者的大部分復(fù)發(fā)(Cros等，2004)。在常規(guī)化學(xué)療法初始病程之后的緩解階段中，患者骨髓中的胚細(xì)胞計(jì)數(shù)減少到總骨髓白細(xì)胞的約5%或更少，并且從化學(xué)療法幸存的細(xì)胞被稱為“最小殘留病(輕微后遺癥，minimal residual disease)” (MRD)細(xì)胞。這些細(xì)胞富集在AML白血病干細(xì)胞(AML-LSC)中，其尤其抗化學(xué)療法，并且它們構(gòu)成能夠再擴(kuò)張并造成復(fù)發(fā)的特別危險(xiǎn)的細(xì)胞庫(reservoir of cell)。對于急性骨髓性白血病，白血病干細(xì)胞已經(jīng)尤其良好地得到表征(Lapidot 等，1994, Bonnet 和 Dick 1997, Hope 等，2004)。AML-LSC 表達(dá)細(xì)胞表面抗原的特征集合，包括⑶123、C型凝集素類分子-I (CLL-I)、⑶44、⑶33等等且用于AML 病例 CD96 亞組(Jordan 等，2000, Bakker 等，2004, Jin 等,2006, Hauswirth 等，2007,Hosen等,2007,Misaghian等,2009)。這些特異細(xì)胞展示獨(dú)特的生物性質(zhì),包括很少進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)、自我更新潛能和增強(qiáng)的對化學(xué)治療劑和DNA損傷的抗性。因此，它們可能明顯有助于最小殘留病(MRD)細(xì)胞種群并且是常規(guī)治療的AML-患者復(fù)發(fā)的原因(Ravandi和Estrov2006)。小于60歲并且接受標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法的患者4年無病生存率僅達(dá)到約40%。此外，超過60歲的患者具有差的預(yù)后，僅具有10%至15%的4年無病生存率(Mayer等，1994，Gardin等，2007)。AML患者的這種高復(fù)發(fā)率和年老患者差的預(yù)后突出了對優(yōu)先靶向AML-LSC的新療法的急切需要。FDA批準(zhǔn)的用于治療AML的藥物是吉妥單抗(Gemtuzumab Ozogamicin) (G0,Mylotarg ，Wyeth，Madison，NJ，USA)，其是CD33特異性藥物。該藥劑的使用限于第一次復(fù)發(fā)超過60歲的患者并限于對標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法有抗性的患者(Bross等，2001，Sievers 2001)。GO由與細(xì)胞毒劑加里剎霉素(calicheamicin)化學(xué)偶聯(lián)的人源化抗CD33 IgG抗體組成(Hamann等，2002)。在II期臨床試驗(yàn)中，30%復(fù)發(fā)的AML患者對GO響應(yīng)(Sievers 2001，Larson等，2002)。但是，發(fā)現(xiàn)副作用包括肝靜脈閉塞性疾病、肺毒性和嚴(yán)重的超敏反應(yīng)。此夕卜，體外研究揭示了對⑶33陰性細(xì)胞系的抗原非依賴性細(xì)胞毒性(Bross等，2001，Jedema等，2004, Schwemmlein 等，2006)。在過去，已經(jīng)使用不同的方法開發(fā)具有改善的抗腫瘤活性的非結(jié)合單克隆抗體。這些方法之一是通過各種方法產(chǎn)生雙特異性抗體。一般而言，這些分子由針對腫瘤細(xì)胞上的靶抗原的一種結(jié)合位點(diǎn)和針對效應(yīng)細(xì)胞上的激活觸發(fā)分子——比如T細(xì)胞上的CD3，天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的CD16 (Fcy RIII)，嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞上的⑶89 (Fe a RI)和⑶64 (Fe y RI)，和樹枝狀細(xì)胞上的DEC-205——的第二結(jié)合位點(diǎn)組成(Peipp和Valerius 2002, Wang等,2005)。除了優(yōu)選的效應(yīng)細(xì)胞群的特異性募集之外，當(dāng)所選擇的針對效應(yīng)細(xì)胞上觸發(fā)分子的結(jié)合位點(diǎn)不與Fe結(jié)合表位重疊時(shí)，雙特異性抗體避免與內(nèi)源性免疫球蛋白G(IgG)競爭。另外，單鏈Fv片段代替全長免疫球蛋白的使用防止分子結(jié)合至非細(xì)胞毒素細(xì)胞上的Fe受體，比如血小板和B細(xì)胞上的Fe YRII ;結(jié)合至不激活細(xì)胞毒素細(xì)胞的Fe受體，其包括多形核白細(xì)胞(PMN)上的Fe Y RIIIb ;和結(jié)合至抑制性的Fe-受體，比如單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞上的Fe y RIIb (Daeron 1997)。許多雙特異性單鏈Fv (bsscFv)融合蛋白是本領(lǐng)域已知的，其具有對白血病源的細(xì)胞的溶細(xì)胞活性，包括抗⑶19和⑶16的雙特異性雙抗體(Kipriyanov等，2002)、抗⑶19和0)16的串聯(lián)bsscFvs (Bruenke等,2005)和II類人白細(xì)胞抗原和Q)16 (Bruenke等，2004)。這些蛋白質(zhì)募集CD16陽性NK-細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，這是兩種重要的體內(nèi)效應(yīng)細(xì)胞群(Uchida等，2004)。包括MCSP (黑素瘤相關(guān)的硫酸軟骨素蛋白聚 糖)XCD28(0tz等，2009)以及CD19XCD3 (Bargou等，2008)構(gòu)建體的另一組分子募集溶細(xì)胞T細(xì)胞作為效應(yīng)器。⑶19 X⑶3分子是第一個(gè)已經(jīng)在I期臨床和正在進(jìn)行的II期研究中產(chǎn)生有希望的結(jié)果(Nagorsen等,2009)的重組雙特異性單鏈Fv。雖然bsscFvs和一些可選形式提供明顯的優(yōu)勢，但是它們?nèi)孕枰M(jìn)一步的改進(jìn)。決定雙特異性蛋白質(zhì)治療效果的關(guān)鍵參數(shù)是親和性、效價(jià)、穩(wěn)定性和尺寸。由于在轉(zhuǎn)化為重組scFV形式期間招致的損失，許多scFv片段展示比相應(yīng)親本單克隆抗體(mAbs)更低的親和性(Huston等，1988)。而且，由于解折疊和聚集的趨勢，scFvs常常顯示特征性降低的熱穩(wěn)定性，其是藥物批準(zhǔn)和臨床應(yīng)用的考慮因素(Willuda等，1999)。另外，最簡單形式的bsscFvs由通過約10至20個(gè)氨基酸的柔性連接體連接的兩個(gè)scFvs組成,其具有僅約50至60kDa的相對分子量(Mr)，并且Mr < 65kDa的蛋白質(zhì)被迅速地通過腎從血流中清除(Kipriyanov 等，1999,Huhalov 和 Chester 2004)。最后，因?yàn)?bsscFvs 缺乏 Fe 部分，所以它們也缺乏與嵌入Fe結(jié)構(gòu)域的新生FcR的相互作用結(jié)構(gòu)域。新生FcR有助于完整IgG的再循環(huán)(Raghavan等，1994)。從血液中迅速清除導(dǎo)致在腫瘤位點(diǎn)差的保留(Hu等，1996)。為克服這些問題，已經(jīng)做出了許多改進(jìn)。一個(gè)是通過體外誘變在scFv的Vh鏈和Vl鏈之間添加人工分子內(nèi)二硫鍵，稱為“二硫穩(wěn)定化” (Reiter等，1994,Bruenke等,2005)。該額外的鍵防止scFv解折疊和變性并導(dǎo)致穩(wěn)定性獲得增加(Reiter等，1994)。通過各種修飾已經(jīng)增加了雙特異性蛋白的尺寸，所述修飾包括聚乙二醇化(Kubetzko等,2006);添加另外的蛋白結(jié)構(gòu)域，比如人血清白蛋白(Huhalov和Chester 2004, Muller等,2007);或添加額外的scFv組分(Schoonjans等,2000)。這些修飾產(chǎn)生改善的血衆(zhòng)和體內(nèi)身體保留時(shí)間(Kontermann 2005)。通過雙特異性蛋白的scFv組分的體外親和性成熟實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的改進(jìn)(McCall等，2001)。親和性增加可增加完整抗體和雙特異性抗體的體外細(xì)胞毒素潛能(McCall等,2001, Tang等,2007)并有利于scFvs的體內(nèi)特異性腫瘤保留(Adams等，1998)。最后，通過包括對腫瘤細(xì)胞上靶抗原的第二或進(jìn)一步的結(jié)合位點(diǎn)而增加它們的效價(jià)，實(shí)現(xiàn)雙特異性蛋白的溶細(xì)胞潛能的重要改進(jìn)(Shahied等,2004)。已經(jīng)描述了具有增加的效價(jià)和增加的質(zhì)量的抗體源蛋白質(zhì)的許多不同形式，包括抗體-scFv融合體(Coloma和Morrison 1997)、微小抗體(minibodies) (Hu 等，1996, Shahied 等，2004)、Fab_scFv 融合體(Schoonjans等,2000)、多聚scFvs比如三抗體和四抗體(Todorovska等,2001)、串聯(lián)scFv雙抗體(Kipriyanov 等，1999)和二 -雙抗體(Lu 等，2003, Muller 和 Kontermann 2007)。W02009/007124描述了另外的形式，其通過提供新的單鏈構(gòu)建體克服bsscFv的限制。該分子由3個(gè)串聯(lián)共價(jià)連接的scFvs組成，2個(gè)對腫瘤細(xì)胞上的靶抗原具有特異性和I個(gè)對效應(yīng)細(xì)胞上的觸發(fā)分子具有特異性。稱為單鏈Fv三重抗體(triplebody) (sctb)的該 形式由于是單鏈多肽，不同于為多鏈構(gòu)建體的多聚scFvs、三鏈抗體(triabody)和四抗體(tetrabody)。盡管在開發(fā)治療相關(guān)的抗體構(gòu)建體中的上述優(yōu)勢，但目前沒有滿意的療法可用于治療急性骨髓性白血病以及骨髓增生異常綜合征。通過提供權(quán)利要求中表征的實(shí)施方式滿足了該需求。因此，本發(fā)明在第一實(shí)施方式中涉及具有對(a)⑶123 ;(b)⑶16和(C)⑶33結(jié)合特異性的分子。根據(jù)本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，結(jié)合特異性由優(yōu)選為模塊形式的分子的不同部分賦予。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，具有對CD123、CD16和CD33結(jié)合特異性的分子的那些部分具有蛋白質(zhì)性質(zhì)，例如多肽或在這些多肽中的氨基酸序列。這些氨基酸序列可以是多肽中的連續(xù)氨基酸序列?？蛇x地，來自多肽不同部分的氨基酸或氨基酸段(stretch)可賦予分子結(jié)合特異性。更優(yōu)選地，本發(fā)明的整個(gè)分子是多肽。如本文所使用的術(shù)語“多肽”描述氨基酸的線性分子鏈，包括單鏈蛋白或它們的片段，其包含超過30個(gè)氨基酸。因此，如在本發(fā)明中使用的術(shù)語“肽”描述包含至多30個(gè)氨基酸的氨基酸線性鏈。如根據(jù)本發(fā)明所使用的術(shù)語“(多)肽”指一組分子，其包括由至多30個(gè)氨基酸組成的肽組，以及由超過30個(gè)氨基酸組成的多肽組。此外，這種蛋白質(zhì)/多肽的肽模擬物也被本發(fā)明所包括，其中氨基酸(一個(gè)或多個(gè))和/或肽鍵(一條或多條)已經(jīng)被功能類似物替換。這些功能類似物包括除20種基因編碼的氨基酸之外的所有已知氨基酸，比如硒代胱氨酸。可交換使用的術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”也指天然修飾的多肽/蛋白質(zhì)，其中修飾是通過例如糖基化、乙?；?、磷酸化以及本領(lǐng)域熟知的類似修飾實(shí)現(xiàn)的。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“具有結(jié)合特異性”意思是本發(fā)明分子的部分(即其結(jié)合部分)結(jié)合至它們各自的靶標(biāo)，即抗原CD123、CD16和CD33。尤其優(yōu)選地，它們特異性地結(jié)合它們各自的靶標(biāo)。如根據(jù)本發(fā)明所使用，術(shù)語“特異性結(jié)合”和“特異性地結(jié)合”(具有與“特異性相互作用”相同的意思)意思是這些結(jié)合部分不與或基本上不與具有和靶抗原類似結(jié)構(gòu)的表位交叉反應(yīng)。例如，通過評估在常規(guī)條件下研究的一系列分子與感興趣表位的結(jié)合以及與許多或多或少(結(jié)構(gòu)上和/或功能上)密切相關(guān)的表位的結(jié)合，可測試所述一系列分子的交叉反應(yīng)。只有在其相關(guān)內(nèi)容(例如蛋白結(jié)構(gòu)的特異性基序)與感興趣的表位結(jié)合而不與或基本上不與任何其他表位結(jié)合的那些分子被認(rèn)為是對感興趣的表位是特異性的，并因此是根據(jù)本發(fā)明的分子。相應(yīng)的方法描述在例如Harlow和Lane“Antibodies, A LaboratoryManual，，，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 和 Harlow 和 Lane “UsingAntibodies:A Laboratory Manual，，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999。根據(jù)本發(fā)的一種示例性分子是結(jié)合CD16并特異性結(jié)合CD123和CD33的分子。因此，該優(yōu)選的分子結(jié)合CD123和CD33而沒有對其他靶抗原的任何交叉反應(yīng)，同時(shí)該分子可包括能夠結(jié)合其他靶抗原的CD16結(jié)合部分。這種CD16結(jié)合部分可以是，例如已知結(jié)合其他靶抗原比如例如⑶32、⑶64或新生Fe受體FcRn的免疫球蛋白G的Fe部分。根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的分子是特異性結(jié)合所有CD16、CD123和CD33并且不與任何其他抗原交叉反應(yīng)的分子。實(shí)現(xiàn)也對CD16特異性結(jié)合的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且例如在下面實(shí)施例中描述。對列在本發(fā)明分子的(a)至(C)的抗原具有結(jié)合特異性的本發(fā)明分子的結(jié)合部分可在所述分子中以任何順序排列，比如例如(a)-(b)-(c), (b)-(c)-(a), (c)-(a)-(b),(b)-(a)-(c)等。更優(yōu)選地，(a)至(C)的結(jié)合部分以所述的順序(例如對于蛋白質(zhì)序列，它們可以以(a)-(b)-(c)順序排列)以N末端至C末端方向，或可選地以C末端至N末端的方向排列。如上詳述的，在常規(guī)化學(xué)療法的初始病程之后的緩解階段中，患者骨髓中的胚細(xì)胞計(jì)數(shù)減少到總骨髓白細(xì)胞的約5%或更少。從化學(xué)療法幸存的細(xì)胞——“最小殘留病”細(xì)胞——富集在AML白血病干細(xì)胞(AML-LSC)中。這些關(guān)鍵腫瘤祖細(xì)胞的無效清除被認(rèn)為是在化學(xué)療法之后AML患者中見到大量復(fù)發(fā)的原因。這些腫瘤再生細(xì)胞因此具有重要的臨床意義，因?yàn)樗鼈兊奶禺愋郧宄ＷC提供最有利的時(shí)機(jī)以改善AML治療。AML干細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表面抗原的特征集合，包括⑶123、C型凝集素類分子-I (CLL-I)、⑶44、⑶33等等，并且用于 AML 病例 CD96 亞組(Jordan 等，2000, Bakker 等，2004, Jin 等,2006, Hauswirth 等，2007，Hosen 等，2007，Misaghian 等，2009)。約 60% 的 AML-LSC 表達(dá) CD33 并且約 70% 表達(dá)CD 123 (Taussig 等，2005, Hauswirth 等，2007)。⑶123——白細(xì)胞介素-3受體的a亞基(IL_3Ra)——在許多造血細(xì)胞上表達(dá)，包括大部分骨髓細(xì)胞，但也在B淋巴細(xì)胞的亞群體上表達(dá)。其不在外圍T細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞(NK-細(xì)胞)、血小板和紅細(xì)胞上表達(dá)(Moretti等，2001)。⑶123廣泛地在造血惡性腫瘤中表達(dá)，并也已經(jīng)在AML-LSC上檢測至Ij (Jordan等,2000, Munoz等，2001, Testa等,2004,Taussig等，2005，Jin等，2009)，同時(shí)它僅在正常造血干細(xì)胞中以低密度存在(Huang等，1999，Jin等，2009)。因此，⑶123與正常HSC相比較顯示在AML-LSC上4倍增加的表達(dá)，使其成為用于治療的尤其感興趣的靶標(biāo)(Jin等，2009)。⑶33是67kDa的細(xì)胞表面糖蛋白，其存在于超過80%的AML患者的胚細(xì)胞上和正常骨髓細(xì)胞上?？乖怀霈F(xiàn)在造血系統(tǒng)之外的組織上，但其被討論在正常造血干細(xì)胞的亞組中表達(dá)(HSC) (Dinndorf 等，1986, Grossbard 等，1992, Legrand 等，2000, Sievers 2001,Taussig 等，2005)。⑶16是IgG的親和力受體(Fe Y RIII)，其作為跨膜同種型組成性表達(dá)在NK-細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(⑶16a)的表面上，并且作為糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定的分子組成性表達(dá)在嗜中性粒細(xì)胞(CD16b)的表面上(Ravetch 和 Kinet, 1991 ;van deWinkel 和 Anderson,1991)。為了細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，CD16a需要與包含免疫受體酪氨酸基激活基序(ITAM)的FcRy鏈聯(lián)合，其觸發(fā)下游信號傳導(dǎo)。利用常規(guī)偶聯(lián)的經(jīng)CD16重定向NK-細(xì)胞的二特異性抗體的研究表明培養(yǎng)的惡性細(xì)胞和動物模型中的有效細(xì)胞溶解(de Palazzo等，1992 ；Hombach等，1993 ;Kipriyanov等,2002)。所以，啟動了用CD16定向的二特異性抗體的臨床試驗(yàn)(Weiner等1995 ；Hartmann等1997)。但是,雜合雜交瘤抗體的免疫原性，以及由于Fe-結(jié)構(gòu)域的存在引起的不期望的副作用，以及產(chǎn)生足夠量臨床級材料的困難限制了這些臨床試驗(yàn)。本發(fā)明分子通過使用雙重靶向方法能夠優(yōu)先靶向AML-LSC，⑶123作為主靶標(biāo)和CD33作為另外的用于治療AML的驗(yàn)證的靶抗原。本發(fā)明分子與CD16的特異性結(jié)合更進(jìn)一步允許募集效應(yīng)細(xì)胞，其能夠清除本發(fā)明分子靶向的AML白血病干細(xì)胞。實(shí)現(xiàn)的治療效果是通過抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC，也稱作“再定向溶胞作用”)直接清除腫瘤細(xì)胞以及由于它們?nèi)馨饔卯a(chǎn)生AML細(xì)胞的凋亡片段的結(jié)果。這些片段隨后被吞噬細(xì)胞攝取并加工以及被CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞再次呈遞。兩種機(jī)制幫助建立體液抗腫瘤抗體的第二效價(jià)(secondary titer)和通過⑶8+細(xì)胞毒素T-淋巴細(xì)胞的細(xì)胞抗腫瘤響應(yīng)。
W02009/007124描述提供三重抗體的一般概念。但是，該文件未公開CD123、CD33和CD16的具體組合以實(shí)現(xiàn)AML-LSC的靶向清除，用于治療AML和骨髓增生異常綜合征。據(jù)發(fā)明人所知，結(jié)合AML細(xì)胞上的⑶123和⑶33和效應(yīng)細(xì)胞上的⑶16的三特異性抗體或重組三特異性抗體衍生物迄今都未被報(bào)道，并且不可能預(yù)期該具體組合在AML和骨髓增生異常綜合征的治療中將導(dǎo)致成功靶向AML-LSC。但是，本發(fā)明的三重抗體提供卓越的靶細(xì)胞清除，如在下面實(shí)施例6中所顯示的。對在AML腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原(即⑶123和⑶33)的結(jié)合特異性和對效應(yīng)細(xì)胞抗原(即CD16)的結(jié)合特異性的至少2 I的比例是本發(fā)明的優(yōu)勢特征。對在白血病腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原更高分?jǐn)?shù)的結(jié)合特異性具有增加對腫瘤細(xì)胞的親和性的作用。因此，靶向在白血病腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原的更多數(shù)量的抗原結(jié)合部分增加本發(fā)明分子在其與效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合之前，與白血病腫瘤細(xì)胞結(jié)合的可能性。由于下列原因，在效應(yīng)細(xì)胞之前募集白血病腫瘤細(xì)胞是有優(yōu)勢的在治療背景下，一旦具有一個(gè)或兩個(gè)特異性的免疫球蛋白或天然觸發(fā)分子與在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的效應(yīng)細(xì)胞表面上表達(dá)的各自抗原結(jié)合，通常誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。從而，效應(yīng)細(xì)胞不能區(qū)分抗體分子是否與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，因此在抗體衍生物未與白血病腫瘤細(xì)胞結(jié)合的情況下導(dǎo)致非特異性免疫應(yīng)答。相反，對白血病腫瘤抗原特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和對效應(yīng)細(xì)胞特異性的結(jié)合位點(diǎn)的2I的比例加強(qiáng)了本發(fā)明分子在其與效應(yīng)細(xì)胞的抗原結(jié)合之前與白血病腫瘤細(xì)胞結(jié)合的可能性。作為對白血病腫瘤細(xì)胞增加的親和力(avidity)的結(jié)果，延長了在腫瘤細(xì)胞上的細(xì)胞表面保留時(shí)間，因此產(chǎn)生改善的靶向潛能。這顯著減少了非特異性免疫應(yīng)答的量并可因此減少之前已知分子的嚴(yán)重副作用。在本發(fā)明分子的優(yōu)選實(shí)施方式中，結(jié)合特異性由Vh和\結(jié)構(gòu)域賦予。根據(jù)本領(lǐng)域提供的定義使用術(shù)語“VH結(jié)構(gòu)域”和結(jié)構(gòu)域”。因此，它們分別指免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)(\)。一般而言，V1^P'結(jié)構(gòu)域的每個(gè)包含3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其中CDR是主要負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的高度可變區(qū)。根據(jù)本發(fā)明，Vl或Vh結(jié)構(gòu)域的每個(gè)結(jié)構(gòu)域可由至少一個(gè)CDR、優(yōu)選地至少兩個(gè)或優(yōu)選地所有3個(gè)CDR組成，只要所得的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域發(fā)揮期望的功能，即與其靶抗原特異性結(jié)合。優(yōu)選地，靶抗原是人抗原，即人⑶123、人⑶33和人⑶16。將理解，結(jié)合特異性可獨(dú)立地僅通過Vh或僅通過\結(jié)構(gòu)域，或通過Vh和\結(jié)構(gòu)域二者的組合由于每個(gè)對(a)、(b)和(C)的結(jié)合特異性賦予。優(yōu)選地，通過V1^P'結(jié)構(gòu)域賦予的結(jié)合特異性是通過組合即Vh和'結(jié)構(gòu)域二者由于每個(gè)對(a)、(b)和(C)的結(jié)合特異性賦予。在本發(fā)明分子的另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，結(jié)合特異性由配體、anticalins (抗運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白)、adnectins、aff ibodies (親和體)或 DARPins 賦予。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“配體”指能夠與各自的靶標(biāo)，即⑶123、⑶16或⑶33結(jié)合并形成復(fù)合體的分子。該術(shù)語也指其片段和/或衍生物。對于CD123天然發(fā)生的配體是白細(xì)胞介素-3 (IL-3)，而對于CD16天然發(fā)生的配體是免疫球蛋白G的Fe部分和對于CD33天然發(fā) 生的配體是唾液酸，優(yōu)選N-乙?；窠?jīng)氨酸-a 6-半乳糖-P 4-N-乙酰葡糖胺。結(jié)合本發(fā)明的術(shù)語“其片段和/或衍生物”指分子的片段和/或分子的修飾形式，其仍然具有全長分子的一種或多種生物功能。尤其，如在本實(shí)施方式中設(shè)想的配體的片段和/或衍生物能夠結(jié)合各自的抗原CD123、CD16或CD33。最優(yōu)選地，配體的片段和/或衍生物能夠特異性結(jié)合各自的抗原⑶123、⑶16或⑶33。本領(lǐng)域熟知，功能性分子，比如例如(多)肽或糖類可被切割以產(chǎn)生具有改變的或基本上未改變的功能的片段。這種切割可包括從(多)肽中去除給定數(shù)量的N端和/或C端氨基酸。另外或可選地，許多內(nèi)部(非末端)氨基酸可被去除，條件是獲得的(多)肽具有全長(多)肽的功能。從末端和/或內(nèi)部區(qū)域去除的所述氨基酸的數(shù)目可以是1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50或超過50。根據(jù)本發(fā)明，I和50之間的任何其他數(shù)目也可被特意想到。類似地，糖類的片段包括在末端具有缺失的那些以及具有內(nèi)部缺失的那些。用于確定(多)肽或糖類這種功能性結(jié)構(gòu)域的手段和方法是本領(lǐng)域熟知的并包括實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)手段。實(shí)驗(yàn)手段包括系統(tǒng)性產(chǎn)生缺失突變體和其在試驗(yàn)中對于上面本領(lǐng)域已知的期望功能的評估。生物信息學(xué)手段包括數(shù)據(jù)庫檢索。合適的數(shù)據(jù)庫包括蛋白序列數(shù)據(jù)庫以及用于糖生物學(xué)的數(shù)據(jù)庫，如，例如在von der Lieth (2003)中描述的。在該情況下，顯著擊中(significant hits)的多重序列比對指示結(jié)構(gòu)域邊界,其中結(jié)構(gòu)域(一個(gè)或多個(gè))由與序列的剩余部分相比展示升高水平序列保守的該/那些子序列組成。進(jìn)一步合適的數(shù)據(jù)庫包括保守蛋白結(jié)構(gòu)域統(tǒng)計(jì)模型的數(shù)據(jù)庫，比如Sanger Institute, UK維護(hù)的Pfam(www. sanger. ac. uk/Software/Pfam)。此外本領(lǐng)域已知，分子可被修飾以便獲得衍生物。這種修飾包括，但不限于(i)羧基的酯化作用，或(ii)羥基與羧酸的酯化作用，或(iii)羥基酯化成例如磷酸酯、焦磷酸酯或硫酸酯或半琥珀酸酯，或(iv)形成藥學(xué)上可接受的鹽，或(V)引入親水部分，或(vi)在芳族(aromates)或側(cè)鏈上取代基的引入/交換，取代基模式的改變，或(vii)通過引入電子等排或生物電子等排部分的修飾，或(viii)合成同系物，或(ix)引入分枝側(cè)鏈，或(X)烷基取代基轉(zhuǎn)化成環(huán)狀類似物，或(Xi)羥基衍生為縮酮、縮醛，或(Xii)N-乙酰化成酰胺、氨基甲酸苯酯，或(xiii)合成曼尼希堿、亞胺，或(xiv)酮或醛轉(zhuǎn)化成席夫堿、肟、縮醛、縮酮、烯醇酯、曝唑烷、噻唑烷或其組合。上面敘述的許多步驟在本領(lǐng)域一般是已知的。它們包括或依賴于定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)分析(Kubinyi, “Hausch-分析 and Related Approaches，，，VCH Verlag, ffeinheim,1992年)、組合生物化學(xué)、經(jīng)典化學(xué)和其他(見，例如，Holzgrabe和Bechtold, DeutscheApotheker Zeitungl40 (8), 813-823 頁，2000 年)。如本文所使用的，術(shù)語“anticalins”指源自脂籠蛋白的工程蛋白(Beste等，1999 ;Gebauer和Skerra, 2009)。Anticalins具有8鏈3 -桶,其形成脂籠蛋白之間高度保守的核心單元并通過在開口端4個(gè)結(jié)構(gòu)上可變化的環(huán)天然形成配體的結(jié)合位點(diǎn)。雖然Anticalins不與IgG超家族同源,但是顯示目前認(rèn)為典型的抗體結(jié)合位點(diǎn)的特征(i)由于序列變化，高度的結(jié)構(gòu)可塑性和(ii)提高的構(gòu)象柔性，允許誘導(dǎo)配合具有不同形狀的靶標(biāo)。根據(jù)本發(fā)明的“adnectins” (也稱作單抗體)基于人纖連蛋白III的第10細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(10Fn3),其采取具有2-3個(gè)暴露環(huán)的94個(gè)殘基的Ig樣b_夾層折疊(sandwichfold),但缺少中心二硫橋(Gebauer 和 Skerra, 2009)。根據(jù)本發(fā)明的“aff ibodies”基于葡萄球菌A蛋白的Z-結(jié)構(gòu)域——在其2個(gè)a_螺旋上提供界面的約58個(gè)殘基的3-螺旋束(Gebauer和Skerra，2009)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“DARPins”指設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域(166個(gè)殘基)，其提供通常起源于3個(gè)重復(fù)b-轉(zhuǎn)角的剛性界面。DARPins通常攜帶對應(yīng)人工共有序列的3個(gè)重復(fù)，借此每個(gè)重復(fù)的6個(gè)位置被隨機(jī)化。因此，DARPins缺乏結(jié)構(gòu)柔性(Gebauer和Skerra，2009)。所有上述結(jié)合分子是技術(shù)人員熟知的并根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)和技術(shù)人員的一般知識定義。在本發(fā)明分子的優(yōu)選實(shí)施方式中，賦予對(a)、(b)和(C)特異性的結(jié)合部分是多肽。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明分子是單多肽鏈。在本發(fā)明分子另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，賦予對(a)、(b)和(C)特異性的分子的結(jié)合部分通過連接體連接。如根據(jù)本發(fā)明所使用的，術(shù)語“連接體”涉及氨基酸序列(即肽連接體)以及非肽連接體，其分開賦予對(a)CD123、(b)CD16和(c)CD33特異性的本發(fā)明分子的結(jié)合部分。如本發(fā)明設(shè)想的肽連接體是至少I個(gè)氨基酸長度的(多)肽連接體。優(yōu)選地，連接體長度為1-100個(gè)氨基酸。更優(yōu)選地，連接體長度為5-50個(gè)氨基酸并甚至更優(yōu)選地，連接體長度為10-20個(gè)氨基酸。分開本發(fā)明分子的3個(gè)結(jié)合部分的連接體可具有相同或不同的長度并且可包括相同或不同的氨基酸序列。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，連接體具有相同的長度和相同的氨基酸序列。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，分開本發(fā)明分子的3個(gè)結(jié)合部分的連接體長度和/或氨基酸序列彼此不同。此外，連接體的性質(zhì)，即長度和/或氨基酸序列可改變或增加分子的穩(wěn)定性和/或溶解度。連接體的長度和序列取決于本發(fā)明分子的各自結(jié)合部分的組成。技術(shù)人員知道測試不同連接體適合性的方法。例如，通過比較本發(fā)明分子的結(jié)合部分的結(jié)合親和性可容易地測試分子的性質(zhì)。在本發(fā)明三特異性分子的情況下，對于每個(gè)結(jié)合部分可進(jìn)行各自測量。所得分子的穩(wěn)定性可使用基于流式細(xì)胞術(shù)的方法測量以在人血清中37°C下溫育數(shù)個(gè)時(shí)間段后確定分子的殘留結(jié)合能力。其他合適的測試可以在例如 Bruenke 等(2005)中發(fā)現(xiàn)。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，連接體是使用例如氨基酸丙氨酸和絲氨酸或甘氨酸和絲氨酸的柔性連接體。優(yōu)選地，連接體序列是(Gly4Ser)4,或(Gly4Ser)3。技術(shù)人員將意識到，當(dāng)本發(fā)明分子是單多肽鏈時(shí)，連接體是肽連接體。如根據(jù)本發(fā)明所使用的，術(shù)語“非肽連接體”指具有兩個(gè)或多個(gè)反應(yīng)基但不包括如上所定義的肽連接體的連接基團(tuán)。例如，非肽連接體可以是在兩端都具有反應(yīng)基的聚合物，所述反應(yīng)基單獨(dú)地結(jié)合至本發(fā)明分子的結(jié)合部分的反應(yīng)基，例如，氨基末端、賴氨酸殘基、組氨酸殘基或半胱氨酸殘基。聚合物的反應(yīng)基包括醛基、丙醛基、丁醛基、馬來酰亞胺基、酮基、乙烯基砜基、硫醇基、酰肼基、羰基二咪唑(CDI)基、碳酸硝基苯酯(NPC)基團(tuán)、三氟乙基磺酸酯基(trysylate group)、異氰酸酯基團(tuán)和琥拍酰亞胺衍生物。琥拍酰亞胺衍生物的例子包括琥珀亞胺基丙酸酯(SPA)、琥珀亞胺基丁酸(SBA)、琥珀亞胺基羧甲基酯(SCM)、琥珀亞胺基琥珀酰胺(SSA)、琥珀亞胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀亞胺基碳酸酯和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。在非肽聚合物兩端的反應(yīng)基可以相同或不同。例如，非肽聚合物可在一端具有馬來酰亞胺基并且在另一端具有醛基。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中,連接體是肽連接體。本發(fā)明在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中涉及本發(fā)明的分子，其中所述分子包括第一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其包括與Vh結(jié)構(gòu)域連接的\結(jié)構(gòu)域，其中該免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域與CD123特異性結(jié)合；第二免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其包括與Vh結(jié)構(gòu)域連接的'結(jié)構(gòu)域，其中該免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域與CD16特異性結(jié)合；和第三免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其包括與Vh結(jié)構(gòu)域連接的\結(jié)構(gòu) 域，其中該免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域與CD33特異性結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，與CD123特異性結(jié)合的所述第一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域涉及在本發(fā)明上述分子的(a)中陳述的結(jié)合特異性。類似地，與CD16特異性結(jié)合的所述第二免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域涉及在本發(fā)明上述分子的(b)中陳述的結(jié)合特異性，并且與CD33特異性結(jié)合的所述第三免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域涉及在本發(fā)明上述分子的(c)中陳述的結(jié)合特異性。如根據(jù)本發(fā)明所使用的術(shù)語“包括與Vh結(jié)構(gòu)域連接的\結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域”指免疫球蛋白的單鏈片段可變結(jié)構(gòu)域(scFv)，已經(jīng)顯示其對于結(jié)合它們的抗原是必要的和足夠的。\結(jié)構(gòu)域與Vh結(jié)構(gòu)域連接，即它們直接或通過連接體彼此連接。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明分子可包括源自單個(gè)物種的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，但也可以是嵌合的或人源化的分子。本發(fā)明分子的(a)至(C)的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域比如可以以任何順序排列，例如(a)-(b)-(c), (b)-(c)-(a), (c)-(a)-(b), (b)-(a)-(c)等。更優(yōu)選地，(a)至(c)的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以所敘述的順序(即(a)-(b)_(c))以N末端至C末端方向，或可選地以C末端至N末端方向排列。優(yōu)選地，(a)至(C)的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以所敘述順序以N末端至C末端方向排列。\和Vh結(jié)構(gòu)域可在免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域中這樣排列以便\結(jié)構(gòu)域位于Vh結(jié)構(gòu)域的N-或C端。因此，在編碼本發(fā)明分子的核酸分子中，編碼\結(jié)構(gòu)域的核酸序列可位于編碼Vh結(jié)構(gòu)域的核酸序列的5’或3’。技術(shù)人員能夠確定Vh和\結(jié)構(gòu)域的哪種排列更適合特異性的scFv。優(yōu)選地，Vl結(jié)構(gòu)域位于Vh結(jié)構(gòu)域的N端。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，至少一個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域包括能夠形成分子內(nèi)二硫橋的至少兩個(gè)半胱氨酸殘基。根據(jù)本發(fā)明，與感興趣抗原結(jié)合的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域可通過形成至少一個(gè)分子內(nèi)二硫橋而被穩(wěn)定。合適的半胱氨酸殘基可天然存在于免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域中或可通過將合適的氨基酸突變成半胱氨酸而被引入免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。當(dāng)設(shè)計(jì)具有人工半胱氨酸橋的修飾抗體時(shí)，必須滿足下列條件。第一，二硫橋應(yīng)當(dāng)連接Fv結(jié)構(gòu)上保守區(qū)域即在免疫球蛋白的％和'區(qū)中的氨基酸。換句話說，根據(jù)本發(fā)明的方法，二硫橋在免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(a)至(C)的一個(gè)內(nèi)的Vh的半胱氨酸和'的半胱氨酸之間形成。二硫橋可在這些免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的超過一個(gè)中形成，但是，不在不同的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域之間形成。此外，Vh和'結(jié)構(gòu)域之間的距離應(yīng)當(dāng)足夠小以使得能夠形成二硫橋，而不在Fv分子中產(chǎn)生不利的應(yīng)變(strain)。最后，二硫橋應(yīng)當(dāng)足夠遠(yuǎn)離⑶R以便不干擾抗原結(jié)合。結(jié)果，被引入以形成二硫橋的半胱氨酸應(yīng)當(dāng)在大部分抗體中結(jié)構(gòu)上保守的位置上連接Vh和\區(qū)的⑶R的Fv框架區(qū)域中。Glockshuber 等(1990)、Brinkmann 等(1993)和 Reiter 等(1994)陳述了這些標(biāo)準(zhǔn)并成功建立了第一個(gè)二硫穩(wěn)定的Fv抗體。本發(fā)明分子的氨基酸序列的突變可例如根據(jù)Reiter等(1994)以堿基三聯(lián)體在\結(jié)構(gòu)域的位置100或在Vh結(jié)構(gòu)域的位置44引入編碼所述分子的核酸分子中，以便它們編碼半胱氨酸殘基。所有的位置根據(jù)Kabat編碼(Kabat等，1991)。將突變引入核酸分子的手段是技術(shù)人員熟知的并可例如從Sambrook和 Russell^Molecular cloning,A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory,N. Y. (2001) ^PAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green PublishingAssociates和Wiley Interscience,N. Y. (2001)獲取。優(yōu)選地，二硫橋在根據(jù)本發(fā)明分子的(b)的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的Vh中的半胱氨酸和\區(qū)中的半胱氨酸之間形成。如已經(jīng)在W02009/007124中公開的，之前已經(jīng)顯示將二硫橋引入scFv的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域大大增加了這些分子的穩(wěn)定性，而不影響它們的特異性或降低它們的親和性和功能性，而且不損失分子的溶解性。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明分子包括至少一個(gè)連接體，其將至少一Avh結(jié)構(gòu)域與\結(jié)構(gòu)域分開或?qū)⒅辽僖粋€(gè)\結(jié)構(gòu)域與Vh結(jié)構(gòu)域分開。將一個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的Vh和\結(jié)構(gòu)域分開的連接體和將不同免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域分開的連接體可具有相同的或不同的長度，并可進(jìn)行選擇以包含相同或不同的組成，例如它們可包括相同或不同的氨基酸序列或非肽聚合物。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，連接體具有相同的長度和相同的組成。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，將不同免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域分開的連接體與將免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)％和\區(qū)分開的連接體的長度和/或組成不同。例如，前者可更長并進(jìn)行設(shè)計(jì)以便促進(jìn)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域朝向彼此的柔性或有助于分子的正確折疊和/或增強(qiáng)一個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域與其靶抗原的親和性。此外，連接體的性質(zhì)即長度和/或組成可改變或增強(qiáng)分子的穩(wěn)定性和/或溶解性。如上所提到，連接體的長度和序列取決于形成免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的各自V1^P'結(jié)構(gòu)域的組成。例如，從本發(fā)明多肽的N末端開始，如果Vh結(jié)構(gòu)域在\結(jié)構(gòu)域之后，則將一個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的V區(qū)分開的20個(gè)氨基酸的連接體可以是最佳的。相反，如果\結(jié)構(gòu)域在Vh結(jié)構(gòu)域之后，則各自的連接體可具有15個(gè)氨基酸的最佳長度。不希望被任何科學(xué)理論束縛，認(rèn)為這些不同可能由于空間原因，導(dǎo)致不同長度的連接體促進(jìn)具有不同V結(jié)構(gòu)域排列的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的正確折疊。技術(shù)人員知道測試在免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)或之間不同連接體合適性的方法，例如通過使用上述任何方法。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，至少兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域通過使用例如氨基酸丙氨酸和絲氨酸或甘氨酸和絲氨酸的柔性連接體進(jìn)行融合。優(yōu)選地，連接體序列是(Gly4Ser)4或(Gly4Ser)3O在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)或之間的至少一個(gè)Vh和\結(jié)構(gòu)域或\和Vh結(jié)構(gòu)域之間不存在連接體。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所有可變結(jié)構(gòu)域通過連接體融合。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明分子進(jìn)一步包括至少一個(gè)另外的(多)肽。優(yōu)選地，另外的(多)肽與免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域不相關(guān)并可以是例如標(biāo)簽或適合改 善本發(fā)明多肽性能的功能性(多)肽。標(biāo)簽可以是例如Str印-標(biāo)簽、His-標(biāo)簽、Myc-標(biāo)簽或Flag-標(biāo)簽。功能性的(多)肽是例如K分泌前導(dǎo)肽、人血清白蛋白(hsa)或其片段、能夠與hsa或其他血清蛋白結(jié)合的(多)肽；能夠與新生Fe受體(FcRn)結(jié)合的(多)肽、人肌肉醛縮酶(hma)或其片段、CD8鉸鏈區(qū)、免疫球蛋白恒定區(qū)、白細(xì)胞介素_2、白細(xì)胞介素-15和白細(xì)胞介素-18、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)、粒細(xì)胞刺激因子(G-CSF)或提供至少一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的(多)肽。術(shù)語“其片段”是如上所定義。尤其是，如在該實(shí)施方式中想到的(多)肽的片段能夠增加本發(fā)明抗體衍生物的穩(wěn)定性和/或血清半衰期。本發(fā)明核酸分子進(jìn)一步編碼的一些(多)肽可有助于純化重組表達(dá)的多肽，例如各種標(biāo)簽。添加標(biāo)簽和/或其他(多)肽至被本發(fā)明核酸分子編碼的多肽的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并在上述引文例如Sambrook，2001中描述。 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，第一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域包括選自SEQ ID N0s:2、4、
6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 和 26 的氨基酸序列。在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，第一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列，其表示CD123特異性scFv的優(yōu)選形式。在本發(fā)明另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明分子具有在SEQ ID NO: 28中顯示的氨
基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼本發(fā)明分子的核酸分子。核酸分子可編碼整個(gè)分子，即分子是單鏈多肽的情況，或可選地，可編碼本發(fā)明分子的單個(gè)結(jié)合部分，其中這些結(jié)合部分具有蛋白質(zhì)性質(zhì)。在這些結(jié)合部分表達(dá)后，它們經(jīng)由比如非共價(jià)鍵，例如氫鍵、離子鍵、范德華力或疏水相互作用或經(jīng)由比如共價(jià)鍵，例如二硫鍵可形成本發(fā)明分子。優(yōu)選地，本發(fā)明核酸分子編碼的多肽是單鏈多肽。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“核酸分子”定義由超過30個(gè)核苷酸組成的線性分子鏈。本文指定為“核酸分子”的分子基團(tuán)也包括全部的基因。根據(jù)本發(fā)明，“核酸分子”包括DNA，比如例如cDNA或基因組DNA ;和RNA，例如mRNA。進(jìn)一步包括的是本領(lǐng)域已知的核酸模擬分子，比如例如DNA或RNA的合成的或半合成的衍生物和混合的聚合物。根據(jù)本發(fā)明的這種核酸模擬分子或核酸衍生物包括磷硫酰核酸、氨基磷酸酯(phosphoramidate)核酸、2’_0_甲氧基乙基核糖核酸、嗎啉代核酸、己糖醇核酸(HNA)和鎖定核酸(LNA)(見&^38吐和(0代7，016111 Biol 2001，8:1)。LNA 是 RNA 衍生物，其中核糖環(huán)被2’ -氧和4’ -碳之間的亞甲基鍵合約束。它們可包含另外的非天然的或衍生的核苷酸堿基，如將被本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識到的。本發(fā)明此外考慮與上述定義的核酸分子互補(bǔ)的核酸分子以及在嚴(yán)格條件下與其雜交的核酸分子。 本領(lǐng)域熟知如何用核酸分子進(jìn)行雜交試驗(yàn)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道他/她必須使用什么樣的雜交條件以使得成功雜交。合適的雜交條件的建立參考標(biāo)準(zhǔn)教科書，比如 Sambrook, Russell^Molecular Cloning,A Labouraory Manual", Cold Spring HarborLaboratory, N. Y0 (2001) ；Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology",Green Publishing Associates 和 Wiley Interscience, N. Y. (1989),或 Higgins 和 Hames(Eds. )"Nucleic acid hybridization, a practical approach〃IRL Press Oxford,Washington DC, (1985)?！皣?yán)格條件”指下述雜交條件，其使得能夠與本發(fā)明核酸分子或其部分雜交的核酸分子與這些靶序列以比與其他序列雜交更大可檢測程度(例如超過背景至少2倍)進(jìn)行雜交。嚴(yán)格條件是序列依賴性的并根據(jù)環(huán)境而不同。通過控制雜交條件和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可鑒定與各自探針，即本發(fā)明核酸分子具有至少90%的序列同一性，更優(yōu)選地95%，比如98%和更優(yōu)選地100%的序列同一性的靶序列(高度嚴(yán)格的雜交條件)?？蛇x地，嚴(yán)格條件可被調(diào)整以允許更高程度的序列錯(cuò)配(低嚴(yán)格雜交條件)。這種高度嚴(yán)格的和低嚴(yán)格的雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。本文上面敘述的實(shí)施方式優(yōu)選地指高度嚴(yán)格條件。例如，高度嚴(yán)格的雜交條件包含例如在4XSSC(600mM NaCl，60mM檸檬酸鈉)中在65°C下溫育過夜，隨后在65°C下以0. I X SSC洗滌I小時(shí)?？蛇x地，高度嚴(yán)格的雜交條件可包括在42°C下在包括下列的溶液中溫育，隨后用例如0. 1-0. 5XSSC在約55-65°C下洗滌約5至20分鐘，所述溶液包括50%甲酰胺、5 X SSC (750mM NaCl、75mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH
7.6) ,5 XDenhardtJ s雜交溶液、10%硫酸葡聚糖和20 y g/ml變性的、剪切蛙魚精子DNA。主要通過操縱甲酰胺濃度(較低的甲酰胺百分比產(chǎn)生降低的嚴(yán)格性)、鹽條件或溫度實(shí)現(xiàn)雜交嚴(yán)格性的變化。例如，較低的嚴(yán)格條件包括在4XSSC中在50°C下溫育過夜或在包括下列的溶液中在37°C下溫育過夜6x SSPE (20XSSPE=3M NaCl ；0. 2M NaH2PO4 ；0.02M EDTA，pH 7. 4),0. 5% SDS、30% 甲酰胺、lOOmg/ml 蛙魚精子封閉 DNA ;隨后用 I X SSPE、
0.1% SDS在50°C下洗滌。另外，為實(shí)現(xiàn)甚至更低的嚴(yán)格性，嚴(yán)格的雜交后可以以更高的鹽濃度(例如5XSSC)進(jìn)行洗滌。眾所周知，上面條件的變化可通過包括和/或替換另一封閉劑實(shí)現(xiàn)。典型的封閉劑包括Denhardt’ s試劑、BL0TT0、肝素、變性的蛙魚精子DNA和商業(yè)上可得的專用制劑。因?yàn)橄嗳菪缘膯栴}，包括特異性封閉劑可能需要修改上述雜交條件。這種修飾可通常由技術(shù)人員毫不費(fèi)力地實(shí)現(xiàn)。雜交復(fù)合體可在溶液中(例如，Cot或Rot分析)或在存在于溶液中的一條核酸序列和固定在固體載體(例如，細(xì)胞已經(jīng)固定在其上的，例如薄膜、濾膜、芯片、針或載玻片)上的另一條核酸序列之間形成。在本發(fā)明核酸分子的優(yōu)選實(shí)施方式中，核酸分子包括⑴如在SEQ ID N0:27中顯示的核酸序列；(ii)編碼SEQ ID N0:28中顯示的氨基酸序列的核酸序列；或(iii)關(guān)于
(i)或(ii)的核酸分子簡并的核酸序列。本發(fā)明也涉及包括本發(fā)明核酸分子的載體。優(yōu)選地，載體是質(zhì)粒、黏粒、病毒、噬菌體或例如在遺傳工程中常規(guī)使用的另外載體。本發(fā)明核酸分子可插入數(shù)種商業(yè)上可得的載體。非限制性的例子包括原核質(zhì)粒載體，比如pUC系列、pBluescript (Stratagene)、pET系列表達(dá)載體(Novagen)或pCRTOPO(Invitrogen)和與哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)相容的載體，如pREP(Invitrogen)、pSecTag2HygroC(Invitrogen)、pcDNA3(Invitrogen)、pCEP4 (Invitrogen)、pMCIneo (Stratagene)、pXTl (Stratagene)、pSG5 (Stratagene)、EB0_pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2_dhfr、pIZD35、pLXIN、pSIR (Clontech)、pIRES-EGFP (Clontech)、pEAK-10 (Edge Biosystems)pTriEx-Hygro (Novagen)和pCINeo (Promega)。適合畢赤酵母(Pichia pastoris)的質(zhì)粒載體的例子包含例如質(zhì)粒pA0815、pPIC9K 和 pPIC3. 5K (都來自 Intvitrogen)。上面提到的本發(fā)明核酸分子也可插入載體以便產(chǎn)生與另一種核酸分子的翻譯融合體。其他核酸分子可編碼例如可增加本發(fā)明核酸分子編碼的蛋白的溶解性和/或有助于其純化的(多)肽。非限制性例子包括pET32、pET41、pET43(NOVagen)。載體也可包含另外的 可表達(dá)的多核苷酸，其編碼一種或多種蛋白伴侶以有助于正確的蛋白折疊。合適的細(xì)菌表達(dá)宿主包含，例如源自 BL21 (比如 BL21 (DE3)、BL21 (DE3) PlysS, BL21 (DE3) RIL、BL21 (DE3)PRARE)或Rosetta 的菌株。對于載體修飾技術(shù),見上述引文中的Sambrook和Russel,2001。一般而言，載體可包含一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)(ori)和遺傳系統(tǒng)用于克隆或表達(dá)，一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記用于宿主中的選擇，例如，抗生素抗性，和一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒。合適的復(fù)制起點(diǎn)(ori)包括，例如，ColE1、SV40病毒和M 13復(fù)制起點(diǎn)。典型的哺乳動物表達(dá)載體包含調(diào)節(jié)mRNA轉(zhuǎn)錄起始的啟動子元件、蛋白編碼序列和終止轉(zhuǎn)錄體轉(zhuǎn)錄和多聚腺苷酸化所需要的信號。而且，也可包括，比如復(fù)制起點(diǎn)、抗藥基因、調(diào)節(jié)子(作為誘導(dǎo)型啟動子的一部分)的元件。Iac啟動子是典型的可用于原核細(xì)胞的誘導(dǎo)型啟動子，其可使用乳糖類似物異丙基硫醇-b_D-半乳糖苷(“IPTG”)誘導(dǎo)。對于重組體表達(dá)，抗體片段可連接在例如在周質(zhì)中引導(dǎo)重組體蛋白的PelB前導(dǎo)信號和稱作pHEN4的噬菌?；騃II之間(Ghahroudi等1997中描述)。其他元件可包括增強(qiáng)子、Kozak序列和在間插序列，在其兩側(cè)為供體和受體位點(diǎn)，用于RNA剪接。用來自SV40的早期和晚期啟動子，來自逆病毒，例如RSV、HTLVI、HIVI的長末端重復(fù)(LTR)，和巨細(xì)胞病毒(CMV)的早期啟動子可實(shí)現(xiàn)高度有效的轉(zhuǎn)錄。但是，也可使用細(xì)胞元件(例如，人肌動蛋白啟動子)。用于實(shí)施本發(fā)明的合適的表達(dá)載體包括，例如載體，比如pSVL和pMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden)、pRSVcat (ATCC 37152)、pSV2dhfr (ATCC 37146)和 pBC12MI (ATCC67109)。與可選擇的標(biāo)記，比如用于真核細(xì)胞的dhfr、gpt、新霉素、潮霉素基因或用于在大腸桿菌(E. coli)和其他細(xì)菌中培養(yǎng)的四環(huán)素、卡那霉素或氨芐青霉素抗性基因的共轉(zhuǎn)染使得能夠鑒定和分離轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的核酸也可擴(kuò)增以表達(dá)大量編碼的(多)肽。DHFR(二氫葉酸還原酶)標(biāo)記可用于開發(fā)攜帶數(shù)百或甚至數(shù)千感興趣基因拷貝的細(xì)胞系。另一個(gè)有用的選擇標(biāo)記是酶，谷氨酰胺合成酶(GS) (Murphy等，1991 ；Bebbington等，1992)。使用這些標(biāo)記,哺乳動物細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中生長并選擇具有最高抗性的細(xì)胞。允許在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)的可能的調(diào)節(jié)元件包括,例如，lac、trp或tac啟動子、大腸桿菌中的lacUV5或trp啟動子,并且允許在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)元件的例子(更優(yōu)選的實(shí)施方式)是酵母或CMV-(巨細(xì)胞病毒)中的AOXl或GALl啟動子、SV40-、RSV-啟動子(Rous肉瘤病毒)、gail0啟動子、人延長因子I a-啟動子、CMV增強(qiáng)子、CaM激酶啟動子、苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)多面體啟動子或哺乳動物和其他動物細(xì)胞中的珠蛋白內(nèi)含子。優(yōu)選的啟動子是天然免疫球蛋白啟動子。除了負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄起始的元件之外，這種調(diào)節(jié)元件在多聚核苷酸的下游也可包括轉(zhuǎn)錄終止信號，比如SV40-聚-A位點(diǎn)或tk-聚-A位點(diǎn)或SV40、IacZ和AcMNPV多面體多聚腺苷酸化信號。載體中插入的編碼序列可例如通過標(biāo)準(zhǔn)方法合成，或從天然源分離或半合成產(chǎn)生，即通過結(jié)合化學(xué)合成和重組體技術(shù)?？墒褂么_定的方法進(jìn)行編碼序列與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件和/或與其他氨基酸編碼序列的連接。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知確保在原核生物或真核細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(表達(dá)盒的部分)。這些元件包含確保轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)節(jié)序列(例如，翻譯起始密碼子、啟動子、增強(qiáng)子和/或絕緣子)、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES) (Owens等，2001)和任選的聚A信號，其確保轉(zhuǎn)錄的終止和轉(zhuǎn)錄體的穩(wěn)定性。另外的調(diào)節(jié)元件可包括轉(zhuǎn)錄以及翻譯增強(qiáng)子和/或天然關(guān)聯(lián)的或異源啟動子區(qū)。優(yōu)選地，本發(fā)明核酸分子可操作地連接至這種表達(dá)控制序列，其允許在原核生物或真核細(xì)胞中表達(dá)。載體可進(jìn)一步包含作為進(jìn)一步調(diào)節(jié)元件的核苷酸序列編碼分泌信號。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這種序列。此外，根據(jù)使用的表達(dá)系統(tǒng)，能夠引導(dǎo)表達(dá)的多肽至細(xì)胞間隔的前導(dǎo)序列可添加至本發(fā)明多核苷酸的編碼序列。本領(lǐng)域熟知這種前導(dǎo)序列。特定設(shè)計(jì)的載體使得DNA能夠在不同的宿主，比如細(xì)菌-真菌細(xì)胞或細(xì)菌-動物細(xì)胞之間穿梭。根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體能夠引導(dǎo)本發(fā)明多核苷酸和編碼的酶的復(fù)制和表達(dá)。本領(lǐng)域已知包含所述調(diào)節(jié)元件的合適表達(dá)載體，比如Okayama-Berg cDNA表達(dá)載體pcDVl (Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNAl、pcDNA3、pSecTag2HygroC(Invitrogen,如在所附實(shí)施例中等所使用的)、pSPORTl (GIBCO BRL)或pGEMHE (Promega)、或原核表達(dá)載體，比如lambda gtll、pJOE、pBBRl_MCS或優(yōu)選地，pET載體(Novagen)。·如本文上面所述的本發(fā)明的核酸分子可被設(shè)計(jì)用于直接引入細(xì)胞或用于經(jīng)脂質(zhì)體、噬菌體載體或病毒載體(例如腺病毒、逆病毒)引入細(xì)胞。另外，桿狀病毒系統(tǒng)或基于痘苗病毒或塞姆利基森林(Semliki Forest)病毒的系統(tǒng)可用作本發(fā)明核酸分子的真核表達(dá)系統(tǒng)。源自病毒，比如逆病毒、痘苗病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒或牛乳頭瘤病毒的表達(dá)載體可用于將多核苷酸或載體輸送進(jìn)入靶標(biāo)細(xì)胞群。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可用于構(gòu)建重組病毒載體；見，例如，在上述引文Sambrook，2001和Ausubel，2001中描述的技術(shù)。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化的非人宿主?？赏ㄟ^將本發(fā)明載體引入宿主產(chǎn)生所述宿主，當(dāng)其存在時(shí)調(diào)節(jié)由載體編碼的多肽的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，宿主可以是用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)染的和/或表達(dá)本發(fā)明載體的轉(zhuǎn)基因非人動物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因動物是哺乳動物，例如倉鼠、牛、貓、豬、狗或馬。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，宿主是細(xì)胞，比如可以是細(xì)胞培養(yǎng)物一部分的分離的細(xì)胞。合適的原核宿主細(xì)胞包括例如下述種的細(xì)菌埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus),鏈霉菌屬(Streptomyces)和鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)。合適的真核宿主細(xì)胞是例如真菌細(xì)胞等；酵母，比如釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)或畢赤酵母(Pichia pastoris)或昆蟲細(xì)胞比如果妮屬(Drosophila) S2和灰翅夜蛾屬(Spodoptera) Sf9細(xì)胞和植物細(xì)胞以及哺乳動物細(xì)胞。本領(lǐng)域已知用于上述宿主細(xì)胞的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和條件。哺乳動物宿主細(xì)胞包括但不限于人Hela、HEK293、H9和Jurkat細(xì)胞、小鼠NIH3T3和C127細(xì)胞、COS UCOS 7和CVl、quail QC1-3細(xì)胞、小鼠L細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和鮑絲黑素瘤細(xì)胞(Bowes melanoma cell)。可選地,本發(fā)明重組多肽可在包含基因構(gòu)建體的穩(wěn)定細(xì)胞系中表達(dá)，所述基因構(gòu)建體包含整合入染色體的本發(fā)明的核酸分子或載體。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述細(xì)胞是初級細(xì)胞或初級細(xì)胞系。初級細(xì)胞是直接從生物體獲得的細(xì)胞。合適的初級細(xì)胞是，例如小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、小鼠初級肝細(xì)胞、心肌 細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞以及小鼠肌肉干細(xì)胞(衛(wèi)星細(xì)胞)和源自其的穩(wěn)定的、無限增殖化細(xì)胞系。本發(fā)明也涉及生產(chǎn)多肽的方法，其包括在合適的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞并分離產(chǎn)生的重組多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知用于培養(yǎng)原核或真核宿主的合適條件。例如，用于培養(yǎng)細(xì)菌的合適條件是使它們在通風(fēng)下、在Luria Bertani (LB)培養(yǎng)基中生長。為增加表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)率和溶解性，可用已知增強(qiáng)或有助于二者的合適添加劑緩沖或補(bǔ)充培養(yǎng)基。大腸桿菌可在4至約37°C下培養(yǎng),精確的溫度或溫度系列取決于待被過量表達(dá)的分子。一般而言，技術(shù)人員也明白這些條件可必須適合宿主的需要以及表達(dá)的多肽的要求。如果誘導(dǎo)型啟動子控制存在于宿主細(xì)胞中載體內(nèi)的本發(fā)明的核酸分子，則通過添加適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑可誘導(dǎo)多肽的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知合適的表達(dá)方案和策略。取決于細(xì)胞類型和其特異性要求，哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)可例如在RPMI或DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行，所述培養(yǎng)基包含10%(V/V)FCS、2mM L-谷氨酰胺和100U/ml青霉素/鏈霉素。細(xì)胞可保持在37 °C、5%C02、水飽和的氣氛中。昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)的合適培養(yǎng)基是例如TNM+10%FCS或SF900培養(yǎng)基。昆蟲細(xì)胞通常在27°C下作為粘附或懸浮培養(yǎng)物生長。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知真核細(xì)胞的合適表達(dá)方案并可從例如在上述引文Sambrook，2001中獲取。本領(lǐng)域熟知分離產(chǎn)生的多肽的方法并包括但不限于方法步驟比如離子交換層析、凝膠過濾層析(尺寸排阻層析)、親和層析、高壓液相色譜(HPLC)、反向HPLC、圓盤凝膠電泳或免疫沉淀，見，例如在上述引文Sambrook，2001中。本發(fā)明也涉及包括至少一種本發(fā)明分子，優(yōu)選本發(fā)明多肽、核酸分子，或本發(fā)明載體的診斷組合物。本發(fā)明分子增強(qiáng)的親和性和/或親和力使得其能夠用于診斷試驗(yàn)。例如，該分子可用作靈敏檢測試劑用于檢測AML-LSC，因?yàn)檫@些在細(xì)胞表面上表達(dá)⑶123和⑶33。尤其地，二硫鍵穩(wěn)定的⑶16特異性scFv (本文也稱作dsl6)的高度穩(wěn)定性和以該形式并入的天然高度穩(wěn)定的⑶123-和⑶33-特異性scFvs使得能夠長時(shí)間保存，這是診斷試劑所期望的。此外，本發(fā)明涉及包括至少一種本發(fā)明的分子，優(yōu)選地本發(fā)明的多肽、核酸分子或本發(fā)明的載體的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“藥物組合物”指施用給患者，優(yōu)選地人類患者的組合物。本發(fā)明的藥物組合物包括單獨(dú)或組合的上述化合物(其中術(shù)語“化合物”指提到的分子、核酸分子和載體以及其片段或衍生物或修飾物)。任選地，其可包括能夠改變本發(fā)明化合物特征的另外分子，從而，例如穩(wěn)定、調(diào)制和/或活化它們的功能。該組合物可以為固體、液體或氣體形式并可以為粉末(一種或多種)、片劑(一種或多種)、溶液(一種或多種)或氣溶膠(一種或多種)等形式。本發(fā)明藥物組合物可任選地和另外地包括藥學(xué)上可接受的載體?！八帉W(xué)上可接受的載體”意思是非毒性固體、半固體或液態(tài)填料、稀釋劑、包封材料或任何類型的制劑輔劑。合適的藥學(xué)上可接受的載體的例子是本領(lǐng)域熟知的并包括磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水、乳劑，比如油/水乳劑、各種類型的濕潤劑、消毒溶液、包括DMSO在內(nèi)的有機(jī)溶劑等?？赏ㄟ^熟知的常規(guī)方法制備包含這種載體的組合物。如本文所使用的，術(shù)語“腸胃外的”指施用的模式，其包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注。這些藥物組合物可以以合適的劑量施用給對象。主治醫(yī)師和臨床因素將決定劑量方案。如醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所熟知的，對任何一個(gè)患者的劑量取決于許多因素，包括患者尺寸、身體表面積、年齡、待被施用的具體化合物、性別、施用時(shí)間和途徑、健康狀況以及同時(shí)施用的其他藥物。通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)將容易地確定對于給定情況的治療有效量并且在普通臨床醫(yī)生或醫(yī)師的技術(shù)與判斷力之內(nèi)。一般而言，作為常規(guī)施用藥物組合物的方案應(yīng)當(dāng)在每天I U g至5g單位的范圍內(nèi)。但是，更優(yōu)選的劑量可能范圍為每天0. Olmg至lOOmg、甚至更優(yōu)選地0. Olmg至50mg和最優(yōu)選地0. Olmg至10mg。如上所提到的，本發(fā)明核酸分子可配制成藥物組合物。該核酸分子最終被引入期望的細(xì)胞。適當(dāng)?shù)闹苿┌ㄆ渲忻縿┦┯迷诤线m的載體中有利地包括IO6至IO12拷貝的DNA分子的那些。載體可以是，例如噬菌體、質(zhì)粒、病毒或逆病毒載體。逆病毒載體可能夠復(fù)制或具有復(fù)制缺陷。在后一情況中，病毒增殖一般僅僅發(fā)生在互補(bǔ)宿主/細(xì)胞中。本發(fā)明也涉及本發(fā)明分子，優(yōu)選地本發(fā)明的多肽、核酸分子或本發(fā)明載體，用于治療急性骨髓性白血病和/或骨髓增生異常綜合征。 根據(jù)本領(lǐng)域提供的定義使用術(shù)語“急性骨髓性白血病”(AML)。因此，它指骨髓血細(xì)胞系的癌癥，特征為異常白細(xì)胞的快速生長，其積聚在骨髓并且干擾正常血細(xì)胞的生產(chǎn)。在后來的階段，異常白細(xì)胞也積聚在血流中。根據(jù)本領(lǐng)域提供的定義使用術(shù)語“骨髓增生異常綜合征”(MDS)。因此，它指導(dǎo)致造血細(xì)胞不可逆的定量和定性缺陷表現(xiàn)出來的紊亂和無效的血細(xì)胞生成的骨髓干細(xì)胞不適。在大多數(shù)病例中，疾病的病程是慢性的，由于越來越嚴(yán)重的骨髓衰竭，細(xì)胞減少逐漸惡化。約1/3的MDS患者在幾個(gè)月到數(shù)年內(nèi)發(fā)展成AML。本發(fā)明的分子、本發(fā)明的核酸分子或本發(fā)明的載體可用于治療急性骨髓性白血病和/或骨髓增生異常綜合征。所以，本發(fā)明也涉及治療急性骨髓性白血病和/或骨髓增生異常綜合征的方法，其包括給有需要的患者施用有效發(fā)揮期望作用的一定量的本發(fā)明的分子，優(yōu)選地本發(fā)明的多肽、核酸或本發(fā)明的載體。關(guān)于治療方法的期望作用是誘導(dǎo)對表達(dá)⑶123和⑶33抗原的細(xì)胞，尤其是對AML白血病干細(xì)胞(AML-LSC)的免疫應(yīng)答。本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明的分子，優(yōu)選地本發(fā)明的多肽、核酸分子或本發(fā)明的載體，用于治療急性骨髓性白血病和/或骨髓增生異常綜合征，其中核酸分子、載體或多肽在急性骨髓性白血病的緩解階段或在骨髓增生異常綜合征的診斷之后施用。
根據(jù)本領(lǐng)域提供的定義使用術(shù)語“緩解(remission)”。因此，它指當(dāng)預(yù)期將來疾病將再次顯現(xiàn)時(shí)在具有慢性病的患者中沒有疾病活性的狀態(tài)。根據(jù)本發(fā)明，其用于指在其治療后沒有急性骨髓性白血病。如上面概述，在常規(guī)化學(xué)療法的初始病程之后的緩解中，患者骨髓中胚細(xì)胞計(jì)數(shù)減少至總骨髓白細(xì)胞的約5%或更少，并且化學(xué)療法中存活的細(xì)胞被稱為“最小殘留病”(MRD)細(xì)胞。這些細(xì)胞富集在AML白血病干細(xì)胞(AML-LSC)中，其尤其抗化學(xué)療法，并構(gòu)成能夠再次擴(kuò)張并造成復(fù)發(fā)的尤其危險(xiǎn)的細(xì)胞庫，如上所述。在緩解階段，正常的健康白細(xì)胞初始數(shù)量較少，因?yàn)榇蟛糠忠呀?jīng)被化學(xué)療法清除。但是，數(shù)周之后恢復(fù)正常的髓細(xì)胞生成并且從存活的健康造血干細(xì)胞(HSC)再造的第一正常白細(xì)胞是粒細(xì)胞(PMN，多形核粒細(xì)胞)，之后是天然殺傷(NK-)細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、B-淋巴細(xì)胞并且最后重新出現(xiàn)的是T-淋巴細(xì)胞。粒細(xì)胞迅速變得足夠數(shù)量上可用，因?yàn)榛颊咄ǔ２伙@示對細(xì)菌感染明顯增加的風(fēng)險(xiǎn)，這是明顯的。因?yàn)榱＜?xì)胞生成和其他骨髓效應(yīng)細(xì)胞的再造以劑量-時(shí)間關(guān)系發(fā)生，所以NK-細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞變得可用。所以，CD16陽性效應(yīng)細(xì)胞在該階 段以足夠的數(shù)量可被本發(fā)明的分子募集(sctb[123X 二硫鍵穩(wěn)定的dsl6X33]，用于清除AML-MRD (即 AML-LSC)細(xì)胞。在人非霍奇金淋巴瘤(NHL)小鼠模型中——其用⑶20和⑶19抗體治療，據(jù)報(bào)道單核細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞群最相關(guān)(Tedder等2006)。另外，在下面實(shí)施例中提供的體外研究提供了清楚的證據(jù)本發(fā)明的多肽激活NK-細(xì)胞以清除AML細(xì)胞。但是，預(yù)計(jì)在人類患者中，所有上面敘述的效應(yīng)細(xì)胞群將有助于總體治療效果。該總體效果不僅僅是通過抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC，也稱作“再定向溶胞作用”)直接清除腫瘤細(xì)胞的結(jié)果，而且也是源自它們?nèi)馨饔玫腁ML細(xì)胞凋亡片段被吞噬細(xì)胞攝取并加工以及通過⑶4+和⑶8+T-淋巴細(xì)胞再次呈遞的結(jié)果。兩種機(jī)制幫助建立體液抗腫瘤抗體的第二效價(jià)和通過CD8+細(xì)胞毒素T-淋巴細(xì)胞的細(xì)胞抗腫瘤響應(yīng)。因此，認(rèn)為本發(fā)明的分子、核酸分子或載體有助于顯著的治療效果，完全超過之前的化合物，比如麥羅塔(Mylotarg)和常規(guī)化學(xué)療法可能的效果，而同時(shí)伴隨遠(yuǎn)遠(yuǎn)更小的副作用，因?yàn)闆]有化學(xué)、細(xì)菌或植物毒素參與。附圖
顯示圖I.單鏈三重抗體(sctb) [123Xdsl6X33]的構(gòu)建和表達(dá)。(A) sctb [123 X dsl6 X 33]的設(shè)計(jì)。兩個(gè)遠(yuǎn)端scFvs對腫瘤抗原CD123和CD33是特異性的，中間ScFv對準(zhǔn)激活觸發(fā)分子⑶16。Ig K，來自鼠Ig K L鏈的分泌前導(dǎo)序列八、VH，編碼Ig L-鏈或H-鏈的V區(qū)的cDNA序列；L，編碼20個(gè)氨基酸柔性連接體，例如(Gly4Ser)4的cDNA ;S、H、M、STREP-、六組氨酸-和myc-標(biāo)簽；S_S，穩(wěn)定二硫鍵。用Ni-NTA瓊脂糖微球親和層析后sctb[123Xdsl6X33]的完整性和純度，如通過還原性SDS-PAGE ;以及用考馬斯藍(lán)染色(B);和使用抗His抗體的蛋白質(zhì)印記分析進(jìn)行檢測(C)評估的。圖2. sctb[123Xdsl6X33]的特異性抗原結(jié)合。Sctb與U937細(xì)胞(I)、CD123-轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞(II)、未轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞(III)、CD16轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞(IV)和未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞(V)特異性結(jié)合的FACS分析。白對照sctb ;黑:sctb[123Xdsl6X33]。圖3. sctb[123Xdsl6X33]的同時(shí)抗原結(jié)合。
U937細(xì)胞與sctb —起溫育并且通過添加由⑶16細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和GFP(CD16ex-GFP) (I，在FLl通道測量的)以及CD123細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和RFP (CD123ex_RFP)(II，在FL2通道測量的)組成的可溶蛋白揭示同時(shí)結(jié)合。圖4 由sctb[123Xdsl6X33]不同腫瘤細(xì)胞系的ADCC的劑量依賴性誘導(dǎo)。⑶123/⑶33雙陽性腫瘤細(xì)胞系M0LM-13(A)和THP-1⑶用作靶標(biāo)以比較恒定的E:T細(xì)胞比40:1下的sctb效力。sctb[123Xdsl6X33](實(shí)心三角形)以劑量依賴性方式觸發(fā)ADCC。非相關(guān)對照sctb (空心黑三角形)不誘導(dǎo)明顯的殺傷。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示從至少4個(gè)不同健康供體獲得的分離MNC的溶胞作用的平均百分?jǐn)?shù)+SEM。*與對照sctb相比較，ADCC的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。圖5.通過 sctb[123Xdsl6X33]/[123Xdsl6X123]和[33Xdsl6X33]的初級AML細(xì)胞溶胞作用。Sctb[123Xdsl6X33](實(shí)心三角形)、[123Xdsl6X 123](空心圓)和[33Xdsl6X33](空心三角形)介導(dǎo)初級AML細(xì)胞的劑量依賴性的ADCC，而對照sctb (實(shí) 心正方形)不能誘導(dǎo)細(xì)胞溶胞作用。(A和B)通過從外周血(患者I和2)分離的純化初級AML細(xì)胞的sctb誘導(dǎo)ADCC。(C和D)通過從骨髓(患者6和7)分離的純化初級AML細(xì)胞的sctb誘導(dǎo)ADCC。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示從一個(gè)健康供體以40 : I的E : T比獲得的分離MNC的特異性溶胞作用的百分?jǐn)?shù)。(E)通過來自6個(gè)不同患者(患者1-6)的外周血的純化AML細(xì)胞的sctbs誘導(dǎo)ADCC，組合的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示用從每個(gè)患者樣品一個(gè)健康供體以40 I的E T比獲得的分離MNC對6個(gè)患者平均的特異性溶胞作用的平均百分?jǐn)?shù)。特異性溶胞作用是總?cè)馨饔脺p去自發(fā)溶胞作用。實(shí)施例闡明本發(fā)明實(shí)施例I:細(xì)胞系和雜交瘤用人⑶16 cDNA表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞由Dr. J. van deWinkel (University Medical Centre, Utrecht, the Netherlands)提供。雜交瘤 3G8;FcyRIII，CD16 ;IgGl(Fleit 等 1982)和人 293T 細(xì)胞來自 American Type Cell CultureCollection (ATCC, Manassas, VA, USA)。人 AML 細(xì)胞系 M0LM-13、THP-I (t (9 ；11) (p22 ；q23),表達(dá) MLL-AF9)和 U937 來自 German Collection of Microorganisms and CellCultures (DSMZ, Braunschweig, Germany)。CH0、THP_1、U937 和 3G8 雜交瘤細(xì)胞在 RoswellPark Memorial Institute (RPMI) 1640 Glutamax-I 培養(yǎng)基(Invitrogen, Karlsruhe,Germany)中培養(yǎng),所述培養(yǎng)基包含10%胎牛血清(FCS ； Invitrogen) >100單位/ml青霉素(Invitrogen)和 100 u g/ml 鏈霉素(Invitrogen)。MOLM-13 在包含 20%FCS、100 單位 /ml青霉素和100 u g/ml鏈霉素(Invitrogen)的RPMI 1640Glutamax_I培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用CD123穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人293、293T (ATCC)和293細(xì)胞保存在包含10%FCS、100單位/ml青霉素和 100 u g/ml 鏈霉素(Invitrogen)的 DMEM(Invitrogen) Glutamax-I 培養(yǎng)基中。用于 CD123表達(dá)細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)一步包含400 V- g/ml的Geneticin (Invitrogen)。實(shí)施例2 :⑶123特異性scFv的產(chǎn)生和表征通過用由人⑶123的細(xì)胞外部分和人IgGl的Fe部分組成的重組體融合蛋白免疫BALB/c小鼠產(chǎn)生4種新的⑶123特異性scFv抗體片段。這根據(jù)產(chǎn)生⑶33特異性scFv的過程進(jìn)行(Schwemmlein等2006)。Fe部分用于確保融合蛋白的溶解性和天然構(gòu)象以及由于經(jīng)新生Fe受體(FcRn)的循環(huán)引起的延長的血清半衰期。制備免疫小鼠的脾RNA并用于產(chǎn)生噬菌體展示庫。用完整的⑶123+細(xì)胞就⑶123結(jié)合噬菌體淘洗(pan)該庫。來自反應(yīng)噬菌體的cDNA被亞克隆入原核表達(dá)載體pAK400。4種不同的克隆在大腸桿菌中表達(dá)并通過親和層析在天然條件下從周質(zhì)提取物中純化。所有4種scFv被有力地富集，收率在
0.65和2. 75mg/l大腸桿菌培養(yǎng)物之間(表I)并在蛋白印跡實(shí)驗(yàn)中與對六組氨酸標(biāo)簽特異性的抗體反應(yīng)。所有4種scFv結(jié)合⑶123+人急性骨髓性白血病源的MOLM-13細(xì)胞并結(jié)合⑶123-轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞，如通過流式細(xì)胞術(shù)可視的。scFv不能與⑶123_293細(xì)胞反應(yīng)，這指示結(jié)合是CD123-特異性的。在校準(zhǔn)的流式細(xì)胞術(shù)分析中，測定scFv的平衡結(jié)合常數(shù)(Kd)并且范圍在4. 5和IOlnM之間(表I)。具有最高親和力的scFv——克隆43(SEQ IDNos: I和2)，用于產(chǎn)生sctb [123 X dsl6 X 33]。近來，分離了目前被表征的第5種scFv (克隆 52 ；SEQ ID Nos:9 和 10)。
權(quán)利要求
1.對下列具有結(jié)合特異性的分子 (a)CDI23；(b)CD16;和(c)CD33。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分子，其中所述結(jié)合特異性由Vh和/或\結(jié)構(gòu)域賦予。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分子，其中所述結(jié)合特異性由配體、anticalins、adnectins、affibodies 或 DARPins 賦予。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的分子，其中賦予對(a)、(b)和(C)特異性的所述分子的結(jié)合部分是多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的分子，其是單多肽鏈。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的分子，其中賦予對(a)、(b)和(c)特異性的所述分子的結(jié)合部分通過連接體連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的分子，其中所述分子包括 (d)第一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其包括與Vh結(jié)構(gòu)域連接的\結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域與CD123特異性結(jié)合； (e)第二免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其包括Vh結(jié)構(gòu)域連接的'結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域與CD 16特異性結(jié)合；和 (f)第三免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其包括與Vh結(jié)構(gòu)域連接的\結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域與CD33特異性結(jié)合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的分子，其中至少一個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域包括能夠形成分子內(nèi)二硫橋的至少兩個(gè)半胱氨酸殘基。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的分子，進(jìn)一步包括至少一個(gè)另外的(多)肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)所述的分子，其中所述第一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域包括SEQID NO:2的氨基酸序列。
11.編碼權(quán)利要求4-10任一項(xiàng)所述分子的核酸分子。
12.診斷組合物，其包括下列至少一個(gè) (g)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述的分子；或 (h)權(quán)利要求11所述的核酸分子。
13.藥物組合物，其包括下列至少一個(gè) (i)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述的分子；或 (j)權(quán)利要求11所述的核酸分子。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述的分子或權(quán)利要求11所述的核酸分子，用于治療急性骨髓性白血病和/或骨髓增生異常綜合征。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述的分子或權(quán)利要求11所述的核酸分子，用于治療急性骨髓性白血病和/或骨髓增生異常綜合征，其中所述核酸分子或多肽在急性骨髓性白血病的緩解階段或在骨髓增生異常綜合征的診斷之后施用。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有對(a)CD123；(b)CD16和(c)CD33結(jié)合特異性的分子。本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明的分子，其中所述分子包括第一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其包括與VH結(jié)構(gòu)域連接的VL結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域與CD123特異性結(jié)合；第二免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其包括與VH結(jié)構(gòu)域連接的VL結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域與CD16特異性結(jié)合；和第三免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其包括與VH結(jié)構(gòu)域連接的VL結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域與CD33特異性結(jié)合。本發(fā)明更進(jìn)一步涉及編碼本發(fā)明分子的核酸分子。另外，本發(fā)明涉及診斷和藥物組合物以及本發(fā)明的分子或核酸分子在治療急性骨髓性白血病和/或骨髓增生異常綜合征中的應(yīng)用。
文檔編號C07K16/46GK102762594SQ201080063458
公開日2012年10月31日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月9日
發(fā)明者C·凱爾納, C·斯坦因, G·H·費(fèi)伊, M·庫勒 申請人:G·H·費(fèi)伊, 埃爾朗根-紐倫堡弗里德里希·亞歷山大大學(xué)