急性髓系白血病miRNA標(biāo)記物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種急性髓系白血病miRNA標(biāo)記物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML)是一組高度異質(zhì)性疾病，其發(fā) 生發(fā)展是一個(gè)多基因改變和多步驟的過程，目前確診時(shí)細(xì)胞遺傳學(xué)異常已成為AML常用的 臨床預(yù)后指標(biāo)，但傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)尚存在一些缺陷，分子遺傳學(xué)的改變對預(yù)后的意義日趨 重要。近年來，AML發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢，盡管現(xiàn)有治療方法使患者完全緩解率可達(dá) 50 %~70 %，但該病病死率仍較高，對不同患者實(shí)施個(gè)體化分層治療成為首要問題。綜合研 究基因?qū)ML發(fā)生發(fā)展的作用及其預(yù)后影響，有助于探尋有效的抗白血病血管生成治療靶 點(diǎn)，從而進(jìn)一步指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療。雖然已有某些專利研究利用基因或蛋白標(biāo)志物對患 者進(jìn)行分類，但是這種分類僅依據(jù)mRNA和蛋白表達(dá)的差異，具有一定的局限性，結(jié)合miRNA 所顯示的表達(dá)情況，將會(huì)進(jìn)一步豐富基因表達(dá)譜，為急性髓系白血病提供更明確的診斷和 預(yù)后手段。
[0003] miRNA是天然存在于體內(nèi)的21-22nt的非編碼RNA分子，是一類通過轉(zhuǎn)錄后基因沉 默對靶基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)的RNA。據(jù)估計(jì)，生物體內(nèi)約有1/3的基因受miRNA的調(diào)控。miRNA 與RISC的復(fù)合體通過堿基配對可與靶基因mRNA 5' -UTR或者3' -UTR中的互補(bǔ)序列相結(jié) 合，抑制蛋白質(zhì)翻譯，或是引發(fā)mRNA降解，從而負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。
[0004] 檢測miRNA的表達(dá)水平可以為癌癥的臨床診斷提供參考。而miRNA的異常表達(dá)直 接導(dǎo)致一些與疾病發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)異常，誘發(fā)癌癥的發(fā)生。已有報(bào)道證明miRNA可以 通過調(diào)控靶基因mRNA的表達(dá)，在急性髓系白血病中起重要作用。在未來臨床治療中，miRNA 不僅可以成為新的急性髓系白血病早期診斷和疾病進(jìn)程相關(guān)的標(biāo)記物，而且也有望通過改 變miRNA的表達(dá)或者其靶基因的表達(dá)治療急性髓系白血病等疾病。尋找和鑒定與急性髓系 白血病發(fā)生相關(guān)的miRNA及其靶基因?yàn)閙iRNA的臨床治療提供基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于診斷急性髓系白血 病的miRNA標(biāo)記物。相比傳統(tǒng)的急性髓系白血病的診斷方法，使用miRNA標(biāo)記物來診斷急 性髓系白血病具有及時(shí)性、靈敏性，從而使患者在疾病早期就能知曉疾病風(fēng)險(xiǎn)，從而采取相 應(yīng)的預(yù)防和治療措施。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了 miRNA-1262在制備診斷急性髓系白血病的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述 miRNA-1262 選自以下組中的至少一種：miRNA-1262 初始 miRNA、miRNA-1262 前體 miRNA、 成熟miRNA-1262 ;所述miRNA-1262初始miRNA能在人細(xì)胞內(nèi)被剪切并表達(dá)成成熟 miRNA-1262 ;所述miRNA-1262前體miRNA能在人細(xì)胞內(nèi)被剪切并表達(dá)成成熟miRNA-1262。
[0008] 進(jìn)一步，所述miRNA-1262是成熟miRNA-1262,核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 應(yīng)當(dāng)知道，本發(fā)明的miRNA-1262包括組成型核酸分子的功能等同物，即變體，其 顯示完整miRNA-1262核酸分子相同的功能，它們可能通過核苷酸殘基的缺失、置換或者插 入而突變。
[0010] 本領(lǐng)域人員熟知，為了保證miRNA的穩(wěn)定性，可以在miRNA的一端或者兩端增加保 護(hù)性堿基，如TT，也可對miRNA堿基進(jìn)行修飾，但是不影響miRNA的功能。因此，本領(lǐng)域技術(shù) 人員熟知，在不影響miRNA-1262功能的條件下，對miRNA-1262進(jìn)行堿基修飾或者在兩端增 加堿基獲得的序列同樣包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0011] 在本發(fā)明的一些具體的實(shí)施方式中，所述miRNA-1262是成熟miRNA-1262。
[0012] 雖然在某些【具體實(shí)施方式】中所使用的是成熟miRNA-1262,但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以預(yù)期，初始miRNA(pri-miRNA-1262)、前體miRNA(pre-miRNA-1262)將可以獲得與成熟 miRNA-1262同樣的技術(shù)效果，因?yàn)榧?xì)胞有能力進(jìn)一步將初始miRNA (pri-miRNA-1262)、前 體 miRNA (pre-miRNA-1262)加工為成熟 miRNA-1262〇
[0013] 本發(fā)明的miRNA-1262核酸分子可以以單鏈或雙鏈的形式存在。成熟的 miRNA-1262主要呈單鏈形式，而miRNA-1262前體是部分自互補(bǔ)的，以形成雙鏈結(jié)構(gòu)。本發(fā) 明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。
[0014] 本發(fā)明提供了 miRNA-1262在高通量測序平臺(tái)中的應(yīng)用。通過高通量測序能獲知 待檢測樣本中miRNA-1262的表達(dá)水平，將待測樣本的結(jié)果同健康人的樣本相比，容易判斷 待測樣本是否患有急性髓系白血病以及患急性髓系白血病的風(fēng)險(xiǎn)。因此，通過高通量測序 獲得miRNA-1262表達(dá)水平與急性髓系白血病相關(guān)性的應(yīng)用同樣包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍 之內(nèi)。
[0015] 本發(fā)明提供了一種診斷急性髓系白血病的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過檢測 miRNA-1262的表達(dá)水平來診斷急性髓系白血病。
[0016] 進(jìn)一步，上面所述的產(chǎn)品包括芯片或試劑盒。其中，所述芯片包括固相載體；以及 固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對應(yīng)于上面所述 的miRNA-1262的部分或全部序列。所述試劑盒包括用于檢測上面所述的miRNA-1262的表 達(dá)水平的試劑。
[0017] 進(jìn)一步，上面所述的寡核苷酸探針還可包括針對現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報(bào)道的可用于診 斷急性髓系白血病的miRNA的寡核苷酸探針。將多種miRNA的檢測探針放置在同一芯片上 通過檢測多種miRNA指標(biāo)聯(lián)合診斷急性髓系白血病的情況也包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之 內(nèi)。
[0018] 進(jìn)一步，所述固相載體包括所述固相載體可采用基因芯片領(lǐng)域的各種常用材料， 例如但不限于尼龍膜，經(jīng)活性基團(tuán)（如醛基、氨基等）修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑 料片等。
[0019] 所述的miRNA芯片的制備可采用本領(lǐng)域已知的生物芯片的常規(guī)制造方法，例如， 如果固相載體采用的是修飾玻片或硅片，探針的5'端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡 核苷酸探針配制成溶液，然后采用點(diǎn)樣儀將其點(diǎn)在修飾玻片或硅片上，排列成預(yù)定的序 列或陣列，然后通過放置過夜來固定，就可得到本發(fā)明的miRNA芯片。如果核酸不含氨 基修飾，則其制備方法也可參照：王申五主編的《基因診斷技術(shù)-非放射性操作手冊》； J. L. erisi, V. R. Iyer, P. 0. BROWN. Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science，1997 ;278:680和馬立人，蔣中華主編?生 物芯片.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000,1-130。
[0020] 進(jìn)一步，所述檢測miRNA-1262表達(dá)水平的試劑包括針對miRNA-1262的引物和/ 或探針。所述試劑還包括針對現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報(bào)道的診斷急性髓系白血病miRNA的引物和 /或探針。將多種miRNA的檢測引物和/或探針放置在同一試劑盒中通過檢測多種miRNA 指標(biāo)聯(lián)合診斷急性髓系白血病的情況也包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0021] 本發(fā)明的miRNA-1262可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表達(dá) miRNA-1262的DNA片段的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得。所述載體包括病毒載體、真核表達(dá)載體。
[0022] 病毒載體可以是任何適當(dāng)?shù)妮d體，包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺 病毒相關(guān)病毒載體、皰疹病毒（例如單純皰疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）載體、甲病毒載 體。
[0023] 真核表達(dá)載體可以是任何適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，包括但不限于pCMV-Myc表達(dá)載體、 pcDNA3. 0表達(dá)載體、pcDNA3. 1表達(dá)載體、pEGFP表達(dá)載體、pEF Bos表達(dá)載體、pTet表 達(dá)載體、PTRE表達(dá)載體、或者在公知表達(dá)載體的基礎(chǔ)上經(jīng)改造的載體，比如pBin438、 PCAMBIA1301 等。
[0024] 可以表達(dá)miRNA-1262的DNA片段可以通過如下方式獲?。簭膍iRNA數(shù)據(jù)庫中 (http: //microrna. sanger. ac. uk/sequences/)尋找 miRNA-1262 在基因組上的位置及 具體序列信息，根據(jù)基因組序列確定miRNA-1262初始miRNA的位置，在miRNA-1262初始 miRNA位置的上下游500-800bp區(qū)間內(nèi)設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增引物中間的序列即可獲得表 達(dá) miRNA-1262 的 DNA 片段。
[0025] 本發(fā)明提供了上面所述的miRNA-1262在制備治療急性髓系白血病藥物中的應(yīng) 用。
[0026] 進(jìn)一步，所述藥物包含miRNA-1262抑制劑。所述的miRNA-1262抑制劑能夠抑制 miRNA-1262的表達(dá)或者能夠抑制miRNA-1262的功能。所述miRNA-1262抑制劑的抑制靶標(biāo) 不限于miRNA-1262本身，還包括miRNA-1262的上下游，例如：編碼miRNA-1262的基因組序 列，miRNA-1262靶基因、調(diào)控miRNA-1262的蛋白或者基因。
[0027] 進(jìn)一步，m