一種抗腫瘤免疫原z5的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗腫瘤免疫原Z5的制備方法及應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前我國(guó)肝癌患病人數(shù)逐年升高，香菇多糖作為一種具有良好生理活性的功能性 因子，在肝癌患者的治療與康復(fù)上具有重要意義。按照腫瘤病發(fā)位置的不同，肝癌分為原發(fā) 性和繼發(fā)性兩大種，其具有長(zhǎng)潛伏期、高度惡性、進(jìn)展快、易轉(zhuǎn)移、強(qiáng)侵襲性、起病隱匿、預(yù)后 差等特點(diǎn)。
[0003] 每年全世界新發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤病人人數(shù)約為635萬人，其中肝癌占到惡性腫瘤的 4%即6萬例，并且世界各地的肝癌發(fā)病率也在逐年上升。目前，肝癌已成為國(guó)內(nèi)腫瘤死亡 病因的第二位，每年約十三萬患者死于肝癌。每年全世界因肝癌死亡的人數(shù)占所有因癌癥 死亡的人的人數(shù)的40%，致死率高。由于它是發(fā)生在代償功能極強(qiáng)、體積巨大的肝臟中，說 以過去一般性檢查方法難以發(fā)現(xiàn)早期肝癌。一旦發(fā)現(xiàn)就常常已是中、晚期肝癌，失去了治療 的良機(jī)，所以肝癌患者的存活期往往很短。
[0004] LC是一種高度惡性的腫瘤，目前其治療方法有中醫(yī)中藥治療、西醫(yī)的手術(shù)治療、介 入治療、放射治療、免疫治療、基因治療等方面。但是臨床治療效果不佳?，F(xiàn)已形成以手術(shù) 切除為主，其他非手術(shù)切除治療措施（如：放射治療、生物及免疫治療、中藥治療等）為輔的 治療格局。迄今為止，對(duì)肝癌的研宄僅在治療上取得一定的成果，但是在肝癌的預(yù)防上仍是 空白，目前采用的免疫治療方法也只是應(yīng)用到術(shù)后的恢復(fù)上，并沒有真正的利用免疫系統(tǒng) 從預(yù)防的角度防止肝癌的發(fā)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種抗腫瘤免疫原的制備方法，所采取的技術(shù)方 案如下：
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種抗腫瘤免疫原的制備方法，該方法是在培養(yǎng)基中接種 H22肝癌細(xì)胞同時(shí)加入香菇多糖進(jìn)行共培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后取出，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，離心分 離后留取沉淀。
[0007] 所述方法的步驟如下：
[0008] 1)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠H22肝癌細(xì)胞加入到RPMI1640培養(yǎng)液中，同時(shí)加入香菇多 糖進(jìn)行共培養(yǎng)，獲得培養(yǎng)物；
[0009] 2)將步驟1)所得的培養(yǎng)物進(jìn)行反復(fù)凍融后，離心分離留取沉淀。
[0010] 優(yōu)選地，所述步驟1)所述小鼠H22肝癌細(xì)胞，接種數(shù)量為2~6. 25 X IO7個(gè)/mL ; 所述RPMI1640培養(yǎng)液，含有10%已滅活胎牛血清，使用量為ImL ;所述香菇多糖，添加量為 50~175 y g/mL ;所述共培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間為40-56h，CO2濃度為5%。
[0011] 優(yōu)選地，步驟2)所述反復(fù)凍融，是使用液氮反復(fù)凍融5次；步驟2)所述離心分離， 是在4°C，4000r/min條件下離心5min。
[0012] 所述方法的具體步驟如下：
[0013] 1)在4mL含有10%已滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小 鼠H22肝癌細(xì)胞至細(xì)胞濃度為2~6. 25XIO7個(gè)/mL，同時(shí)加入ImL175 yg/mL的香菇多糖， 在37°C，CO2濃度為5%的條件下培養(yǎng)48h，培養(yǎng)結(jié)束后獲得培養(yǎng)物；
[0014] 2)利用液氮反復(fù)凍融步驟1)所得培養(yǎng)物5次后，在4°C，4000r/min條件下離心 5min，棄去上清液，保留沉淀。
[0015] 所述方法用于肝癌免疫預(yù)防。
[0016] 本發(fā)明獲得的有益效果如下：
[0017] 1.利用本發(fā)明所提供的制備方法制備出的免疫原接種小鼠可以有效的延長(zhǎng)小鼠 的存活率，相對(duì)于對(duì)照組，接種本發(fā)明所制備的免疫原的小鼠存活率可提高100 %。
[0018] 2.利用本發(fā)明所提供的制備方法制備出的免疫原接種小鼠可以有效的保護(hù)小鼠 的免疫器官，相對(duì)于對(duì)照組，接種本發(fā)明所制備的免疫原的小鼠存的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù) 分別達(dá)到3. 31、4. 83。
[0019] 3.利用本發(fā)明所提供的制備方法制備出的免疫原接種小鼠可以有效的提高小 鼠的細(xì)胞免疫，相對(duì)于對(duì)照組，接種本發(fā)明所制備的免疫原的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù) 12. 44 (ConA)、9. 39 (LPS)，巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)分別達(dá)到60%、3. 1。
[0020] 4.利用本發(fā)明所提供的制備方法制備出的免疫原接種小鼠可以有效的提高 小鼠的體液免疫，相對(duì)于對(duì)照組，接種本發(fā)明所制備的免疫原的小鼠血清抗體效價(jià)達(dá)到 51200X〇
【附圖說明】
[0021] 圖1為實(shí)施例1-7小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)（#P〈0.0 lvs模型組，*P〈0. 05vs模 型組）。
[0022] 圖2為實(shí)施例1-7小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率（#P〈0.0 lvs模型組，*P〈0. 05vs模 型組）。
[0023] 圖3為實(shí)施例1免疫成功小鼠血清抗體效價(jià)（*P〈0.0 lvs模型組）。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。
[0025] 以下實(shí)施例所用小鼠H22肝癌細(xì)胞由北京301醫(yī)院惠贈(zèng)，其他所用儀器、材料、試 劑和方法，未經(jīng)特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)儀器、材料、試劑和方法，均可通過商業(yè)渠道獲 取。
[0026] 實(shí)施例1
[0027] 本實(shí)施例提供了一種抗腫瘤免疫原的制備方法，步驟如下：
[0028] 1)在4mL含有10%已滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小 鼠H22肝癌細(xì)胞至細(xì)胞濃度為6. 25XIO7個(gè)/mL，同時(shí)加入ImL175 yg/mL的香菇多糖，在 37°C，CO2濃度為5%的條件下培養(yǎng)48h，培養(yǎng)結(jié)束后獲得培養(yǎng)物；
[0029] 2)利用液氮反復(fù)凍融步驟1)所得培養(yǎng)物5次后，在4°C，4000r/min條件下離心 5min，棄去上清液，保留沉淀。
[0030] 實(shí)施例2
[0031] 本實(shí)施例提供了一種抗腫瘤免疫原的制備方法，步驟如下：
[0032] 1)在4mL含有10%已滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小 鼠H22肝癌細(xì)胞至細(xì)胞濃度為2~6. 25 X IO7個(gè)，同時(shí)加入ImL 50 y g/mL的香菇多糖，在 37°C，CO2濃度為5%的條件下培養(yǎng)48h，培養(yǎng)結(jié)束后獲得培養(yǎng)物；
[0033] 2)利用液氮反復(fù)凍融步驟1)所得培養(yǎng)物5次后，在4°C，4000r/min條件下離心 5min，棄去上清液，保留沉淀。
[0034] 實(shí)施例3
[0035] 本實(shí)施例提供了一種抗腫瘤免疫原的制備方法，步驟如下：