專利名稱：赭曲霉毒素a核酸適體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用分子生物學(xué)技術(shù)----SELEX技術(shù)設(shè)計和制備一種與赭曲霉毒素A高特異性和高親和力結(jié)合的赭曲霉毒素A核酸適體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
赭曲霉毒素是由真菌產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似的有毒的次級代謝產(chǎn)物，有A、B、C、D四種化合物，其中毒性最大、分布最廣、產(chǎn)毒量最高、對農(nóng)作物污染最嚴(yán)重、與人類健康關(guān)系最密切是赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)。OTA是由vender Merve于1965年首次從赭曲霉中分離的到的一種真菌毒素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為苯甲酸異香豆素，主要由青霉屬某些菌株和赭曲霉及黑曲霉產(chǎn)生，廣泛存在于谷物、咖啡豆、豆類、葡萄干、啤酒、葡萄汁等各類食物和飼料中，谷物及其副產(chǎn)品是OTA的主要來源。OTA主要危害人和動物的腎臟，具有免疫抑制毒性、神經(jīng)毒性和致畸性，并于1993年被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為可能的人類致癌物。OTA的定性分析方法有微柱法，因靈敏度較低已極少應(yīng)用；定量分析方法有薄層色譜法(TLC)、高效薄層色譜法(HPTLC)、高效液相法(HPLC)、熒光比色法和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等，其中TLC法為我國檢測小麥、玉米和大豆中OTA的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，HPLC 法是谷物、寵物食品、咖啡、啤酒、葡萄汁/干、牛奶、腎臟及其它肉類食品、人和動物組織液中OTA的較靈敏檢測方法，而靈敏、高效、便捷的OTA檢測方法當(dāng)屬ELISA、RIA等免疫學(xué)方法，特別是ELISA，由于簡單的樣品預(yù)處理過程而廣泛應(yīng)用于谷物、飼料、動物組織和血清中 OTA的測定。在ELISA分析中，抗體與待測OTA反應(yīng)的專一性是影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確與否的重要因素。研究結(jié)果顯示，抗OTA單克隆抗體與其同系物OTC的交叉反應(yīng)率為15 20%， 商品化檢測OTA的RIDAscREEN ELISA試劑盒所用抗體與OTC和OTB的交叉反應(yīng)率分別為44%和14%，這無疑會大大影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度，因此獲得高特異性抗OTA的抗體是建立其免疫學(xué)檢測法的基礎(chǔ)。核酸適體(aptamer)是一種比抗體具有更高特異性的配基， 甚至能識別單抗所不能區(qū)分的靶標(biāo)分子單個取代基修飾的極細(xì)微差別，加之對于OTA這種毒性小分子，其體外篩選、體外制備的特點能夠有效克服抗體制備周期長、生產(chǎn)成本高、技術(shù)難度大、批間差異大、克隆株(細(xì)胞)難以有效保存的缺點，因此，核酸適體在OTA這種擁有復(fù)雜結(jié)構(gòu)類似物的毒性小分子的快速檢測中具有良好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種采用新一代SELEX技術(shù)篩選得到的能夠與赭曲霉毒素A高特異性和高親和力結(jié)合的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換信號適體，并提供赭曲霉毒素A核酸適體在赭曲霉毒素A檢測分析和樣品分離富集中的應(yīng)用方法；具有簡便、快速、經(jīng)濟(jì)等特點，與其他組合化學(xué)庫如隨機(jī)肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷酸文庫中篩選出的適體具許多優(yōu)勢。本發(fā)明的技術(shù)方案一種赭曲霉毒素A核酸適體，其特征在于為核苷酸序列GCATCACTACAGTCATTACGCATCGAGCAGGAGACCAGAGGGCGCAGCTACTGAGTGGTATCGTGTGAAGTGCTGTCCC或其互補(bǔ)的核苷酸序列所示的DNA分子。所述赭曲霉毒素A核酸適體的衍生物具有相同功能用途。所述赭曲霉毒素A核酸適體的衍生物為核苷酸序列進(jìn)行氨基化或巰基化或同位素化修飾。所述赭曲霉毒素A核酸適體的衍生物為核苷酸序列結(jié)合生物素或酶或地高辛或熒光物質(zhì)或納米發(fā)光材料。一種赭曲霉毒素A核酸適體的應(yīng)用，其特征在于將赭曲霉毒素A核酸適體用于赭曲霉毒素A的檢測分析，包括以下步驟(1)競爭板準(zhǔn)備50μ g/ml手臂分子氨基丙基三乙氧基硅烷或多聚賴氨酸100μ 1 于4°C包被過夜，交聯(lián)劑次亞苯基二異硫氰酸鹽或戊二醛活化Mi，200-20(K)pmOl/ml NH2-引物100 μ 1偶聯(lián)，0. 2mol/L乙醇胺或甘氨酸封閉2h，硼氫化鈉還原，1 % BSA封閉，PBS洗滌后備用；(2)檢測步驟①赭曲霉毒素A核酸適體5-10pmol，94°C 3min、冰上5min變性；②與O-IOOpmol靶標(biāo)混勻，總體積100 μ 1，加入板中，室溫孵育30min ；③吸取50 μ 1加入熒光板中，加入1 200 OliGreen 100 μ 1，作用5min ；④測定熒光值(Ex:485nm, Em :525nm)。標(biāo)準(zhǔn)曲線通過6次重復(fù)試驗，以熒光數(shù)值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。靈敏度計算通過6次重復(fù)試驗，檢測的標(biāo)靶含量為Ong/ml 士 3*STDV。重復(fù)性標(biāo)樣重復(fù)測定5次，計算其測定離散度CV值。回收率以玉米甲醇提取物稀釋50倍為樣品，加入低、中、高濃度標(biāo)準(zhǔn)，重復(fù)測定3 次，計算其回收率。OTA檢測試劑盒檢測靈敏度1. 14ng/ml，重復(fù)性CV < 6%以玉米勻漿甲醇提取物為樣品1 50稀釋，回收率見表
加入量測定值(ng/ml)測定均值標(biāo)準(zhǔn)差回收率
(ng/inl)(ng/inl)(%)
2.02. 12 2.22 1.962. 100. 131 105.00
10.0 10.12 10.43 11.2110.590.562 105.87
50.0 48.60 49.04 48.43 48.690.315 97.38一種赭曲霉毒素A核酸適體的應(yīng)用，其特征在于將赭曲霉毒素A核酸適體用于從樣品中分離、富集赭曲霉毒素A，包括以下步驟(1)將偶聯(lián)有赭曲霉毒素A核酸適體的磁顆粒與待分離的含赭曲霉毒素A的溶液
4充分混合；(2)用磁分離器富集磁顆粒，并清洗，然后將赭曲霉毒素A從偶聯(lián)有核酸適體的磁顆粒上解離，得到赭曲霉毒素A單組份。—種赭曲霉毒素A核酸適體的互補(bǔ)序列的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于赭曲霉毒素A 檢測分析中，包括以下步驟①赭曲霉毒素A檢測層析試紙條，其基本結(jié)構(gòu)組成包括支撐墊、膠體金結(jié)合墊、 硝酸纖維素膜、吸水墊等；②膠體金結(jié)合墊上含有核酸適體與其互補(bǔ)序列組裝的納米顆粒聚集體(經(jīng)生物素標(biāo)記)6 μ 1，硝酸纖維素膜上含有l(wèi)-10mg/ml鏈霉親和素2 μ 1的檢測線；③檢測時，將試紙條吸收板端插入待測樣品的溶液中，約20s，液體完全濕潤連接板并進(jìn)入膜，取出紙條，放在平臺上讓液體繼續(xù)流動，若待測液中無靶標(biāo)，聚集體較大，不能隨液流進(jìn)入硝酸纖維素膜，不顯色，若待測液中有靶標(biāo)赭曲霉毒素A存在，可導(dǎo)致組裝的聚集體解離而形成分散的納米顆粒，分散的納米顆粒隨液流進(jìn)入纖維素膜，納米顆粒上的生物素標(biāo)記物與膜上鏈霉親和素結(jié)合，顯紅色，是為陽性結(jié)果，且顯色程度與靶標(biāo)濃度呈正比關(guān)系。本發(fā)明一種赭曲霉毒素A核酸適體的特性評測1、熒光定量PCR法評價赭曲霉毒素A核酸適體的活性充分洗滌組裝(通過其互補(bǔ)序列實現(xiàn))有赭曲霉毒素A核酸適體的磁顆粒，然后用終濃度1 μ M的赭曲霉毒素A進(jìn)行競爭，室溫反應(yīng)30min。以競爭反應(yīng)產(chǎn)物為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，采用 Invitrogen 公司的試劑盒Platinum SYBR Green qPCR SuperMix_UD6， 20 μ 1體系中含模板2 μ 1、引物PI、P2各20pmol，退火溫度65°C。同時設(shè)置以溶劑甲醇作為競爭物的對照組。結(jié)果
_Ct 均值(n=3)實驗組12. 1
甲醇對照組/可見赭曲霉毒素A核酸適體對赭曲霉毒素A具有特異性親和能力。2、染料法評價赭曲霉毒素A核酸適體的活性充分洗滌組裝(通過其互補(bǔ)序列實現(xiàn))有赭曲霉毒素A核酸適體的磁顆粒，然后用終濃度ι μ M的赭曲霉毒素A進(jìn)行競爭，室溫反應(yīng)30min。Oligreen染料用結(jié)合緩沖液按 1 200稀釋后，等比例加入競爭反應(yīng)液中，室溫避光反應(yīng)2-5min，用480nm光激發(fā)，測定 520nm處的發(fā)射光。同時設(shè)置以甲醇作為競爭物的對照組和結(jié)合緩沖液本底對照組。結(jié)果本底對照組未檢測到發(fā)射光，實驗組熒光強(qiáng)度顯著高于甲醇對照組，可見赭曲霉毒素A核酸適體對赭曲霉毒素A具有特異性親和能力。3、經(jīng)基團(tuán)修飾的赭曲霉毒素A核酸適體的活性評價依熒光定量PCR法評價赭曲霉毒素A核酸適體的活性的方法，用熒光定量PCR法分別進(jìn)行氨基化赭曲霉毒素A核酸適體、巰基化赭曲霉毒素A核酸適體、同位素化赭曲霉毒素A核酸適體、生物素標(biāo)記的赭曲霉毒素A核酸適體、HRP標(biāo)記的赭曲霉毒素A核酸適體、AP 標(biāo)記的赭曲霉毒素A核酸適體、地高辛標(biāo)記的赭曲霉毒素A核酸適體、TAMRA標(biāo)記的赭曲霉毒素A核酸適體、以及納米發(fā)光材料ISiO5 = Eu標(biāo)記的赭曲霉毒素A核酸適體的活性評價。結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種赭曲霉毒素A核酸適體，其特征在于為核苷酸序列GCATCACTACAGTCATTACGCATCGAGCAGGAGACCAGAGGGCGCAGCTACTGAGTGGTATCGTGTGAAGTGC TGTCCC或其互補(bǔ)的核苷酸序所示的DNA分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種赭曲霉毒素A核酸適體，其特征在于與所述赭曲霉毒素A 核酸適體具有相同功能用途的衍生物為核苷酸序列進(jìn)行氨基化或巰基化或同位素化修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種赭曲霉毒素A核酸適體，其特征在于與所述赭曲霉毒素A 核酸適體具有相同功能用途的衍生物為核苷酸序列結(jié)合生物素或酶或地高辛或熒光物質(zhì)或納米發(fā)光材料。
4.一種權(quán)利要求1所述赭曲霉毒素A核酸適體的應(yīng)用，其特征在于用于赭曲霉毒素A 的檢測分析。
5.一種權(quán)利要求1所述赭曲霉毒素A核酸適體的應(yīng)用，其特征在于用于從樣品中分離、 富集赭曲霉毒素A
6.一種權(quán)利要求2或3所述赭曲霉毒素A核酸適體衍生物的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于赭曲霉毒素A檢測分析和分離富集中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種與赭曲霉毒素A高特異性和高親和力結(jié)合的核酸適體及其應(yīng)用，該核酸適體可以用于赭曲霉毒素A的檢測分析和分離富集，具有特異性好、親和力高、品質(zhì)均一、穩(wěn)定性好、開發(fā)周期短、生產(chǎn)成本低、使用方便的特點。本發(fā)明還涉及所述核酸適體序列的衍生序列，包括修飾后的序列。
文檔編號G01N21/64GK102517288SQ20111037764
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月25日
發(fā)明者劉海霞, 劉雅文, 吳淑慶 申請人:國家納米技術(shù)與工程研究院