專利名稱：一種疫苗黏膜免疫佐劑分子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥與疾病免疫領(lǐng)域，更具體地講，涉及應(yīng)用于生化制藥等領(lǐng)域的經(jīng)皮膚與粘膜免疫的疫苗佐劑，主要應(yīng)用于人或動(dòng)物的預(yù)防傳染病或腫瘤方面的疫苗， 建立了一種類似于LT突變體及其亞基的多亞基復(fù)雜結(jié)構(gòu)的蛋白制備方法。
背景技術(shù)：
各種傳染病的不斷發(fā)生，對(duì)現(xiàn)有的疫苗提出了新的挑戰(zhàn)。比傳統(tǒng)更加簡(jiǎn)便、快捷、 更有利于大規(guī)模的接種的粘膜免疫疫苗，已成為目前國(guó)內(nèi)研究的新方向。安全有效的粘膜免疫佐劑正成為粘膜免疫疫苗的關(guān)鍵。大腸桿菌熱敏感毒素(heat-labile toxin, LT)是目前世界上公認(rèn)的免疫效果最好的之一。因此，采用基因工程技術(shù)高效制備減毒且可作為粘膜免疫佐劑的LT突變體(LTm)及其亞基已成為國(guó)內(nèi)外研究普遍追求的目標(biāo)。但是，由于LT結(jié)構(gòu)的特殊性與復(fù)雜性，主要表現(xiàn)在下列方面LT基因可以編碼兩種蛋白亞基，電泳結(jié)果顯示一個(gè)分子量約為^KD、另一個(gè)約為12KD，LT在細(xì)胞中為穩(wěn)定的二亞單位蛋白。LT分子量為87KD，國(guó)外科學(xué)家已經(jīng)過(guò)一系列的交聯(lián)實(shí)驗(yàn)及純化、電泳已確認(rèn)，LT是由1個(gè)約^KD的A亞基(LTA)和5個(gè)約12KD的B亞基(LTB)組成的6聚體結(jié)構(gòu)蛋白，國(guó)外的有的學(xué)者將其形象的比喻成“月球車”。經(jīng)研究表明，LT操縱子含有兩個(gè)基因，即編碼A亞基單位的toxA基因和編碼B亞單位的toxB基因，并轉(zhuǎn)錄成一條mRNA鏈，二者首尾相接4bp，LT_A的基因編碼區(qū)長(zhǎng)76^p， 編碼2M個(gè)氨基酸，eltA上游約-76至_43bp處為啟動(dòng)子序列，其中_76至-7Ibp區(qū)GCATAT 和-49至-4;3bp區(qū)GTTATCT均為啟動(dòng)子信號(hào)序列，核糖體結(jié)合位點(diǎn)TAAG位于起始密碼子 ATG上游-13至-IObp區(qū)W3]。而eltB起始于eltA末端，LT-A的C末端的最后的兩個(gè)密碼子(TTATGA)與LT-B的N末端的兩個(gè)密碼子(ATGAAT)重疊，這表明eltA和eltB由同一啟動(dòng)子操縱，eltA和eltB可能以共轉(zhuǎn)錄的方式合成mRNA。B亞基雖然離啟動(dòng)子比較遠(yuǎn)，但是B亞單位比A亞單位表達(dá)量高很多，可能與其調(diào)控裝置有密切的關(guān)系，通常認(rèn)為是由于toxB在mRNA上可能與核糖體的結(jié)合更加的牢固導(dǎo)致。在LT全蛋白中，A、B亞基比例是1 :5，但是這并非是A亞基和B亞基在大腸桿菌真實(shí)表達(dá)量情況。在利用同位素示蹤法摻入對(duì)A、B單位的分泌及全毒素裝配動(dòng)力學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)， 在細(xì)胞周質(zhì)中的比例為1. 4-1. 7A/5B，其中絕大部分的B和A結(jié)合在一起，只有55%_60%的 A和B結(jié)合，而多余的A亞基則被菌體自身降解。B亞單位被合成以后一分鐘內(nèi)就被分泌到細(xì)胞的周質(zhì)中，約80%會(huì)迅速的聚集成寡聚體。X射線晶體結(jié)構(gòu)分析表明，B亞基單位有兩組分別由三個(gè)反平行的β片層結(jié)構(gòu)、 一個(gè)N末端的α螺旋和一個(gè)長(zhǎng)的位于中心的α螺旋組成，N末端的α螺旋通過(guò)二硫鍵與 β 5片層連接。Β5聚體與A亞單位相鄰面平行，而中心的α螺旋從另一面向外延伸，形成一個(gè)由50-60為氨基酸組成的小環(huán)，按這種結(jié)構(gòu)合成的肽段可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗LT的抗體。 Β5聚體間只有相鄰的單體間有相互作用，5聚體形成后，原表面39%都會(huì)包埋起來(lái)，有利于維持Β5聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。其中心的α螺旋有25個(gè)陽(yáng)離子和15個(gè)陰離子，可以形成一個(gè)強(qiáng)的親水區(qū)，雖然B5的離子中心里親水性很強(qiáng)，但是只有幾個(gè)特異性結(jié)合的相互作用力， 即空洞中心兩頭的兩個(gè)疏水鍵和一個(gè)離子鍵。電鏡觀察顯示，圍繞這個(gè)中心的5個(gè)亞基結(jié)合成一個(gè)非常緊密的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。A亞基單位呈三角形結(jié)構(gòu)，由兩個(gè)功能不同亞單位組成有酶活性的Al亞單位和一個(gè)短的連接B5聚體的Al亞單位的A2 β片層。Α2亞單位由一個(gè)結(jié)構(gòu)域，含有較短的9個(gè)α螺旋和9個(gè)β片層。Α2亞單位起始于第200位氨基酸殘基，是 Al的一個(gè)延伸α螺旋，在結(jié)構(gòu)上它起始于三角形的一個(gè)角上。因此，利用通常的基因工程技術(shù)制備實(shí)踐證明有較大的困難。在采用大腸桿菌作為表達(dá)宿主制備LT的過(guò)程中，LT在大腸桿菌中的表達(dá)量非常的低，只有1-5%。有研究表明，在LT基因正常表達(dá)形成LT蛋白的過(guò)程中，不到50%的LTA亞基與LTB亞基進(jìn)行了結(jié)合裝配成ΑΒ5形式。通過(guò)調(diào)節(jié)LTA亞基和LTB亞基的表達(dá)量上的比例關(guān)系來(lái)達(dá)到提高LT的產(chǎn)量已成為熱點(diǎn)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種疫苗黏膜免疫佐劑分子的制備方法，所述黏膜免疫佐劑為大腸桿菌熱敏感毒素LT、大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm以及大腸桿菌熱敏感毒素亞基蛋白LTA與LTB。為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案一種疫苗黏膜免疫佐劑分子的制備方法，所述黏膜免疫佐劑為大腸桿菌熱敏感毒素LT、大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm以及大腸桿菌熱敏感毒素亞基蛋白LTA與LTB，其特征在于，將不同亞基蛋白LTA、LTB或全蛋白質(zhì)LT分別構(gòu)建于不同的表達(dá)框以調(diào)節(jié)多亞基蛋白LT、突變體及其亞基的表達(dá)量。利用P⑶FDuet-I和ρ ΒΙΙ兩類載體，在基因水平將LT突變體或其LTA 或LTB亞單位基因或LTA的突變體LTAm的原核表達(dá)載體ρ⑶FDuet-1-LTAm-LTB、 pCDFDuet-l-MCSl-LTm、ρCDFDuet-1-LTB-LTm、ρCDFDuet-1-MCS 1-LTB、 pCDFDuet-l-LTB-LTm、pTYB 11-LTB-EGFP, pTYBll-LTB 或 pTYBll-LTm 中的一種或幾種轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中。表達(dá)質(zhì)粒優(yōu)選為pCDFDuet-1-LTAm-LTB、pCDFDuet-1-MCSl-LTm 或者 ρ ΒΙI-LTB 中的一種或幾種。工程菌BL21/pITBlI-LTB的誘導(dǎo)表達(dá)條件為在2ΧΥΤ培養(yǎng)基之中，在37°C生長(zhǎng)到0D600=0. 8后，轉(zhuǎn)至20°C下培養(yǎng)，以IPTG終濃度0. 4mM進(jìn)行誘導(dǎo)8h。本發(fā)明所述大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm是指既能降低蛋白本身毒性，又能保持免疫活性的突變體，主要包括但不限于LTm7，LTm63，LTmll2，LTml92。本發(fā)明所述LTA的突變體LTAm其突變位點(diǎn)的要求與UTm相同，主要包括但不限于LTAm7，LTAm63, LTAml 12, LTAml92。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明主要運(yùn)用將不同亞基或全蛋白質(zhì)分別構(gòu)建于不同的表達(dá)框以調(diào)節(jié)多亞基蛋白LT、突變體及其亞基的表達(dá)量，以克服多亞基復(fù)雜蛋白對(duì)其整體進(jìn)行基因表達(dá)效能降低的問題，從而促進(jìn)疫苗黏膜免疫佐劑的有效制備。這種對(duì)疫苗黏膜免疫佐劑大腸桿菌熱敏感毒素LT (heat-labile toxin, LT)突變體及其亞基的制備方法，不僅適合于LT及其突變體與亞基本身的有效制備，制作工藝程序簡(jiǎn)便、快捷，而且也對(duì)類似結(jié)構(gòu)的多亞基蛋白質(zhì)，包括酶，建立了一種在基因水平分別構(gòu)建、組合表達(dá)，以最終實(shí)現(xiàn)在蛋白水平的按比例、有活性的組合制備完整蛋白的技術(shù)。通過(guò)的疫苗抗原，為黏膜疫苗經(jīng)皮膚、粘膜產(chǎn)生免疫效應(yīng)起到轉(zhuǎn)運(yùn)和協(xié)助抗原發(fā)揮免疫應(yīng)答功能的作用。其中所述的黏膜免疫佐劑包括LT本身、LT單點(diǎn)或多點(diǎn)突變體、亞基蛋白LTA與LTB。所涉及的蛋白分子主要應(yīng)用于生化制藥等領(lǐng)域的經(jīng)皮膚與粘膜免疫的疫苗，優(yōu)先應(yīng)用于“旅游者腹瀉”、各類流感粘膜疫苗、手足口病、口蹄疫等易于經(jīng)過(guò)呼吸道、 消化道、生殖道等與環(huán)境相曝露的黏膜與皮膚的傳染病疫苗。本發(fā)明的應(yīng)用領(lǐng)域不局限于預(yù)防傳染病的疫苗，還適用于抗腫瘤方面的疫苗；其應(yīng)用對(duì)象不限于人類，還可用于動(dòng)物。


圖1為對(duì)LTm全基因及其亞基的擴(kuò)增所用的引物序列。圖2為生產(chǎn)LTm及其亞基的表達(dá)載體的構(gòu)建路線。圖3為質(zhì)粒pCDFDuet-1-LTAm-LTB構(gòu)建流程示意圖。圖4為質(zhì)粒ρ ΒΙ I-LTB-EGFP構(gòu)建流程示意圖。圖5為8個(gè)原核表達(dá)載體的具體信息。圖 6 為 BL21/pCDFDuet-l-LTAm-LTB, BL21/pCDFDuet-l-MCSl_LTB， BL21/ pCDFDuet-l-MCSl-LTm, BL21 /pCDFDuet-1 -LTm-LTB, BL21/pCDFDuet-l-LTB_LTm 在 LB 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物電泳圖。圖7為BL21/ρ ΒΙI-LTB在LB和2ΧYT培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物電泳圖，其中，1_4 (LB培養(yǎng)基誘導(dǎo))8Μ尿素溶解物、2Μ尿素溶解物、菌液、裂解上清；5 =Marker ；6-9 (2ΧΥΤ 培養(yǎng)基)裂解上清菌液、2Μ尿素溶解物、8Μ尿素溶解物。圖8為BL21/pCDFDuet-l-LTAm-LTB表達(dá)產(chǎn)物分析圖，其中，1:BL21 ；2:菌體；3:全菌體裂解液I ；4:Marker ；5:裂解液I上清；6:2M尿素溶解物；7:2M尿素溶解物上清；8:8M 尿素溶解物。圖 9 為 BL21/pCDFDuet-l-MCSl-LTm表達(dá)產(chǎn)物分析圖，其中，1 :BL21 ；2:菌體；3 全菌體裂解液I ；4 =Marker ；5 裂解液I上清；6 :2M尿素溶解物；7 :2M尿素溶解物上清；8 :8M 尿素溶解物。圖10為BL21/ρ ΒΙI-LTB-EGFP在2ΧΥΤ培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物電泳圖，其中1 Marker ；2:菌液電泳；3 裂解上清菌液；4 陰性對(duì)照；5 :2M尿素溶解物；6 :2M尿素溶解物上清；7 :8M尿素溶解物。圖11為溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，·‘表示37°C ； ■表示30°C ；▲表示20°C。圖12為不同誘導(dǎo)劑濃度對(duì)CBD-LTB蛋白表達(dá)的影響。圖13為溫度對(duì)菌體CBD-LTB總蛋白表達(dá)量的影響，··表示37°C 表示30°C ；▲ 表示20 0C ο圖14為溫度對(duì)可溶的CBD-LTB表達(dá)的影響，“表示37°C ； ■表示30°C ；▲表示 20°C。圖15為溫度對(duì)可溶的CBD-LTB占總蛋白比列的影響，”表示37°C ； ■表示30°C ； ▲表示20°C。圖16為BL21/ρ ΒΙI-LTB表達(dá)產(chǎn)物分析圖，1 =Marker ；2 全菌體；3 全菌體裂解
液；4:沉淀。
圖17為工程菌表達(dá)產(chǎn)物信息表。圖18為6XHis-LTAm融合蛋白純化蛋白電泳圖，其中，1 :2M尿素溶解物；2 :8M尿素溶解物；3 =Marker ；4 :50mM咪唑洗脫液；5 =IOOmM咪唑洗脫液；6 :200mM咪唑洗脫液。圖19為CBD-LTB純化蛋白電泳圖，其中1 =Marker ；2 上樣液；3 洗脫峰I ；4 洗脫峰II。圖20為融合蛋白CBD-LTB的幾丁質(zhì)親和色譜的洗脫曲線。圖21為CBD-LTB-EGFP純化蛋白電泳圖，其中，1 :Marker ；2 上樣液；3 洗脫峰I ； 4:洗脫峰II。圖22為融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳和^ferstern Blotting分析，(左為SDS-PAGE電泳圖，右為Wertern Blotting圖)其中， Line 1Marker, Line2BL21/PTB11-LTB, Line3BL21/pCDFDuet-l-LTAm_LTB，Line4BL21/ pCDFDuet-l-MCSl-LTm,Line5BL21/pCDFDuet-1-MCS1-LTB, Line6:BL21/ pCDFDuet-l-LTB-LTm, Line7:BL21/pCDFDuet-l-LTm_LTB。圖23為融合蛋白LTB-EGFP跨膜實(shí)驗(yàn)，其中，A，C為L(zhǎng)TB-EGFP實(shí)驗(yàn)組；B，D陰性對(duì)照組。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明，實(shí)施例的作用僅是解釋而非限定本發(fā)明。實(shí)施例一生產(chǎn)LTm及其亞基的表達(dá)載體的構(gòu)建。在華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院基因與蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)室保存的LTml92基因序列的基礎(chǔ)上，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要和表達(dá)載體的不同，設(shè)計(jì)了如下的引物，用于對(duì)LTm全基因及其亞基的擴(kuò)增，其序列見圖1。所有引物由上海捷銳生物技術(shù)有限公司合成。利用分子生物學(xué)常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，具體按照《分子克隆》進(jìn)行。按照下列技術(shù)路線及方法進(jìn)行構(gòu)建。以載體pCDFDuet-Ι系列原核表達(dá)載體構(gòu)建流程示意圖如圖3所示，質(zhì)粒 pTYBlI-LTB-EGFP構(gòu)建流程示意圖如圖4所示。通過(guò)PCR和酶切鑒定，正確的構(gòu)建克隆了 UTm、LTB、LTA, EGFP基因的基礎(chǔ)上，利用常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建和鑒定出了 8個(gè)正確構(gòu)建的原核表達(dá)載體，分別是 pCDFDuet-1-LTAm-LTB、pCDFDuet-1-LTB-LTm、pCDFDuet-1-LTm-LTB、 pCDFDuet-1-MCS1-LTB、pCDFDuet_1-MCS1-LTm,pTYBll-LTB、pTYB11-LTB-EGFP、pTYB11-LTm 表達(dá)載體的具體信息如圖5所示。實(shí)施例二轉(zhuǎn)化LTm及其亞基蛋白的工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)與檢測(cè)。1)大腸桿菌DH5a (Novagen，USA，實(shí)驗(yàn)室保存)用于質(zhì)粒擴(kuò)增，大腸桿菌BL21 (DE3) (Novagen, USA，實(shí)驗(yàn)室保存)作為質(zhì)粒表達(dá)的宿主菌。pCDFDuet-1-LTB-LTm、 pCDFDuet-l-LTm-LTB、ρCDFDuet-1-LTAm-LTB、ρCDFDuet-1-MCS1-LTB、 pCDFDuet-l-MCSl-LTm、p!TBll-LTB、pITBlI-LTm均為華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院基因與蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。2)生化試劑與培養(yǎng)基包括一抗羊CTB多克隆抗體和二抗兔抗羊HRP-IgGFc購(gòu)自 Santa Cruz Biotechnology 公司、考馬斯亮藍(lán)購(gòu)自 Amreco 公司、chitin beads 購(gòu)自 NEB 公司。
3) IPTG 將2g IPTG溶于8ml水中，用純水調(diào)節(jié)體積到10ml，用0. 22um 一次性濾皿過(guò)濾除菌。分裝成1 ml小份，貯存于-20°C。4)蛋白電泳緩沖液參照《分子克隆》(第2版相關(guān)章節(jié))。蛋白電泳系統(tǒng)30%丙烯酰胺 丙烯酰胺，N，N’ -亞甲雙丙烯酰胺lg，溶解于水中，定容至100ml，置于棕色瓶中 4 °C 保存；IXSDS 凝膠加樣緩沖液:50mmol/L Tris-HCl (ρΗ6· 8)，1 OOmmo 1/LDTT, 2%SDS, 0. 1%溴酚藍(lán)，10%甘油；TriS-HCl-甘氨酸電泳緩沖液25mmol/L Tris, 250mmol/L甘氨酸， 0.l%SDSo5)目的蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21中，挑取轉(zhuǎn)化子接入5ml含有相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。將過(guò)夜新鮮菌液以1 :50接入 LB和2XYT培養(yǎng)基中，當(dāng)0D600達(dá)到0. 8時(shí)，加入誘導(dǎo)劑至終濃度0. 5mM，誘導(dǎo)6小時(shí)時(shí)分別取樣，菌液經(jīng)12000rpm、lmin離心，去培養(yǎng)基上清，沉淀加入IX上樣緩沖液10(TC水浴 5min,離心后進(jìn)行SDS-PAGE電泳(濃縮膠5%，分離膠12%)，染色、脫色。6)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳和^festern Blotting檢測(cè)蛋白質(zhì)上樣前的處理及 SDS-PAGE電泳。將上述菌體裂解物IOOOOrpm離心，盡量棄凈上清。向菌體裂解物沉淀中加 Λ ρΗ8· 0的TE 100 μ 1和2倍上樣液100 μ 1 ；煮沸2_5min，IOOOOrpm離心5min。每孔上樣 15 μ 1進(jìn)行不連續(xù)垂直電泳。當(dāng)染料處于積層膠中時(shí)電泳電壓為60V ；當(dāng)染料電泳出積層膠后電泳電壓升到160V，直到染料電泳出分離膠為止。Western blotting 檢llj。(1)電轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳后，切出含待轉(zhuǎn)移蛋白的凝膠，剪6張同樣大小的濾紙和1張硝酸纖維素膜，將它們浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中(48mmol/l的Tris堿，39mmol/l 的甘氨酸，0. 037%SDS, 20%甲醇)中，使其對(duì)齊，無(wú)氣泡存在，將支架夾緊插入電泳槽中，硝酸纖維膜一側(cè)接陽(yáng)極，凝膠一側(cè)接陰極，加轉(zhuǎn)移緩沖液沒過(guò)凝膠，以30V電壓4°C轉(zhuǎn)移14-18h。(2)封閉電轉(zhuǎn)移結(jié)束后，加封閉液(10mmol/l Tris-HCL，Ph7. 5，150mmol/l NaCl, l%Tween20, 3%BSA)浸泡硝酸纖維素膜，室溫封閉池。封閉后用洗滌緩沖液(IOmmol/ 1 Tris-HCL, Ph7. 5，150mmol/l NaCl,0. 05%Tween20)，漂洗硝酸纖維素膜，每次 5min。(3)與第一抗體反應(yīng)一抗為羊抗CTB多克隆抗體，用含有1%BSA的洗滌緩沖液 1 :1000稀釋抗體，按濾膜面積0. lml/ cm 2加入稀釋后的抗體(將轉(zhuǎn)移面與抗體接觸)室溫反應(yīng)池，用洗滌緩沖液洗硝酸纖維素膜3次，每次5min。(4)與第二抗體反應(yīng)以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG(HRP-IgGFc)為第二抗體。用含有1%BSA的洗滌緩沖液1 :2000稀釋抗體，按濾膜面積0. lml/ cm 2加入稀釋后的抗體室溫反應(yīng)池，用洗滌緩沖液洗硝酸纖維素膜3次，每次5min。(5)顯色:A.在 9ml 的 0. 01mol/l 的 Tris-HCL (Ph7. 6)的溶液中溶解 6mg 的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)JnA Iml的0. 3% (w/v)的NiCl2，用Whatmanl號(hào)濾紙過(guò)濾底物溶液以除去可能形成的沉淀物；B.加入10μ 1的30%的H2O2，混勻后立即使用，把經(jīng)漂洗的硝酸纖維素膜移至一淺托盤上，按濾膜面積加入0. lml/cm 2的底物溶液，于室溫輕輕搖動(dòng)溫育之(避光)；C.細(xì)心觀察反應(yīng)過(guò)程，一旦蛋白帶顏色深度達(dá)到要求(約5分鐘)，即用水略為漂洗，然后把內(nèi)膜轉(zhuǎn)移到內(nèi)裝250ml的磷酸鹽緩沖液的另一淺托盤中；D.拍攝濾膜照片，留作永久的實(shí)驗(yàn)記錄。將轉(zhuǎn)化好的工程菌接種于LB培養(yǎng)基之中，當(dāng)0D600為0. 8時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG使終濃度為0. 5mM，37°C誘導(dǎo)6小時(shí)，取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖6所示。BL21/pCDFDuet-l-MCSl-LTm工程菌接種到在2 X YT培養(yǎng)基中，接種量5%，在 37°C度誘導(dǎo)至0D600值為0. 8時(shí)加入IPTG至終濃度0. 5mM，誘導(dǎo)6小時(shí)后，誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物 SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖7所示。從圖7中明顯可以看出在37°C、IPTG終濃度為0. 5mM，誘導(dǎo)時(shí)間為6小時(shí)的時(shí)候在66KD處明顯的出現(xiàn)特異性的蛋白目的條帶。運(yùn)用蛋白層析掃描軟件對(duì)目的蛋白區(qū)域進(jìn)行積分66KD處條帶分別占總蛋白的20%和30%左右。結(jié)果顯示BL21/pCDFDuet-l-LTAm-LTB、BL21 /pCDFDuet-1-MCS1-LTB, BL21/ pCDFDuet-l-MCSl-LTm、BL21/pTYBIl-LTB宿主菌在2XYT培養(yǎng)基中的表達(dá)量高于LB。這可能是2 X YT培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)較為豐富，誘導(dǎo)時(shí)相同時(shí)刻的菌體的生長(zhǎng)密度高于在LB表達(dá)時(shí)造成。故本實(shí)驗(yàn)后續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基均以2XYT進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)對(duì)表達(dá)量相對(duì)較高的基因工程菌BL21/pCDFDuet-l-LTAm-LTB、BL21/ pCDFDuet-1-MCS1 -LTm,BL21 /pTYB 11-LTB-EGFP,BL21 /pTYB 11-LTB 的表達(dá)情況進(jìn)行了分析， 結(jié)果如圖8、圖9、圖10所示。將新鮮的BL21/pCDFDuet-l-LTAm-LTB工程菌菌液接種到2 X YT培養(yǎng)基中，接種量 5%，在37°C度誘導(dǎo)至0D600值為0. 8時(shí)加入IPTG至終濃度0. 5mM，誘導(dǎo)6小時(shí)后，誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳圖。由圖8可以看出在^KD和12KD處均有目的條帶產(chǎn)生，運(yùn)用蛋白層析掃描軟件對(duì)目的蛋白區(qū)域進(jìn)行積分^KD占總蛋白的35%左右，12KD處蛋白占總蛋白含量的10%左右。由圖中還可以看出分子量為^KD的蛋白以包涵體形式表達(dá)，而分子量為12KD 的蛋白以可溶性形式表達(dá)。將新鮮的BL21/pCDFDuet-l-MCSl-LTm工程菌菌液接種到2 X YT培養(yǎng)基中，接種量 5%，在37°C度誘導(dǎo)至0D600值為0. 8時(shí)加入IPTG至終濃度0. 5mM，誘導(dǎo)6小時(shí)后，誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖9所示。由圖9可以看出在^KD和12KD處均有目的條帶產(chǎn)生，運(yùn)用蛋白層析掃描軟件對(duì)目的蛋白區(qū)域進(jìn)行積分^KD占總蛋白的30%左右，12KD處蛋白占總蛋白含量的8%左右。由圖中還可以看出分子量為^KD的蛋白以包涵體形式表達(dá)， 而分子量為12KD的蛋白以可溶性形式表達(dá)。BL21/pTYBlI-LTB-EGFP工程菌接種到在2X YT培養(yǎng)基中，接種量5%，在37°C度誘導(dǎo)至0D600值為0. 8時(shí)加入IPTG至終濃度0. 5mM，誘導(dǎo)6小時(shí)后，誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE 電泳結(jié)果如圖10所示。由圖10可以看出在92KD處有目的條帶產(chǎn)生，運(yùn)用蛋白層析掃描軟件對(duì)目的蛋白區(qū)域進(jìn)行積分^KD占總蛋白的20%左右，由圖中還可以看出分子量為92KD 的蛋白以包涵體形式表達(dá)。實(shí)施例三轉(zhuǎn)化LTm及其亞基蛋白的工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化。1) BL21/pITBll-LTB工程菌表達(dá)條件優(yōu)化。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中， 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)對(duì)外源基因在大腸桿菌中進(jìn)行了只表達(dá)與A、B亞基的共表達(dá)情況，經(jīng)初步表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳、Western Blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)圖觀察，表達(dá)情況較好的質(zhì)粒有 pCDFDuet-l-LTAm-LTB、pCDFDuet-l-MCSl-LTm、pTYBll-LTB。其中 pTYBll-LTB 表達(dá)載體，可以與保護(hù)性抗原基因在基因水平上進(jìn)行融合表達(dá)粘膜免疫疫苗的通用載體，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并以EGFP指示作為指示蛋白，特構(gòu)建了 ρ ΒΙI-LTB-EGFP表達(dá)質(zhì)粒，作為L(zhǎng)TB穿膜的指示標(biāo)志。
2)搖瓶培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化子接入25ml種子培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，于37°C，200 rpm搖床培養(yǎng)10h。將培養(yǎng)物按照3%的接種量接入到50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，于 370C，200 rpm搖床培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)到0D600約為0. 6-0. 8時(shí)，開始加入誘導(dǎo)劑IPTG (終濃度為0.4 mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。所有的搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為三次實(shí)驗(yàn)的平均值。3)培養(yǎng)基pH對(duì)表達(dá)量的影響。以2XYT培養(yǎng)基，分別調(diào)整三角瓶中pH為6、6. 5、 7、7. 5、8、8. 5。取Iml新鮮菌液按1%接種量接種于上述培養(yǎng)基中(含有Amp終濃度100 μ g/ ml), 37°C振蕩培養(yǎng)至0D600為0. 6-0. 8時(shí)，加入IPTG至終濃度0. 5mM,培養(yǎng)6h以后取出Iml 菌液至1.5ml印管內(nèi)，離心收集菌體。4)宿主對(duì)CBD-LTB可溶性表達(dá)的影響。挑取轉(zhuǎn)化子BL21(DE3)/pITBll-LTB-EGFP 和 Origami (DE3)/pITBll-LTB-EGFP 接入 25ml LB 培養(yǎng)基中，于 37 °C，200 rpm 搖床培養(yǎng) IOh0將培養(yǎng)物按照3%的接種量接入到50ml 2 X YT培養(yǎng)基中，于37°C，200 rpm搖床培養(yǎng)。 待細(xì)胞生長(zhǎng)到0D600約為0. 6-0. 8時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG (終濃度為0. 5mmol /L)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)將培養(yǎng)溫度設(shè)定為37°C和20°C，誘導(dǎo)他取樣。5)溫度對(duì)CBD-LTB可溶性表達(dá)的影響。挑取轉(zhuǎn)化子BL21 (DE3) /pTYBl I-LTB-EGFP 接入25ml LB種子培養(yǎng)基中，于37°C，200 rpm搖床培養(yǎng)10h。將培養(yǎng)物按照3%的接種量接入到50ml 2XYT中，于37°C，200 rpm搖床培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)到0D600約為0. 6-0. 8時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0. 5mmol進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)將培養(yǎng)溫度設(shè)定為37°C，30°C，20°C， 每隔池取樣。6)工程菌BL21(DE3)/pITBll-LTB可溶性表達(dá)條件優(yōu)化。由于本實(shí)驗(yàn)所有篩選的表達(dá)載體中，BL21(DE3)/pITBll-LTB是融合蛋白中表達(dá)量最高，所以有必要對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)一步優(yōu)化，以期待能獲得更加高產(chǎn)的誘導(dǎo)表達(dá)體系，本實(shí)驗(yàn)以2XYT培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，從誘導(dǎo)溫度、IPTG誘導(dǎo)物的濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等外在條件經(jīng)行了初步的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，以優(yōu)選最佳的表達(dá)條件。7)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響。溫度是菌體生長(zhǎng)的重要影響因素，不同的溫度直接影響最終的菌體密度，進(jìn)而影響總的蛋白表達(dá)量。研究溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響結(jié)果如圖11所示。由圖11可知，30°C至37°C間，溫度對(duì)于菌體的生長(zhǎng)影響較小，但是在20°C時(shí)，菌體生長(zhǎng)速度和終密度均有明顯降低。8)誘導(dǎo)劑濃度對(duì)pITBll-LTB表達(dá)量的影響。由圖12可知，在溫度一定的情況下， 隨著在IPTG濃度的升高，CBD-LTB的表達(dá)量隨著增加。在誘導(dǎo)劑IPTG濃度一定的情況下， CBD-LTB量隨著溫度的升高而增加。然而在0. 6mM時(shí)，誘導(dǎo)8小時(shí)以后，CBD-LTB表達(dá)產(chǎn)物多以包涵體形式存在，而在0. 2mM時(shí)，誘導(dǎo)8小時(shí)以后，在37°C時(shí)CBD-LTB的表達(dá)量到達(dá)了沈％，但是多以包涵體形式存在。在0. 4mM時(shí)，溫度為20°C，誘導(dǎo)時(shí)間為8小時(shí)的情況下，獲得了可溶性比例較高CBD-LTB表達(dá)產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中均采用誘導(dǎo)劑IPTG濃度 0. 4mM，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)條件的優(yōu)化。9)溫度對(duì)ρ ΒΙI-LTB表達(dá)量及可溶性比率的影響。溫度對(duì)CBD-LTB總蛋白表達(dá)量的影響如圖13，對(duì)可溶性CBD-LTB表達(dá)量的影響如圖14所示，可溶性比率如圖15所示。37°C誘導(dǎo)條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)密度以及重組蛋白的表達(dá)水平都是最高的；與37°C 相比，30°C誘導(dǎo)條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)沒有受到很大影響，而重組蛋白的表達(dá)水平也只有少量的下降；30°C與20°C相比，細(xì)胞生長(zhǎng)和重組蛋白表達(dá)水平均有顯著差異，而可溶目標(biāo)蛋白的表達(dá)量及比例也相差較多，主要原因可能是降低溫度增加折疊中間體的穩(wěn)定性或減少折疊中間體之間錯(cuò)誤的相互作用，特別是疏水相互作用，或者是在溫度較低時(shí)，折疊中間體能處于一種熱動(dòng)力學(xué)上更利于折疊的構(gòu)象。當(dāng)誘導(dǎo)溫度繼續(xù)降低到20°C時(shí)，細(xì)胞密度和目標(biāo)蛋白表達(dá)量分別比37 °C降低了 43%和45%，可溶目標(biāo)蛋白表達(dá)水平比30 V也降低了 10%左右， 然而，在誘導(dǎo)溫度20°C，誘導(dǎo)8小時(shí)條件下，37°C誘導(dǎo)時(shí)可溶性比率僅21%，30V誘導(dǎo)比率也只有70%，但是在20°C時(shí)卻獲得了 90%的高可溶比例。綜合考慮選用20°C作為可溶表達(dá)的誘導(dǎo)溫度。通常情況下，低溫培養(yǎng)條件下表達(dá)外源蛋白能有效地增加可溶蛋白的比例，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)降低誘導(dǎo)溫度，考察了溫度對(duì)CBD-LTB (可溶性)表達(dá)的影響，可見，隨著誘導(dǎo)溫度的降低，細(xì)胞密度逐漸下降，總的目標(biāo)蛋白表達(dá)水平降低，目標(biāo)蛋白可溶比例隨之升高。經(jīng)過(guò)一系列表達(dá)條件的篩選和優(yōu)化后，工程菌BL21 (DE3) /pTYBl I-LTB在2 X YT培養(yǎng)基之中，在37°C生長(zhǎng)到0D600=0. 8后，轉(zhuǎn)至20°C下培養(yǎng)，以IPTG終濃度0. 4mM進(jìn)行誘導(dǎo)他，如圖16所示。經(jīng)凝膠薄層掃描后分析，可溶性融合蛋白CBD-LTB的表達(dá)水平可達(dá)菌體總蛋白的27%。這對(duì)于具有粘膜免疫作用而又不穩(wěn)定的LTB的生產(chǎn)具有重要的前景。實(shí)施例四LTm及其亞基蛋白的純化技術(shù)。1)幾丁質(zhì)純化試劑。Cell Lysis Buffer :20 mM Tris-HCl, pH 8.5,500 mM NaCl, 1 mM EDTA,0. 1% Triton X-100 ；
Column Buffer :20 mM Tris-HCl, pH 8.5,500 mM NaCl，1 mM EDTA ；
Cleavage Buffer 20 mM Tris-HCl,pH 8.5,500 mM NaCl，50 mM DTT，1 mM EDTA ；
Stripping Solution :0.3 M NaOH ；
1，4-Dithiothreitol (DTT) (1.0 M DTT)新鮮配制放于-20°C保存；3X SDS Sample Buffer :20mM Tris-HCl (pH 6.8),6% (w/v) SDS，30% 甘氨酸，0. 03% (w/v)溴酚藍(lán)，加入 DTT 至 40 mM，存放于-20°C。2)目的蛋白純化。分離純化基因工程蛋白一直是其規(guī)?；a(chǎn)中的關(guān)鍵問題，工程菌的構(gòu)建策略在很大的程度上決定了下游目標(biāo)多肽純化的難以程度也成本。采用融合蛋白技術(shù)是現(xiàn)階段制備工程蛋白的主要的采用的技術(shù)之一，該技術(shù)的主要的特點(diǎn)是在表達(dá)目的多肽片段時(shí)，使目的多肽具有純化標(biāo)簽(Purification tag)，在其純化過(guò)程中，只需通過(guò)融合標(biāo)簽一步親和層析即可獲得高純的的融合蛋白，在本實(shí)驗(yàn)中LTAm的純化采用His標(biāo)簽融合，而LTB則采用CBD方式融合。3 ) 6 X Hi s-LTAm 蛋白純化。組氨酸標(biāo)簽純化原理多聚組氨酸親和標(biāo)簽(6XHis)層析的原理是組氨酸是具有雜環(huán)的氨基酸，每個(gè)組氨基酸含有一個(gè)咪唑基團(tuán)，這個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)帶有很多額外電子，對(duì)于帶正電的化學(xué)物質(zhì)有靜電引力，能夠與多種過(guò)渡金屬離子如Cu2+，Zn2+, Ni2+, Co2+，！^3+發(fā)生相互作用，有很高的親和力，然后利用咪唑進(jìn)行洗脫，利用這個(gè)原理對(duì)蛋白質(zhì)加以分離。4) 6XHis-LTAm 包涵體的制備。(1)接種表達(dá)菌液于500ml含100 μ g/ml Amp的2 X YT培養(yǎng)基中，經(jīng)IPTG總濃度 0. 5mM，誘導(dǎo)6小時(shí)。
(2) 4°C，8000rpm離心15min，收集菌體。用TE (PH8. 0)洗滌菌體兩次。(3)將菌體重懸于IOmlTE (PH8. 0)中，凍溶數(shù)次，超聲破碎(400W，每次4s，間隔 5s)至菌液清亮。4°C，12000rpm離心20min，收集沉淀。(4)沉淀重懸于:3ml的2mol/l尿素中，4°C放置lh，離心收集沉淀，上清保留。(5)沉淀重懸于5ml的8mol/l尿素中，于4°C放置過(guò)夜，4°C，12000rpm離心 lOmin，取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。5) 6XHis-LTAm融合蛋白的純化。將細(xì)胞破碎后的用NaOH調(diào)至pH7. 5，上樣于親和層析柱，刻柱事先用NTA-O緩沖液平衡，上樣后通過(guò)緩沖液NTA-O與緩沖液NTA-IOOO (20mM Tris-HCl，0. 5M NaCl, IOOOmM 咪唑，pH7. 5)混合，以不同濃度咪唑步進(jìn)式梯度洗脫目標(biāo)蛋白，隨后將收集的目標(biāo)峰上樣于 Sephadex G25凝膠柱進(jìn)行脫鹽，將其緩沖體系更換為IOmM的磷酸鈉緩沖液(pH=7. 4)。6) CBD標(biāo)簽融合表達(dá)蛋白的少量純化。CBD融合蛋白純化原理本實(shí)驗(yàn)中采用的ρ Β 11原核表達(dá)質(zhì)粒是NEB公司 IMPACTTM新型的蛋白融合表達(dá)及純化系統(tǒng)中的一種。表達(dá)的LTB蛋白與一種蛋白自剪接元件(稱為“內(nèi)含肽”，intein)其中含有幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域形成融合蛋白。通過(guò)利用內(nèi)含肽的可誘導(dǎo)自我剪接活性，在幾丁質(zhì)層析柱上將目標(biāo)蛋白釋放出來(lái)，達(dá)到采用一個(gè)層析柱進(jìn)行蛋白分離純化的方法。該系統(tǒng)無(wú)需蛋白酶參與，因而是一種快速而經(jīng)濟(jì)的蛋白純化方法。7) CBD標(biāo)簽融合表達(dá)蛋白樣品的制備。(1)細(xì)菌培養(yǎng)取一個(gè)單菌落先接種于IOml LB培養(yǎng)基含氨芐100 μ g/ml，37°C振蕩培養(yǎng)3-4h，后接種于200mL2XYT含氨芐100 μ g/ml液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D600達(dá) 0. 5后，20°C誘導(dǎo)。(2)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)加入IPTG至終濃度為0. 4mM，誘導(dǎo)8小時(shí)。設(shè)立陰性對(duì)照，陰性對(duì)照不加IPTG。(3)細(xì)胞收集5000Xg，4°C離心10分鐘，棄上清。將細(xì)胞貯存于_20°C。(4)細(xì)胞粗提物的制備用50ml冰冷的細(xì)胞裂解緩沖液(Cell Lysis Buffer)將菌體重懸，冰浴，超聲破碎細(xì)胞，使蛋白釋放。20，000Xg，離心10分鐘，上清即為澄清的細(xì)胞粗提物。8) CBD標(biāo)簽融合表達(dá)蛋白樣品的純化。(1) Chitin 柱的平衡將 24ml chitin beads 15ml 柱床體積倒入 2. 5X IOcm 柱中，用10個(gè)柱床體積的Column Buffer在4°C進(jìn)行柱平衡。Chitin的用量由融合蛋白的總量來(lái)決定，每毫升柱床體積大約能夠結(jié)合:3mg蛋白。(2)上樣將澄清的細(xì)胞粗提物緩慢加入Chitin柱，流速約為0. 5-1. Oml/min。上柱前將細(xì)胞粗提物與Column Buffer按比例1 :2_1 5混合稀釋，以提高蛋白結(jié)合效率。(3)洗柱由于CBD和Chitin beads的結(jié)合力很強(qiáng)，洗柱時(shí)可以用較高的流速 2-3ml/min IM NaCl，20倍柱床體積的緩沖液徹底洗柱。(4) Intein的自我裂解活性的誘導(dǎo)用3倍柱床體積的含有50mM DTT (或β -巰基乙醇或半胱氨酸)的誘裂解緩沖液(Cleavage Buffer)過(guò)柱，使巰基化合物均勻分布于整個(gè)Chitin柱。誘裂解緩沖液過(guò)柱后，將Chitin柱的出水口用柱帽堵上，20°C放置16小時(shí)，誘導(dǎo)htein的自我裂解活性。(5)目標(biāo)蛋白的洗脫釋放裂解反應(yīng)誘導(dǎo)后，目的蛋白與融合的intein尾分離， 可進(jìn)一步用Column Buffer或特定的蛋白貯存液洗脫。(6) Chitin樹脂的再生=Chitin樹脂可通過(guò)以下步驟重復(fù)再生使用4_5次。用3 倍柱床體積的0. 3M NaOH(即蛋白剝脫溶劑化物Gripping Solution)漂洗Chitin柱，使樹脂在該液中浸泡30分鐘后，再用7倍柱床體積的0. 3M NaOH進(jìn)一步洗脫，最后用20倍柱床體積的水和5倍柱床體積的Column Buffer漂洗。Chitin樹脂貯存于4°C。9)表達(dá)產(chǎn)物的純化結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中所構(gòu)建的BL21 (DE;3)/pCDFDuet-l-LTAm-LTB表達(dá)的融合蛋白LTAm含有多聚組氨酸，LTAm表達(dá)量也較高，占總蛋白量的35%，可以通過(guò)一步鎳離子金屬螯合層析得以純化。有文獻(xiàn)報(bào)到，雖然單獨(dú)的LTAm沒有活性，但是其可以增加LTB的活性，為了后續(xù)的 LTB跨膜活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)也對(duì)LTAm進(jìn)行了初步的純化。10) 6XHis-LTAm融合蛋白的純化。BL21/pCDFDuet-l-LTAm-LTB表達(dá)產(chǎn)物分析圖如圖8所示。重組表達(dá)質(zhì)粒在37°C 條件下，IPTG終濃度0. 5mM,誘導(dǎo)6小時(shí)以后，收集菌體后重懸超聲破碎，離心取沉淀。利用 Tris-HCl pH8. 5的8M尿素溶解包含體，4°C攪拌過(guò)夜，確保包涵體完全變性。將已變性的包含體與Ni柱介質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，約3小時(shí)后洗滌、洗脫。取溶解液5mL上樣，先用pH為8. 5 的Tris-HCl緩沖液平衡鎳柱介質(zhì)，讓介質(zhì)處于適合的緩沖體系中，上樣，結(jié)合3小時(shí)效果更好，用不同濃度階段的咪唑緩沖液洗脫目的蛋白，分別收集洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定分析純化結(jié)果見圖18所示。在50mM、100mM、200mM咪唑洗脫濃度下均有目標(biāo)蛋白出現(xiàn)，可知 200mM咪唑洗效果更好。經(jīng)蛋白掃描層析軟件掃描，在咪唑濃度200-250mM洗脫下來(lái)目標(biāo)蛋白，純度可達(dá)85%。由電泳圖18可知，6XHis-LTAm包含體溶解物在咪唑濃度為200mM就被洗脫下來(lái)。 可能是由于洗脫液的PH值會(huì)隨咪唑梯度而改變，一般咪唑的濃度越高，緩沖液的PH值越低。融合蛋白與Ni柱的結(jié)合主要是依賴His與Ni2+之間的靜電相互作用，pH值變化，His 殘基帶靜電荷的性質(zhì)發(fā)生變化，與M2+作用改變，且咪唑能競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合M2+柱，將目標(biāo)蛋白在較低濃度咪唑濃度下洗脫下來(lái)。11) CBD-LTB融合表達(dá)蛋白純化。在本實(shí)驗(yàn)中BL21/pITBll-LTB表達(dá)產(chǎn)物分析圖如圖16所示。重組表達(dá)質(zhì)粒在 20°C條件下，IPTG終濃度0.4mM，誘導(dǎo)8小時(shí)以后，收集菌體后重懸超聲破碎，15000rpm離心IOmin后取上清。用10個(gè)柱床體積的Column Buffer在4°C進(jìn)行柱平衡后，將澄清的細(xì)胞粗提物緩慢加入Chitin柱，流速約為0. 5-1. Oml/min。上柱前將細(xì)胞粗提物與Column Buffer按比例1 :2混合稀釋，以提高蛋白結(jié)合效率。用3倍柱床體積的含有50mM DTT的誘裂解緩沖液(Cleavage Buffer)過(guò)柱，使巰基化合物均勻分布于整個(gè)Chitin柱。誘裂解緩沖液過(guò)柱后，將Chitin柱的出水口用柱帽堵上，20°C放置16小時(shí)以誘導(dǎo)htein的自我裂解活性，用3倍體積Column Buffe洗脫，在用3倍柱床體積的Gripping Solution漂洗柱上的CBD蛋白。通過(guò)50mMDTT (1，4-dithiothreitol)20°C條件下，誘導(dǎo)的內(nèi)含肽的裂解作用16小時(shí)后，可以在幾丁質(zhì)介質(zhì)上將目標(biāo)蛋白釋放出來(lái)，而內(nèi)含肽與幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白仍然結(jié)合在幾丁質(zhì)介質(zhì)上，達(dá)到單柱分離和純化蛋白的目的。結(jié)果如圖19所示。
在使用采用的ρ ΒΙΙ原核表達(dá)質(zhì)粒純化蛋白融合時(shí)，與蛋白純化的結(jié)果與下列因素有關(guān)1)結(jié)合的第一個(gè)氨基酸與切割效率有關(guān)，切割位點(diǎn)最佳處的氨基酸為M、G、L時(shí)切割效率較高，而為P、S、C、T、R時(shí)效率較低；2)裂解溫度和裂解時(shí)間也是其中的一個(gè)關(guān)鍵的因素，裂解溫度越低則裂解效率低，需要的裂解時(shí)間越長(zhǎng)，使用Ρ Β11表達(dá)系統(tǒng)純化時(shí)一般采用4°C，誘導(dǎo)裂解48小時(shí)，但是本實(shí)驗(yàn)采用23°C，誘導(dǎo)16小時(shí)即可達(dá)到95%的裂解量；3) DTT濃度根據(jù)具體的情況來(lái)定。融合蛋白CBD-LTB的幾丁質(zhì)親和色譜的洗脫曲線如圖20所示。由圖19和圖21可以看出在12KD和43KD處均有特異性裂解條帶出現(xiàn)，符合LTB分子量12KD與LTB-EGFP分子量43KD的預(yù)測(cè)。實(shí)施例五純化后LTm及其亞基蛋白的檢測(cè)與初步應(yīng)用。1)細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞株人乳腺癌細(xì)胞株Bcap-37，由華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院基因與蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)室所保存。細(xì)胞的復(fù)蘇、細(xì)胞的傳代、細(xì)胞的凍存(參考細(xì)胞培養(yǎng)手冊(cè))。2)細(xì)胞的計(jì)數(shù)。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。具體方法如下用PBS緩沖液洗滌兩次后，用消化液分散單層培養(yǎng)細(xì)胞，制成單個(gè)細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋玻片邊緣，使懸液充滿蓋玻片和計(jì)數(shù)板之間，靜置:3min后，鏡下觀察，用IOX物鏡觀察計(jì)數(shù)板四角和中間大方格中的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞壓中線時(shí)，只計(jì)左側(cè)和上方，不計(jì)右側(cè)和下方的細(xì)胞。3) LTB-EGFP融合蛋白的體外穿膜活性檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人乳腺癌細(xì)胞株Bcap-37，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5' IO4/ ml并接種于96孔板中，每孔加入100 μ 1，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞充分貼壁后，小心吸掉上清，加入含融合蛋白LTB-EGFP 50mg/L的培養(yǎng)基，每孔100μ 1，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，陰性對(duì)照組為稀釋同樣倍數(shù)的ΡΗ8. 5 PBS。經(jīng)過(guò)9小時(shí)后取出培養(yǎng)板吸掉培養(yǎng)液，剩下的貼壁細(xì)胞繼續(xù)用PBS洗滌3遍，徹底洗凈沒有結(jié)合在細(xì)胞膜蛋白。在紫外熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的狀態(tài)。4)工程菌表達(dá)產(chǎn)物Wfestern Blotting免疫活性檢測(cè)。由于目前尚無(wú)只針對(duì)單一 A亞基檢測(cè)的試劑，故只能采用針對(duì)表達(dá)產(chǎn)物L(fēng)TB做檢測(cè)，進(jìn)而判斷表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性。在LTB的檢測(cè)過(guò)程中，通常采用CTB多克隆抗體對(duì)LTB 進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)以一抗羊CTB多克隆抗體對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的LTB進(jìn)行檢測(cè)來(lái)達(dá)到檢測(cè)目的。 由圖22可知在第2孔道中52-72KD之間出現(xiàn)特異性的結(jié)合條帶，這與CBD-LTB分子量67KD 預(yù)期相符，在3、4、5、6、7孔道中11-17KD之間均出現(xiàn)特異性條帶，這也與LTB分子量12KD 的預(yù)期相符。結(jié)合空白的BL21菌株相比，其他孔道中在^KD處明顯有蛋白的增加，可以推測(cè)出成功的表達(dá)出具有免疫原性的LTB蛋白和CBD-LTB蛋白。5)重組蛋白LTB-EGFP細(xì)胞跨膜作用檢測(cè)結(jié)果。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人乳腺癌細(xì)胞株Bcap-37，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5' IO4/ ml并接種于96孔板中，每孔加入100 μ 1，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞充分貼壁后，小心吸掉上清，加入含融合蛋白LTB-EGFP 50mg/L的培養(yǎng)基，每孔100μ 1，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，陰性對(duì)照組為稀釋同樣倍數(shù)的ΡΗ8. 5 PBS。經(jīng)過(guò)9小時(shí)后取出培養(yǎng)板吸掉培養(yǎng)液，剩下的貼壁細(xì)胞繼續(xù)用PBS洗滌3遍，徹底洗凈沒有結(jié)合在細(xì)胞膜蛋白。在紫外熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的狀態(tài)，如圖23所示。接有LTB-EGFP與陰性對(duì)照相比，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出明顯的綠色熒光。單獨(dú)的 EGFP是不能獨(dú)立的穿透正常生長(zhǎng)的細(xì)胞，表明LTB-EGFP具有跨膜活性。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種疫苗黏膜免疫佐劑分子的制備方法，所述黏膜免疫佐劑為大腸桿菌熱敏感毒素 LT、大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm以及大腸桿菌熱敏感毒素亞基蛋白LTA與LTB，其特征在于，將不同亞基蛋白LTA、LTB或全蛋白質(zhì)LT分別構(gòu)建于不同的表達(dá)框以調(diào)節(jié)多亞基蛋白 LT、突變體及其亞基的表達(dá)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種疫苗黏膜免疫佐劑分子的制備方法，其特征在于，利用 ρ⑶FDuet-I和ρ ΒΙΙ兩類載體，在基因水平將LT突變體LTm或其LTA或LTB亞單位基因或 LTA 的突變體 LTAm 的原核表達(dá)載體 pCDFDuet-1-LTAm-LTB、pCDFDuet-1-MCSl-LTm、 pCDFDuet-l-LTB-LTm、pCDFDuet-l-MCSl-LTB、pCDFDuet-l-LTB-LTm、pTYBl 1-LTB-EGFP、 pTYBIl-LTB或ρ ΒΙI-LTm中的一種或幾種轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種疫苗黏膜免疫佐劑分子的制備方法，其特征在于，表達(dá)質(zhì)粒為 pCDFDuet-1-LTAm-LTB、pCDFDuet-1-MCSl-LTm 或者 pTYBl I-LTB 中的一種或幾種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種疫苗黏膜免疫佐劑分子的制備方法，其特征在于，工程菌BL21/ρ ΒΙI-LTB的誘導(dǎo)表達(dá)條件為在2XYT培養(yǎng)基之中，在37°C生長(zhǎng)到0D600=0. 8 后，轉(zhuǎn)至20°C下培養(yǎng)，以IPTG終濃度0. 4mM進(jìn)行誘導(dǎo)他。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種疫苗黏膜免疫佐劑分子的制備方法，其特征在于，所述 LTm 包括 LTm7，LTm63, LTml 12 和 LTml92。
全文摘要
本發(fā)明公開一種疫苗黏膜免疫佐劑分子的制備方法，主要運(yùn)用將不同亞基或全蛋白質(zhì)分別構(gòu)建于不同的表達(dá)框以調(diào)節(jié)多亞基蛋白LT、突變體及其亞基的表達(dá)量，以克服多亞基復(fù)雜蛋白對(duì)其整體進(jìn)行基因表達(dá)效能降低的問題，從而促進(jìn)疫苗黏膜免疫佐劑的有效制備。這種對(duì)疫苗黏膜免疫佐劑大腸桿菌熱敏感毒素LT(heat-labiletoxin,LT)突變體及其亞基的制備方法，不僅適合于LT及其突變體與亞基本身的有效制備，制作工藝程序簡(jiǎn)便、快捷，而且也對(duì)類似結(jié)構(gòu)的多亞基蛋白質(zhì)，包括酶，建立了一種在基因水平分別構(gòu)建、組合表達(dá)，以最終實(shí)現(xiàn)在蛋白水平的按比例、有活性的組合制備完整蛋白的技術(shù)。
文檔編號(hào)C07K14/245GK102382853SQ20111003896
公開日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月16日
發(fā)明者劉琨, 姚碧, 鄭文云, 馬興元 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)