專利名稱：一種凝膠層析制備殼寡糖單體的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種殼寡糖單一組分的分離純化方法，具體地說是一種凝膠層析制備殼寡糖單體的方法。
背景技術：
殼寡糖是由2-15個氨基葡萄糖單元構成的低聚糖，其醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、輕工業(yè)等領域的廣泛的功能已經(jīng)得到學術界和市場的普遍認可；殼寡糖作為一個整體(2-15糖的混合物)，人們基本清楚它所具有的功能，但隨著技術的發(fā)展，科學家應該逐漸的清楚到底是哪一段起作用，起什么樣的作用，這樣才能針對不同的功能開發(fā)出來不同的產(chǎn)品，并能保證產(chǎn)品的可控性和穩(wěn)定性。為了這個行業(yè)的科學研究能持續(xù)深入，為了這個產(chǎn)業(yè)能夠健康地發(fā)展，必須有一個很好的質量控制平臺，而這個平臺一定會涉及到標準品，如果沒有標準品， 就講不清楚它的組成，更解釋不好它所具備的功能。有了標準品，就可以按照標準要求規(guī)模化制備殼寡糖單體，降低成本，提高應用范圍。目前在殼寡糖單體方面已經(jīng)有了零星的研究成果，比如對糖尿病而言，殼六糖是免疫系統(tǒng)的天然佐劑，是I型糖尿病的天然克星；殼四糖是II型糖尿病的天然克星，它調整細胞膜外被糖鏈異常，起到放大信號，加快速度，提高準確性的作用，且作用極其顯著。另有文獻報道殼六糖抗腫瘤效果良好，而最近中科院大連化物所報道，殼六糖能夠通過抑制血管內皮細胞的遷移而抑制腫瘤的血管生成，即殼六糖可進一步用于制備治療腫瘤和抑制腫瘤轉移的藥物中。但是因制備工藝復雜，目前，殼寡糖單體價格是極其昂貴的，急需一種簡便易行的工藝制得殼寡糖單體純品，以推動殼寡糖行業(yè)的基礎研究和應用研究，對甲殼素產(chǎn)業(yè)起到舉足輕重的推動作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種方法簡單合理、分離效果好、收率高、單體純度較高的凝膠層析制備殼寡糖單體的方法。本發(fā)明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現(xiàn)的。本發(fā)明是一種凝膠層析制備殼寡糖單體的方法，其特點是，其步驟如下
(1)殼寡糖溶液的配制以聚合度為2-15且其中聚合度為2-7的占其質量的90%以上、 脫乙酰度大于90%的殼寡糖為原料，將殼寡糖以20-70%的質量濃度溶于雙重蒸餾水中，待完全溶解后，抽濾，濾液即為殼寡糖溶液；
(2)將殼寡糖溶液上樣于凝膠層析柱，用雙重蒸餾水洗脫，流速為15-100ml/h；用自動部分收集器每30分鐘收集一管，每管取0. 1ml，丙酮沉淀后，將沉淀用蒸餾水溶解，然后用 TLC快速檢測，確定每管所含殼寡糖單體的種類；每管另取少量液體冷凍干燥，稱固形物含量，以確定每管所含的殼寡糖的濃度，繪制洗脫曲線；分離得到分別含有殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖和殼六糖單體的溶液；(3)把上述殼寡糖單體溶液于40°C減壓濃縮，得濃縮液，冷凍干燥，得各殼寡糖單體。以上所述的凝膠層析制備殼寡糖單體的方法的步驟(2)中層析用凝膠優(yōu)選聚丙烯酰胺凝膠，其粒徑為40-100 μ m,吸水膨脹率為2. 5-3. 5倍，有效分離分子量為300-5000 道爾頓。以上所述的凝膠層析制備殼寡糖單體的方法的步驟(2)中所述的原料殼寡糖與層析用凝膠的比例優(yōu)選0. 5-5g: 1500ml。以上所述的凝膠層析制備殼寡糖單體的方法的步驟(2)中TLC快速檢測所用檢測薄層板優(yōu)選高效硅膠板，點樣量為1-20微克，展開距離為10-15cm，顯色方法為加熱顯色。本發(fā)明所分離的殼寡糖最終使用HPLC和MALDI-T0F-MS方法來鑒定純度和糖的種類，其結果與TLC結果相互驗證，證明本發(fā)明所用方法高效實用，制備的殼寡糖單體可作為標注品使用，也可作為研究用生化試劑。本發(fā)明殼寡糖的分離純化，主要是先用凝膠層析法對殼寡糖進行精確分離，所用的流動相為純水，這樣組分的后處理簡單，不易污染，結構不易破壞。本發(fā)明方法所得到的殼寡糖單體純度高，收率高，穩(wěn)定，容易保存；分離方法操作簡單、方便，技術路線成熟，所用的填料均可以重復使用。
具體實施例方式以下進一步描述本發(fā)明的具體技術方案，以便于本領域的技術人員進一步地理解本發(fā)明，而不構成對其權利的限制。實施例1。一種凝膠層析制備殼寡糖單體的方法，其步驟如下
(1)殼寡糖溶液的配制以聚合度為2-15且其中聚合度為2-7的占其質量的90%以上、 脫乙酰度大于90%的殼寡糖為原料，將殼寡糖以20%的質量濃度溶于雙重蒸餾水中，待完全溶解后，抽濾，濾液即為殼寡糖溶液；
(2)將殼寡糖溶液上樣于凝膠層析柱，用雙重蒸餾水洗脫，流速為15ml/h；用自動部分收集器每30分鐘收集一管，每管取0. Iml，丙酮沉淀后，將沉淀用蒸餾水溶解，然后用TLC快速檢測，確定每管所含殼寡糖單體的種類；每管另取少量液體冷凍干燥，稱固形物含量，以確定每管所含的殼寡糖的濃度，繪制洗脫曲線；分離得到分別含有殼二糖、殼三糖、殼四糖、 殼五糖和殼六糖單體的溶液；
(3)把上述殼寡糖單體溶液于40°C減壓濃縮，得濃縮液，冷凍干燥，得各殼寡糖單體。實施例2。一種凝膠層析制備殼寡糖單體的方法，其步驟如下
(1)殼寡糖溶液的配制以聚合度為2-15且其中聚合度為2-7的占其質量的90%以上、 脫乙酰度大于90%的殼寡糖為原料，將殼寡糖以70%的質量濃度溶于雙重蒸餾水中，待完全溶解后，抽濾，濾液即為殼寡糖溶液；
(2)將殼寡糖溶液上樣于凝膠層析柱，用雙重蒸餾水洗脫，流速為100ml/h；用自動部分收集器每30分鐘收集一管，每管取0. 1ml，丙酮沉淀后，將沉淀用蒸餾水溶解，然后用TLC 快速檢測，確定每管所含殼寡糖單體的種類；每管另取少量液體冷凍干燥，稱固形物含量， 以確定每管所含的殼寡糖的濃度，繪制洗脫曲線；分離得到分別含有殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖和殼六糖單體的溶液；(3)把上述殼寡糖單體溶液于40°C減壓濃縮，得濃縮液，冷凍干燥，得各殼寡糖單體。實施例3。一種凝膠層析制備殼寡糖單體的方法，其步驟如下
(1)殼寡糖溶液的配制以聚合度為2-15且其中聚合度為2-7的占其質量的90%以上、 脫乙酰度大于90%的殼寡糖為原料，將殼寡糖以50%的質量濃度溶于雙重蒸餾水中，待完全溶解后，抽濾，濾液即為殼寡糖溶液；
(2)將殼寡糖溶液上樣于凝膠層析柱，用雙重蒸餾水洗脫，流速為60ml/h；用自動部分收集器每30分鐘收集一管，每管取0. Iml，丙酮沉淀后，將沉淀用蒸餾水溶解，然后用TLC快速檢測，確定每管所含殼寡糖單體的種類；每管另取少量液體冷凍干燥，稱固形物含量，以確定每管所含的殼寡糖的濃度，繪制洗脫曲線；分離得到分別含有殼二糖、殼三糖、殼四糖、 殼五糖和殼六糖單體的溶液；
(3)把上述殼寡糖單體溶液于40°C減壓濃縮，得濃縮液，冷凍干燥，得各殼寡糖單體。實施例4。實施例1或2或3所述的方法的步驟(2)中，層析用凝膠為聚丙烯酰胺凝膠，其粒徑為40-100 μ m,吸水膨脹率為2. 5-3. 5倍，有效分離分子量為300-5000道爾頓。實施例5。實施例1或2或3所述的方法的步驟(2)中，所述的原料殼寡糖與層析用凝膠的比例為0. 5-5g: 1500ml。實施例6。實施例1或2或3所述的方法的步驟(2)中，TLC快速檢測所用檢測薄層板為高效硅膠板，點樣量為1-20微克，展開距離為10-15cm，顯色方法為加熱顯色。實施例7。凝膠層析制備殼寡糖單體的方法實驗一。將0. 5g殼寡糖溶于IOml水中，待完全溶解后，過濾，濾液上樣于凝膠層析柱 (Bio-Gel P-2)中，柱子內徑25mmX柱高1500mm，實裝凝膠高度為1200mm ；用雙重蒸餾水洗脫，流速為15-100ml/h。每30分鐘收集一次，組分取0. 1ml，丙酮沉淀后，將沉淀用蒸餾水溶解，然后用TLC快速檢測，確定組分的性質。另取少量液體冷凍干燥，稱固形物含量，以確定每瓶所含的糖濃度，制備洗脫曲線。得出組分35-39為殼二糖；組分42-49為殼三糖； 組分53-71為殼四糖；組分75-91為殼五糖；組分94-102為殼六糖；合并上述的單一組分， 減壓濃縮后冷凍干燥得各殼寡糖單體。殼寡糖與層析凝膠的用量比例為0.5g:1200ml，TLC檢測所用的高效硅膠板為 Merck 1.05553，點樣量為1_20微克，以不同聚合度殼寡糖單體(n=l_6)為對照，展開距離為10-15cm，顯色劑為大茴香醛顯色劑，顯色方法加熱顯色，顯色效果良好，能檢測出樣品中
痕量雜質。對目標物采用HPLC和MS進行純度檢測，得出殼二糖純度> 98%、殼三糖純度 ^ 98%、殼四糖純度> 95%、殼五糖純度> 90%、殼六糖純度> 88%。其中殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖均可用作標準品。實施例8。凝膠層析制備殼寡糖單體的方法實驗二。將Ig殼寡糖溶于15ml水中，待完全溶解后，過濾，濾液上樣于凝膠層析柱 (Bio-Gel P-4)中，柱子內徑35mmX柱高1200mm，實裝凝膠高度為IlOOmm ；用雙重蒸餾水洗脫，流速為20-80ml/h。每30分鐘收集一次，組分取0. 1ml，丙酮沉淀后，將沉淀用蒸餾水溶解，然后用TLC快速檢測，確定組分的性質。另取少量液體冷凍干燥，稱固形物含量，以確定每瓶所含的糖濃度，制備洗脫曲線。得出組分30-36為殼二糖；組分38-44為殼三糖；組分47-65為殼四糖；組分68-76為殼五糖；組分79-84為殼六糖；合并上述的單一組分，減壓濃縮后冷凍干燥得各殼寡糖單體。殼寡糖與層析凝膠的用量比例為lg: 1800ml, TLC檢測所用的高效硅膠板為 Merck 1.05553，點樣量為1_20微克，以不同聚合度殼寡糖單體(n=l_6)為對照，展開距離為10-15cm，顯色劑為大茴香醛顯色劑，顯色方法加熱顯色，顯色效果良好，能檢測出樣品中
痕量雜質。對目標物采用HPLC和MS進行純度檢測，得出殼二糖純度> 99%、殼三糖純度 ^ 98%、殼四糖純度> 96%、殼五糖純度> 92%、殼六糖純度> 90%。其中殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖、殼六糖均可用作化學標準品。實施例7和8中所用的高效液相色譜檢測儀器均為=Waters公司的Breeze HPLC, 2487 Dual λ absorbtance 檢測器；Shodex 公司的 Asahipak NH2P-50 4E 柱。 MALDI-T0F-MS 檢測儀器為=Bruker 公司的 Autoflex III TOF MS。
權利要求
1.一種凝膠層析制備殼寡糖單體的方法，其特征在于，其步驟如下(1)殼寡糖溶液的配制以聚合度為2-15且其中聚合度為2-7的占其質量的90%以上、 脫乙酰度大于90%的殼寡糖為原料，將殼寡糖以20-70%的質量濃度溶于雙重蒸餾水中，待完全溶解后，抽濾，濾液即為殼寡糖溶液；(2)將殼寡糖溶液上樣于凝膠層析柱，用雙重蒸餾水洗脫，流速為15-100ml/h；用自動部分收集器每30分鐘收集一管，每管取0. 1ml，丙酮沉淀后，將沉淀用蒸餾水溶解，然后用 TLC快速檢測，確定每管所含殼寡糖單體的種類；每管另取少量液體冷凍干燥，稱固形物含量，以確定每管所含的殼寡糖的濃度，繪制洗脫曲線；分離得到分別含有殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖和殼六糖單體的溶液；(3)把上述殼寡糖單體溶液于40°C減壓濃縮，得濃縮液，冷凍干燥，得各殼寡糖單體。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中，層析用凝膠為聚丙烯酰胺凝膠，其粒徑為40-100 μ m,吸水膨脹率為2. 5-3. 5倍，有效分離分子量為300-5000道爾頓。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中，所述的原料殼寡糖與層析用凝膠的比例為0. 5-5g: 1500ml。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中，TLC快速檢測所用檢測薄層板為高效硅膠板，點樣量為1-20微克，展開距離為10-15cm，顯色方法為加熱顯色。
全文摘要
一種凝膠層析制備殼寡糖單體的方法，其特征在于，其步驟如下將殼寡糖以20-70%的質量濃度溶于雙重蒸餾水中，待完全溶解后，抽濾，濾液即為殼寡糖溶液；將殼寡糖溶液上樣于凝膠層析柱，用雙重蒸餾水洗脫，用自動部分收集器每30分鐘收集一管，每管取0.1ml，丙酮沉淀后，將沉淀用蒸餾水溶解，然后用TLC快速檢測，確定每管所含殼寡糖單體的種類；每管另取少量液體冷凍干燥，稱固形物含量，以確定每管所含的殼寡糖的濃度，繪制洗脫曲線；分離得到含有殼寡糖單體的溶液；減壓濃縮，冷凍干燥，得各殼寡糖單體。本發(fā)明成本低，操作簡單、方便，技術路線成熟，制備的殼寡糖單體純度高，可作為標準品使用，也可作為研究用生化試劑。
文檔編號C07H5/06GK102174064SQ20111006895
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月22日 優(yōu)先權日2011年3月22日
發(fā)明者曾毅偉, 李燕, 肖輝, 陳列歡 申請人:連云港?？瞪锟萍加邢薰?br>