專利名稱：一種機(jī)體保護(hù)多肽(bpc 157肽)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于肽工程領(lǐng)域，具體涉及機(jī)體保護(hù)多肽(BPC 157肽)的制備方法，尤其適用于放大生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
BPC 157 (body protection compound)為胃液妝(gastric juice peptide)的片段，由15個氨基酸組成，分子量1419。氨基酸序列為Gly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys-Pro-A la-Asp-Asp-AlaAly-Leu-Val (甘-谷-脯-脯-脯-甘-賴-脯-丙-天冬-天冬-丙-甘-亮-纈)。
BPC 157具有細(xì)胞保護(hù)、抗?jié)兒涂寡鬃饔茫渥饔煤图?xì)胞保護(hù)、NO系統(tǒng)、細(xì)胞遷移有關(guān)
O

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種固相合成BPC157肽的制備方法，為機(jī)體保護(hù)多肽(BPC 157肽)的應(yīng)用提供原料保障。包括手工固相多肽合成法和微波自動固相多肽合成法，以適用于放大生產(chǎn)。本發(fā)明提供的技術(shù)方案具體為一種BPC157肽的固相制備方法，包括以下步驟以三苯氯甲基樹脂為合成樹脂，包括4-甲基-三苯氯甲基樹脂、4-甲氧基-三苯氯甲基樹脂、2-氯-三苯氯甲基樹脂或王氏樹脂，以以上樹脂中的任何一種為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有Fmoc保護(hù)的氨基酸，獲的保護(hù)的BPC157肽樹脂，其間依次脫去 Riioc 保護(hù)基團(tuán)，用 DIC/HOBt 或 DIC/HOAt 或 B0P/H0Bt 或 B0P/H0At 或 HBTU/HOBt 或 HBTU/HOAt或HATU/HOBt或HATU/HOAt或HCTU/HOBt中的一種為縮合劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，得保護(hù)的BPC157肽樹脂后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得BPC157肽粗品，并經(jīng)C18或C8 色譜柱進(jìn)行分離純化，獲得所需的BPC157肽純品。更具體地，按照本發(fā)明，依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)BPC157肽樹脂，其間依次脫去Fmoc保護(hù)基團(tuán)的方法包括以下步驟(1)制備 Fmoe-Val-樹脂選用三苯氯甲基樹脂、4-甲基-三苯氯甲基樹脂、4-甲氧基-三苯氯甲基樹脂、 2-氯-三苯氯甲基樹脂或王氏樹脂中任一種樹脂，用N，N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷浸泡10 60分鐘，混合物中，樹脂的重量體積濃度為5-20ml/g ；然后在上述的樹脂中，加入 DIEA、DIC或DMAP、Fmoc-Val-OH, 10 50°C反應(yīng)0. 5 5小時，再加入封閉試劑甲醇、苯甲酰氯或吡啶10 50°C反應(yīng)0. 2-3小時，樹脂用異丙醇、N, N-二甲基甲酰胺洗滌，獲得 Fmoc-Val-樹脂；DIEA或DMAP的摩爾數(shù)為樹脂的2 20倍；Fmoc-Val-OH的摩爾數(shù)為樹脂的1 10倍反應(yīng)溶液中，樹脂的濃度為0. 1 5ml/g ；(2)制備 Fmoc-Leu-Val-樹脂
在步驟(1)的Fmoc-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°c反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Leu-0H、DIEA、TBTU/H0Bt或HBTU/ HOBt或BOP/HOBt的混合物，10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3 次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，抽干，獲得Fmoc-Leu-Val-樹脂；所說的脫帽試劑的組分和體積比為PIP DMF = 1 2_5，下同；Fmoc-Leu-OH的摩爾數(shù)為樹脂的1-5倍；Fmoc-Val-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5 20ml/g ；TBTU/HBTU/B0P的摩爾數(shù)為樹脂的2_5倍；Η0ΒΤ/Η0ΑΤ摩爾數(shù)為樹脂的2_5倍；(3)制備 Fmoc-Gly-Leu-Val-樹脂在步驟⑵的Fmoc-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘， 用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°c反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次， DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Gly-OH、DIEA、TBTU/HOBt 或HBTU/HOBt或B0P/H0Bt的混合物，10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，抽干，獲得Fmoc-Gly-Leu-Val-樹脂；Fmoc-Gly-OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍；其余操作以及工藝條件同上；(4)制備 Fmoc-Ala-Gly-Leu-Val-樹脂在步驟(3)的Fmoc-Gly-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30 分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3 次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Ala_0H、DIEA、TBTU/H0Bt 或HBTU/HOBt或B0P/H0Bt的混合物，10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，抽干，獲得Fmoc-Ala-Gly-Leu-Val-樹脂；Fmoc-Ala-OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍其余操作以及工藝條件同上；(5)制備 Fmoc-Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂在步驟⑷的Fmoc-Ala-Gly-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Asp (otBu) -0H、 DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 B0P/H0Bt 的混合物，10 50 °C 反應(yīng) 10 60 分鐘， 用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，抽干，獲得 Fmoc-Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹月旨；Fmoc-Asp (otBu) -OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍其余操作以及工藝條件同上； (6)制備 Fmoc-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂在步驟(5)的 Fmoc-Asp (otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑 10
50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，加入用DMF溶解的 Fmoc-Asp (otBu) -OH.DIEA.TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10 50°C反應(yīng) 10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，抽干，獲得 Fmoc-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala_GIy-Leu-Val-樹月旨；Fmoc-Asp (otBu) -OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍其余操作以及工藝條件同上；(7)制備 Rnoc-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂在步驟(6)的Fmoc-Asp (otBu)-Asp (otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，加入用DMF溶解的 Fmoc-Ala-OH, DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 B0P/H0Bt 的混合物，10 50°C反應(yīng) 10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，抽干，獲得 Fmoc-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-樹月旨；Fmoc-Ala-OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍其余操作以及工藝條件同上；(8)制備 Fmoc-Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂在步驟(7)的Rnoc-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng) 10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，加入用DMF 溶解的 Fmoc-Pro-0H、DIEA、TBTU/H0Bt 或 HBTU/HOBt 或 B0P/H0Bt 的混合物，10 50°C反應(yīng) 10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，抽干，獲得 Fmoc-Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂； Fmoc-Pro-OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍其余操作以及工藝條件同上；(9)制備 Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-樹脂在步驟(8)的Rnoc-Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂中， 加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用洗滌異丙醇3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，加入用 DMF 溶解的 Fmoc-Lys (Boc) -0H、DIEA、TBTU/H0Bt 或 HBTU/HOBt 或 B0P/H0Bt 的混合物，10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌 2 次，抽干，獲得 Fmoc-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂；Fmoc-Lys (Boc) -OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍其余操作以及工藝條件同上；(10)制備 Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Va 1-樹脂在步驟(9)的 Fmoc-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val -樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，加入用 DMF 溶解的 Rnoc-Gly-0H、DIEA、TBTU/H0Bt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌 2 次，抽干，獲得 Fmoc-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val -樹脂樹脂；Fmoc-Gly-OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍其余操作以及工藝條件同上； (11)制備 Fmoc-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Le U-Val-樹脂在步驟(10)的 Fmoc-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Le u-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌 2 次，加入用 DMF 溶解的 Fmoc-Pro-0H、DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 B0P/H0Bt 的混合物，10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的 DMF 洗滌 2 次，抽干，獲得 Fmoc-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -A Ia-Gly-Leu-Val-樹脂；Fmoc-Pro-OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍其余操作以及工藝條件同上；(12)制備 Fmoc-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gl y-Leu-Val-樹脂在步驟(11)的 Fmoc-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gl y-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF 洗滌 2 次，加入用 DMF 溶解的 Fmoc-Pro-OH, DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的 DMF 洗滌 2 次，抽干，獲得 Fmoc-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (ο tBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂；Fmoc-Pro-OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍其余操作以及工藝條件同上；(13)制備 Fmoc-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Al a-Gly-Leu-Val-樹脂在步驟(12)的 Fmoc-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Al a-Gly-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的 DMF 洗滌 2 次，加入用 DMF 溶解的 Fmoc-Pro-OH、DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/ HOBt的混合物，10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌 3 次，重蒸過的 DMF 洗滌 2 次，抽干，獲得 Fmoc-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (ο tBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂；Fmoc-Pro-OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍
其余操作以及工藝條件同上；(14)制備 Fmoc-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-As ρ (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹月旨在步驟(I3)的 Fmoc-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otB u)-Ala-Gly-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干， 重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次， 重蒸過的 DMF 洗滌 2 次，加入用 DMF 溶解的 Fmoc-Glu (otBu) -OH.DIEA.TBTU/HOBt 或 HBTU/ HOBt或BOP/HOBt的混合物，10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3 次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，抽干，獲得Fmoc-Glu (otBu) -Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-樹月旨；Fmoc-Glu (otBu) -OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍其余操作以及工藝條件同上；(15)制備 Fmoc-Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp (otBu )-Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂在步驟(14)的 Fmoc-Glu (otBu) -Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu )-Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Gly-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/ HOBt或BOP/HOBt的混合物，10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3 次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，抽干，獲得Fmoc-Gly-Glu (otBu) -Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-樹月旨；Fmoc-Gly-OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍其余操作以及工藝條件同上； (16)制備 Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp (otBu)-Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹月旨在步驟(15)的 Fmoc-Gly-Glu (otBu) -Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp ( otBu)-Asp (otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘， 用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次， DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，甲醇洗滌2次，用甲醇浸泡0. 5 3小時，抽干，用氮?dú)獯蹈蓸渲珊芨傻念w粒，所得到的樹脂為Gly-Glu (otBu) -Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-樹月旨；(17)把吹干的 Gly-Glu (otBu) -Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂倒入玻璃的切割瓶中，加入預(yù)冷至-20 10°C的切肽試劑(TFA/EDT/H20/Thio = 90-95/2-5/2-5/1-5，體積比)，10°C _50°C反應(yīng) 1-5 小時，過濾除去樹脂，加-20 10°C的冰乙醚沉淀，離心收集沉淀物，用乙醚洗滌1 6次，低溫冷凍干燥10 M小時，獲得BPC157肽粗品；切肽試劑中，樹脂的濃度為8_12ml/g按照本發(fā)明，粗品經(jīng)C18或C8色譜柱純化的方法包括如下步驟流動相有兩種=A :0. 三氟乙酸加99. 9%水；B 0. 1 %三氟乙酸加99. 9 %乙腈;梯度洗脫；流速為l-150ml/min ；檢測波長為215 觀5歷；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后去鹽，凍干，獲得成品。在本文中，如未特別指出，“常溫”表示室溫，即25°C。盡管理論上有DIC/DMAP 或 DIC/HOBt 或 DIC/HOAt 或 BOP/HOBt 或 BOP/HOAt 或 HBTU/HOBt 或 HBTU/HOAt 或 HATU/HOBt 或 HATU/HOAt 或 HCTU/HOBt 或 HUTC/HOAt 或 TBTU/ HOBt等試劑可以選擇，而且理論上也沒有重大區(qū)別。但是令人意想不到的是，盡管小試階段各試劑效果差異不顯著，但是進(jìn)入中試階段(即，實(shí)驗(yàn)放大)，我們發(fā)現(xiàn)，相對于其他試劑組合，用TBTU/HOBt反應(yīng)粗品純度較好，小試試驗(yàn)粗品純度達(dá)到78%以上，而中試批量生產(chǎn)粗品純度也能在基本不降低產(chǎn)率的條件下達(dá)到75%，經(jīng)過純化的成品，純度大于98%，不低于95%的藥用純度要求。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的BPC157肽固相合成制備方法具有以下特點(diǎn)原輔材料來源方便，工藝穩(wěn)定，收率高，質(zhì)量可控，產(chǎn)品純度高，生產(chǎn)周期短，成本低，可規(guī)模化生產(chǎn)。采用本發(fā)明方法制備的BPC157肽極具市場競爭力，其生產(chǎn)規(guī)模完全能夠滿足BPC157 肽的應(yīng)用需求，其質(zhì)量完全能夠達(dá)到BPC157肽的應(yīng)用要求。另外，在本發(fā)明的工藝中，采用溫和的Fmoc路線，每步脫Fmoc僅用20 %的PIP，每步縮合反應(yīng)時間短，大大縮短了生產(chǎn)周期；采用合理封閉技術(shù)，提高粗肽產(chǎn)品的純度；切割采用TFA，避免了常用的氟化氫，減少了生產(chǎn)中產(chǎn)生的三廢，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。前述過程中所采用的原料中英文列表如下
權(quán)利要求
1.制備BPC157肽的方法，其特征在于包括如下步驟以三苯氯甲基樹脂、4-甲基-三苯氯甲基樹脂、4-甲氧基-三苯氯甲基樹脂、2-氯-三苯氯甲基樹脂或王氏樹脂其中的任何一種為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有芴甲氧羰?；Ｗo(hù)的氨基酸，獲得保護(hù)的BPC157肽樹脂，其間依次脫去芴甲氧羰酰基保護(hù)基團(tuán)，用N，N- 二異丙基碳化二亞胺/1-羥基-苯并-三氮唑、N，N- 二異丙基碳化二亞胺/ N-羥基-7-偶氮苯并三氮唑、7-氮雜苯并唑-1-基-氧-(三-(二甲胺基)膦)六氟磷酸鹽/1-羥基-苯并-三氮唑、7-氮雜苯并唑-1-基-氧-(三-(二甲胺基)膦)六氟磷酸鹽/1-羥基-苯并-三氮唑/N-羥基-7-偶氮苯并三氮唑、苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯/1-羥基-苯并-三氮唑、苯并三氮唑_N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯 /N-羥基-7-偶氮苯并三氮唑、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N, N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯/1-羥基-苯并-三氮唑、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N, N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯 /N-羥基-7-偶氮苯并三氮唑或6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯八-羥基-苯并-三氮唑中的一種為縮合劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，得保護(hù)的BPC157肽樹脂后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得BPC157肽粗品，任選經(jīng)C18或C8色譜柱進(jìn)行分離純化，獲得所說的BPC157肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，制備過程中用微波輻射以加快反應(yīng)速度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于包括如下步驟(1)制備Fmoc-Val-樹脂以三苯氯甲基樹脂、4-甲基-三苯氯甲基樹脂、4-甲氧基-三苯氯甲基樹脂、2-氯-三苯氯甲基樹脂或王氏樹脂其中的一種作樹脂，用N，N- 二甲基甲酰胺或二氯甲烷浸泡10 60分鐘，混合物中，樹脂的重量體積濃度為5-20ml/g ；然后在上述的樹脂中，加入DIEA、DIC或DMAP、Fmoc-Val-OH, 10 50°C反應(yīng)0. 5 5 小時，再加入封閉試劑甲醇、苯甲酰氯或吡啶10 50°C反應(yīng)0. 2-3小時，樹脂用異丙醇、N， N-二甲基甲酰胺洗滌，獲得Fmoc-Val-樹脂； DIEA或DMAP的摩爾數(shù)為樹脂的2 20倍； Fmoc-Val-OH的摩爾數(shù)為樹脂的1 10倍 反應(yīng)溶液中，樹脂的濃度為0. 1 5ml/g ；(2)制備Fmoc-Leu-Val-樹脂在步驟(1)的Fmoc-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌 3次，重蒸過的DMF洗滌2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Leu-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/ HOBt或BOP/HOBt的混合物，10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3 次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，抽干，獲得Fmoc-Leu-Val-樹脂； 所說的脫帽試劑的組分和體積比為PIP DMF=I 2-5，下同； Fmoc-Leu-OH的摩爾數(shù)為樹脂的1_5倍；Fmoc-Val-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5 20ml/g ； TBTU/HBTU/B0P的摩爾數(shù)為樹脂的2_5倍； Η0ΒΤ/Η0ΑΤ摩爾數(shù)為樹脂的2-5倍；(3)制備Fmoc-Gly-Leu-Val-樹脂在步驟⑵的Fmoc-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Gly-0H、DIEA、TBTU/H0Bt或HBTU/ HOBt或BOP/HOBt的混合物，10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3 次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，抽干，獲得Fmoc-Gly-Leu-Val-樹脂； Fmoc-Gly-OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍； 其余操作以及工藝條件同上；(4)制備Fmoc-Ala-Gly-Leu-Val-樹脂在步驟⑶的Fmoc-Gly-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘， 用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次， DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Ala-0H、DIEA、TBTU/HOBt 或HBTU/HOBt或B0P/H0Bt的混合物，10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，抽干，獲得Fmoc-Ala-Gly-Leu-Val-樹脂；Fmoc-Ala-OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍 其余操作以及工藝條件同上；(5)制備Fmoc-Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂在步驟的Fmoc-Ala-Gly-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30 分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Asp (otBu)-0H、 DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 B0P/H0Bt 的混合物，10 50 °C 反應(yīng) 10 60 分鐘， 用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，抽干，獲得 Fmoc-Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹月旨；Fmoc-Asp (otBu) -OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍 其余操作以及工藝條件同上；(6)制備Fmoc-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂在步驟(5)的Fmoc-Asp (otBu) -Ala_GIy-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50 0C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，異丙醇洗滌3次，用DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，加入用DMF溶解的 Fmoc-Asp (otBu) -0H.DIEA,TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 B0P/H0Bt 的混合物，10 50°C反應(yīng) 10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，抽干，獲得 Fmoc-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala_GIy-Leu-Val-樹月旨； Fmoc-Asp (otBu) -OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍 其余操作以及工藝條件同上；(7)制備Rnoc-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂在步驟(6)的 Fmoc-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala_GIy-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60 分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，加入用DMF溶解的 Fmoc-Ala-OH, DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 B0P/H0Bt 的混合物，10 50°C反應(yīng) 10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，抽干，獲得 Fmoc-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-樹月旨； Fmoc-Ala-OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍 其余操作以及工藝條件同上；(8)制備Fmoc-Pro-Ala-Asp (otBu)-Asp (otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-樹脂在步驟(7)的 Fmoc-Ala-Asp (otBu)-Asp (otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，加入用DMF溶解的 Fmoc-Pro-OH, DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10 50°C反應(yīng) 10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，抽干，獲得 Fmoc-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-樹月旨； Fmoc-Pro-OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍 其余操作以及工藝條件同上；(9)制備Fmoc-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹月旨 在步驟(8)的 Fmoc-Pro-Ala-Asp (otBu)-Asp (otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng) 10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，加入用DMF 溶解的 Fmoc-Lys (Boc) -OH、DIEA、TBTU/HOBt 或HBTU/HOBt 或BOP/HOBt 的混合物，10 50°C 反應(yīng)10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2 次，抽干，獲得 Fmoc-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂； Fmoc-Lys (Boc) -OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍 其余操作以及工藝條件同上；(10)制備Fmoc-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂在步驟(9)的 Fmoc-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，加入用 DMF 溶解的 Rnoc-Gly-OH、DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌 2 次，抽干，獲得 Fmoc-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val -樹脂樹脂；Fmoc-Gly-OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍 其余操作以及工藝條件同上；(11)制備Fmoc-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Va 1-樹脂在步驟(10)的 Fmoc-Gly-Lys (Boc)-Pro-Ala-Asp (otBu)-Asp (otBu)-Ala-Gly-Leu-V al_樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑 10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌 2 次，加入用 DMF 溶解的 Fmoc-Pro-OH, DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的 DMF 洗滌 2 次，抽干，獲得 Fmoc-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala -Gly-Leu-Val-樹脂；Fmoc-Pro-OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍 其余操作以及工藝條件同上；(12)制備Fmoc-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Le U-Val-樹脂在步驟(11)的 Fmoc-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Le u-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌 2 次，加入用 DMF 溶解的 Fmoc-Pro-OH、DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的 DMF 洗滌 2 次，抽干，獲得 Fmoc-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otB U) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂；Fmoc-Pro-OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍 其余操作以及工藝條件同上；(13)制備Fmoc-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gl y-Leu-Val-樹脂在步驟(12)的 Fmoc-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gl y-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF 洗滌 2 次，加入用 DMF 溶解的 Fmoc-Pro-OH, DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的 DMF 洗滌 2 次，抽干，獲得 Fmoc-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -A sp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂；Fmoc-Pro-OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍 其余操作以及工藝條件同上；(14)制備Fmoc-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp (otBu)-Asp (ot Bu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂在步驟(1 的 Fmoc-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Al a-Gly-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的 DMF 洗滌 2 次，加入用 DMF 溶解的 Fmoc-Glu (otBu) -OH.DIEA,TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt的混合物，10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF 洗滌 3 次，重蒸過的 DMF 洗滌 2 次，抽干，獲得 Fmoc-Glu (otBu) -Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc )-Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂； Fmoc-Glu (otBu) -OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍 其余操作以及工藝條件同上；(15)制備Fmoc-Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asρ (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹月旨在步驟(14)的 Fmoc-Glu (otBu)-ftO-ftO-ftO-Gly-Lys (Boc)-Pro-Ala-Asp (otBu)-A sp (otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌 3次，重蒸過的DMF洗滌2次，加入用DMF溶解的Fmoc-Gly-OH、DIEA、TBTU/HOBt或HBTU/ HOBt或BOP/HOBt的混合物，10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌3 次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，抽干，獲得Fmoc-Gly-Glu (otBu) -Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp(otBu)-Ala-Gly-Leu-Val-樹月旨；Fmoc-Gly-OH摩爾數(shù)為樹脂的2 5倍其余操作以及工藝條件同上；(16)制備Gly-Glu(otBu)-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ala-Asp(otBu)-Asp (otB U) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂在步驟(15)的 Fmoc-Gly-Glu (otBu)-ftO-ftO-ftO-Gly-Lys (Boc)-Pro-Ala-Asp (otBu )-Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹脂中，加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)5 30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10 50°C反應(yīng)10 60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌3次，DMF洗滌3次，重蒸過的DMF洗滌2次，甲醇洗滌2次，用甲醇浸泡0. 5 3小時，抽干，用氮?dú)獯蹈蓸渲筛稍锏念w粒，所得到的樹脂為Gly-Glu (otBu) -Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-A la-Asp (otBu) -Asp (otBu) -Ala-Gly-Leu-Val-樹月旨；(17)粗品的獲得把吹干的 Gly-Glu (otBu) -Pro-Pro-Pro-Gly-Lys (Boc) -Pro-Ala-Asp (otBu) -Asp (otBu )-Ala-Gly-Leu-Val-樹脂倒入玻璃的切割瓶中，加入預(yù)冷至-20 10°C的切肽試劑(TFA/ EDTM20/Thio = 90-95/2-5/2-5/1-5，體積比)，10°C _50°C 反應(yīng) 1-5 小時，過濾除去樹脂， 加-20 10°C的冰乙醚沉淀，離心收集沉淀物，用乙醚洗滌1 6次，低溫冷凍干燥10 24小時，獲得BPC157肽粗品；切肽試劑中，樹脂的濃度為5 50ml/g。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其還包括粗品經(jīng)C18或C8色譜柱分離純化的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中粗品經(jīng)C18或C8色譜柱分離純化的步驟為將BPC157肽粗品溶于水溶液中，過濾，濾液經(jīng)C18或C8色譜柱純化，流動相有兩種A 0. 三氟乙酸加99. 9%水；B 0. 三氟乙酸加99. 9%乙腈；梯度洗脫；流速為l_150ml/ min ；檢測波長為215 ；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，凍干，獲得成品。
6.權(quán)利要求3所述的方法，其中TBTU/HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物優(yōu)選是 TBTU/HOBt的混合物。
7.權(quán)利要求3所述的方法，其如實(shí)施例1或2所述。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種合成機(jī)體保護(hù)多肽(BPC 157肽)的方法，包括以三苯氯甲基樹脂、4-甲基-三苯氯甲基樹脂、4-甲氧基-三苯氯甲基樹脂、2-氯-三苯氯甲基樹脂或王樹脂中的任何一種為起始原料，用DIC/HOBt或DIC/HOAt或BOP/HOBt或BOP/HOAt或HBTU/HOBt或HBTU/HOAt或HATU/HOBt或HATU/HOAt或HCTU/HOBt中的一種為縮合劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，獲得保護(hù)機(jī)體保護(hù)多肽(BPC 157肽)樹脂，其后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得BPC 157粗品，再經(jīng)C18(或C8)柱分離純化，冷凍干燥后，制得機(jī)體保護(hù)多肽(BPC 157肽)純品。該方法可用微波輻射以加快反應(yīng)速度，縮短多肽合成周期，降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明的方法制備的機(jī)體保護(hù)多肽(BPC 157肽)，具有原輔材料來源方便，工藝穩(wěn)定，接肽收率高，質(zhì)量可控，收率高，純度高，生產(chǎn)成本低，周期短，可規(guī)模化生產(chǎn)等諸多優(yōu)點(diǎn)，完全滿足機(jī)體保護(hù)多肽(BPC 157肽)的應(yīng)用要求。
文檔編號C07K1/04GK102229649SQ20111011480
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月5日
發(fā)明者張英起, 楊賽, 王增祿 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)