專利名稱：在昆蟲細胞中表達重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用昆蟲細胞-桿狀病毒蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)在昆蟲細胞中高效表達具有生物活性的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP2、BMP7的新技術(shù)方法。
背景技術(shù)：
骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)是1965年首次發(fā)現(xiàn)的一種能誘導(dǎo)常位及異位成骨的蛋白質(zhì)，具有誘導(dǎo)間充質(zhì)細胞和骨祖細胞分化為軟骨細胞和成骨細胞從而誘導(dǎo)新骨生成的能力。目前已鑒定并克隆出20多種BMP，它們屬于轉(zhuǎn)化生長因子3 (transforming growthfactor, TGF- ^ )超基因家族中的成員。BMP2是目前研究最為廣泛、誘導(dǎo)成骨活性最強的BMP之一。BMP7主要在骨和腎中表達，具有強大的骨誘導(dǎo)活性， 能刺激未分化的間充質(zhì)細胞增殖及其向成骨細胞或軟骨細胞方向分化，并促進成骨細胞的增殖和堿性磷酸酶的分泌。由于骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP具有高效誘導(dǎo)成骨活性，因而有重要的臨床應(yīng)用價值，包括用于修復(fù)骨缺損；用于脊柱融合術(shù)；治療股骨頭壞死；修復(fù)牙槽骨缺損。近年來基因重組的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP2和BMP7的安全性和有效性得到了充分的證實，美國FDA也于2002年7月批準重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP2、BMP7用于脊柱融合和骨缺損修復(fù)。但由于利用動物細胞制備的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白表達量低，制備成本高，致使治療成本高達6000-10000美元，從而大大限制了 BMP在臨床上的應(yīng)用。昆蟲細胞-桿狀病毒蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)由于其操作安全，表達量高，成本低，表達蛋白質(zhì)經(jīng)糖基化修飾易于折疊和產(chǎn)生高活性的特點，已被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)藥用蛋白質(zhì)。利用昆蟲細胞-桿狀病毒蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)高效表達生產(chǎn)重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP2、BMP7成熟肽，能夠大大降低其制備成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用昆蟲細胞-桿狀病毒蛋白質(zhì)表達系統(tǒng),高效、低成本地表達具有誘導(dǎo)成骨活性的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白，特別是BMP2、BMP7成熟肽，使其在臨床上得到廣泛應(yīng)用成為可能。本發(fā)明提供一種利用昆蟲細胞-桿狀病毒蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)表達制備人骨形態(tài)發(fā)生蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(I)將人骨形態(tài)發(fā)生蛋白成熟肽基因片段克隆到昆蟲細胞-桿狀病毒表達載體上，共轉(zhuǎn)染第一昆蟲細胞，培養(yǎng)該細胞，制備帶有人骨形態(tài)發(fā)生蛋白成熟肽基因片段的重組桿狀病毒；(2)用步驟(I)制備的重組桿狀病毒感染第二昆蟲細胞，培養(yǎng)該細胞，獲得表達的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白；(3)經(jīng)親和層析純化步驟(2)獲得的表達的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白。在一個實施方案中，所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白為BMP2或BMP7。在另一個實施方案中，所述第一昆蟲細胞為sf9昆蟲細胞，所述第二昆蟲細胞為High5昆蟲細胞。在一個優(yōu)選實施方案中，上述方法的步驟(3)中進行的親和層析在Ni-親和柱上進行。在更優(yōu)選的實施方案中，所述Ni-親和柱純化變性狀態(tài)的BMP2或BMP7，并在純化柱上直接復(fù)性BMP2或BMP7成熟肽。在更優(yōu)選的實施方案中，上述步驟(3)還包括脫鹽，例如經(jīng)PDlO柱脫鹽。


圖I顯示人BMP2、BMP7成熟肽的氨基酸序列與相應(yīng)的核酸序列。所述序列也記載在序列表中。BMP2含114個氨基酸，BMP7含139個氨基酸。圖2是重組桿狀病毒樣品經(jīng)PCR擴增后的凝膠電泳圖，證實了制備的重組桿狀病毒DNA包含編碼BMP2或BMP7成熟肽的DNA片段。M，DNA Marker ;1，陰性對照；2，BMP2陽性對照；3，含BMP2的病毒；4，BMP7陽性對照；5，含BMP7的病毒。
圖3顯示BMP2或BMP7成熟肽在昆蟲細胞High5中的表達。M，蛋白Marker ;dl，第I天；d2，第2天；d3，第3天。圖4顯示BMP2或BMP7成熟肽的純化。M，蛋白Marker ；T,昆蟲細胞總裂解物；Ρ，
純化蛋白。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進一步說明。下述實施例是說明性的，而不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。在昆蟲細胞中高效表達重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白ΒΜΡ2、ΒΜΡ7成熟肽的方法步驟如下(I)重組桿狀病毒的制備與鑒定分別在人ΒΜΡ2、ΒΜΡ7成熟肽(圖10-端加入6沾匕標簽，并將其基因片段以8&111!11和EcoRI位點克隆到改進的昆蟲-桿狀病毒表達載體上，然后共轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細胞，28°C培養(yǎng)5天后，收集轉(zhuǎn)染上清培養(yǎng)液，用蛋白酶K裂解桿狀病毒，以病毒基因組DNA為模板進行PCR,擴增出分別編碼BMP2和BMP7成熟肽的DNA片段(圖2)，表明已成功制備了帶有BMP2或BMP7成熟肽基因片段的重組桿狀病毒。(2)重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP2、BMP7在昆蟲細胞中的表達與純化將制備和鑒定的重組病毒上清液大量感染sf9昆蟲細胞，28°C培養(yǎng)5天后，收集重組病毒上清液，再大量感染High5昆蟲細胞，28°C培養(yǎng)2-3天后，2000rpm離心IOmin收集細胞，溶于裂解液(IOOmMNaH2PO4,8M尿素，pH8. O)。12000rpm離心20min后，上清液過Ni-親和柱，用緩沖液(IOOmM NaH2PO4,8M尿素，20mM咪唑，pH8. O)清洗后，用洗脫液(IOOmMNaH2PO4, 250mM咪唑，pH8. O)洗脫蛋白，蛋白洗脫液再經(jīng)I3DlO柱脫鹽。圖3表明重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP2、BMP7在High5昆蟲細胞28°C培養(yǎng)2天后便得到高效表達。昆蟲細胞High5表達的BMP2成熟肽經(jīng)純化和復(fù)性后，以單體和二聚體形式存在。純化和復(fù)性的BMP7主要是單體(圖4)。經(jīng)骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP含量測定，每I升培養(yǎng)的昆蟲細胞可得純化到BMP2或BMP7成熟肽蛋白約40mg。(3)昆蟲細胞表達的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP2、BMP7的生物學(xué)活性檢測
小鼠成纖維細胞MC3T3經(jīng)以上制備的BMP處理后，細胞內(nèi)的堿性磷酸酶活性顯著升高，表明昆蟲細胞表達的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP可促進MC3T3細胞繼續(xù)成骨分化。將純化的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP2、BMP7各取10μ g，分別與明膠海綿(O. 5cmX Icm)復(fù)合后，包埋入小鼠肌肉內(nèi)。14天后取材，甲醛固定，石蠟包埋，組織切片用甲苯胺藍染色。結(jié)果顯示，14天后肌肉組織中有明顯的軟骨細胞，表明昆蟲細胞表達的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP2、BMP7均具有異位誘骨活性。本發(fā)明的有益效果(I)本發(fā)明利用昆蟲細胞-桿狀病毒蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)成功地在 昆蟲細胞High5中高效表達和制備了重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP2和BMP7成熟肽。體外細胞活性檢測表明，昆蟲細胞表達的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP2和BMP7均能顯著提高小鼠成纖維細胞內(nèi)的堿性磷酸酶活性。小鼠體內(nèi)的肌袋包埋誘骨實驗顯示，昆蟲細胞表達的BMP2和BMP7誘導(dǎo)肌肉組織中形成明顯的軟骨細胞，表明其具有異位誘導(dǎo)骨生成的活性。(2)由于昆蟲細胞培養(yǎng)基無需血清，培養(yǎng)溫度為28°C且無需CO2,昆蟲細胞High5生長速度快(12小時生長一代，而動物細胞一般為24小時)，大大降低了重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP的生產(chǎn)成本。利用昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng),每升培養(yǎng)昆蟲細胞可得純化BMP2、BMP7成熟肽蛋白各約40mg。按我們在昆蟲細胞中制備BMP的費用計算，要比在CHO細胞中的成本降低至少10倍，從而使重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP在臨床上的廣泛應(yīng)用成為可能。BMP本身具有高度誘導(dǎo)骨生成的能力，與種植體復(fù)合可提高其生物結(jié)合能力和誘骨活性，如將鈦心多孔羥磷灰石涂層種植體與BMP復(fù)合，將制成的復(fù)合種植體植入動物體內(nèi)，能較大程度地提高新骨的形成速度和成骨量，縮短種植體的骨整合時間。
權(quán)利要求
1.一種利用昆蟲細胞-桿狀病毒蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)表達制備人骨形態(tài)發(fā)生蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 (1)將人骨形態(tài)發(fā)生蛋白成熟肽基因片段克隆到昆蟲細胞-桿狀病毒表達載體上，共轉(zhuǎn)染第一昆蟲細胞，培養(yǎng)該細胞，制備帶有人骨形態(tài)發(fā)生蛋白成熟肽基因片段的重組桿狀病毒; (2)用步驟(I)制備的重組桿狀病毒感染第二昆蟲細胞，培養(yǎng)該細胞，獲得表達的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白； (3)經(jīng)親和層析純化步驟(2)獲得的表達的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白為BMP2或BMP7。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述第一昆蟲細胞為sf9昆蟲細胞。
4.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述第二昆蟲細胞為High5昆蟲細胞。
5.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述親和層析在Ni-親和柱上進行。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述Ni-親和柱純化變性狀態(tài)的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白，并在純化柱上直接復(fù)性人骨形態(tài)發(fā)生蛋白成熟肽。
7.一種利用昆蟲細胞-桿狀病毒蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)表達制備人骨形態(tài)發(fā)生蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 (1)分別在人BMP2、BMP7成熟肽基因N-端加入6xHis標簽，并將該基因片段克隆到改進的昆蟲-桿狀病毒表達載體上，然后共轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細胞，培養(yǎng)后收集轉(zhuǎn)染上清培養(yǎng)液，用蛋白酶K裂解桿狀病毒，以病毒基因組DNA為模板進行PCR鑒定，制備出帶有BMP2或BMP7成熟肽基因片段的重組桿狀病毒； (2)將步驟(I)制備的重組病毒上清液大量感染sf9昆蟲細胞，培養(yǎng)后收集重組病毒上清液，再大量感染High5昆蟲細胞，培養(yǎng)后離心收集細胞，溶于裂解液中； (3)離心步驟(2)獲得的裂解液，上清液過Ni-親和柱，用緩沖液清洗后，用洗脫液洗脫蛋白，蛋白洗脫液再經(jīng)HHO柱脫鹽，得到純化的BMP2或BMP7。
全文摘要
本發(fā)明涉及在昆蟲細胞中表達重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白的方法。所述方法包括以下步驟將人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)成熟肽基因片段克隆到改進的昆蟲細胞-桿狀病毒蛋白質(zhì)表達載體上，共轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細胞，制備帶有BMP成熟肽基因片段的重組桿狀病毒，然后侵染High5昆蟲細胞，高效表達BMP成熟肽，再經(jīng)Ni親和柱純化表達的BMP成熟肽。體外細胞堿性磷酸酶活性檢測和小鼠體內(nèi)肌袋包埋誘骨實驗表明，表達的BMP2和BMP7均具有異位誘導(dǎo)骨生成的活性。利用昆蟲細胞-桿狀病毒蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)，每升培養(yǎng)昆蟲細胞可獲得純化BMP2或BMP7成熟肽蛋白約40mg，比在CHO細胞中的成本降低至少10倍。
文檔編號C07K14/495GK102776198SQ20111012029
公開日2012年11月14日 申請日期2011年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月9日
發(fā)明者刁愛坡, 王飛, 羅深恒, 許麗紅 申請人:揚州泰達生物科技有限公司