專利名稱：綠原酸在制備增加骨髓細(xì)胞功效藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及綠原酸的新用途，具體來說是綠原酸在制備具有升高白細(xì)胞和增加骨髓細(xì)胞功效藥物的用途。
背景技術(shù)：
綠原酸廣泛存在于各種藥用植物如金銀花等中，目前對它的化學(xué)結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)清楚，已有人對其進(jìn)行藥用研究，報道了綠原酸可以應(yīng)用于治療腫瘤等疾病。盡管如此，我們通過藥理實驗又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)它還具有許多其他新的醫(yī)療功效，而這些新的醫(yī)療功效在現(xiàn)有文獻(xiàn)中還從來沒有報導(dǎo)過。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供綠原酸在制備具有增加骨髓細(xì)胞功效藥物的用途。
本發(fā)明的又一個目的是提供綠原酸在制備具有升高白細(xì)胞功效藥物的用途。
經(jīng)過實驗，發(fā)現(xiàn)綠原酸可升高白細(xì)胞；可刺激犬骨髓細(xì)胞增生，包括對骨髓干細(xì)胞的增加作用，并且綠原酸對60Co-γ射線致小鼠脾臟造血干細(xì)胞損傷有顯著地保護(hù)作用。
機(jī)體的造血過程是一個活躍的細(xì)胞增殖、分化、成熟與釋放的過程。它是由多潛能造血干細(xì)胞的自我更新維持其數(shù)量的恒定，并由多潛能造血干細(xì)胞到各系定向祖細(xì)胞，再進(jìn)一步增殖、分化、釋放到外周血循環(huán)。藥物可通過影響造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞的增殖分化等多種環(huán)節(jié)影響造血過程。因此，造血祖細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的建立為我們探討藥物的作用提供了手段和方法。
SAM小鼠是由日本學(xué)者竹田俊男教授開發(fā)培殖的一種快速老化模型小白鼠，其特征是隨月齡增加自然出現(xiàn)老化諸特征，這些特征包括外在表現(xiàn)和病理、生化、免疫諸方面。其中SAM P8亞系小鼠又是以學(xué)習(xí)記憶障礙并伴有免疫功能降低為主要特征的老化模型，其造血功能也隨月齡增加出現(xiàn)低下狀態(tài)，因此我們選用9月齡的SAM P8小鼠為實驗?zāi)Ｐ筒⒁酝慢g的SAM R1為對照探討了綠原酸對其造血功能的影響。研究結(jié)果顯示SAM P8小鼠CFU-S、CFU-GM、CFU-E和BFU-E的增殖分化能力和外周血WBC數(shù)明顯低于同月齡的SAMR1小鼠。而綠原酸可使SAM P8小鼠降低的CFU-S數(shù)明顯增加，說明綠原酸可刺激造血干細(xì)胞的增殖，同時綠原酸可明顯促進(jìn)SAM P8小鼠骨髓粒單系祖細(xì)胞，早期、晚期紅系祖細(xì)胞的增殖分化，并可使其外周血WBC數(shù)升高，提示綠原酸可影響小鼠造血的整個過程。因此我們有理由推測綠原酸可能調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)造血調(diào)控系統(tǒng)。小鼠血清集落刺激活力的測定結(jié)果說明綠原酸可通過促進(jìn)小鼠機(jī)體產(chǎn)生集落刺激因子來增強(qiáng)其祖細(xì)胞的增殖分化。組織學(xué)的研究結(jié)果則進(jìn)一步證實了綠原酸確能增強(qiáng)SAM P8小鼠的造血功能。
由此，綠原酸可治療各種原因引起的貧血，如但不僅僅限于失血性貧血、溶血性貧血，造血不良性貧血包括巨細(xì)胞性貧血、再生障礙性貧血和脾功能亢進(jìn)，對各種原因引起的白細(xì)胞減少狀態(tài)、粒細(xì)胞減少癥、粒細(xì)胞缺乏癥有治療作用，對各種原因引起的巨核系統(tǒng)改變?nèi)绲粌H僅限于特發(fā)性血小板減少性紫癜有治療作用；對各種原因引起的骨髓纖維化，骨髓感染有一定治療作用。
基于上述發(fā)現(xiàn)，綠原酸可以單獨或與其他具有已知功效的藥物一起采用各種制藥技術(shù)制備成各種藥用劑型如但不僅僅限于口服劑型、靜脈給藥劑型和外用劑型。
另外，本發(fā)明所述的“其他具有已知功效的藥物”是指現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報道的具有升高白細(xì)胞功效的藥物和增加骨髓細(xì)胞功效的藥物。
以下通過實驗對綠原酸所具有的上述功效加以證實。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實驗例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進(jìn)行的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
實驗例1綠原酸對外周血象的影響用環(huán)磷酰胺將犬制成白細(xì)胞減少的犬模型。
將綠原酸對犬給藥治療7天，陽性藥(甘露聚糖肽)組和綠原酸各劑量組的白細(xì)胞WBC均升高，其中給藥第13天和14天大、中劑量組中白細(xì)胞WBC的增長率與模型組有顯著性差異(P＜0.05)。見表1，綠原酸對犬白細(xì)胞的影響。表2，綠原酸對犬血小板的影響。
表1 綠原酸對犬白細(xì)胞的影響

與正常對照組比較**P＜0.001與模型對照組比較△P＜0.05△△P＜0.01表2 綠原酸對犬血小板的影響

與模型對照組比較△P＜0.05
實驗例2對病理模型動物骨髓的影響結(jié)果見表3、4、5。
表3 實驗前正常骨髓細(xì)胞檢查(％，X±SD)

各組犬給藥前正常骨髓象顯微鏡下觀察，各犬骨髓細(xì)胞增生活躍，未見異常。
中性粒細(xì)胞桿狀為主，占全片總數(shù)45～50％，其次為中幼、晚幼、分葉細(xì)胞。偶見嗜酸粒細(xì)胞，未見原始、早幼粒細(xì)胞。未見中幼和晚幼粒細(xì)胞。紅細(xì)胞系統(tǒng)以晚幼紅細(xì)胞為主，約占全片計數(shù)25～30％左右，其次為中幼紅細(xì)胞，全片鏡下未見原紅、早幼紅、早巨、中巨、晚巨紅細(xì)胞。淋巴系統(tǒng)以成熟淋巴細(xì)胞為主(約占9～12％)，未見原始和幼稚淋巴細(xì)胞。單核系統(tǒng)各組各犬未見有原始、幼稚、單核細(xì)胞。巨核細(xì)胞以成熟有血小板形成為主，成熟無血小板形成次之，未見幼稚巨核細(xì)胞。其它細(xì)胞未見漿細(xì)胞，未見網(wǎng)狀、內(nèi)皮、吞噬、寄生蟲、組織巨細(xì)胞、不明細(xì)胞以及特殊細(xì)胞。粒細(xì)胞系統(tǒng)與紅細(xì)胞系統(tǒng)之比各組間比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
表4 造模6天骨髓細(xì)胞檢查(％，X±SD)


造模第7天36只犬骨髓增生低下，非造血細(xì)胞淋巴細(xì)胞增多，粒系細(xì)胞，紅系細(xì)胞，巨核細(xì)胞總數(shù)減少，未見成熟有血小板形成和成熟無血小板形成。
表5 治療14天骨髓細(xì)胞檢查(％，X±SD)


治療第14天，除模型組2只犬，小劑量組2只犬骨髓增生低下，非造血細(xì)胞淋巴細(xì)胞增多，粒系細(xì)胞，紅細(xì)胞系統(tǒng)減少，骨髓增生未能恢復(fù)，其余各犬骨髓細(xì)胞增生活躍，已恢復(fù)正常。
實驗例3對正常骨髓細(xì)胞的影響結(jié)果見表6、7、8。
表6 給藥90天骨髓細(xì)胞檢查(％，X±SD)


給藥90天8只犬，顯微鏡下觀察，各犬骨髓細(xì)胞增生活躍和極度活躍。
表7 給藥180天骨髓細(xì)胞檢查(％，X±SD)



給藥180天8只犬，顯微鏡下觀察，各犬骨髓細(xì)胞增生活躍和極度活躍。
表8 給藥270天骨髓細(xì)胞檢查(％，X±SD)


給藥270天16只犬，顯微鏡下觀察，各犬骨髓細(xì)胞增生活躍和極度活躍。
實驗例4綠原酸對60Co-γ射線致小鼠脾臟造血干細(xì)胞損傷的保護(hù)作用1.、實驗方法取健康C57小鼠60只，依性別體重隨機(jī)分成5組。按分組分別給藥，陰性組各鼠腹腔注射生理鹽水0.4ml/20g體重，陽性組(粒細(xì)胞集落刺激因子)各鼠腹腔注射給予0.4ml/20g體重(2ug/kg)，其余三組分別以0.1％、0.05％和0.025％的綠原酸藥液給各組各鼠腹腔注射0.4ml/20g體重(劑量20、10和5mg/kg)。以上5組各鼠均每日給藥一次，連續(xù)7日，第7日稱存活動物體重，末次給藥后1小時。各組小鼠全身一次照射后第9天頸椎脫臼處死，取出脾臟，除去粘連的脂肪，然后置于Bouins液中固定3min，用放大鏡觀察并進(jìn)行內(nèi)源性脾結(jié)節(jié)計數(shù)(CFU-S)，骨髓單個核細(xì)胞計數(shù)(BMNC)。組間比較顯著差異。
2、實驗結(jié)果表9 綠原酸對60Co-γ射線致小鼠脾臟造血干細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

與模型對照組比較***P＜0.001 **P＜0.01 *P＜0.054、結(jié)論表9的結(jié)果表明，綠原酸20、10和5mg/kg給小鼠腹腔注射，每日一次，連續(xù)7日，對60Co-γ射線致小鼠脾臟造血干細(xì)胞損傷有較強(qiáng)的保護(hù)作用。
實驗例5綠原酸小鼠造血功能的影響1實驗方法快速老化模型小白鼠(簡稱SAM)。其中根據(jù)老化速度與病狀特征又分為正常老化的R系和快速老化的P系。采用9月齡SAMR1和SAMP8兩品系。
骨髓細(xì)胞(BMC)的制備 將動物斷脊處死后，酒精消毒，無菌剝?nèi)∫粋?cè)股骨，用RPMI-1640液通過6號針頭反復(fù)沖洗骨髓腔數(shù)次，再將沖出的骨髓細(xì)胞液通過4號針頭制備成單細(xì)胞懸液。
小鼠骨髓造血干細(xì)胞(CFU-S)的測定 活殺小鼠，無菌制備BMC懸液，計數(shù)有核細(xì)胞后配成每毫升5×104個細(xì)胞，給經(jīng)8.0 Gy60Go照射后小鼠尾靜脈輸注0.2ml細(xì)胞懸液，第9天活殺受體鼠，取脾用Bouin液固定24h后計數(shù)表面結(jié)節(jié)數(shù)。
骨髓粒單系祖細(xì)胞(CFU-GM)的測定 將定量(1×105)的骨髓細(xì)胞懸液加馬血清與RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃水浴中保溫10～20min，加入30g/L瓊脂后混勻，轉(zhuǎn)入含有0.2ml鼠肺條件刺激液的瓊脂培養(yǎng)皿中，于37℃，0.05％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7天，置低倍鏡下計數(shù)含50個細(xì)胞以上的集落(CFU-GM)數(shù)。
骨髓早期、晚期紅系祖細(xì)胞(BFU-E、CFUE)的測定 將培養(yǎng)體系配成終濃度為10％骨髓細(xì)胞懸液(5×104ml)，200g/L馬血清，100g/L小牛血清白蛋白，1×10-5mol/L二巰基乙醇、10％爆式集落促進(jìn)活性(BPA)，0.8％甲基纖維素及每毫升1U EPO等充分混合后，加10μl至微孔塑料培養(yǎng)板中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，用聯(lián)苯胺染色后在倒置顯微鏡下計數(shù)8個以上染色陽性細(xì)胞集落計為紅系集落形成單位(CFU-E)，培養(yǎng)8天計數(shù)含50個以上聯(lián)苯胺染色陽性細(xì)胞集落為爆式紅系集落形成單位(BFU-E)。
小鼠外周血象的測定 小鼠尾靜脈采血，Coulter血細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)。
小鼠骨髓組織學(xué)觀察 斷頭活殺小鼠取完整左側(cè)股骨，入Hellyps液固定，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察組織學(xué)變化。
2實驗結(jié)果綠原酸小鼠骨髓造血干細(xì)胞的影響將SAM P8小鼠隨機(jī)分為3組1組為SAM P8對照組，2、3組為綠原酸10，20m g/kg/天×8天，靜脈注射。另取同月齡SAMR1與SAMP8對照組，每天給予生理鹽水。9天活殺各組小鼠制備BMC懸液，按前述方法輸注給受體鼠。9天活殺取脾固定觀察結(jié)果，結(jié)果顯示SAM P8小鼠CFU-S數(shù)223±107明顯低于同月齡的SAMR1小鼠CFU-S 550±189(n＝12，P＜0.01)。而給予綠原酸后SAM P8小鼠CFU-S數(shù)明顯增多，其CFU-S數(shù)分別為483±125和527±183結(jié)果提示綠原酸對SAMP8小鼠骨髓造血干細(xì)胞的增殖分化有一定刺激作用。
綠原酸對小鼠骨髓造血祖細(xì)胞增殖的影響動物分組，給藥與前相同，于給藥第9天斷脊處死小鼠無菌制備BMC懸液按前述方法進(jìn)行實驗。結(jié)果表明SAM P8小鼠骨髓造血祖細(xì)胞的增殖能力明顯低于SAMR1小鼠，二者之間有明顯差異。而綠原酸則可使SAM P8小鼠的粒單系造血祖細(xì)胞，早期及晚期紅系祖細(xì)胞的增殖能力均明顯增。
綠原酸對小鼠外周血象的影響結(jié)果表明SAM P8小鼠外周血象中，其WBC數(shù)明顯低于同月齡SAMR1小鼠。綠原酸10，20mg/kg則可明顯使其WBC數(shù)增加。
綠原酸對小鼠血清CSA的影響將各組小鼠分別心臟采血，靜止離心制備血清，以血清取代肺條件刺激液(CSF-GM)，觀察其對CFU-GM增殖的影響，以CFU-GM的產(chǎn)率代表CSA。結(jié)果證明SAMR1小鼠血清的CFU-GM的產(chǎn)率79.6±7.9明顯高于SAM P8小鼠CFU-GM 57.3±7.4(n＝12，P＜0.01)。而給予綠原酸后10，20mg/kg SAM P8小鼠的CFU-GM明顯增加(CFU-GM分別為74.2±7.2和81.5±8.2)與SAM P8組相比有顯著差異，提示綠原酸可明顯增強(qiáng)SAM P8小鼠體內(nèi)的CSA，促進(jìn)SAM P8小鼠骨髓造血祖細(xì)胞的增殖分化。
綠原酸對小鼠骨髓組織學(xué)的影響組織學(xué)研究結(jié)果顯示SAM R1小鼠骨髓腔內(nèi)造血祖細(xì)胞豐富，各系細(xì)胞均可見到，并且形態(tài)良好，增殖旺盛，血竇較多。而同月齡SAMP8小鼠骨髓腔內(nèi)造血細(xì)胞明顯減少，增生不活躍，以中晚幼粒細(xì)胞為主，甚至局部缺少造血細(xì)胞，纖維結(jié)締組織增生，血竇較少。給予綠原酸后的SAM P8小鼠與未用藥SAM P8小鼠相比其骨髓腔內(nèi)造血細(xì)胞明顯增多，增生活躍，血竇較多，但較SAM R1小鼠骨髓造血細(xì)胞及血竇為少。這一結(jié)果提示綠原酸可明顯改善SAM P8小鼠骨髓造血功能。
權(quán)利要求
1.綠原酸單用或與其他藥物一起在制備具有增加骨髓細(xì)胞功效藥物的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的藥物具有增加骨髓干細(xì)胞功效。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的藥物可治療各種原因引起的骨髓纖維化和骨髓感染。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的藥物可治療各種原因引起的血小板減少癥。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的藥物對脾臟造血干細(xì)胞損傷有顯著的保護(hù)作用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、5所述的用途，其中所述的藥物能夠增強(qiáng)造血功能。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、5所述的用途，其中所述的藥物可治療各種原因引起的貧血和脾功能亢進(jìn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、5所述的用途，其中所述的藥物可治療失血性貧血、溶血性貧血、巨細(xì)胞性貧血和再生障礙性貧血。
9.綠原酸單用或與其他藥物一起在制備升高白細(xì)胞功效藥物的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中的該藥物可治療各種原因引起的白細(xì)胞減少，粒細(xì)胞減少癥、粒細(xì)胞缺乏癥。
全文摘要
本發(fā)明公開了綠原酸單用或與其他藥物一起在制備增加骨髓細(xì)胞功效藥物的用途。本發(fā)明還公開了綠原酸單用或與其他藥物一起在制備升高白細(xì)胞功效藥物的用途。
文檔編號A61P7/06GK1899280SQ20051008802
公開日2007年1月24日 申請日期2005年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月22日
發(fā)明者張潔, 張舒, 張亮, 李鑫泉, 徐小平, 雍智全, 包旭 申請人:四川九章生物化工科技發(fā)展有限公司