專利名稱：改進(jìn)對es細(xì)胞自我更新和譜系特化的控制以及用于此目的的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于促進(jìn)干細(xì)胞自我更新和預(yù)防或控制干細(xì)胞分化的培養(yǎng)多能干細(xì)胞的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和方法。本發(fā)明也提供衍生、分離和維持多能干細(xì)胞均質(zhì)制劑的方法。提供的方法和組合物適合培養(yǎng)和分離多能干細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞(ES)，具體是哺乳動物包括人的干細(xì)胞。
在含有血清和白血病抑制因子(LIF)的條件下建立和維持多能干細(xì)胞的體外培養(yǎng)物是從所周知的(Smith等，Nature.336688-90，1988)。已利用這類方法維持了許可的小鼠品系的多能干細(xì)胞許多代。當(dāng)將干細(xì)胞在飼養(yǎng)細(xì)胞，通常為小鼠成纖維細(xì)胞或其提取物存在下培養(yǎng)時，進(jìn)一步支持了多能干細(xì)胞培養(yǎng)物的維持和自我更新。在這種條件下能維持培養(yǎng)的人ES細(xì)胞處在多能狀態(tài)許多代。
該領(lǐng)域后續(xù)的問題是盡管作了大量努力，只有少數(shù)動物產(chǎn)生的多能ES細(xì)胞培養(yǎng)物才能維持較長時間，并且即使這些動物也不是所有的胚胎都能形成ES細(xì)胞培養(yǎng)物。某些情況下可鑒定到多能細(xì)胞但不能維持培養(yǎng)足夠時間來研究細(xì)胞或?qū)λ鼈冞M(jìn)行遺傳操作。這特別發(fā)生在嚙齒類動物(除某些小鼠品系外)細(xì)胞。
迄今，另一問題是要將ES細(xì)胞培養(yǎng)物維持于多能狀態(tài)許多代，只有采用含血清或血清提取物的培養(yǎng)基才有可能，或所用的培養(yǎng)條件要求存在其它細(xì)胞，如采用作為飼養(yǎng)細(xì)胞的成纖維細(xì)胞方能維持人ES細(xì)胞。然而，要使ES細(xì)胞經(jīng)過后續(xù)控制分化成為所需的細(xì)胞類型，采用成分不明確的培養(yǎng)基或存在異源細(xì)胞是不利的。
通常用于培養(yǎng)多能干細(xì)胞的血清是胎牛(牛)血清，已知其含有復(fù)雜的混合細(xì)胞因子和其它信號分子。為了控制分化途徑，在培養(yǎng)基中加入未知的細(xì)胞因子是不利的，因為它們會不確定地影響分化的最終結(jié)果而可能有潛在的有害作用。另外，每批血清不統(tǒng)一可引起培養(yǎng)方案的變化。
因此，用這種復(fù)雜的培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的ES細(xì)胞及其分化的后代，有污染培養(yǎng)基和/或維持ES細(xì)胞所需飼養(yǎng)細(xì)胞某些成分的危險。這些因素違背了ES細(xì)胞及其子代細(xì)胞的治療應(yīng)用和其它應(yīng)用的優(yōu)良生產(chǎn)規(guī)程的開發(fā)。
當(dāng)從ES細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生分化的細(xì)胞群時，需要使高比例的ES細(xì)胞轉(zhuǎn)化成同一類型的子代細(xì)胞，即盡可能維持均質(zhì)性細(xì)胞群。然而，實際上觀察到分化后獲得的細(xì)胞群含有異質(zhì)性混合的細(xì)胞。因此需要用獲得較純的子代細(xì)胞群的方式或因素來進(jìn)行ES細(xì)胞的分化。
本申請人以前的專利申請WO-A-03/095628，是關(guān)于在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞如ES細(xì)胞，該培養(yǎng)基含有g(shù)p130(即LIF)和TGF-β超家族(如BMP4)信號傳導(dǎo)途徑的激動劑，用以促進(jìn)干細(xì)胞多次傳代進(jìn)行自我更新。存在gp130信號傳導(dǎo)分子時，TGF-β超家族信號傳導(dǎo)途徑的激動劑令人驚奇地提供了自我更新的刺激作用，而不是促分化信號。
本發(fā)明的一個目的是提供培養(yǎng)多能干細(xì)胞的另一種，優(yōu)選改進(jìn)的方法和適合的培養(yǎng)基，能支持所述干細(xì)胞以非分化狀自我更新傳代多次。本發(fā)明另一目的是提供另一種能維持多能干細(xì)胞的體外培養(yǎng)直到以可控制的方式誘導(dǎo)其分化的培養(yǎng)系統(tǒng)。本發(fā)明還有一目的是提供增強(qiáng)多能干細(xì)胞的衍生和分離，和促進(jìn)它們從難駕馭的生物體或還沒分離得到過多能干細(xì)胞的生物體衍生與分化成ES細(xì)胞的方法和組合物。
根據(jù)本發(fā)明，在存在gp130信號傳導(dǎo)分子時多能細(xì)胞中的Id蛋白可抑制其分化和促進(jìn)其自我更機(jī)新。
本發(fā)明將多能干細(xì)胞，如SE細(xì)胞培養(yǎng)在無血清而含有g(shù)p130信號傳導(dǎo)途徑激動劑(即LIF)同時表達(dá)Id基因的培養(yǎng)基中，例如通過(i)直接激活Smad途徑而表達(dá)Id諸基因或表達(dá)一個Id基因，或(ii)存在產(chǎn)生Id基因的細(xì)胞或或等價信號。從而促進(jìn)了干細(xì)胞的多次傳代自我更新。因此，在存在gp130信號傳導(dǎo)時，多能細(xì)胞中的Id基因活性提供了自我更新的刺激。
本發(fā)明因此提供了Id基因產(chǎn)物促進(jìn)培養(yǎng)的多能細(xì)胞自我更新的應(yīng)用。遵照本發(fā)明，在細(xì)胞中有意提供Id基因產(chǎn)物和/或Id基因或等價物目的是激活。同時利用gp130信號傳導(dǎo)，具體利用細(xì)胞因子如LIF，獲得了多能細(xì)胞的自我更新。
從本發(fā)明人先前的專利申請可知，LIF和激活TGF-β超家族受體的下游信號傳導(dǎo)可促進(jìn)自我更新。在本發(fā)明中，Id基因激活與LIF組合可導(dǎo)致ES細(xì)胞的自我更新。因此本發(fā)明提供了另一種通過提供自我更新信號的方法，即通過以下的組合(i)一種Id蛋白或能增強(qiáng)Id蛋白活性的制劑，所述制劑是TGF-β超家族受體信號傳導(dǎo)途徑下游激活劑之外的制劑；和(ii)一種gp130下游信號傳導(dǎo)途徑的激活劑。
Id蛋白指包括Id蛋白與其它蛋白如轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的融合物，和如下所述含有Id蛋白的組合物。(i)中所述制劑是能誘導(dǎo)Id基因表達(dá)和/或誘導(dǎo)Id蛋白激活但不通過TGF-β超家族受體起作用的適當(dāng)?shù)耐庠匆蜃?。例子包括纖連蛋白、纖連蛋白受體激動劑、整合素信號傳導(dǎo)激活劑、nanog和上述能誘導(dǎo)Id基因表達(dá)或Id蛋白活性的所有制劑的同類物。本發(fā)明的方法適合培養(yǎng)多能干細(xì)胞，特別是胚胎干細(xì)胞。
在以下例子中，我們誘導(dǎo)Id基因表達(dá)不促進(jìn)自我更新。本發(fā)明另一實施方式中，也如下所述，例如我們用遺傳學(xué)方法通過在多能細(xì)胞中導(dǎo)入一含有Id基因的載體，操縱了多能細(xì)胞使其表達(dá)Id基因。利用該載體中的誘導(dǎo)型啟動子可達(dá)到精確控制。當(dāng)細(xì)胞用于藥物篩選時此種形式的基因修飾是可接受的，但當(dāng)這些細(xì)胞或其子代用于治療時不可接受，此時宜采用外源因子來促進(jìn)自我更新。
在下述具體方法更詳細(xì)的描述中，促進(jìn)培養(yǎng)的多能細(xì)胞自我更新的方法包括(i)表達(dá)Id基因或誘導(dǎo)Id基因的表達(dá)，和(ii)激活gp130下游信號傳導(dǎo)。Id基因可方便地通過游離型載體表達(dá)。
本發(fā)明另一方面提供聯(lián)用以下制劑以促進(jìn)培養(yǎng)的多能細(xì)胞自我更新(a)Id基因表達(dá)激活劑和/或?qū)е翴d基因表達(dá)的Id蛋白活性；及(b)gp130下游信號傳導(dǎo)途徑激活劑。
本發(fā)明還有一方面提供聯(lián)用以下制劑以促進(jìn)培養(yǎng)的多能細(xì)胞自我更新(a)Id基因產(chǎn)物；和(b)gp130下游信號傳導(dǎo)途徑激活劑。
在下面更詳細(xì)描述的本發(fā)明一具體實施方式
中，在培養(yǎng)組成性表達(dá)Id1的ES細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入LIF。增強(qiáng)了自我更新證明LIF和Id基因的表達(dá)有協(xié)同作用。
本發(fā)明的一個優(yōu)點是在細(xì)胞中直接提供Id基因產(chǎn)物以促進(jìn)自我更新。由于直接誘導(dǎo)了自我更新從而更大程度控制了自我更新，由于此途徑激活的幾個階段不需要自我更新機(jī)制的制劑而副作用少。
Id基因意指包括文獻(xiàn)中定義的那些基因，如Id1、Id2、Id3和Id4，也意指包括它們的模擬物，包括其顯示具有Id基因性能(即能抑制bHLH因子，如myoD和mash1轉(zhuǎn)錄活性)的功能性片段和衍生物。小鼠、大鼠、犬和人Id蛋白的具體序列見SEQ IDNO1-4。其它Id蛋白的具體序列可通過公眾可得的序列數(shù)據(jù)庫中獲得?？蛇m當(dāng)通過預(yù)防或降低bHLH基因的表達(dá)和活性，或預(yù)防或降低E蛋白的表達(dá)或活性來模擬Id基因的活性?？刹捎没蚯贸蛞种芌NA的方法或通過消除外源性誘導(dǎo)因子來實現(xiàn)此目的。在一種RNA靶向方法中采用反義RNA，或可采用siRNA方法。
可通過(i)bHLH基因抑制劑，(ii)myoD抑制劑，(iii)mash1抑制劑，(iv)提高的hes基因活性，(v)提高的hes蛋白活性，和(vi)以上一種或多種方法的組合來提供能增強(qiáng)Id蛋白活性的信號。
在現(xiàn)有技術(shù)中，采用諸如BMP等因子來激活TGF-β超家族受體的一種或多種下游信號傳導(dǎo)途徑。本發(fā)明的不同處在于，例如本發(fā)明依靠通過表達(dá)Id基因的載體直接在細(xì)胞中提供Id基因的活性，或依靠Id基因的表達(dá)和/或Id蛋白的活性，而不是通過TGF-β超家族的受體或直接模擬這種活性的作用。本發(fā)明比現(xiàn)有技術(shù)有更高的目的，能比目前更精確地維持自我更新表型。
可利用通過gp130起作用的細(xì)胞因子，如LIF受體的細(xì)胞因子或其它激動劑來實現(xiàn)對一種或多種gp130下游信號傳導(dǎo)途徑的激活。
能通過gp130起作用從而激活gp130信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞因子包括LIF、CNTF、心養(yǎng)蛋白、抑瘤蛋白M、IL-6加sIL-6受體和hyper II-6。適合的細(xì)胞因子包括能結(jié)合gp130和/或通過gp130激活信號傳導(dǎo)的模擬物、融合蛋白或嵌合蛋白。已明確知曉存在血清時這些細(xì)胞因子可通過gp130起作用，但在缺乏血清時這些細(xì)胞因子能否維持細(xì)胞不分化知識有限。
因此本發(fā)明在一實施方式中提供在無血清、血清提取物、飼養(yǎng)細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞提取物的培養(yǎng)基中另一種和/或改進(jìn)的ES細(xì)胞培養(yǎng)的方法。采用本發(fā)明一具體實施方式
的含有LIF和直接表達(dá)Id基因和/或Id蛋白活性的激活培養(yǎng)基培養(yǎng)，可延長ES細(xì)胞的傳代。
本發(fā)明培養(yǎng)系統(tǒng)的另一優(yōu)點是與含血清培養(yǎng)相比，ES細(xì)胞的分化減少。這具有顯著意義，因為在血清中大多數(shù)多能ES細(xì)胞常傾向于分化，使它們的操縱和擴(kuò)增成為問題。結(jié)果顯示本發(fā)明的培養(yǎng)條件能使ES細(xì)胞在缺乏血清時自我更新。
已報導(dǎo)了許多哺乳動物來源的胚胎干細(xì)胞，包括小鼠(Bradley等，Nature.309255-56，1984)、美洲鼬(Mol Reprod Dev.Dec；33(4)418-31，1992)、豬和綿羊(J Reprod Fertil Suppl.43255-60，1991)、侖鼠(Dev Biol.May；127(1)224-7，1988)和牛(Roux Arch Dev Biol.201134-141，1992)?？衫斫獗景l(fā)明的方法適合采納培養(yǎng)其它哺乳動物的多能細(xì)胞培養(yǎng)物，包括靈長動物特別是人、嚙齒動物特別是小鼠和大鼠、和禽類的ES細(xì)胞。
關(guān)于人ES細(xì)胞，具體知道人ES細(xì)胞可對LIF發(fā)生反應(yīng)，因此本發(fā)明的培養(yǎng)基和方法中，在對LIF和Id蛋白聯(lián)用的反應(yīng)中獲得的自我更新可應(yīng)用于人ES細(xì)胞。
適合本發(fā)明方法的細(xì)胞密度根據(jù)所用的多能細(xì)胞和所需的子代細(xì)胞性質(zhì)而不同。已獲得的良好結(jié)果是將胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)成單層，解離胚胎干細(xì)胞然后以單層形式培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞，培養(yǎng)的表面密度為0.2-2.5×104細(xì)胞/cm2，更具體說密度為0.5-1.5×104細(xì)胞/cm2。細(xì)胞增殖成粘附性單層，并觀察到比生長在含血清培養(yǎng)基與LIF中的ES細(xì)胞多二倍。
培養(yǎng)本發(fā)明ES細(xì)胞及其子代細(xì)胞的典型表面是本領(lǐng)域已知的培養(yǎng)細(xì)胞所用的表面，這些表面包括塑料、金屬、組合物表面，但可采用從商業(yè)上可廣泛得到的常用表面，如塑料組織培養(yǎng)板。這類培養(yǎng)板常為幾厘米直徑。為了放大規(guī)模，可采用大得多的直徑和采用具有許多重復(fù)單元的板。
其它常用的培養(yǎng)表面含有細(xì)胞粘附蛋白，常包被在該表面上?？衫眉?xì)胞上的能結(jié)合蛋白質(zhì)或其它細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)的受體或其它分子。這可促進(jìn)與表面的粘附而促進(jìn)生長。經(jīng)常可獲得的明膠包被板適合于本發(fā)明，也可采用其它蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明一實施方式中，在培養(yǎng)基中至少一部分培養(yǎng)期間可含有能抑制分化的制劑，如FGF受體或MEK/Erk信號傳導(dǎo)的抑制劑，發(fā)觀這樣可抑制ES細(xì)胞的分化傾向。在一實施方式中，在明確無血清的含LIF和FGF受體抑制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)ES細(xì)胞一特定時間，然后除去FGF受體抑制劑用Smad信號傳導(dǎo)的直接激活劑代替。具體可用于人細(xì)胞之外細(xì)胞的FGF受體抑制劑例子包括化合物SU5402和PD173074。或者，可采用的FGF受體競爭性抑制劑合適的是該受體的可溶形式。合適的MEF/Erk抑制劑包括PD98059、U0126和PD184352。
在另一實施方式中，選擇不除去FGF受體或MEK/Erk抑制劑。因此在培養(yǎng)基中存在該抑制劑一段時間，同時存在或缺乏Id蛋白的誘導(dǎo)劑。在存在LIF和FGF抑制劑的N2B27培養(yǎng)基中可培養(yǎng)ES細(xì)胞至少20代。如果不從培養(yǎng)基中去除該抑制劑，此抑制劑宜是一種特定的抑制劑對其它受體無活性或極小活性。
本發(fā)明第二方面提供一種培養(yǎng)ES細(xì)胞以促進(jìn)ES細(xì)胞自我更新的方法，該方法包括將ES細(xì)胞維持在含有以下物質(zhì)的培養(yǎng)基中(1)(a)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑的激活劑，而不是通過導(dǎo)致Id基因表達(dá)的TGF-β超家族受體起作用的制劑，或(b)Id基因產(chǎn)物；和(2)gp130下游信號傳導(dǎo)途徑的激活劑。
可采用本發(fā)明的方法刺激在無血清和無血清提取物的培養(yǎng)基中ES細(xì)胞的自我更新，而SE細(xì)胞原先需在血清或血清物中培養(yǎng)才能傳代。優(yōu)選也可在缺乏飼養(yǎng)細(xì)胞和/或飼養(yǎng)細(xì)胞提取物時進(jìn)行此種培養(yǎng)。例如，培養(yǎng)ES細(xì)胞可包括以下步驟-任選在飼養(yǎng)細(xì)胞上存在通過gp130起作用的細(xì)胞因子和血清或血清提取時維持培養(yǎng)的ES細(xì)胞于多能狀態(tài)；-傳代ES細(xì)胞至少一次；-撤除培養(yǎng)基中的血清或血清提取物，并撤除飼養(yǎng)細(xì)胞(如果存在)，使培養(yǎng)基無飼養(yǎng)細(xì)胞、血清和血清提取物；和-然后在存在Id基因表達(dá)和/或Id蛋白活性(而不是通過TGF-β受體起作用的制劑)直接激活劑或效應(yīng)劑和gp130下游信號傳導(dǎo)途徑激活劑時將ES細(xì)胞維持在多能狀態(tài)。
在撤除培養(yǎng)基中的血清或血清提取物時，任選在培養(yǎng)基中加入能抑制分化的制劑，如FGF受體抑制劑。一種選擇是同時撤除分化抑制劑或隨后在存在Id蛋白時維持SE細(xì)胞。可在撤除飼養(yǎng)細(xì)胞或其提取物的同時、之前或之后撤除血清或其提取物。
本發(fā)明還提供獲得轉(zhuǎn)染的ES細(xì)胞群的方法，該方法包括-用編碼一選擇標(biāo)記的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞；-接種該ES細(xì)胞；-在存在Id基因表達(dá)和/或Id蛋白活性直接激活劑或效應(yīng)劑和gp130下游信號傳導(dǎo)途徑激活劑時培養(yǎng)該ES細(xì)胞；和-選出表達(dá)該選擇標(biāo)記的細(xì)胞。
所述選擇標(biāo)記可編碼抗生素抗性、細(xì)胞表面標(biāo)記或如EP-A-0695351中所述的其它選擇標(biāo)記，并宜含有編碼該選擇標(biāo)記的核苷酸序列，所述選擇標(biāo)記操作性連接于優(yōu)先在所需細(xì)胞中表達(dá)該選擇標(biāo)記的啟動子。
在另一實施方式中，本發(fā)明提供培養(yǎng)ES細(xì)胞的方法，該方法的步驟包括將ES細(xì)胞單個轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)器皿中，例如培養(yǎng)板的單個孔中，在存在Smad信號傳導(dǎo)途徑的直接激活劑或效應(yīng)劑和gp130下游信號傳導(dǎo)途徑激活劑時培養(yǎng)該ES細(xì)胞，而獲得克隆的ES細(xì)胞群，它們的所有細(xì)胞都是一個ES細(xì)胞的后代。
一旦獲得穩(wěn)定的均質(zhì)性的ES細(xì)胞培養(yǎng)物，可改變培養(yǎng)條件來引導(dǎo)細(xì)胞分化成為選自外胚層、中胚層或內(nèi)胚層細(xì)胞的一種或多種細(xì)胞類型。此外或撤除細(xì)胞因子或信號傳導(dǎo)因子后，可高效衍生特異性分化的細(xì)胞群?？稍诖嬖谕ㄟ^gp130起作用的細(xì)胞因子和Smad信號傳導(dǎo)途徑直接激活劑或效應(yīng)劑時維持ES細(xì)胞，然后撤除細(xì)胞因子同時維持Smad信號傳導(dǎo)途徑的直接激活劑或效應(yīng)劑和/或加入能引導(dǎo)分化的另一信號傳導(dǎo)分子，使ES細(xì)胞向非神經(jīng)外胚層分化。上述方法均可任選包括獲得和/或分離此過程產(chǎn)生的分化細(xì)胞的步驟。
例如，在缺乏LIF時接觸BMP4可導(dǎo)致誘生中胚層的內(nèi)胚層類型細(xì)胞。撤除gp130和TGF-β信號傳導(dǎo)途徑的激動劑和/或阻斷此二途徑可導(dǎo)致誘生神經(jīng)外胚層細(xì)胞表型。或者，可在培養(yǎng)條件中加入其它信號傳導(dǎo)因子以引導(dǎo)其它分化途徑，例如活化素、sonic hedgehog(shh)、Wnts和FGF。
應(yīng)用時，到ES細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束，引起分化之前需要至少傳代一次去除Smad信號，以確保該信號衰減以后分化時不再遺留此信號。一實施方式中，在一次至二次傳代的培養(yǎng)物中加入FGF受體拮抗劑，同時去除Id基因表達(dá)和/或Id蛋白活性的直接激活劑或效應(yīng)劑。
本發(fā)明的其它方面提供ES細(xì)胞自我更新的細(xì)胞培養(yǎng)基，一種這類培養(yǎng)基包含-基礎(chǔ)培養(yǎng)基；-Id基因表達(dá)和/或Id蛋白活性的直接激活劑或效應(yīng)劑；-gp130下游信號傳導(dǎo)途徑激活劑；和-鐵轉(zhuǎn)運蛋白；其中所述培養(yǎng)基任選無血清和無血清提取物。
人多能干細(xì)胞的優(yōu)選培養(yǎng)基包含Id基因表達(dá)和/或Id蛋白活性的直接激活劑或效應(yīng)劑，gp130下游信號傳導(dǎo)途徑激活劑，和FGF受體激動劑。人干細(xì)胞以外的多能干細(xì)胞的優(yōu)選培養(yǎng)基包含Id基因表達(dá)和/或Id蛋白活性的直接激活劑或效應(yīng)劑，gp130下游信號傳導(dǎo)途徑激活劑，和ES細(xì)胞分化抑制劑。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基是能提供ES細(xì)胞所需的碳和/或維生素和/或礦物質(zhì)基本來源的培養(yǎng)基。基礎(chǔ)培養(yǎng)基通常不含蛋白質(zhì)不能自身支持ES細(xì)胞的自我更新。所述鐵轉(zhuǎn)運蛋白提供了鐵的來源或提供了從培養(yǎng)基中攝取鐵的能力。合適的鐵轉(zhuǎn)運蛋白包括運鐵蛋白和脫鐵運鐵蛋白。
優(yōu)選該培養(yǎng)基還包含一種或多種胰島素或胰島素樣生長因子和白蛋白(優(yōu)選重組的)，沒有飼養(yǎng)細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞提取物。
本發(fā)明的具體培養(yǎng)基包含有LIF、BMP、胰島素、白蛋白和運鐵蛋白，有或沒有其它基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
本發(fā)明還提供含有以下物質(zhì)的培養(yǎng)基-Id基因表達(dá)和/或Id蛋白活性的直接激活劑或效應(yīng)劑；-通過gp130起作用的細(xì)胞因子。
所述培養(yǎng)基任選可添加上述ES細(xì)胞分化抑制劑，或當(dāng)需要分化時，添加能ES細(xì)胞向特定表型分化的信號傳導(dǎo)因子。
優(yōu)選該培養(yǎng)基不含血清或血清提取物。最優(yōu)選該培養(yǎng)基是成分完全明確的。
本發(fā)明一優(yōu)選實施方式中，培養(yǎng)基包含gp130受體結(jié)合細(xì)胞因子LIF，其濃度在10U/ml-1000U/ml之間。更優(yōu)選在50U/ml-500U/ml之間，甚至更優(yōu)選為100U/ml。
具體的人多能細(xì)胞培養(yǎng)基含有(a)LIF，(b)BMP和(c)FGF。非人多能干細(xì)胞的具體培養(yǎng)基含有(a)LIF，(b)BMP和(c)FGF抑制劑?？扇绫疚乃鲞M(jìn)行培養(yǎng)基組分的置換。
本發(fā)明還提供從胚泡產(chǎn)生多能細(xì)胞的方法，該方法包括(1)獲得胚泡；(2)在存在gp130下游信號傳導(dǎo)途徑激活劑時培養(yǎng)該胚泡以獲得內(nèi)細(xì)胞團(tuán)；(3)分解該內(nèi)細(xì)胞團(tuán)；(4)從分解的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離獲得細(xì)胞；(5)在存在gp130下游信號傳導(dǎo)途徑的激活劑和Id基因表達(dá)激活劑或Id基因表達(dá)產(chǎn)物時培養(yǎng)該分離的細(xì)胞。
該方法宜包括用LIF培養(yǎng)胚泡，更優(yōu)選培養(yǎng)2-4天。
分離的細(xì)胞宜培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中。通常這些細(xì)胞以集落再接種。在下面的實施例中，我們聯(lián)用LIF和BMP受體激動劑獲得了良好結(jié)果。
也宜將胚泡培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中，任選缺乏BMP受體激動劑。
本發(fā)明還提供含有操作性連接于一啟動子的Id基因的載體。
所述啟動子宜為誘導(dǎo)型啟動子，而可利用外界因素控制表達(dá)?？梢允怯坞x型載體，如以下實施例中所述。
本發(fā)明的另一種培養(yǎng)基是含有能誘導(dǎo)Id蛋白表達(dá)的制劑，而不含有通過TGF-β超家族受體起作用的制劑的培養(yǎng)基。例子包括纖連蛋白、纖連蛋白受體激動劑、整合素信號傳導(dǎo)激活劑、nanog和所有上述能誘導(dǎo)Id基因表達(dá)和/或Id蛋白活性的同類物。
該培養(yǎng)基含有Id蛋白，如連接有轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的Id蛋白，以促進(jìn)Id蛋白轉(zhuǎn)位穿過多能細(xì)胞的細(xì)胞膜。
“轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域”指蛋白中能影響其自身和/或其它蛋白和物質(zhì)穿過細(xì)胞膜或脂質(zhì)雙層的結(jié)構(gòu)域或片段，包括保留這種結(jié)合功能的天然結(jié)構(gòu)域和片段。所述細(xì)胞膜可以是轉(zhuǎn)位過程中發(fā)生受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的內(nèi)體膜。通常在低pH時通過在脂質(zhì)膜中形成可檢測的小孔能力來鑒定轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域(見Shone等，Eur J Biochem.167175-180，1987所述的相宜試驗)。因此可利用轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的這種性能來鑒定本發(fā)明其它蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中可能起轉(zhuǎn)位作用的結(jié)構(gòu)域。衍生自細(xì)菌神經(jīng)毒素的轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的例子如下肉毒桿菌A型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(449-871)肉毒桿菌B型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(441-858)肉毒桿菌C型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(442-866)
肉毒桿菌D型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(446-862)肉毒桿菌E型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(423-845)肉毒桿菌F型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(440-864)肉毒桿菌G型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(442-863)破傷風(fēng)神經(jīng)毒素 -氨基酸殘基(458-879)其它合適的轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域是TAT(如來自HIV-1的)和穿透蛋白(penetratin)，即一種能內(nèi)化共價連接的肽和輸送它們，或能將它們輸送到細(xì)胞核的短氨基酸序列。其它稱為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的合適結(jié)構(gòu)域，如VP22、antp基因(antennapedia)的衍生物等，見Wadia等(2002)的描述?？赏ㄟ^化學(xué)方法，如通過巰基將這些結(jié)構(gòu)域連接于Id蛋白，或可表達(dá)含有Id蛋白和該結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。具體的結(jié)構(gòu)域見SEQ ID NO5-6。具體的融合蛋白包括Id蛋白和蛋白的轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域見SEQ ID NO7-9。連接的分子、融合蛋白和組合物含有本發(fā)明另一方面的相同內(nèi)容。可利用這些東西，例如作為培養(yǎng)基的添加物，用作以Id基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的另一種方法。
與轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域相關(guān)的“轉(zhuǎn)位”指與細(xì)胞表面結(jié)合后發(fā)生的內(nèi)化活動。這些活動導(dǎo)致物質(zhì)轉(zhuǎn)運入細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中。
因此將某因子輸送給ES細(xì)胞的組合物含有該因子，和能將該因子轉(zhuǎn)位至ES細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域，適合的是梭狀芽胞桿菌毒素的HN結(jié)構(gòu)域。
該結(jié)構(gòu)域也可選自(1)白喉毒素的HN結(jié)構(gòu)域，(2)基本上保留了白喉毒素HN結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)位活性的(1)的片段或衍生物，(3)融合性肽，(4)膜破壞性肽，和(5)(3)和(4)的轉(zhuǎn)位片段和衍生物。
本發(fā)明還提供利用能提高多能細(xì)胞中Id蛋白活性的制劑來促進(jìn)多能細(xì)胞的自我更新。該制劑將在本文適當(dāng)處進(jìn)行描述，可以是能提高細(xì)胞Id蛋白表達(dá)量的或增強(qiáng)Id蛋自在細(xì)胞中活性的制劑。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解，可通過TGF-β受體的上游激動劑(如受體的配體)、組成性活性受體，或激活該信號傳導(dǎo)途徑的下游組分，如SMAD信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，來影響TGF-β超家族受體的下游信號傳導(dǎo)途徑的激活。同樣gp130信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的上游效應(yīng)(如細(xì)胞因子)和下游效應(yīng)劑(如Stats)也能激活此通路。因此本發(fā)明的實施方式指激活TGF-β受體的下游信號傳導(dǎo)途徑，例如，使ES細(xì)胞衍生的方法包括所有含能激活TGF-β受體超家族信號傳導(dǎo)途徑分子的組合物，優(yōu)選通過BMP受體起作用以促進(jìn)多能干細(xì)胞的自我更新。BMP受體的合適配體包括BMP和GDF。
按照本發(fā)明，還優(yōu)選以粘附性培養(yǎng)形式來培養(yǎng)細(xì)胞，本發(fā)明實施例中，可發(fā)現(xiàn)維持細(xì)胞于多能狀態(tài)后，可誘導(dǎo)出高度均一性和高細(xì)胞活力的分化。通過加入細(xì)胞粘附性蛋白可促進(jìn)粘附性培養(yǎng)，在本發(fā)明具體實施例中，已采用明膠作為培養(yǎng)基質(zhì)的包被層。
還優(yōu)選以單層培養(yǎng)物形式培養(yǎng)本發(fā)明的多能細(xì)胞，但可任選懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或作為預(yù)先細(xì)胞凝聚物培養(yǎng)，可將細(xì)胞培養(yǎng)在小珠上或其它適合的支架上，如膜或其它三維結(jié)構(gòu)物上。
培養(yǎng)本發(fā)明多能細(xì)胞培養(yǎng)基中宜存在的其它成分是能促進(jìn)細(xì)胞存活和/或代謝的因子。在本發(fā)明一具體實施方式
中，在存在胰島素時培養(yǎng)細(xì)胞?？纱娌捎玫牧硪灰蜃邮且葝u素樣生長因子和其它促存活和/或促代謝因子。
本發(fā)明實施例中所用的培養(yǎng)基還宜含血清白蛋白。可采用其純化或重組形式，如采用重組形式優(yōu)點是沒有潛在的污染因素、細(xì)胞因子等。培養(yǎng)基中不需要含有血清白蛋白，此成分可刪去或用另一種豐富的蛋白質(zhì)或合成的多聚物(聚乙烯醇)代替，見Wiles等所述。
本發(fā)明特別優(yōu)選的培養(yǎng)基是成分完全明確的培養(yǎng)基。此種培養(yǎng)基不含不明確的組分，即不含成分不知的或含有不明確或可變因子的無特定功能的成分。采用成分完全明確的培養(yǎng)基的優(yōu)點是培養(yǎng)方法可高效一致和可后續(xù)操縱多能細(xì)胞。此外，發(fā)現(xiàn)可以更高效率和更大的預(yù)見性維持細(xì)胞于多能狀態(tài)，當(dāng)用成分明確的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化時，其對分化信號的反應(yīng)比用成分不明確的培養(yǎng)基更為均一。
可用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)任何成年人組織的多能干細(xì)胞。
本發(fā)明的方法還包括獲得分化細(xì)胞的方法，該方法包括如上所述培養(yǎng)多能細(xì)胞并使細(xì)胞分化，當(dāng)細(xì)胞含有選擇標(biāo)記時，與其它類型細(xì)胞相比，其能在所需的分化細(xì)胞(包括多能干細(xì)胞)中差異性表達(dá)，該選擇標(biāo)記的表達(dá)導(dǎo)致所需要的分化細(xì)胞優(yōu)先分離和/或存活和/或分裂。
分化的細(xì)胞可能是組織干細(xì)胞或子代細(xì)胞，可能是終末分化細(xì)胞。
本發(fā)明還提供分離多能干細(xì)胞或EG或SC細(xì)胞的方法，該方法包括在含有以下物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚胎細(xì)胞或組織，或胎兒或成年人的體細(xì)胞-通過gp130起作用的細(xì)胞因子；和-Id蛋白或Id基因表達(dá)和/或Id蛋白活性的直接激活劑或效應(yīng)劑；和/或-FGF受體或MEK/Erk的抑制劑。
優(yōu)選該培養(yǎng)基是成分完全明確的培養(yǎng)基。
本發(fā)明還延伸到用以下描述的本發(fā)明任一方法獲得細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞可用于試驗中來發(fā)現(xiàn)藥物。本發(fā)明的細(xì)胞也可用作細(xì)胞治療，因此本發(fā)明的方法包括聯(lián)合利用本發(fā)明的gp130信號傳導(dǎo)和Id蛋白活性和/或其表達(dá)來產(chǎn)生和/或維持多能細(xì)胞，將產(chǎn)生的細(xì)胞用于細(xì)胞治療，和在細(xì)胞治療中運用這些細(xì)胞。
本發(fā)明提供重新程序化細(xì)胞，從非多能細(xì)胞產(chǎn)生多能細(xì)胞的方法。因此獲得多能細(xì)胞的方法包括在細(xì)胞中表達(dá)Id基因或誘導(dǎo)Id基因的表達(dá)，可在含有Id蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，激活細(xì)胞中的gp130下游信號傳導(dǎo)途徑，從胎兒或成年人的體細(xì)胞或組織獲得多能細(xì)胞。所得到的多能細(xì)胞特征優(yōu)選為Rex1、Oct4和nanog陽性。
本發(fā)明提供檢測能替代Id蛋白活性的某因子的試驗，所述試驗包括(1)在存在Id蛋白活性和gp130下游信號傳導(dǎo)時培養(yǎng)細(xì)胞，從而將此細(xì)胞維持在多能狀態(tài)；(2)去除或降低Id蛋白活性；(3)在細(xì)胞中引入該因子；和(4)測定細(xì)胞是否保持在多能狀態(tài)或發(fā)生分化。
(1)中，在存在Id蛋白活性時培養(yǎng)細(xì)胞宜包括(a)表達(dá)Id基因，(b)誘導(dǎo)Id基因的表達(dá)，或(b)在培養(yǎng)該細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入Id蛋白，在細(xì)胞中加入該因子宜包括(a)表達(dá)該因子，或(b)在培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入該因子。本發(fā)明另一方面擴(kuò)大到獲得該因子。
Id基因是未分化ES細(xì)胞中BMP/Smad信號傳導(dǎo)的主要靶子。Id是負(fù)螺旋-環(huán)-螺旋因子，能螯合E蛋白阻止bHLH因子如myoD和mash1轉(zhuǎn)錄活性(Jen等，1992；Lyden等，1999)，是造血生成的候選負(fù)調(diào)節(jié)劑(Nogueira等，2000)。在本發(fā)明一具體實施方式
中，用只加有LIF的Id自我更新無血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞，確定BMP/Smad的關(guān)鍵性貢獻(xiàn)是誘導(dǎo)了Id的表達(dá)。
撤除LIF時，表達(dá)Id的ES細(xì)胞易于分化但不產(chǎn)生神經(jīng)前體細(xì)胞。因此Id蛋白是以譜系特異性方式起作用，抑制神經(jīng)前體細(xì)胞的定型，不影響或很少影響中胚層或原始內(nèi)胚層的定型。因此Id通過彌補(bǔ)STAT3對其它譜系的阻斷而產(chǎn)生自我更新作用(圖7)。Id的功能至少一部分是阻斷過早表達(dá)的促神經(jīng)原因子的作用。Id的可能作用是使干細(xì)胞與譜系引發(fā)的功能性后果相分隔(Hu等，1997)。
因此LIF/STAT3和BMP/Smad聯(lián)合作用支持了ES細(xì)胞的自我更新。這二條途徑還介導(dǎo)了非洲爪蟾(Xenopus)胚胎的腹側(cè)生成(Nishinakamura等，1999)。此例中，各基因的活動是充分獨立于其它基因的，STAT3和Smad1之間沒有交叉調(diào)節(jié)的證據(jù)。
同源域蛋白Nanog可繞過含血清培養(yǎng)基中激活STAT3的需求(Chambers等，2003)。Nanog也可用于替代對BMP/血清刺激的需求，至少部分可使Id組成性表達(dá)。
現(xiàn)在給予以下本發(fā)明的說明性實施例及附圖

圖1顯示LIF加BMP可維持ES細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中的自我更新；圖2顯示ES細(xì)胞在含LIF加BMP的N2B27中的集落形成、潛能和衍生能力；圖3顯示ES細(xì)胞中BMP的信號傳導(dǎo)；圖4顯示ES細(xì)胞中Id的表達(dá)和功能；圖5顯示Id抑制了神經(jīng)原的分化，此為ES細(xì)胞自我更新的需要；圖6顯示Nanog繞過對BMP/血清的需要而誘導(dǎo)了Id；和圖7顯示BMP/Id和LIF/STAT3對協(xié)作性細(xì)胞譜系的限制。
更詳細(xì)的內(nèi)容可參見以下實施例。
圖1顯示LIF加BMP可維持ES細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中的自我更新能力A.用所示細(xì)胞因子在N2B27中培養(yǎng)的Oct4-GiP細(xì)胞的相差和熒光顯微鏡圖象。TuJ1免疫染色檢測到神經(jīng)原分化，綠熒光反映了在未分化的ES細(xì)胞中Oct4啟勸子的活性。標(biāo)尺條50微米。
B.在含F(xiàn)CS加LIF的常規(guī)培養(yǎng)基中，或在含LIF(10ng/ml)加BMP4(10ng/ml)的N2B27中連續(xù)傳代時Oct4-GFP陽性未分化ES細(xì)胞累積數(shù)的標(biāo)示圖。每隔48小時用細(xì)胞解離緩沖液傳代培養(yǎng)物，再接種每10cm2的孔4×105個細(xì)胞。每次傳代用FACS分析測定GFP陽性細(xì)胞數(shù)。
C.對在(1)用含LIF加BMP的N2B27培養(yǎng)的ES細(xì)胞，(2)用含LIF的血清培養(yǎng)的ES細(xì)胞，(3)8天的胚胎樣小體，(4)用視黃酸處理的8天胚胎樣小體中Oct4、Nanog、T(短尾)和Sox1 mRNA的RT-PCR分析。
圖2顯示ES細(xì)胞在含LIF加BMP的N2B27中的集落形成、潛能和衍生能力A.通過電穿孔E14Tg2a細(xì)胞和用嘌呤霉素選擇分離得到的CAG-taugfp轉(zhuǎn)染子集落。
B.單個CAG-taugfp轉(zhuǎn)染子ES細(xì)胞和衍生的集落。
C.在含LIF加BMP的N2B27中傳代6次后TP6.3ES細(xì)胞產(chǎn)生的妊娠中期胚胎嵌合體。GFP熒光標(biāo)出了ES細(xì)胞的子代。
D.CAG-taugfp轉(zhuǎn)染的ES細(xì)節(jié)與C57BI/6母體和子代形成的雄性嵌合體?；ò灼っ珮?biāo)出了子代細(xì)胞的ES細(xì)胞起源。
E.用含LIF加BMP的N2B27培養(yǎng)衍生的第一代SF1ES細(xì)胞的集落。從SF1ES細(xì)胞產(chǎn)生的嵌合體。標(biāo)尺條50微米。
圖3顯示ES細(xì)胞中BMP的信號傳導(dǎo)A.Oct-GiP細(xì)胞RNA樣品的逆轉(zhuǎn)錄-PCR分析，具體是(1)在含LIF加BMP的N2B27中培養(yǎng)6代，(2)血清+LIF，無逆轉(zhuǎn)錄酶的對照，(3)血清+LIF，(4)接種于不含LIF或BMP的N2B27中1天后，(5)不含LIF或BMP，培養(yǎng)5天。
B.免疫印跡顯示對模擬處理(non)或用LIF、BMP或者LIF加BMP刺激15分鐘或在N2B27中培養(yǎng)過夜后1小時的Smad1、erk和p38反應(yīng)。
C.免疫印跡顯示對LIF、BMP和LIF加BMP的STAT3酪氨酸磷酸化反應(yīng)。
D.在存在血清和LIF時Smad7游離體型轉(zhuǎn)染子分化和表達(dá)了神經(jīng)原前體細(xì)胞(Sox1-GFP)和神經(jīng)原(TuJ)標(biāo)記。
E.SB203580(30μM)p38抑制劑不能抑制在LIF加BMP中的自我更新或單獨在LIF中的神經(jīng)原分化。Oct4-GFP標(biāo)出了未分化的ES細(xì)胞，TuJ1免疫印跡鑒定了神經(jīng)原。
F.ES細(xì)胞中活性Smad1和STAT3的共免疫沉淀。左圖用FLAG標(biāo)記的Smad1轉(zhuǎn)染后的FLAG免疫沉淀。右圖未操作的ES細(xì)胞的STAT3免疫沉淀。細(xì)胞如所示刺激1小時。標(biāo)尺條50微米。
圖4顯示ES細(xì)胞中Id的表達(dá)和功能A.用光循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄PCR分析法分析對LIF、BMP或LIF+BMP的反應(yīng)中基因的誘導(dǎo)。ESN2B27中培養(yǎng)過夜，然后刺激45分鐘。
B.Oct4-GiP細(xì)胞中Id mRNA表達(dá)的Northern雜交。Con維持在含血清加LIF培養(yǎng)基中的穩(wěn)定態(tài)ES細(xì)胞。泳道2-11在不含細(xì)胞因子的N2B27中培養(yǎng)過夜然后如所示刺激45分鐘。Fn纖連蛋白。
C.只用載體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)在含血清加LIF培養(yǎng)基中的46C ES細(xì)胞的Id蛋白穩(wěn)態(tài)水平，在Id1和fld1穩(wěn)定整合子克隆中和46C/T細(xì)胞游離體超轉(zhuǎn)染后的過度表達(dá)。后者印跡只接觸了10秒鐘。轉(zhuǎn)染的Id1加有FLAG尾，因此與內(nèi)源Id1相比移動滯后。
D.培養(yǎng)在含LIF的N2B27中的Id1穩(wěn)定整合子ES細(xì)胞集落的Nanog和Oct4mRNA原位雜交。用Id2和Id3轉(zhuǎn)染子獲得同樣結(jié)果。標(biāo)尺條50微米。
圖5顯示Id抑制了神經(jīng)原的分化，此為ES細(xì)胞自我更新的需要A.在沒有細(xì)胞因子的N2B27中分化6天后，載體和Id3穩(wěn)定整合子46C克隆的相差和GFP熒光顯微鏡圖象。Id1和Id2轉(zhuǎn)染子顯示了對神經(jīng)原分化的相似抑制。
B.上圖fld1轉(zhuǎn)染子46C細(xì)胞在單含LIF的N2B27中形成了自我更新的集落。中圖Cre切割的fld1C細(xì)胞在LIF中分化后需要LIF加BMP才能形成ES集落。下圖在切除兩側(cè)加上loxP位點的(floxed)Id1-STOP盒后，fld1C集落中組成性CAG單元驅(qū)動的GFP表達(dá)。
C.撤除N2B27中的LIF時fld1細(xì)胞經(jīng)歷了非神經(jīng)原分化，但不激活Sox1-GFP或表達(dá)TuJ。Cre切割后，fld1C細(xì)胞顯示恢復(fù)了TuJ陽性神經(jīng)原細(xì)胞的分化。(由于GFP的組成性激活不能在fldC細(xì)胞中特異性檢測到Sox1-GFP)。
D.ES細(xì)胞中和神經(jīng)原分化時mash1和ngn2表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄PCR分析。樣品同圖3A。
E.E47的過度表達(dá)阻抑了ES細(xì)胞質(zhì)自我更新，可通過提高Id1拯救。用E47超轉(zhuǎn)染46C/T ES細(xì)胞，或用E47加Id1游離型表達(dá)載體協(xié)同超轉(zhuǎn)染，在含血清和LIF的培養(yǎng)基中經(jīng)嘌呤霉素和零霉素雙選擇培養(yǎng)6天。
F.提高E47克服了Id1對神經(jīng)原分化的抑制。如E中超轉(zhuǎn)染46C/T ES細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24小時轉(zhuǎn)移到N2B27中不加細(xì)胞因子，雙選擇培養(yǎng)6天。標(biāo)尺條50微米。
圖6顯示Nanog繞過對BMP/血清的需要而誘導(dǎo)了Id；A.在N2B27或在N2B27加BMP中培養(yǎng)EF4C細(xì)胞6天。在所示條件下培養(yǎng)EF4 Nanog轉(zhuǎn)染子6代，然后拍照。標(biāo)尺條；50微米。
B和C.在血清加LIF(Con)中培養(yǎng)的，或在不含細(xì)胞因子的N2B27中培養(yǎng)過夜的E14Tg2a親代ES細(xì)胞和EF4 Nanog轉(zhuǎn)染子的Id1和Id3 mRNA的Northern雜交，和mRNA水平。
圖7顯示BMP/Id和LIF/STAT3對協(xié)作性細(xì)胞譜系的限制ES細(xì)胞的自我更新需要抑制細(xì)胞譜系的定型。BMP誘導(dǎo)的Id基因或其它信號阻斷進(jìn)入神經(jīng)原譜系，這只能用LIF/STAT3來部分防止。同時，BMP誘導(dǎo)中胚層和內(nèi)胚層分化的能力受到STAT3的約束，可能涉及到直接及間接機(jī)制。因此撤除LIF可導(dǎo)致將BMP的作用從支持自我更新轉(zhuǎn)變到促進(jìn)細(xì)胞譜系的定型。
在本發(fā)明的序列表中，以下的序列編號SEQ ID NO對應(yīng)于以下序列1.小鼠Id3的氨基酸序列2.大鼠Id3的氨基酸序列3.犬Id3的氨基酸序列4.人Id3的氨基酸序列5.Tat的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域
6.antp基因的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域7.Tat-人Id3融合物8.antp基因-人Id3融合物9.小鼠Id3-antp基因融合物實施例對在最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的未分化ES細(xì)胞的活力而言，胎牛血清很重要(Wiles和Johansson，1999)。然而富含N2和B27添加劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，ES細(xì)胞的活力維持高水平(Ying和Smith，2003)。這使我們要檢驗LIF是否能在缺乏血清因子時驅(qū)動自我更新的不斷循環(huán)。
在單純N2B27培養(yǎng)基中，粘附性ES細(xì)胞能有效轉(zhuǎn)化為Sox1陽性神經(jīng)原前體細(xì)胞(Ying等，2003)在這些條件下LIF減少了但不是消除了神經(jīng)原人分化。在含LIF的N2B27培養(yǎng)基中連續(xù)傳代時，我們發(fā)現(xiàn)未，未分化的ES細(xì)胞數(shù)經(jīng)最初增長達(dá)到一平臺，2-3代后開始下降。這種發(fā)現(xiàn)用，和種分化的ES細(xì)胞系得到重復(fù)。這些培養(yǎng)物中的許多細(xì)胞具有神經(jīng)原前體細(xì)胞或不成熟神經(jīng)原的形態(tài)。通過46C ES細(xì)胞中的Sox1-GFP神經(jīng)原報告劑的激活證實了神經(jīng)原的分化(Ying等，2003)。這些觀察表明，需要LIF/STAT3的其它信號傳導(dǎo)途徑來促進(jìn)ES細(xì)胞質(zhì)自我更新，特別是抑制神經(jīng)原的定型。
BMP是熟知的脊椎動物胚胎中的抗神經(jīng)(anti-neural)因子(Wiles和Hemmati-Brivanlou，1995；Wiles和Edlund，2001)已證明基能拮抗ES細(xì)胞分化成神經(jīng)原(Tropepe等，2001；Ying等，2003)。BMP只能促進(jìn)ES細(xì)胞最終分化成非神經(jīng)原(Johansson和Wiles，1005；Wiles和Johansson，1999；Ying等，2003)，因此真實不可能視為候選的自我更新因子。然而，我們檢驗了加入BMP是否可能與LIF的共刺激結(jié)合來抑制分化。我們發(fā)現(xiàn)LIF加BMP4(或BMP2)組合增強(qiáng)了自我更新，在N2B27中傳代2或3次后導(dǎo)致高純度的未分化ES細(xì)胞群(圖1A)。這些培養(yǎng)物可繼續(xù)擴(kuò)增許多代而生長速度或活力不下降，沒有神經(jīng)原分化(圖1A、B)。在起源于3種獨立衍生物的11個不同的ES細(xì)胞系的每一個中都觀察到此種反應(yīng)。代表性的Oct4陽性未分化細(xì)胞群的倍增時間略高于用血清加LIF培養(yǎng)時獲得的(圖1B)。SSEA-1和堿性磷酸酶(未顯示)和ES細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Nanog和Oct4的表達(dá)，與缺乏中胚層(T)和神經(jīng)外胚層(Sox1)標(biāo)記，證實了ES細(xì)胞的狀態(tài)(圖1C)。
N2和B27組分可改善細(xì)胞活力但不是自我更新所必須。在只添加了運鐵蛋白的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，LIF加BMP可維持未分化的ES細(xì)胞自我更新和擴(kuò)增許多代，但單用LIF不行。因此B27組分不會導(dǎo)致對BMP的需要。
我們測試了BMP的相關(guān)生長和分化因子-6(GDF-6)，發(fā)現(xiàn)在存在LIF時它可類似地支持ES細(xì)胞的自我更新(圖1A)。然而，這不是TGF-β超家族的一般特征而是限于BMP受體的配體。TGF-β1對ES細(xì)胞沒有可辨別的作用，而活化素增強(qiáng)了ES細(xì)胞的活力和/或增殖，但不抑制分化。
為了測試LIF加BMP支持的ES細(xì)胞增殖，我們進(jìn)行了電穿孔和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子的選擇。容易地分離得到了能穩(wěn)定表達(dá)tauGFP的集落(圖2A)并擴(kuò)增成大培養(yǎng)物，顯示了在遺傳操作方案中利用此無血清系統(tǒng)的可行性。
然后研究了分離得到的ES細(xì)胞的自我更新。將單個ES細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96孔N2B27培養(yǎng)基中，只加LIF或LIF與BMP4(圖2B)。只存在LIF時形成了單個集落，含有高比例的分化細(xì)胞不能進(jìn)一步擴(kuò)增。相反，在LIF加BMP4的192個孔中有12個形成了未分化集落，其中10個不用血清可擴(kuò)增(表)。
在LIF加BMP中培養(yǎng)的ES細(xì)胞經(jīng)多次傳代維持了二倍體染色體互補(bǔ)。它們也保留了分化潛力。撤除LIF和BMP將導(dǎo)致原分化，去除LIF但保留BMP導(dǎo)致分化成為扁平上皮樣細(xì)胞片層。對BMP的這種自我更新反應(yīng)仍然依賴于持續(xù)的LIF信號傳導(dǎo)。
小鼠ES細(xì)胞的明確功能是它們能夠重新進(jìn)入胚胎發(fā)育在嵌合小鼠中產(chǎn)生分化組織的完全組分。在用N2B27和LIF加BMP培養(yǎng)增殖3周后，我們將含有GFP報告劑的ES細(xì)胞注射到小鼠胚泡中。分析妊娠中期鑒定到的含許多ES細(xì)胞的幾個嵌合體的組織類型(圖2C)。由于測試更嚴(yán)格，我們采用了以taugfp轉(zhuǎn)染的在LIF加BMP中選擇和擴(kuò)增的ES細(xì)胞。獲得了活體出生的嵌合體和遺傳了ES細(xì)胞基因組的二個雄性動物(2D)。
不用飼養(yǎng)細(xì)胞或血清衍生ES細(xì)胞我們研究了對BMP的反應(yīng)是否適合建立的ES細(xì)胞培養(yǎng)或顯示ES細(xì)胞衍生的最初階段。我們將胚泡接種在添加了BMP和LIF的N2B27培養(yǎng)基中。幾天后分解擴(kuò)增的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)再接種在同樣的培養(yǎng)條件下。在初步試驗中，培養(yǎng)5-6天(ES細(xì)胞衍生的標(biāo)準(zhǔn)時間)后的JCM分解不能獲得ES細(xì)胞集落(Nichols等，1990；Robertson，1987)。然而在缺乏血清存在BMP時，LIF顯示能降低生長速度和更迅速發(fā)生明顯的分化。因此我們后來只在LIF中培養(yǎng)胚泡4天后分解ICM和在接種時加入BMP。在這些條件下原代ES細(xì)胞集落確實形成了(圖2E)。這些集落能傳代和擴(kuò)增成形態(tài)為未分化的ES細(xì)胞。一個細(xì)胞系(SF1)也具有此特征。撤除LIF和BMP時，SF1細(xì)胞經(jīng)歷了體內(nèi)神經(jīng)原分化。然而，SF1細(xì)胞產(chǎn)生了數(shù)目眾多的嵌合小鼠(圖2F)。12個嵌合體都是雄性，表明由于主要是XY ES細(xì)胞而發(fā)生性別轉(zhuǎn)變(Bradley等，1984)。
因此，按照本發(fā)明在存在gp130信號傳導(dǎo)和TGF-β超家族愛體的下游信號傳導(dǎo)時培養(yǎng)不規(guī)則接種的細(xì)胞我們衍生了ES細(xì)胞。
未分化的ES細(xì)胞表達(dá)功能性BMP信號傳導(dǎo)機(jī)制在LIF加BMP中培養(yǎng)只能形成單個細(xì)胞克隆幾乎完全沒有分化，提示我們BMP可能直接作用于ES細(xì)胞，而不是通過分化的子代細(xì)胞介導(dǎo)。然而先前研究報告，ES細(xì)胞分化時有BMP受體表達(dá)和BMP反應(yīng)不能確定是否未分化狀態(tài)的ES細(xì)胞可對BMP產(chǎn)生確切反應(yīng)。為了證實這一點，我們利用對Oct4轉(zhuǎn)基因活性的選擇(Ying等，2002)來純化用于RNA和蛋白質(zhì)分析的未分化的細(xì)胞。
BMP通過1型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的異質(zhì)二聚體起作用(Shi和Massaque，2003)。未分化ES細(xì)胞很少或沒有I型Bmprlb mRNA，但表達(dá)I型Bmprla和II型BmprII受體mRNA(圖3A)。在未分化ES細(xì)胞中也易檢測到BMP4和GDF6轉(zhuǎn)錄物。BMP受休的主要下游因子是Smad轉(zhuǎn)錄因子(Attisano和Wrana，2002；vonBubnoff和Cho，2001)。活性BMP受體復(fù)合物可募集和磷酸化R-Smad1、5和8，然后與Smad4組合轉(zhuǎn)位于核中。我們用絲氨酸磷酸化活性形式的Smad1特異性抗體作免疫印跡研究了Smad的激活。加入BMP4后顯示未分化ES細(xì)胞中Smad1的磷酸化化增加(圖3B)。BMP刺激也提高了p38的，一小時后提高了erk絲裂原-活化的蛋白激酶的基礎(chǔ)活性(圖3B)。這些資料確定未分化的ES細(xì)胞具有對BMP刺激起反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，因而它們可能具有通過產(chǎn)生BMP4和GDP進(jìn)行自分泌刺激的潛能。
BMP通過Smad激活支持自我更新LIF的自我更新作用是通過轉(zhuǎn)錄因子STAT3介導(dǎo)的(到Matsuda等，1999；Niwa等，1998)。經(jīng)酪氨酸705的磷酸化測定，單獨BMP不能激活STAT3(圖3C)。LIF也不能提高STAT3的活性。gp130的下游Erk激活是ES細(xì)胞自我更新不需要的，但它似乎是促分化信號(Burdon等，1999a)。因此降低erk活性有利于ES細(xì)胞的衍生(Buehr和Smith，2003)和促進(jìn)自我更新(Burdon等，1999b)。然而，對LIF反應(yīng)時Erk的激活不宜因存在BMP而受到抑制(圖3B)。這些資料表明，BMP不能調(diào)節(jié)ES細(xì)胞中的gp130信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，提示信號傳導(dǎo)途徑直接對自我更新起作用。
我們將抑制性gp130家族成員Smad6和Smad7(Shi和Massague，2003；von Bubnoff和Cho，2001)導(dǎo)入ES細(xì)胞中來拮抗BMP信號傳導(dǎo)。在存在血清和LIF嘌呤霉素選擇下轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)細(xì)胞。與空載體相比，Smad6和Smad7表達(dá)載體產(chǎn)生了少量和較小的ES細(xì)胞集落。此外，傳代后Smad6，甚至加上Smad7轉(zhuǎn)染子擴(kuò)增差。在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群中表現(xiàn)出高水平的分化。在粘附性培養(yǎng)中通常血清可抑制神經(jīng)原的分化，但這在Smad7轉(zhuǎn)染后易于出現(xiàn)(圖3D)。
除阻抑Smad激活外，Smad6/7也能抑制BMPR的下游TAK/p38途徑(Kimura等，2000)。為了評估p38在ES細(xì)胞中的潛在作用，我們采用了特異性抑制劑SB203580(Cuenda等，1995)。此試劑對BMP支持自我更新的能力沒有顯而易見的作用(圖3E)。在只用LIF時。SB203580不能改變自我更新與神經(jīng)原分化之間的平衡，但看來能提高細(xì)胞的整體活力，提示在ES細(xì)胞和其它類型細(xì)胞中，p38具有促凋亡作用(Kimura等，2000)。因此Smad途徑可能是自我更新信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)器。
已特征鑒定了神經(jīng)上皮細(xì)胞中Smad和STAT3之間協(xié)作性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的機(jī)制(Nakashima等，1999；Sun等，2001)。這涉及到形成由遍在轉(zhuǎn)錄協(xié)同激活劑p300橋連的三元復(fù)合體，導(dǎo)致協(xié)同激活膠質(zhì)細(xì)胞持異性啟動子。我們研究了用LIF加BMP刺激的ES細(xì)胞中是否可能形成含有STAT3和Smad的復(fù)合體。用FLAG加尾的Smad1轉(zhuǎn)染后進(jìn)行免疫沉淀，表明活化的STAT3和Smad1可共定位(圖3F)。在LIF加BMP刺激后內(nèi)源磷酸化的Smad1和STAT3的共免疫沉淀證實了此結(jié)論。
ES細(xì)胞中的BMP靶基因為了引起ES細(xì)胞自我更新，可同時操縱對不同靶基因的BMP/Smad和LIF/STAT3信號傳導(dǎo)，和/或可會聚于共同的靶基因，例如，通過與p300的三元復(fù)合體。我們利用實時RT-PCR在Oct-選擇的ES細(xì)胞中檢測了LIF、BMP或LIF加BMP所誘導(dǎo)的候選基因(圖4A)。已知的二個LIF靶基因tisll和c-fos顯示對BMP不反應(yīng)。其它二junB和特別是socs3在存在BMP時看來可被LIF更好誘導(dǎo)。這些資料提示，STAT3靶基因的一個亞組可能對BMP的共刺激起反應(yīng)。然而junB和Socs3均不是自我更新效應(yīng)的候選基因junB裸ES細(xì)胞顯示沒有缺損(Schorpp-Kistner等，1999)，而SOCS3功能是gp130信號傳導(dǎo)的負(fù)反潰調(diào)節(jié)劑(Schmitz等，2000)，當(dāng)過度表達(dá)時阻抑了自我更新。
我們也檢測了Id基因的表達(dá)，該基因編碼負(fù)調(diào)節(jié)bHLH因子，證明在神經(jīng)上皮細(xì)胞(Nakashima等，2001)和C2C12肌母細(xì)胞(Lopez-Rovira等，2002)中可被BMP/Smad誘導(dǎo)。也有報導(dǎo)在分化的ES細(xì)胞培養(yǎng)物中BMP可誘生Id mRNA(Hollnagel等，1999)。我們發(fā)現(xiàn)BMP(和GDF，資料未顯示)，但不是LIF可強(qiáng)效誘導(dǎo)Id1和Id3(圖4A)。Northern雜交證實了這些發(fā)現(xiàn)，并將其延伸到Id2(圖4B)?；罨?資料未顯示)或TGF-β1均不能誘導(dǎo)Id基因表達(dá)，表明此反應(yīng)是對BMP受體下游的Smad特異的。
胎牛血清和纖連蛋白也可誘導(dǎo)Id基因，雖然程度比BMP差(圖4B)。血清培養(yǎng)的ES細(xì)胞顯示能容易地檢測到穩(wěn)定狀態(tài)的Id mRNA量。我們檢驗了誘導(dǎo)Id2和Id3的纖連蛋白在N2B27培養(yǎng)中能否替代BMP?？扇苄岳w連蛋白與LIF組合可擴(kuò)增未分化Oct4-GiP細(xì)胞至少10代，雖然比BMP有更多的分化和較慢的細(xì)胞群擴(kuò)增。
組成性Id可繞過BMP或血清需求使ES細(xì)胞自我更新我們假設(shè)誘導(dǎo)Id可能對神經(jīng)原分化提供特定限制而彌補(bǔ)STAT3的自我更新活性。因此我們制備了Id1、Id2和Id3的表達(dá)構(gòu)建物，將它們導(dǎo)入ES細(xì)胞中。通過游離型載體超轉(zhuǎn)染和常規(guī)的穩(wěn)定整合，不難回收到許多集落。免疫印跡證實Id1的蛋白表達(dá)升高(圖4C)。靶基因的過度表達(dá)看來與內(nèi)源性Id1蛋白的減少相關(guān)，提示反潰或自身調(diào)節(jié)起了作用。
迫使Id表達(dá)并不損傷ES細(xì)胞的自我更新也不阻斷存在血清時的分化。在這些條件下，轉(zhuǎn)染子與親代ES細(xì)胞或空載體轉(zhuǎn)染子沒有顯著不同。相反，在無血清的N2B27培養(yǎng)時，Id轉(zhuǎn)染子雖然維持對LIF的依賴，但不需要BMP。這些細(xì)胞在單用LIF時可增殖，速度與用LIF加BMP培養(yǎng)的親代ES細(xì)胞幾乎無差別。培養(yǎng)物可傳代多次而未分化形態(tài)或因子依賴性不改變。表達(dá)Oct4和Nanog mRNA證實了ES細(xì)胞表型(圖4D)。由于嚴(yán)格測試到Id表達(dá)能替代血清或BMP/GFP，我們在N2B27中接種了單個細(xì)胞。只用LIF形成了未分化的傳代細(xì)胞集落，其產(chǎn)生頻率(10％)與用LIF加BMP培養(yǎng)分離細(xì)胞形成的集落相當(dāng)(表)。
Id蛋白對ES細(xì)胞分化具有譜系特異性阻抑作用在我們的培養(yǎng)物中，LIF為Id轉(zhuǎn)染子自我更新所必須，因為Id不會完全阻抑ES細(xì)胞的分化。如果撤除含血清培養(yǎng)基中的LIF，Id轉(zhuǎn)染細(xì)胞象親代ES細(xì)胞那樣分化。在粘附性培養(yǎng)中，它們主要產(chǎn)生扁平狀上皮樣細(xì)胞和一些成纖維細(xì)胞。凝聚時它們形成胚胎樣小體并表達(dá)中胚層(T)和內(nèi)胚層(Hnf4)標(biāo)記(資料未顯示)，自發(fā)產(chǎn)生的收縮性表明有心肌細(xì)胞分化。然而，在缺乏LIF的N2B27培養(yǎng)時，Id轉(zhuǎn)染子的表現(xiàn)與其它ES細(xì)胞不同。以形態(tài)學(xué)和Sox1-GFP激活評估的神經(jīng)原分化很少(圖5A)。而是這些轉(zhuǎn)染子分化成扁平上皮樣細(xì)胞的片層，類似于只接觸BMP的親代ES細(xì)胞(cf圖1A)。
我們制備了可逆性表達(dá)構(gòu)建物來測試自我更新和阻抑神經(jīng)原分化是否依賴于持續(xù)性Id表達(dá)。我們制備了表達(dá)兩側(cè)加上loxP位點的Id1的46C ES細(xì)胞(fld1細(xì)胞)和后續(xù)Cre處理的Id1轉(zhuǎn)基因已被切除的衍生克隆(fld1C)。切除Cre后，fld1C細(xì)胞顯示沒有FLAG-Id1，恢復(fù)到內(nèi)源性Id1水平(圖4C)。將fld1和fld1C細(xì)胞以克隆密度接種于含LIF或LIF加BMP的N2B27培養(yǎng)基中。fld1細(xì)胞在單用LIF時有效形成了干細(xì)胞集落，但fld1C細(xì)胞丟失了這種能力在無BMP的LIF培養(yǎng)時只產(chǎn)生分化的細(xì)胞(5B)。在單用N2B27培養(yǎng)時，fld1細(xì)胞無神經(jīng)原分化，而fld1C細(xì)胞表現(xiàn)與親代ES細(xì)胞相同，產(chǎn)生了高比例的TuJ陽性神經(jīng)原(圖5C)。
這些觀察表明Id表達(dá)特異性地阻斷了神經(jīng)原譜系的定型，使分化中的ES細(xì)胞轉(zhuǎn)變成另一結(jié)局，如在缺乏LIF時用BMP處理經(jīng)常觀察到那樣(Ying等，2003)。表達(dá)Id的ES細(xì)胞完全依賴于LIF/STAT3才能抑制非神經(jīng)原譜系的定型并維持多能性。
在CNS發(fā)育中已知Id蛋白可拮抗神經(jīng)原性bHLH轉(zhuǎn)錄因子的作用(Lyden等，1999)。神經(jīng)系發(fā)生前這些bHLH因子的體內(nèi)作用沒見報導(dǎo)，然而培養(yǎng)的ES細(xì)胞預(yù)計只在分化譜系中才能發(fā)現(xiàn)其mRNA的表達(dá)(Ramalho-Santos等，2002)因此我們研究了二種bHLH基因mash1和neurogenin2在Oct4選擇的ES細(xì)胞中的可能表達(dá)。雖然未測到neurogenin2 mRNA高于背景水平，但mash1 mRNA看來較為豐富(圖5D)。因此我們提出Id表達(dá)可能是防止過早表達(dá)mash1和其它促神經(jīng)原bHLH因子所觸發(fā)的ES細(xì)胞繼續(xù)分化成為神經(jīng)原所必須。這種作用也可能包括非bHLH伴侶，如Pax和Ets因子(Norton，2000)。
Id蛋白能以高親合力結(jié)合遍在性HLH因子E蛋白(Norton，2000)。二者之一的過度表達(dá)可隔斷可阻斷另一因子的活性。為了評估Id蛋白是否為ES細(xì)胞增殖所需，我們通過游離型載體單獨超轉(zhuǎn)染，或與Id1或Id3共轉(zhuǎn)染過度表達(dá)了E47蛋白。E47單獨或與空載體共轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了很少和很小的不健康集落(圖5E)。相反，E47和Id載體共轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了健康的ES細(xì)胞集落。共轉(zhuǎn)染子集落外觀與含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的單用Id或用空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不能區(qū)別。這提示E47無顯著毒性，但由于隔斷了Id具有特異性生長抑制作用。如在其它類型細(xì)胞中所見，ES細(xì)胞增殖可能需要某種水平的游離Id(Norton，2000)。當(dāng)轉(zhuǎn)移到無LIF或BMP的N2B27中培養(yǎng)時，此共轉(zhuǎn)染子發(fā)生神經(jīng)原而不是非神經(jīng)原分化，如Sox1-GFP激活所顯示的那樣(圖5F)。因此E47中和了Id的神經(jīng)原抑制作用。這與Id作用是限制與促神經(jīng)原性bHLH因子相伴的E蛋白利用度相一致。
Nanog可繞過對BMP或血清的需求提高各種同源域蛋白Nanog的水平在存在血清時賦予了ES細(xì)胞不依賴LIF/STAT3的自我更新(Chambers等，2003)。我們檢驗了過度表達(dá)Nanog的ES細(xì)胞在N2B27中培養(yǎng)時自我更新是否需要LIF和/或BMP。圖6A顯示表達(dá)兩側(cè)加上loxP位點的Nanog轉(zhuǎn)基因的EF4細(xì)胞可在沒有LIF或BMP的N2B27中增殖。這種現(xiàn)象直接歸因于Nanog，因為產(chǎn)生的EF4C細(xì)胞(其Nanog轉(zhuǎn)基因已被Cre重組酶切除)可迅速經(jīng)歷神經(jīng)原分化。單項獎加入BMP對EF4細(xì)胞無明顯作用，除非維持培養(yǎng)物不傳代6天以上某些分化變得明顯(見討論)。除LIF外，加或不加BMP，EF4細(xì)胞更均勻地粘附于培養(yǎng)皿(圖6A)，細(xì)胞群倍增速度提高。這與先前發(fā)現(xiàn)LIF/STAT3和Nanog在ES細(xì)胞中具有組合性作用相一致(Chambers等，2003)。
因為Nanog使BMP或血清的刺激作用成為多余，我們提問EF4細(xì)胞是否表達(dá)Id？在不含LIF或BMP的N2B27中培養(yǎng)過夜后，親代E14Tg2a細(xì)胞中Id1和Id3的表達(dá)顯著下調(diào)。相反，EF4細(xì)胞中，Id1 mRNA降低然而仍有相當(dāng)量，而Id3 mRNA確實增加(圖6B)?？衫肗anog的過度表達(dá)來維持基本水平的Id組成性表達(dá)。
實驗方法ES細(xì)胞培養(yǎng)不用飼養(yǎng)細(xì)胞維持ES細(xì)胞培養(yǎng)。對于無血清培養(yǎng)，將ES細(xì)胞接種在明膠包N2B27培養(yǎng)基中，添加10ng/ml LIF(Sigma)和10ng/ml BMP4或200ng/ml GDF6(R&DSystems)(Ying和Smith，2003)。每隔2-3天用不含酶的細(xì)胞分解緩沖液(Invitrogen)或0.025％胰蛋白酶/1％雞血清傳代細(xì)胞一次。將分解的細(xì)胞收集在N2B27中離心沉淀。吸去上清將細(xì)胞沉淀重懸于N2B27直接再接種。對于單細(xì)胞克隆，用預(yù)先裝有N2B27液的移液器挑取單個細(xì)胞一滴10微升。將單個細(xì)胞滴轉(zhuǎn)移到預(yù)先裝有150微升N2B27的96孔板中各孔含有LIF或LIF加BMP。8天后，鑒定ES細(xì)胞集落并傳代。為了產(chǎn)生嵌合體，將ES細(xì)胞注射到C57BI/6胚泡中。通過使雄性嵌合體與雌性C57BI/6交配測試種系傳遞。
在無血清培養(yǎng)基中ES細(xì)胞的衍生取出妊娠第三天129品系小鼠的卵細(xì)胞，胚胎停育4天(Nichols等，1990)。將完整的胚泡接種在明膠包被的塑料板孔中，N2B27培養(yǎng)基添加有LIF(10ng/ml)。3-6天后，挑出每個外植體的中心團(tuán)塊，用PBS淋洗，置于一滴胰蛋白酶中幾分鐘。通過精細(xì)抽吸移液器中預(yù)先裝載的培養(yǎng)基挑出細(xì)胞團(tuán)，確保盡量不攜帶胰蛋白酶，輕輕研碎推到加有LIF和BMP(10ng/ml)的N2B27培養(yǎng)基的新鮮孔中。將得到的原代ES細(xì)胞集落在96孔板中分別傳代。然后離心和吸取胰酶消化整個培養(yǎng)物，使其擴(kuò)增用于再接種。
RNA分析將Oct4-GIp ES細(xì)胞培養(yǎng)在嘌呤霉素中4天以去除分化細(xì)胞(Ying等，2002)。將純化的ES細(xì)胞培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基加LIF中24小時，然后用PBS洗一次，轉(zhuǎn)移到N2B27培養(yǎng)基中過夜，然后用20ng/ml LIF、50ng/ml BMP4、LIF加BMP4、10ng/mlTGF-β1(所有均購自R&D Systems)或15％FCS刺激45分鐘。用光循環(huán)儀(Roche)進(jìn)行定量RT-PCR。數(shù)據(jù)按Oct4擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)化。按需要利用引物對和反應(yīng)條件。對5微升等份的總RNA進(jìn)行Northern雜交。
質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染Smad6和Smad7質(zhì)粒為Hitoshi Niwa友好提供，F(xiàn)LAG加尾Id1質(zhì)粒為Tetsuya Taga提供。用PCR擴(kuò)增小鼠Id2、Id3的E47開放讀框，克隆入pCR2.1中，經(jīng)序列分析證實無突變。將表達(dá)載體以游離形式或穩(wěn)定的整合形式導(dǎo)入ES細(xì)胞中。用Chambers等(2003)所述方法衍生兩側(cè)加上loxP位點的Id1和Cre切除產(chǎn)生的ES細(xì)胞。
免疫化學(xué)將預(yù)先選出的Oct4-GiP ES細(xì)胞轉(zhuǎn)移到N2B27培養(yǎng)基中過夜，然后用LIF(20ng/ml)、BMP4(50ng/ml)或LIF加BMP4刺激15分鐘或1小時。用免疫印跡法(Cell Signalling Technology)檢測磷酸化的stat3、smad1、erk1/2和p38。細(xì)胞裂解液和免疫沉淀物(Nakashima等，1997)采用抗-FLAG(Sigma)或抗-Stat3(Transduction Labs)印跡。如Ying等所述進(jìn)行免疫染色。
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表轉(zhuǎn)染后單個ES細(xì)胞在含有LIF加BMP，或只有LIF的無血清培養(yǎng)基中的增殖情況
序列表以下列出本發(fā)明具體實施方式
所用的序列以及本發(fā)明的具體融合蛋白。
SEQ ID No1 小鼠Id3的氨基酸序列2 大鼠Id3的氨基酸序列3 犬Id3的氨基酸序列4 人Id3的氨基酸序列5 Tat的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域6 antp基因的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域7 Tat-人Id3融合物8 antp基因-人Id3融合物9 小鼠Id3-antp基因融合物SEQ ID NO1-小鼠Id3MKALSPVRGCYEAVCCLSERSLAIARGRGKSPSTEEPLSLLDDMNHCYSRLRELVPGVPRGTQLSQVEILQRVIDYILDLQVVLAEPAPGPPDGPHLPIQTAELTPELVISKDKRSFCHSEQ ID NO2-大鼠Id3MKALSPVRGCYEAVCCLSERSLAIARGRGKSPSAEEPLSLLDDMNHCYSRLRELVPGVPRGTQLSQVEILQRVIDYILDLQVVLAEPAPGPPDGPHLPIQTAELTPELVISKDKRSFCHSEQ ID NO3-犬Id3MKALSPVRGCYEAVCCLSERSLAIARGRGKGPAAEEPLSLLDDMNHCYSRLRELVPGVPRGTQLSQVEILQRVIDYILDLQVVLAEPAPGPPDGPHLPIQTAELAPELVISNDKRSFCHSEQ ID NO4-人Id3MKALSPVRGCYEAVCCLSERSLAIARGRGKGPAAEEPLSLLDDMNHCYSRLRELVPGVPRGTQLSQVEILQRVIDYILDLQVVLAEPAPGPPDGPHLPIQTAELAPELVISNDKRSFCHSEQ IDNO5-Tat的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域YGRKKRRQRRRSEQ IDNO6-antp基因的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域RQIKIWFQNRRMKWKKSEQIDNO7-Tat-人Id3融合物YGRKKRRQRRRMKALSPVRGCYEAVCCLSERSLAIARGRGKGPAAEEPLSLLDDMNHCYSRLRELVPGVPRGTQLSQVEILQRVIDYILDLQVVLAEPAPGPPDGPHLPIQTAELAPELVISNDKRSFCH
SEQ ID NO8-antp基因-人Id3融合物RQIKIWFQNRRMKWKKMKALSPVRGCYEAVCCLSERSLAIARGRGKGPAAEEPLSLLDDMNHCYSRLRELVPGVPRGTQLSQVEILQRVIDYILDLQVVLAEPAPGPPDGPHLPIQTAELAPELVISNDKRSFCHSEQ IDNO9-小鼠Id3-antp基因融合物MKALSPVRGCYEAVCCLSERSLAIARGRGKSPSTEEPLSLLDDMNHCYSRLRELVPGVPRGTQLSQVEILQRVIDYILDLQVVLAEPAPGPPDGPHLPIQTAELTPELVISKDKRSFCHRQIKIWFQNRRMKWKK
權(quán)利要求
1.Id基因產(chǎn)物在促進(jìn)培養(yǎng)的多能細(xì)胞自我更新中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，將Id基因產(chǎn)物與gp130下游信號傳導(dǎo)途徑的激活劑聯(lián)合應(yīng)用。
3.聯(lián)合應(yīng)用(i)能增強(qiáng)Id蛋白表達(dá)或活性的制劑；和(ii)gp130下游信號傳導(dǎo)途徑激活劑來促進(jìn)培養(yǎng)的多能細(xì)胞的自我更新。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述gp130下游信號傳導(dǎo)途徑激活劑是LIF。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述多能細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述胚胎干細(xì)胞是小鼠細(xì)胞或人的細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求3-6中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述制劑(i)選自纖連蛋白、纖連蛋白受體激動劑、整合素信號傳導(dǎo)激活劑、nanog和能誘導(dǎo)Id基因表達(dá)或Id蛋白活性的所有上述物質(zhì)的同類物。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括誘導(dǎo)Id基因的表達(dá)。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括用遺傳方法操縱多能細(xì)胞使其表達(dá)Id基因。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項所述的用途，其特征在于，所述應(yīng)用包括在多能細(xì)胞中導(dǎo)入含有Id基因的載體。
11.如權(quán)利要求1-11中任一項所述的用途，其特征在于，所述Id基因產(chǎn)物是Id蛋白。
12.一種促進(jìn)培養(yǎng)的多能細(xì)胞自我更新的方法，該方法包括(1)在細(xì)胞中表達(dá)Id基因或誘導(dǎo)Id基因的表達(dá)，或在含有Id蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該細(xì)胞，和(2)激活gp130下游信號傳導(dǎo)。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，該方法包括在細(xì)胞中以游離體形式表達(dá)Id基因。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，該方法包括表達(dá)含有誘導(dǎo)型啟動子的游離型載體中的Id基因。
15.如權(quán)利要求12-14中任一項所述的方法，其特征在于，該方法包括通過在含有經(jīng)gp130起作用的細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞來刺激gp130下游信號傳導(dǎo)。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞因子選自LIF、CNTF、心養(yǎng)蛋白、抑瘤蛋白M和IL-6加sIL-6受體的組合。
17.聯(lián)合應(yīng)用(a)Id基因表達(dá)和/或Id蛋白活性的直接激活劑或效應(yīng)劑，而非通過TGF-β超家族受體起作用的制劑；和(b)gp130下游信號傳導(dǎo)途徑激活劑；來促進(jìn)培養(yǎng)的多能細(xì)胞的自我更新。
18.一種培養(yǎng)ES細(xì)胞以促進(jìn)ES細(xì)胞自我更新的方法，該方法包括將ES細(xì)胞維持在含有以下物質(zhì)的培養(yǎng)基中(a)Id蛋白或Id基因表達(dá)和/或Id蛋白活性的直接激活劑或效應(yīng)劑，而非通過TGF-β超家族受體起作用的制劑；和(b)gp130下游信號傳導(dǎo)途徑激活劑。
19.一種培養(yǎng)ES細(xì)胞的方法，該方法包括(a)任選在飼養(yǎng)細(xì)胞上，在存在通過gp130起作用的細(xì)胞因子和血清或血清提取物時，將ES細(xì)胞維持培養(yǎng)在多能狀態(tài)；(b)傳代ES細(xì)胞至少一次；(c)撤除培養(yǎng)基中的血清或血清提取物，如果存在飼養(yǎng)細(xì)胞則將其撤除，使該培養(yǎng)基不含飼養(yǎng)細(xì)胞、血清和血清提取物；和(d)在存在(i)Id基因表達(dá)和/或Id蛋白活性的直接激活劑或效應(yīng)劑而非通過TGF-β超家族受體起作用的制劑；和(ii)gp130下游信號傳導(dǎo)途徑激活劑時，繼續(xù)維持ES細(xì)胞于多能狀態(tài)。
20.一種獲得轉(zhuǎn)染的ES細(xì)胞群的方法，該方法包括(a)用編碼操作性連接于一啟動子的選擇標(biāo)記的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞，該啟動子優(yōu)先在ES細(xì)胞中表達(dá)該選擇標(biāo)記；(b)接種這些ES細(xì)胞；(c)在存在以下物質(zhì)時培養(yǎng)該ES細(xì)胞(i)Id基因表達(dá)和/或Id蛋白活性的直接激活劑或效應(yīng)劑，而非通過TGF-β超家族受體起作用的激活劑；和(ii)gp130下游信號傳導(dǎo)途徑激活劑；和(d)選出表達(dá)該選擇標(biāo)記的細(xì)胞。
21.一種培養(yǎng)ES細(xì)胞的方法，該方法包括將單個SE細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)容器中，并在存在以下物質(zhì)時培養(yǎng)ES細(xì)胞(a)Id基因表達(dá)和/或Id蛋白活性的直接激活劑或效應(yīng)劑，而非通過TGF-β超家族受體起作用的制劑；和(b)gp130下游信號傳導(dǎo)途徑激活劑，從而獲得ES細(xì)胞的克隆群體，該群體中的每一個細(xì)胞都是單個ES細(xì)胞的子代。
22.一種引導(dǎo)ES細(xì)胞最終分化為非神經(jīng)外胚層(non-neurectodermal)的方法，該方法包括(a)在存在通過gp130起作用的細(xì)胞因子和Id基因表達(dá)和/或Id蛋白活性的直接激活劑或效應(yīng)劑，而非通過TGF-β超家族受體起作用的制劑時維持ES細(xì)胞，和(b)撤除該細(xì)胞因子，同時(c1)維持Id基因表達(dá)和/或Id蛋白活性的直接激活劑或效應(yīng)劑，和/或(c2)加入其它能引導(dǎo)分化的信號傳導(dǎo)分子。
23.一種用于ES細(xì)胞自我更新的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包含(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(2)Id基因表達(dá)和/或Id蛋白活性的直接激活劑或效應(yīng)劑，而非通過TGF-β超家族受體起作用的制劑；(3)gp130下游信號傳導(dǎo)途徑激活劑；和(4)鐵轉(zhuǎn)運蛋白；其中所述培養(yǎng)基不含血清或血清提取物。
24.一種從胚泡產(chǎn)生多能細(xì)胞的方法，該方法包括(1)獲得胚泡；(2)在存在gp130下游信號傳導(dǎo)途徑激活劑時培養(yǎng)該胚泡獲得內(nèi)細(xì)胞團(tuán)；(3)分解該內(nèi)細(xì)胞團(tuán)；(4)從該分解的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離細(xì)胞；和(5)在存在gp130下游信號傳導(dǎo)途徑激活劑和Id基因表達(dá)激活劑或Id基因表達(dá)產(chǎn)物時培養(yǎng)分離的細(xì)胞。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，該方法包括用LIF培養(yǎng)胚泡。
26.如權(quán)利要求24或25所述的方法，其特征在于，該方法包括聯(lián)用LIF和BMP受體激動劑培養(yǎng)分離的細(xì)胞。
27.如權(quán)利要求24-26中任一項所述的方法，其特征在于，該方法包括培養(yǎng)胚泡2-4天。
28.如權(quán)利要求24-27中任一項所述的方法，其特征在于，該方法包括用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)分離的細(xì)胞。
29.如權(quán)利要求24-28中任一項所述的方法，其特征在于，該方法包括用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)胚泡。
30.如權(quán)利要求24-29中任一項所述的方法，其特征在于，該方法包括在缺乏BMP受體激動劑時培養(yǎng)胚泡。
31.一種載體，其含有操作性連接于一啟動子的Id基因。
32.如權(quán)利要求31所述的載體。其特征在于，所述啟動子是誘導(dǎo)型啟動子。
33.如權(quán)利要求31或32所述的載體。其特征在于，所述載體是游離型載體
34.一種培養(yǎng)基，其含有誘導(dǎo)Id蛋白表達(dá)的制劑，而不含有通過TGF-β超家族受體起作用的制劑。
35.一種含有Id蛋白的培養(yǎng)基。
36.如權(quán)利要求35所述的培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基含有連接于一轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的Id蛋白，以促進(jìn)該Id蛋白通過多能細(xì)胞的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位。
37.如權(quán)利要求35或36所述的培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基含有與TAT、VP22或穿透蛋白相連的Id蛋白。
38.一種組合物，其含有Id蛋白和轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域。
39.如權(quán)利要求38所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有融合蛋白。
40.如權(quán)利要求38或39所述的組合物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域包括TAT、VP22或穿透蛋白。
41.一種能提高多能細(xì)胞中Id蛋白活性的制劑在促進(jìn)多能細(xì)胞自我更新中的應(yīng)用。
42.如權(quán)利要求41所述的應(yīng)用，其特征在于，所述制劑能提高細(xì)胞中Id蛋白的量。
43.如權(quán)利要求41所述的應(yīng)用，其特征在于，所述制劑含有權(quán)利要求38-40中任一項所述的組合物。
44.一種在存在gp130信號信號傳導(dǎo)和Id蛋白活性和/或表達(dá)時體外培養(yǎng)多能細(xì)胞所獲得的細(xì)胞。
45.一種獲得分化細(xì)胞的方法，該方法包括(1a)在細(xì)胞中表達(dá)Id基因或誘導(dǎo)Id基因的表達(dá)，和(1b)激活該細(xì)胞中的gp130下游信號傳導(dǎo)；(2)分化該細(xì)胞；和(3)獲得分化的細(xì)胞。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，步驟(1)的細(xì)胞含有的構(gòu)建物中，編碼選擇標(biāo)記的核苷酸序列操作性連接于一啟動子，該啟動子可在所需細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)此選擇標(biāo)記。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，該方法包括選擇表達(dá)所述選擇標(biāo)記的細(xì)胞。
48.一種用權(quán)利要求45-47中任一項所述方法獲得的細(xì)胞。
49.一種獲得多能細(xì)胞的方法，該方法包括在細(xì)胞中表達(dá)Id基因或誘導(dǎo)Id基因的表達(dá)，或在含有Id蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，并激活該細(xì)胞的gp130下游信號傳導(dǎo)，其中所述細(xì)胞獲自胎兒或成人的體細(xì)胞或組織。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述多能細(xì)胞的特征是Rex1、Oct4和nanog陽性。
51.一種用權(quán)利要求49-50中任一項所述方法獲得的細(xì)胞。
52.一種測試其活性能替代Id蛋白的因子的試驗，該試驗包括(1)在存在Id蛋白活性和gp130下游信號傳導(dǎo)時培養(yǎng)細(xì)胞，從而維持該細(xì)胞于多能狀態(tài)；(2)去除或降低Id蛋白的活性；(3)將所述因子引入該細(xì)胞；和(4)測定該細(xì)胞是否維持于多能狀態(tài)或者發(fā)生分化。
53.如權(quán)利要求52所述的試驗，其特征在于，(1)中，在存在Id蛋白活性時培養(yǎng)所述細(xì)胞包括(a)表達(dá)Id基因，(b)誘導(dǎo)Id基因表達(dá)或(b)在培養(yǎng)該細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入Id蛋白。
54.如權(quán)利要求52或53所述的試驗，其特征在于，將細(xì)胞因子加入細(xì)胞中包括(a)表達(dá)該因子，或(b)在培養(yǎng)該細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入該因子。
55.一種按權(quán)利要求52-54中任一項所述方法獲得的細(xì)胞因子。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用Id基因產(chǎn)物和gp130下游信號傳導(dǎo)途徑的組合促進(jìn)培養(yǎng)中的多能細(xì)胞自我更新。
文檔編號C12N5/06GK1867666SQ200480030621
公開日2006年11月22日 申請日期2004年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月16日
發(fā)明者A·G·史密斯, 應(yīng)其龍, J·尼克爾斯 申請人:愛丁堡大學(xué)管理處