專利名稱：一種蛋清源凝血酶抑制肽的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬保健食品開發(fā)領(lǐng)域，涉及蛋清源凝血酶抑制肽純化方法，尤其涉及利用凝膠柱色譜與半制備高效液相色譜對(duì)蛋清源凝血酶抑制肽的純化。
背景技術(shù)：
凝血是機(jī)體重要的生理防御過程，可誘發(fā)血栓，但其導(dǎo)致的病理性血栓可引發(fā)肺梗塞、腦血栓、視網(wǎng)膜動(dòng)靜脈阻塞、心肌梗塞和四肢及周圍血管栓塞。因此，病理性血栓是一類嚴(yán)重影響人類身體健康的心血管疾病。中國CDC慢性病中心綜合防治室主任白雅敏2009 年3月20日說，心腦血管病是目前我國發(fā)病率、致殘率和死亡率最高的疾病，每12秒就有一人因中風(fēng)或心梗而倒下。盡管有肝素、口服香豆素、鏈激酶和尿激酶等功能性物質(zhì)多年應(yīng)用的歷史，但是這類物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致血小板減少、出血等副作用。隨著對(duì)保健食品、功能性食品研究地不斷深入，人們對(duì)凝血過程中的各種酶類、活性因子及相關(guān)受體有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。 研發(fā)有效的、副作用小的抗凝血產(chǎn)品引起了越來越多的關(guān)注。蛋類是人體蛋白質(zhì)的重要來源之一，也是生物活性肽的原料。我國是禽蛋大國，但是禽蛋產(chǎn)品的深加工還有待開發(fā)。蛋清占蛋內(nèi)容物重的45% -60%左右，而蛋清中除水分外，主要成分為蛋白質(zhì)，含量為8% -11.6%。蛋清蛋白質(zhì)受熱變性，極大地限制了其發(fā)展。 將蛋清酶解制備的活性肽具有低滲性、低致敏性、高穩(wěn)定性和高的溶解性。有研究表明某些肽類化合物具有抗凝血的功能，稱之為抗凝血肽。目前抗凝血肽大都從毒物毒液中提取，采用陰陽離子交換色譜和凝膠柱色譜進(jìn)行純化。但其存在毒副作用強(qiáng)，資源稀少，成本高，分離效果較差等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是選取安全的食源性抗凝血肽替代毒液源抗凝血肽，降低成本，采用高效液相色譜法提高分離度。本方法的技術(shù)方案如下本方法采用凝膠柱色譜和半制備高效液相色譜法純化蛋清源凝血酶抑制肽。按如下步驟進(jìn)行1、凝膠柱色譜純化蛋清源凝血酶抑制肽取一定量凝膠加水溶脹，待平衡后，傾去上清液以便除去破碎顆粒。取適宜的層析柱，清洗所有組件，關(guān)閉柱的出口，在柱中加入洗脫液，使底部充滿液體，把溶脹好的凝膠調(diào)成薄漿，倒入柱內(nèi)，膠粒擴(kuò)散下沉，薄漿連續(xù)倒入后，打開柱的出口，以均勻不變的流速灌膠到裝完為止。柱裝好后，靜止一段時(shí)間后，打開柱的出口，排除過量的洗脫液，使柱內(nèi)膠面上保留一定高度的洗脫液，平衡層析柱，用恒流泵在恒定壓力下走柱子，直至膠床高度不變?yōu)橹埂Ｓ盟{(lán)色葡聚糖上柱檢驗(yàn)柱子是否裝得均勻。首先正確連接檢測器、電源，接通電源；將檢測儀波長旋到220nm刻度上，檢測儀出口塑料管接到部分收集器上。待基線平直后，加樣測試。關(guān)閉出口，將一定量的樣品加至柱床表面，打開出口，當(dāng)樣品滲入床中接近床表面時(shí)關(guān)閉出口，同時(shí)小心地加入少量洗脫液，再打開柱的出口，使床表面的的樣品全部滲入床中。這時(shí)樣品已加好，在床的表面小心地加入洗脫液，加上恒壓泵，紫外檢測儀220nm波長下檢測。層析開始，在柱的出口處以試管分管收集流出液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)冷凍干燥于干燥器內(nèi)保存以備下步純化。2半制備液相色譜純化蛋清源凝血酶抑制肽將100 μ L-5000 μ L濃度為5mg_15mg 的蛋清源凝血酶抑制肽上樣，在配備有紫外檢測器的半制備高效液相色譜純化系統(tǒng)上進(jìn)行分離純化。在220nm處室溫檢測并收集所有洗脫峰旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)冷凍干燥后置于干燥器內(nèi)備用。并測得蛋清源凝血酶抑制肽對(duì)凝血酶的抑制率達(dá)到63%。本發(fā)明的有益效果在于研究目標(biāo)為食源性蛋清源凝血酶抑制肽，與現(xiàn)有抗凝血肽相比安全性更高，毒副作用更小；來源廣泛，資源消耗少；并且采用高效液相色譜法提高分離效率，分離效果好。
具體實(shí)施例方式實(shí)例1￠( Sephadex G_5(Mg 沸水浴 lh，后冷卻裝入 0. 9 X 60cm 層析柱。取 0. 5mL IOmg/ mL蛋清源凝血酶抑制肽上樣，4°C條件下采用紫外檢測儀在220nm處進(jìn)行檢測，收集得到的組分。將收集得到的組分經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)冷凍干燥后制成5mg/mL溶液，流動(dòng)相為含有三氟乙酸的乙腈與水，以梯度洗脫的模式進(jìn)行分離純化，柱溫為室溫，采用紫外檢測器進(jìn)行檢測。洗脫梯度見下表。表1洗脫梯度
權(quán)利要求
1.一種純化蛋清源凝血酶抑制肽的方法，采用凝膠柱色譜和半制備高效液相色譜聯(lián)用的方法對(duì)蛋清源凝血酶抑制肽進(jìn)行純化，其特征在于凝膠柱色譜和半制備高效液相色譜純化條件的建立。
2.根據(jù)權(quán)利1所述的蛋清源凝血酶抑制肽的純化方法，其特征在于所述的凝膠柱色譜純化條件的建立依據(jù)樣品不同組分分子量不同進(jìn)行純化，具體步驟為蒸餾水溶脹凝膠， 加熱煮沸除去氣泡，裝柱至所需高度，用緩沖液平衡，上樣，洗脫，并用記錄儀記錄洗脫曲線至紫外檢測器檢測不到吸收為止，分段收集洗脫液，按先后順序排列，分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥后進(jìn)一步純化并留樣檢測活力。
3.根據(jù)權(quán)利1所述的蛋清源凝血酶抑制肽的純化方法，其特征在于所述的半制備高效液相色譜純化條件的建立，其特征在于不同組分的疏水性，采用C4或者C18柱，柱溫 25-40°C，A相為三氟乙酸水溶液，B相為三氟乙酸乙腈溶液，用超濾膜過濾，超聲脫氣，以梯度洗脫的方式進(jìn)行分離，流速在3 lOmL/min條件下進(jìn)樣100 5000 μ L，通過紫外檢測器檢測，記錄峰面積并據(jù)峰收集，經(jīng)真空干燥后貯存。
4.根據(jù)權(quán)利2、3所述的蛋清源凝血酶抑制肽的純化方法，通過抗凝活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該方法純化的蛋清源凝血酶抑制肽具有較好的抗凝活性。
全文摘要
本發(fā)明屬于保健食品開發(fā)領(lǐng)域，涉及蛋清源凝血酶抑制肽的純化方法，尤其涉及利用凝膠柱色譜和半制備高效液相色譜法聯(lián)用對(duì)蛋清源凝血酶抑制肽進(jìn)行純化。采用凝膠柱色譜和半制備高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)，可得到高純度和高活性的蛋清源凝血酶抑制肽。測得蛋清源凝血酶抑制肽對(duì)凝血酶的抑制率達(dá)到63％。本發(fā)明研究目的物為食源性蛋清源凝血酶抑制肽，提高產(chǎn)品安全性、降低成本、節(jié)省資源。
文檔編號(hào)C07K1/16GK102229669SQ20111013932
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月27日
發(fā)明者劉靜波, 王菲 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)