專利名稱：一種帶谷胱甘肽配體的親和層析多孔介質(zhì)的制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種帶帶谷胱甘肽(以下簡稱谷胱甘肽)配體的親和層析多孔介質(zhì)的制備方法和應用，屬于生物醫(yī)用高分子材料領域。
背景技術：
谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)是一種分子量約沈000的蛋白質(zhì)，因其水中溶解性能良好，在大腸桿菌中高水平表達且保持與谷胱甘肽特異性結合的酶活性等特點，被廣泛應用于基因工程融合蛋白體系的標簽蛋白。通過在親和介質(zhì)上固定谷胱甘肽分離破碎菌液中帶有GST標簽的蛋白，采用游離谷胱甘肽將其洗脫，而后切除GST標簽可以獲得目標蛋白。目前用于GST標簽蛋白分離的親和介質(zhì)技術為少數(shù)公司壟斷，通常采用瓊脂糖凝膠微球作為基體，在其表面引入活性基團，再鍵合配體谷胱甘肽得到親和層析介質(zhì)。此種親和層析介質(zhì)制備過程復雜，價格昂貴。中國專利(CN1715403A)曾經(jīng)嘗試在商品化瓊脂糖微球表面通過1，4_ 丁二醇二縮水甘油醚或環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑，優(yōu)化反應條件鍵合谷胱甘肽，希望得到與國外商品化產(chǎn)品性能相近的親和層析介質(zhì)。結果雖然這種材料價格有所降低，也有一定的分離作用，但是它制備過程仍然繁瑣，需要多步反應并純化才可鍵連上配體。另外凝膠微球形式的填料對填柱的技術要求都很高，如果在填柱過程中填料顆粒堆積不均勻或者有氣泡產(chǎn)生就會影響分離效果，以上原因限制了此種分離材料的應用。也有文獻[1]采用磁性微球技術，表面通過二硫鍵鍵合配體谷胱甘肽，用于GST標簽蛋白分離。此種介質(zhì)不需要使用分離柱，但超順磁微球的制備和表面修飾本身有相當大的技術難度和相當高的制造成本，如做成產(chǎn)品售價將遠高于瓊脂糖凝膠微球，且分離時必須使用外加磁場，進一步增加了分離成本。磁性微球產(chǎn)品通常在毫克級，分離能力也受到限制，僅適用于微量多品種蛋白的分離純化。所以，目前親和層析介質(zhì)已經(jīng)成為限制基因工程產(chǎn)業(yè)化的巨大瓶頸，迫切需要制備方法簡單、廉價、操作簡單而高效的GST蛋白親和層析介質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決已有技術存在的問題，本發(fā)明提出一種帶谷胱甘肽的親和層析多孔介質(zhì)的制備方法和應用。本發(fā)明采用乳液模板法，以雙鍵修飾的葡聚糖溶液為外部水相，以自由基引發(fā)劑的甲苯溶液為內(nèi)部油相，以溶解在外水相中的谷胱甘肽(谷胱甘肽)為鏈轉移劑，通過自由基聚合，一鍋法合成帶谷胱甘肽配體的親和層析多孔介質(zhì)。本發(fā)明提供的一種帶谷胱甘肽配體的親和層析多孔介質(zhì)的制備方法，步驟如下(1)配制谷胱甘肽的水溶液稱取谷胱甘肽，溶解在蒸餾水中，谷胱甘肽濃度為 1% 2.5% (w/v)，加入谷胱甘肽摩爾量1.2-2倍的二硫蘇糖醇(DTT)，機械攪拌反應 l-2h ；
(2)配制雙鍵修飾葡聚糖的乳液稱取雙鍵修飾葡聚糖加入上述(1)制備的谷胱甘肽的水溶液中，谷胱甘肽的水溶液體積與雙鍵修飾葡聚糖質(zhì)量的比例為 IOOmL 20-30g，加入乳化劑，乳化劑質(zhì)量與水相溶液體積比例為10-15g IOOmL,機械攪拌20min ；使用的乳化劑是Triton X-405、吐溫80、吐溫40或Pluronic F-68 ；(3)配制偶氮二異丁腈(AIBN)的甲苯溶液，濃度為1-2% (w/v)；(4)油水乳液配制攪拌下向雙鍵修飾葡聚糖的乳液中滴加AIBN甲苯溶液，AIBN 甲苯溶液總體積是雙鍵修飾葡聚糖溶液體積的3至5倍，滴加完成后繼續(xù)攪拌5min ；(5)聚合固化將上述反應混合物倒入模具內(nèi)腔中，置于60-80°C烘箱中固化 12-36h成型；所述的模具內(nèi)腔的形狀為圓柱體；(6)洗滌純制從模具中取出塊狀材料，先在25°C搖床中用二甲基亞砜(DMSO)振蕩抽提甲苯，后用索氏提取器對水提取，除去有機溶劑及其他雜質(zhì)，冷凍干燥，獲得親和層析多孔介質(zhì)；所述的雙鍵修飾的葡聚糖具有下列結構
權利要求
1. 一種帶谷胱甘肽配體的親和層析多孔介質(zhì)的制備方法，其特征在于步驟和條件如下(1)配制谷胱甘肽的水溶液稱取谷胱甘肽，溶解在蒸餾水中，谷胱甘肽濃度為 2. 5% (w/v)，加入谷胱甘肽摩爾量1. 2-2倍的二硫蘇糖醇(DTT)，機械攪拌反應1- ；(2)配制雙鍵修飾葡聚糖的乳液稱取雙鍵修飾葡聚糖加入上述(1)制備的谷胱甘肽的水溶液中，谷胱甘肽的水溶液體積與雙鍵修飾葡聚糖質(zhì)量的比例為IOOmL 20-30g，加入乳化劑，乳化劑質(zhì)量與水相溶液體積比例為10_15g IOOmL,機械攪拌20min ；使用的乳化劑是 iTriton X-405、吐溫 80、吐溫 40 或 Pluronic F-68 ；(3)配制偶氮二異丁腈(AIBN)的甲苯溶液，濃度為1-2%(w/v)；(4)油水乳液配制攪拌下向雙鍵修飾葡聚糖的乳液中滴加AIBN甲苯溶液，AIBN甲苯溶液總體積是雙鍵修飾葡聚糖溶液體積的3至5倍，滴加完成后繼續(xù)攪拌5min ；(5)聚合固化將上述反應混合物倒入模具內(nèi)腔中，置于60-80°C烘箱中固化12-3 !成型；所述的模具內(nèi)腔的形狀為圓柱體；(6)洗滌純制從模具中取出塊狀材料，先在25°C搖床中用二甲基亞砜(DMSO)振蕩抽提甲苯，后用索氏提取器對水提取，除去有機溶劑及其他雜質(zhì)，冷凍干燥，獲得親和層析多孔介質(zhì)；所述的雙鍵修飾的葡聚糖具有下列結構其中，母體葡聚糖的數(shù)均分子量為4-50萬，每100個糖環(huán)上雙鍵的個數(shù)為20-30個。
2.用權利要求1制備的帶谷胱甘肽配體的親和層析多孔介質(zhì)的應用，其特征在于，其用于谷胱甘肽-S-轉移酶或以谷胱甘肽-S-轉移酶為標簽的融合蛋白的分離純化。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種帶谷胱甘肽配體的親和層析多孔介質(zhì)的制備方法和應用。以配體谷胱甘肽為自由基轉移劑，巧妙地合成帶谷胱甘肽配體的親和層析多孔介質(zhì)，基體的制備、介質(zhì)的加工賦形和配體的擔載一步反應完成。采用價廉的基體材料，大幅降低了成本。所述的親和層析多孔介質(zhì)材料為開孔結構，孔徑約100～200μm，配體谷胱甘肽的鍵合量可達75.3mg/g，鍵合效率高且純度高，結果表明所述的親和層析多孔介質(zhì)具有很好的蛋白分離能力，谷胱甘肽-s-轉移酶(GST)結合效率達1.5mg/g。用所制備的帶谷胱甘肽配體的親和層析多孔介質(zhì)裝填層析柱，可用于谷胱甘肽-s-轉移酶或以谷胱甘肽-s-轉移酶為標簽的融合蛋白的分離純化。
文檔編號C07K1/22GK102335594SQ20111016121
公開日2012年2月1日 申請日期2011年6月16日 優(yōu)先權日2011年6月16日
發(fā)明者景遐斌, 董曉慶, 黃宇彬 申請人:中國科學院長春應用化學研究所