一種重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法。本發(fā)明在誘導(dǎo)產(chǎn)生包涵體后，通過優(yōu)化的裂解方法破碎菌體，初步去除了一部分雜質(zhì)，接著通過對包涵體進(jìn)行一系列處理，使得包涵體形成可溶性目標(biāo)蛋白，避免了使用尿素、鹽酸胍等變性劑對包涵體的變性溶解和復(fù)性。而鎳柱親和層析使得可以純化獲得的蛋白量比較大，具有純度高，操作簡單等優(yōu)點。本發(fā)明從不溶性包涵體中分離純化出來可溶性的目的蛋白，避免了反復(fù)變性復(fù)性的繁瑣步驟以及復(fù)性過程中的蛋白沉淀的危險，并且所獲得的蛋白純度可以達(dá)到電泳純。
【專利說明】-種重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬圓環(huán)病毒II型（Porcine circovirus type 2, PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰 竭綜合征（PMWS)的主要病原。自1991年首次在加拿大發(fā)生PMWS以來，現(xiàn)在全世界大多數(shù) 養(yǎng)豬國家均有該病的報道，給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。PCV 2基因組11個 開放閱讀框（open reading frames, ORFs)中0RF 2是主要的開放閱讀框。在PCV2中， 0RF2起始密碼子起始于第1033或1034位核苷酸，共有702個堿基，編碼234個氨基酸(基 因序列反義鏈上0RF2終止子由TAA變?yōu)锳AG，而造成0RF2閱讀框加長，全長705bp，其終止 子為TGA)，編碼分子量約為30kDa的主要功能蛋白一Cap蛋白。Cap蛋白作為病毒的主要 結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成PCV2的核衣殼，而且也是PCV2的主要免疫保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn) 生特異性免疫應(yīng)答，是研制PCV2亞單位疫苗的理想靶抗原。目前市場上銷售的豬圓環(huán)病毒 疫苗有全毒株疫苗即滅活疫苗和減毒活疫苗，以及通過昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)以及腺病毒表達(dá)系統(tǒng) 進(jìn)行生產(chǎn)的衣殼蛋白亞單位疫苗。但是全毒株病毒有毒力恢復(fù)的潛在危險，而通過昆蟲細(xì) 胞培養(yǎng)獲和腺病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得的亞單位疫苗價格昂貴。
[0003] 大腸桿菌是一種廉價且技術(shù)成熟的表達(dá)系統(tǒng)，其遺傳背景清楚、繁殖能力強(qiáng)、培養(yǎng) 周期短、目標(biāo)基因表達(dá)水平高，某些外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)量可達(dá)總蛋白的5 %? 30 %，且下游工藝簡單、易于控制，抗污染能力強(qiáng)，代謝途徑和基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較清楚， 已有大量可供選擇利用的表達(dá)載體。被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物，運用非 常廣泛。另外，目前報道研究豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白作為亞單位疫苗的研究很多，但是用于工 業(yè)化生產(chǎn)的研究并不是很透徹。
[0004] 高超[豬圓環(huán)病毒2型0RF2基因原核表達(dá)蛋白間接ELISA檢測方法的建立及應(yīng) 用[J] ·中國獸醫(yī)學(xué)報，2008,28⑶：888-891.]利用PCV2 0RF2內(nèi)含的Eco/PI酶切位點， 及載體上含有的ΧΑοΙ酶切位點，從已構(gòu)建的克隆質(zhì)粒PMD-0RF2上切除含5'端核定位信號 區(qū)域，將截短的0RF2基因片段克隆到pGEX-6p-l表達(dá)載體上，并將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大 腸桿菌感受態(tài)BL21中，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組菌，重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在于 菌體中，進(jìn)行超聲波裂解菌體，包涵體洗滌、溶解及尿素梯度透析復(fù)性，最后電洗脫法純化 重組蛋白。本發(fā)明在誘導(dǎo)產(chǎn)生包涵體后，通過優(yōu)化的裂解方法破碎菌體，初步去除了一部分 雜質(zhì)，接著通過對包涵體進(jìn)行一系列處理，使得包涵體形成可溶性目標(biāo)蛋白，避免了使用尿 素、鹽酸胍等變性劑對包涵體的變性溶解和復(fù)性。而鎳柱親和層析使得可以純化獲得的蛋 白量比較大，具有純度高，操作簡單等優(yōu)點，為開發(fā)商業(yè)化的豬圓環(huán)病毒基因工程亞單位疫 苗以及相關(guān)研究提供了工業(yè)化的理論基礎(chǔ)及為重組疫苗進(jìn)行商業(yè)化提供了理論依據(jù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于此，本發(fā)明提供了一種重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法。
[0006] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下： 一種重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法，包括重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)、菌體 破碎和裂解、鎳柱親和層析純化、透析。
[0007] 所述重組菌的制備：豬圓環(huán)病毒II型病毒的開放閱讀框0RF2基因的576bp整合到 載體pET28a上，導(dǎo)入到宿主大腸桿菌BL-21 (DE3)中，得到重組菌。
[0008] 所述菌體破碎和裂解的步驟包括：用PBS緩沖液洗滌菌體，溶菌酶處理30min，離 心后去除部分雜蛋白，經(jīng)過兩次的TritonX-100的裂解洗滌，獲得含目的蛋白的沉淀，用含 有0. 5% (v/v)脫氧膽酸鈉的PBS緩沖液溶解沉淀，獲得可溶性目的蛋白。
[0009] 具體步驟如下： ⑴：洗滌菌體，按每克濕重菌體用15ml PBS緩沖液重復(fù)洗滌，高速離心，棄上清，離心 條件為 8000rpm，4°C，5 min ; ⑵：溶菌酶破壞細(xì)胞壁，使用濃度為1?l〇mg/ml的溶菌酶裂解大腸桿菌，37°C，震蕩 30min，高速離心，棄上清，收集沉淀； ⑶加入去污劑TritonX-ΙΟΟ,使終濃度為0. 5% (v/v)，充分混勻，此時溶液變得粘稠， 說明細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的核酸釋放出來，細(xì)菌裂解，加入DNase I，終濃度lug/ml，充分混勻，待溶 液不再粘稠，說明核酸被降解，高速離心，棄上清，收集沉淀；為了使菌體充分裂解，再次用 PBS緩沖液重懸沉淀，加入TritonX-ΙΟΟ,使終濃度為0. 5%(v/v)，充分混勻，高速離心，收集 沉淀； ⑷：獲得含包涵體沉淀，使用含有0. 5% v/v脫氧膽酸鈉的PBS緩沖液溶解沉淀，靜置 30min，離心，上清含有較多目的蛋白，而且該目的蛋白為可溶性，即為所獲得的上清液。 [0010] 所述PBS緩沖液為pH=7. 4、50mM PBS緩沖液。
[0011] 所述鎳柱親和層析純化的步驟包括：上樣即步驟四所獲得的上清液，后用 bufferA平衡鎳柱，bufferB洗漆雜蛋白，bufferC洗脫并收集目的蛋白。
[0012] 具體步驟如下： ① 鎳柱的平衡 (1) 5倍柱體積的bufferA洗漆鎳柱； (2) 1M NaOH洗滌柱子，確保NaOH與鎳柱至少結(jié)合30min ; (3) 去離子水沖洗鎳柱，使得鎳柱pH小于9 ; (4) 5倍柱體積的bufferA平衡鎳柱； ② 上樣：樣品需要經(jīng)過高速離心去除顆粒較大的雜質(zhì)，或者用〇. 45um孔徑的濾膜過 濾； ③ 緩沖液平衡柱料：上完樣品后用10倍柱體積的bufferA再平衡鎳柱； ④ bufferB洗漆雜蛋白； ⑤ bufferC洗脫并收集目的蛋白。
[0013] 所用 bufferA 為 pH=7. 4、20mM Na3P04,0. 5M NaCl ; bufferB 為 ρΗ=7· 4、20mM Na3P04,0. 5M NaCl，lOOmM 咪唑； bufferC 為 ρΗ=7· 4、20mM Na3P04,0. 5M NaCl，250mM 咪唑。
[0014] 本發(fā)明的技術(shù)路線如圖1所示。
[0015] 本發(fā)明從不溶性包涵體中分離純化出來可溶性的目的蛋白，避免了反復(fù)變性復(fù)性 的繁瑣步驟以及復(fù)性過程中的蛋白沉淀的危險，并且所獲得的蛋白純度可以達(dá)到電泳純。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明的技術(shù)路線圖。
[0017] 圖2為目的蛋白的SDS-PAGE以及western blot檢測結(jié)果，其中1-3上樣，穿流峰， 100mM咪唑洗脫峰，4-6 250mM咪唑洗脫峰。
[0018] 圖3純化的目的蛋白的SDS-PAGE。

【具體實施方式】
[0019] 1重組細(xì)菌的誘導(dǎo)表達(dá) 本實驗室所用病毒毒株來自福州大北農(nóng)生物科技有限公司，通過擴(kuò)增獲得該 豬圓環(huán)病毒II型病毒的開放閱讀框0RF2基因的576bp，其中整合到該基因上Nco I和 Xho I兩個酶切位點，雙酶切該基因，并且用相同的酶切體系消化pET28a載體，酶連0RF2基 因和pET28a載體，轉(zhuǎn)化到克隆菌種T0P10中，測序驗證，然后將該質(zhì)粒導(dǎo)入到宿主大腸桿菌 BL-21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過SDS-PAGE以及Western blot技術(shù)分析，檢測到有目的 蛋白的表達(dá)，并且該目的蛋白以包涵體形式存在。
[0020] 2工程菌的發(fā)酵 將保存的工程菌種在含有的kana抗性的LB培養(yǎng)基平板上畫線，37°C活化過夜，挑取表 面光滑，顆粒較大的菌落，37°C擴(kuò)大培養(yǎng)10h，培養(yǎng)條件為37°C，200rpm。將菌液按1:100轉(zhuǎn) 接到含有kana抗性的LB液體培養(yǎng)基中。待菌體生長到對數(shù)期時加入誘導(dǎo)物IPTG，終濃度 為lmg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)10h，培養(yǎng)條件為37°C，200rpm。
[0021] 所用kana抗生素濃度為50ug/ml。
[0022] 所用LB培養(yǎng)基配方如下： Yeast extract (0. 5% w/w) NaCl (1% w/w) Tryptone (1% w/w)〇
[0023] 3細(xì)菌的優(yōu)化破碎方法 高速離心收獲菌體，其中每l〇〇ml培養(yǎng)液約含菌體0. 5~0. 7g，破碎菌體。其中破碎菌體 方法較多，高壓均質(zhì)裂解法、超生裂解法、化學(xué)裂解液裂解法、酶解法、反復(fù)凍融法等等各種 方法。
[0024] 本實驗通過一種新的方法來從包涵體中獲取可溶性目的蛋白。
[0025] 步驟詳細(xì)如下： ⑴：洗滌菌體，按每克濕重菌體用15ml PBS重選洗滌。高速離心，棄上清。離心條件為 8000rpm,4°C ,5 min〇
[0026] ⑵：溶菌酶破壞細(xì)胞壁。使用濃度為1?10mg/ml的溶菌酶裂解大腸桿菌，37°C， 震蕩30min。高速離心，棄上清，收集沉淀。由于大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，單獨使用溶菌酶 效果不理想。
[0027] ⑶去污劑裂解大腸桿菌PBS重懸沉淀，加入去污劑TritonX-100,終濃度為0. 5%， 充分混勻，此時溶液變得粘稠，說明細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的核酸釋放出來，細(xì)菌裂解，加入DNase I， 終濃度lug/ml，充分混勻，此時可以使用功率較小的超聲波清洗器來加速溶液的混勻，但必 須加入冰，確保溫度不至于升高太快。待溶液不再粘稠，說明核酸被降解，高速離心，棄上 清。收集沉淀。為了使菌體充分裂解，再次用PBS重懸沉淀，加入TritonX-ΙΟΟ,充分混勻， 高速離心，收集沉淀。
[0028] (4):經(jīng)過前幾步的裂解菌體以及去污劑的使用，可以獲得含包涵體沉淀，使用含有 0. 5%的脫氧膽酸鈉的PBS溶解沉淀，靜置30min，離心，上清含有較多目的蛋白，而且該目的 蛋白為可溶性。該方法的優(yōu)點是破碎菌體時雖然使用了溶菌酶，但是離心后將該雜蛋白去 除，并且經(jīng)過兩次的TritonX-100的裂解洗滌，去除了較多的雜蛋白，為以后的純化帶來了 方便。
[0029] 其中PBS緩沖液為50mM的磷酸鹽緩沖液，ρΗ=7· 4。
[0030] 4鎳柱親和層析 詳細(xì)步驟如下： ①鎳柱的平衡 (1) 5倍柱體積的bufferΑ洗漆鎳柱； (2) 1M NaOH洗滌柱子，確保NaOH與鎳柱至少結(jié)合30min ; (3) 去離子水沖洗鎳柱，使得鎳柱pH小于9 ; (4) 5倍柱體積的bufferA平衡鎳柱。
[0031] ②上樣，樣品需要經(jīng)過高速離心去除顆粒較大的雜質(zhì)，或者用0. 45um孔徑的濾 膜過濾。對于每毫升柱料流速不超過〇. 2ml/min。
[0032] ③緩沖液平衡柱料，上完樣品后用10倍柱體積的buff erA再平衡鎳柱。
[0033] ④bufferB洗漆雜蛋白。經(jīng)過大量實驗的摸索，發(fā)現(xiàn)100mM的咪唑可以洗脫下絕 大多數(shù)雜蛋白。
[0034] ⑤bufferC洗脫并收集目的蛋白。
[0035] SDS-PAGE以及western blot檢測結(jié)果如圖2所示。標(biāo)有箭頭的為純化的目的蛋 白，以及western blot檢測結(jié)果。
[0036] 所用 bufferA 為 pH=7. 4 ;20mM Na3P04 ;0· 5M NaCl ; bufferB 為 ρΗ=7· 4 ;20mM Na3P04 ;0· 5M NaCl; lOOmM 咪唑； bufferC 為 ρΗ=7· 4 ;20mM Na3P04 ;0· 5M NaCl; 250mM 咪唑； ⑥純化的目的蛋白的透析和濃縮 將純化的目的蛋白放入到透析袋中，在PBS緩沖液透析4h，然后重新?lián)Q緩沖液透析過 夜。隨后將透析袋取出，并用聚乙二醇20000進(jìn)行濃縮，獲得的蛋白濃度較高，達(dá)到0. 3mg/ ml，如圖3。
[0037] 5總結(jié)展望 目前對不溶性蛋白，尤其是包涵體的純化依然是個難題，本實驗通過優(yōu)化破碎菌體，減 少了純化時的雜蛋白的污染，其次，使用較溫和的表面活性劑溶解包涵體。通過該步驟可以 使50%的包涵體溶解。并且通過鎳柱親和層析獲得非常純的重組蛋白，為工業(yè)化純化包涵 體提供了新的思路。
【權(quán)利要求】
1. 一種重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法，其特征在于：包括重組 菌的誘導(dǎo)表達(dá)、菌體破碎和裂解、鎳柱親和層析純化、透析；所述菌體破碎和裂解的步驟 包括：用PBS緩沖液洗滌菌體，溶菌酶處理30min，離心后去除部分雜蛋白，經(jīng)過兩次的 TritonX-ΙΟΟ的裂解洗滌，獲得含目的蛋白的沉淀，用含有0. 5%v/v脫氧膽酸鈉的PBS緩沖 液溶解沉淀，獲得可溶性目的蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法，其特征在 于：所述菌體破碎和裂解的步驟，具體步驟如下： ⑴：洗滌菌體，菌體用PBS緩沖液重復(fù)洗滌，高速離心，棄上清，離心條件為8000rpm， 4°C , 5 min ； ⑵：溶菌酶破壞細(xì)胞壁，使用濃度為1?l〇mg/ml的溶菌酶裂解大腸桿菌，37°C，震蕩 30min，高速離心，棄上清，收集沉淀； ⑶加入去污劑TritonX-ΙΟΟ,使終濃度為0. 5%v/v，充分混勻，此時溶液變得粘稠，說明 細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的核酸釋放出來，細(xì)菌裂解，加入DNase I，終濃度lug/ml，充分混勻，待溶液不 再粘稠，說明核酸被降解，高速離心，棄上清，收集沉淀；為了使菌體充分裂解，再次用PBS 緩沖液重懸沉淀，加入TritonX-ΙΟΟ,使終濃度為0. 5%(v/v)，充分混勻，高速離心，收集沉 淀； ⑷：獲得含包涵體沉淀，使用含有0. 5% v/v脫氧膽酸鈉的PBS緩沖液溶解沉淀，靜置 30min，離心，取上清，得到可溶性目的蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法，其特 征在于：所述PBS緩沖液為pH=7. 4、50mM PBS緩沖液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法，其特征在 于：所述鎳柱親和層析純化的步驟包括：上樣后用bufferA平衡鎳柱，bufferB洗漆雜蛋白， bufferC洗脫并收集目的蛋白。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法，其特征在 于：所用 bufferA 為 pH=7. 4、20mM Na3P04,0. 5M NaCl ; bufferB 為 ρΗ=7· 4、20mM Na3P04,0. 5M NaCl，lOOmM 咪唑； bufferC 為 ρΗ=7· 4、20mM Na3P04,0. 5M NaCl，250mM 咪唑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白包涵體的分離純化方法，其特征在 于：所述鎳柱親和層析純化，具體步驟如下： ① 鎳柱的平衡 (1) 5倍柱體積的bufferA洗漆鎳柱； (2) 1M NaOH洗滌柱子，確保NaOH與鎳柱至少結(jié)合30min ; (3) 去離子水沖洗鎳柱，使得鎳柱pH小于9 ; (4) 5倍柱體積的bufferA平衡鎳柱； ② 上樣：樣品需要經(jīng)過高速離心去除顆粒較大的雜質(zhì)，或者用〇. 45um孔徑的濾膜過 濾； ③ 緩沖液平衡柱料：上完樣品后用10倍柱體積的bufferA再平衡鎳柱； ④ bufferB洗漆雜蛋白； ⑤ bufferC洗脫并收集目的蛋白。
【文檔編號】C12R1/19GK104109704SQ201410324737
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月9日
【發(fā)明者】呂暾, 王立波, 喬春曉, 王偉東, 莊星來, 洪晶, 林拱陽, 陳晟生 申請人:福州大學(xué), 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司