專利名稱：水稻OsI2蛋白、編碼該蛋白的基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及水稻0sI2蛋白、編碼該蛋白的基因及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中用水最多的作物，其節(jié)水抗旱性對(duì)我國(guó)的糧食、水和生態(tài)安全具有重要意義。利用基因工程技術(shù)進(jìn)行分子育種，將抗旱基因轉(zhuǎn)入優(yōu)良的水稻品種中，從而改良其抗旱性，培育既抗旱又高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的農(nóng)作物新品種是抗旱育種的有效途徑之一。發(fā)掘抗旱基因是抗旱分子育種的基礎(chǔ)。已發(fā)表的抗旱相關(guān)基因及其蛋白的研究越來(lái)越多。目前，雖然與植物抵御非生物逆境有關(guān)的基因及蛋白不斷被發(fā)掘鑒定出來(lái)，同時(shí)還有更多和復(fù)雜的基因及蛋白被證明與植物抗逆有關(guān)，但是其作用機(jī)理和結(jié)構(gòu)模式尚不清晰。0sI2基因及其編碼蛋白即屬于這一類。植物核基因組的基因編碼模式大多使用一般密碼子編碼，但是也有極少數(shù)質(zhì)體及線粒體基因的編碼方式比較特別，采用特殊密碼子編碼蛋白。所以正確解析鑒定抗旱相關(guān)基因的編碼方式，對(duì)正確了解蛋白功能至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與水稻抗逆性相關(guān)的0sI2蛋白及編碼該蛋白的基因。本發(fā)明的另一目的是提供編碼水稻0sI2蛋白的基因在提高植物非生物逆境條件下的抗逆性(包括但不限于抗旱、耐冷、抗鹽等)中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種水稻0sI2蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1 所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。編碼上述水稻0sI2蛋白的基因，優(yōu)選地，其編碼的核苷酸序列與SEQ ID No. 2所示的從89-364位的核苷酸序列具有至少70%的同源性；或者所述基因編碼的核苷酸序列能與SEQ ID NO. 2中從89-364位的核苷酸序列雜交。更優(yōu)選地，其核苷酸序列為SEQ ID No. 2所示的從89_364位的核苷酸序列。本發(fā)明還提供一種核酸探針?lè)肿?，其含有上述水?sI2基因編碼序列的8-100個(gè)連續(xù)核苷酸，優(yōu)選地，含有上述水稻0sI2基因編碼序列的15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼水稻0sI2相關(guān)的核酸分子。本發(fā)明還提供含有上述水稻0sI2基因的載體。本發(fā)明還提供含有上述水稻0sI2基因載體的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞。本發(fā)明還提供含有上述水稻0sI2基因的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。優(yōu)選地，所述植物為水稻。本發(fā)明還提供上述水稻0sI2基因在提高植物抗逆性(包括但不限于抗旱、耐冷、 抗鹽等)中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步提供上述水稻0sI2基因在縮短水稻穗一次枝梗和二次枝梗，調(diào)節(jié)水稻穗型使之緊湊化中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的還可以采用以下的技術(shù)措施來(lái)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。前述的水稻0sI2蛋白，其為具有如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列的多肽或其保守性變異多肽，或其活性片段，或其活性衍生物。在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”DNA是指該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“水稻抗逆蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有水稻0sI2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 2中第89-364位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ IDN0. 2序列的編碼框第89-364位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO. 2中第89-364位核苷酸序列同源性低至約70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO. 2 所述的序列。本發(fā)明采用線粒體偏愛(ài)密碼子編碼蛋白。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件(70-85%序列一致性)下，優(yōu)選地，在高度嚴(yán)緊條件(85%以上序列一致性)下與SEQ ID NO. 2中從核苷酸第89-364位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO. 2中從核苷酸第89-364位的核苷酸序列的同源性至少70 %，優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與天然的水稻0sI2相同功能的蛋白的SEQ ID N0. 2中開(kāi)放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)， 優(yōu)選為1-60個(gè)，更優(yōu)選為1-20個(gè)，最優(yōu)選為1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，優(yōu)選為30個(gè)以內(nèi)，更優(yōu)選為10個(gè)以內(nèi)， 最優(yōu)選為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“水稻抗旱蛋白或多肽”、“調(diào)節(jié)葉綠體發(fā)育蛋白或多肽”，指具有水稻0sI2蛋白活性的SEQ ID NO. 1序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與天然水稻0sI2相同功能的SEQ ID NO. 1序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為 1-50個(gè)，優(yōu)選為1-30個(gè)，更優(yōu)選為1-20個(gè)，最優(yōu)選為1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，優(yōu)選為10個(gè)以內(nèi)， 更優(yōu)選為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)， 通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括水稻0sI2蛋白的活性片段和活性衍生物。本發(fā)明的水稻0sI2多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、 天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與水稻0sI2相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白，以及利用水稻0sI2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。在本發(fā)明中，“水稻0sI2保守性變異多肽”指與SEQ ID NO. 1的氨基酸序列相比， 有至多10個(gè)，優(yōu)選為至多8個(gè)，更優(yōu)選為至多5個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽按照表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。表1可替換氨基酸替換前的殘基替換后的殘基優(yōu)選的替換殘基Ala(A)Val ；Leu ；IleValArg(R)Lys ；Gln ；AsnLysAsn(N)Gln ；His ；Lys ；ArgGlnAsp(D)GluGluCys (C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro ；AlaAlaHis(H)Asn ；Gln ；Lys ；ArgArgIle(I)Leu ；Val ；Met ；Ala ；PheLeuLeu (L)Ile ；Val ；Met ；Ala ；PheIleLys (K)Arg ；Gln ；AsnArgMet (M)Leu；Phe ；IleLeuPhe(F)Leu ；Val ；Ile ；Ala ；TyrLeuPro (P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr (T)SerSerTrp (W)Tyr ；PheTyrTyr (Y)Trp ；Phe ；Thr ；SerPheVal (V)Ile ；Leu ；Met ；Phe ；AlaLeu 本發(fā)明還包括水稻0sI2蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然水稻0sI2相關(guān)多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的具有代表性的多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的水稻0sI2多肽時(shí)，可以將水稻0sI2編碼序列可操作地連接表達(dá)調(diào)控序列，從而形成水稻0sI2蛋白表達(dá)載體。在本發(fā)明中，“可操作地連接”是指線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性 DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連接多肽DNA ；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連接編碼序列。一般，“可操作地連接”意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”為真核細(xì)胞。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、 煙草細(xì)胞和其它植物細(xì)胞。還可用Northern印跡法技術(shù)分析水稻0sI2基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析水稻0sI2的 RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。此外，根據(jù)本發(fā)明的水稻0sI2核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選水稻0sI2相關(guān)同源基因或同源蛋白。為了得到與水稻0sI2相關(guān)基因相關(guān)的水稻cDNAs的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選水稻cDNA文庫(kù)，這些探針是在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，用32P對(duì)水稻0sI2相關(guān)的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得。最適合于篩選的cDNA文庫(kù)是來(lái)自水稻的文庫(kù)。構(gòu)建來(lái)自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫(kù)的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫(kù)也可以購(gòu)買(mǎi)到，例如購(gòu)自Clontech, Stratagene, Palo Alto、Cal.等。這種篩選方法可以識(shí)別與水稻0sI2相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。本發(fā)明的水稻0sI2相關(guān)核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增獲得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR 擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確順序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成法將突變弓I入本發(fā)明蛋白序列中。
除了重組法之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過(guò)直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart 等，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co., San Francisco ；Merrifield J. (1963) J. Am Chem. Soc85 :2149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City, CA)來(lái)自動(dòng)合成肽。可以分別化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接，以產(chǎn)生全長(zhǎng)的分子。利用本發(fā)明的水稻0sI2蛋白，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與水稻0sI2相關(guān)基因或蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果(1)本發(fā)明的水稻0sI2基因及其編碼蛋白在植物抗旱性方面具有明顯作用，能夠顯著降低在干旱土地上種植的各種農(nóng)作物生物產(chǎn)量的損失，具有很大的應(yīng)用價(jià)值。(2)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到改良的含有本發(fā)明水稻0sI2基因的轉(zhuǎn)化植物在包括干旱、低溫、高鹽等條件下，生長(zhǎng)、生存狀況明顯優(yōu)于野生型植物，表明了水稻0sI2基因能夠明顯提高植物的抗逆性。(3)本發(fā)明的水稻0sI2基因不僅能夠有效調(diào)節(jié)逆境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，而且能夠直接或間接調(diào)節(jié)控制葉綠體發(fā)育以及光合作用相關(guān)功能蛋白和酶系統(tǒng)的表達(dá)，具有潛在的、巨大的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為干旱脅迫下水稻IRAT109中0sI2基因的表達(dá)量變化，其中A、B分別為葉片、根系中的表達(dá)變化值。圖2為干旱脅迫下0sI2基因在IRAT109分蘗期和孕穗期的表達(dá)量變化，其中A、B 分別為分蘗期、孕穗期的表達(dá)變化值。圖3為轉(zhuǎn)0sI2煙草Tl代種子150mmol/L甘露醇脅迫發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。圖4為轉(zhuǎn)0sI2煙草苗期干旱脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖5表明轉(zhuǎn)0sI2煙草對(duì)不同濃度ABA抗性增強(qiáng)。圖6表明超表達(dá)0sI2轉(zhuǎn)基因煙草葉片持水能力增強(qiáng)。圖7為超表達(dá)0sI2擬南芥植株，芽期NaCl (100mmol/L)脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖8為超表達(dá)0sI2擬南芥植株，芽期甘露醇(150mmOl/L)脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖9為超表達(dá)0sI2擬南芥植株，苗期PEG6000 (20% )模擬干旱脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，均按照常規(guī)條件，例如Sambrook等， 《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商建議的條件。實(shí)施例1水稻基因0sI2在水稻品種IRAT109中表達(dá)譜分析1. PEG模擬旱處理苗期水稻IRAT109種子(由上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心種質(zhì)資源庫(kù)收集保存)催芽后，采用營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)的方式培養(yǎng)水稻，至四葉一心；然后用20%的PEG6000溶液模擬干旱脅迫，并在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣，提取總RNA。實(shí)驗(yàn)以同時(shí)期的水培材料為對(duì)照(ck)。2.自然干旱處理水稻IRAT109種子催芽后，移栽到土中培養(yǎng)，分蘗盛期(六葉一心)、孕穗期(減數(shù)分裂時(shí)期)進(jìn)行旱處理。在各個(gè)時(shí)期，當(dāng)盆中土層無(wú)水時(shí)開(kāi)始斷水，同時(shí)作為旱處理的開(kāi)始，在旱處理時(shí)期的每天同一時(shí)間剪取植株葉片，投入液氮中冷凍用于RNA提取。3. RNA的提取取部分組織，在研缽中用液氮冷凍后研磨成粉狀，加入盛有TRIzol 試劑(天根生化科技有限公司)的1.5mL EP管，充分振蕩后，室溫放置5分鐘，于4°C， 12000r/min離心15min后，上清液移至新的1.5mL EP管中，氯仿去蛋白后，等體積異丙醇沉淀RNA，溶解后用Dnase消化降解殘留DNA。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量。4.定量 PCR(qRT-PCR)分析定量PCR體系與方法qRT_PCR反應(yīng)使用美國(guó)ABI PRISM 7000定量 PCR儀，使用Takara公司的定量PCR試劑盒。每個(gè)PCR反應(yīng)重復(fù)三次。反應(yīng)體系包含SYBR Premix Ex TaqT、2X) 12. 5 μ L，正、反向引物(定量PCR擴(kuò)增引物序列為F 5，-AGAAACACTTTCTTCTTCG-3，，R :5，-ATAGATAAAGGCATGCATCG-3，)各 0. 5 μ L，各種處理的 cDNA模板lyL，加水補(bǔ)足體積至20yL。反應(yīng)條件如下:95°C 10s，然后在95°C k，60°C 31s， 循環(huán)40次，設(shè)定在每個(gè)循環(huán)中60°C Is時(shí)讀取熒光值，同時(shí)進(jìn)行ROX值校正，最后添加熒光 PCR產(chǎn)物融解曲線分析，其它具體操作詳見(jiàn)儀器使用說(shuō)明書(shū)。目的基因與參照基因的擴(kuò)增效率任取一樣品分別稀釋10、100、1000、10000倍， 取1 10000倍各稀釋樣品1 μ L進(jìn)行定量PCR，方法同上，重復(fù)三次，計(jì)算目的基因與參照基因的平均CT值以及Δ CT值，通過(guò)cDNA濃度梯度的log值對(duì)Δ CT值作圖，根據(jù)直線斜率絕對(duì)值判斷擴(kuò)增效率(Kenneth等，2001)。結(jié)果分析方法每種處理樣品重復(fù)三次，取平均CT值，利用2_ΔΔετ法進(jìn)行結(jié)果分析。根據(jù)水稻干旱脅迫芯片表達(dá)譜分析結(jié)果顯示，干旱脅迫后0sI2基因在水稻葉片中的表達(dá)量明顯增強(qiáng)，上調(diào)倍數(shù)達(dá)230倍以上，即0sI2基因的表達(dá)受到干旱脅迫的誘導(dǎo)。圖1結(jié)果顯示，干旱脅迫處理對(duì)苗期水稻0sI2基因在根和葉中的表達(dá)有不同程度的影響，在葉中的表達(dá)量相對(duì)較高。在葉中(圖1)，隨干旱處理時(shí)間延長(zhǎng)，0sI2表達(dá)量逐步增高，在處理后他時(shí)達(dá)最高(是對(duì)照條件下的138倍)，處理20h時(shí)表達(dá)量又出現(xiàn)了回落 (是對(duì)照條件下的觀倍)。在根中(圖2) 0sI2的表達(dá)也受干旱脅迫的誘導(dǎo)，并且受干旱脅迫誘導(dǎo)上升表達(dá)的反應(yīng)比葉片中更靈敏，在干旱脅迫處理0. 5h時(shí)表達(dá)量即達(dá)到最高(是對(duì)照條件的65倍)，在處理池和他以及隨后的20h，表達(dá)量較高峰值逐步下降。由此可見(jiàn)， 0sI2在水稻中的表達(dá)受干旱脅迫的誘導(dǎo)而增加，并且隨著處理時(shí)間的延伸，整體呈現(xiàn)先升高在逐步下降的趨勢(shì)。自然干旱處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖2)，干旱處理對(duì)水稻0sI2基因在分蘗期和孕穗期中的表達(dá)都有不同程度的影響；但是0sI2基因的表達(dá)量均隨著干旱脅迫程度的增加而增加，即分蘗期或孕穗期間旱處理水稻葉片0sI2基因的表達(dá)量均高于正常水處理，說(shuō)明干旱脅迫誘導(dǎo)0sI2基因表達(dá)量增加。在分蘗期，隨干旱處理時(shí)間延長(zhǎng)，0sI2表達(dá)量相比對(duì)照(IOd)有增高的趨勢(shì)，在處理14d達(dá)最高(是對(duì)照的21.7倍)，差異達(dá)到極顯著水平。0sI2 在孕穗期也是呈現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)，在處理9d時(shí)表達(dá)量最高(是對(duì)照的10. 86倍)。無(wú)論是在分蘗期還是在孕穗期，旱處理初期均比正常水分條件下表達(dá)量略有增加，而在分蘗期 0sI2基因受干旱的影響比孕穗期更為敏感(前者表達(dá)量增幅較大，14d旱處理為12d旱處理的6. 76倍)，即分蘗期0sI2基因表達(dá)量變化較大，說(shuō)明在分蘗期間0sI2基因?qū)λ秩鄙佥^為敏感。由此可知，干旱對(duì)0sI2的表達(dá)有顯著的影響，在正常水分條件下0sI2基因在孕穗期的表達(dá)量比分蘗期高，但受干旱脅迫影響較分蘗期要小，即不同發(fā)育時(shí)期的水稻中， 0sI2基因?qū)λ秩狈Φ拿舾行杂忻黠@差異。實(shí)施例2水稻0sI2基因的克隆1.幼苗培育水稻(品種為“IRAT109”)購(gòu)自上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心，將水稻置于35°C萌發(fā) 48小時(shí)，然后播種于溫室中，待水稻葉片為3-5片時(shí)，準(zhǔn)備提取DNA或RNA。2. RNA的提取按照實(shí)施例1中的方法提取RNA。3.基因的全長(zhǎng)克隆根據(jù)GeneBank中水稻數(shù)據(jù)庫(kù)信息中提供的序列信息，設(shè)計(jì)引物，采用兩端末端快速擴(kuò)增法(RACE法)獲得包括完整ORF在內(nèi)的cDNA序列信息；然后據(jù)此設(shè)計(jì)引物，用 RT-PCR方法進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆。根據(jù)其預(yù)測(cè)序列擴(kuò)增基因的保守片段；以保守片段序列為基礎(chǔ)進(jìn)行cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)。RACE 實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵照 BD SMART RACE cDNA Amplification Kit 使用手冊(cè)。然后對(duì)保守片段、5、及；TRACE所得序列進(jìn)行回收，并連接到pGEMT-Easy載體(購(gòu)自美國(guó)Promega公司)上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye， Perkin-Elmer, USA)的方法，在 ABI 377 測(cè)序儀(Perkin-Elmer, USA)上進(jìn)行測(cè)序，并將序列進(jìn)行拼接。根據(jù)拼接序列信息，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物5’ -ACTCAACTCGATCGACCATATAC-3’和 5，-ATACCATGCCTCTTTATTGC-3，，通過(guò)RT-PCR法得到一個(gè)包含有完整開(kāi)放閱讀框在內(nèi)的 cDNA序列(SEQ ID NO. 2)，長(zhǎng)度為MObp ；回收擴(kuò)增產(chǎn)物，連接該序列到pGEMT-Easy載體上， 用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer, USA)的方法， 在ABI 377測(cè)序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)生物信息學(xué)方法分析編碼蛋白方式，認(rèn)為其通過(guò)植物線粒體密碼子編碼蛋白序列。查詢Gramene網(wǎng)站，發(fā)現(xiàn)0sI2基因位于抗旱QTL區(qū)間內(nèi)。其中，SEQ ID NO. 2的信息如下⑴序列特征(A)長(zhǎng)度540bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(mRNA，cDNA)，雙鏈(對(duì)應(yīng)染色體基因位點(diǎn)DNA序列)(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型mRNA，cDNA, DNA(iii)序列描述:SEQ ID NO. 2實(shí)施例3水稻0sI2基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明水稻0sI2全長(zhǎng)cDNA的長(zhǎng)度為MObp，其序列如SEQ ID NO. 2所示，其中開(kāi)放讀框位于89-364位核苷酸076個(gè)核苷酸)。根據(jù)全長(zhǎng)cDNA推導(dǎo)出水稻0sI2的氨基酸序列，共92個(gè)氨基酸殘基，分子量為10. 4k道爾頓，等電點(diǎn)(pi)為4. 72，其序列如SEQ ID NO. 1所示。將水稻0sI2的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenB ank+EMBL+DDBJ+PDB禾口Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+ Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0sI2基因在核苷酸與 0s07g0142100基因100%同源，有99%的序列同源性。但是以上數(shù)據(jù)庫(kù)中0s07g0142100基因以及與其相關(guān)的EST均沒(méi)有功能注釋。0sI2基因位于水稻抗旱QTL區(qū)間內(nèi)，同時(shí)從實(shí)施例中可以看出，0sI2基因在干旱條件下明顯增強(qiáng)表達(dá)，因此，可以認(rèn)為水稻0sI2基因與水稻的抗旱性相關(guān)。在已有的各公共數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有找到與水稻0sI2蛋白高度同源的氨基酸序列；推測(cè)這與其特殊的編碼方式有關(guān)。實(shí)施例4水稻0sI2蛋白或多肽在水稻中進(jìn)行過(guò)表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的獲得步驟1 含目的基因(水稻0sI2基因)的表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)水稻基因0sI2的全長(zhǎng)序列(SEQ ID N0. 2)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將水稻基因0sI2的cDNA 克隆至中間載體(如PBI121)，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體(如pCAMBIA1300)上，在保證閱讀框架正確的前提下再將該雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，并轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥、煙草以及水稻(寒優(yōu)湘晴和秀水12 (上述植物材料均購(gòu)自上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心)。步驟2 水稻愈傷誘導(dǎo)將水稻種子用無(wú)菌水漂洗15-20分鐘，再用70%的乙醇消毒1分鐘，然后用次氯酸鈉(1.5%有效濃度)溶液振蕩消毒20分鐘。最后再用無(wú)菌水沖洗5遍。將洗好的種子用吸水紙吸干接種在誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基中，25°C暗培養(yǎng)2周。愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用表2的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，加入0. 3g脯氨酸、0. 6g水解酪蛋白酶、 30g蔗糖和2. 5mL2，4-D (濃度lmg/mL)，配成IL溶液，調(diào)pH至5. 9，加入7g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。步驟3:繼代培養(yǎng)把胚性愈傷組織切下，接入繼代培養(yǎng)基中，25°C暗培養(yǎng)2周。繼代培養(yǎng)基采用表2的繼代培養(yǎng)基，加入0.5g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g 蔗糖和2mL 2，4-D (濃度lmg/mL)，配成IL溶液，調(diào)pH至5. 9，加入7g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。步驟4 農(nóng)桿菌和愈傷組織共培養(yǎng)挑取步驟1的農(nóng)桿菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，接種于ImL農(nóng)桿菌培養(yǎng)液(含抗生素)中，28°C 培養(yǎng)過(guò)夜；取以上培養(yǎng)物，加入50mL農(nóng)桿菌培養(yǎng)液(含抗生素)中培養(yǎng)至0D_ = 0. 6-1.0。將獲得的農(nóng)桿菌菌液離心，將收集到的菌體加入懸浮培養(yǎng)液中，震蕩培養(yǎng)30分鐘至OD6tltl = 0. 6-1. 0。然后將愈傷組織放入含有農(nóng)桿菌菌液的懸浮培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)20分鐘左右。將愈傷組織在滅菌濾紙上晾干，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，25°C暗培養(yǎng)5天。懸浮培養(yǎng)液采用表2的懸浮培養(yǎng)液，加入0. 08g水解酪蛋白酶、2g蔗糖和0. 2mL2，4-D (濃度lmg/mL)，配成IOOml溶液，調(diào)pH至5. 4，分成兩瓶(每瓶50mL)，高溫高壓滅菌。 使用之前加入ImL 50%的葡萄糖和100 μ L AS(IOOmM)。共培養(yǎng)培養(yǎng)基采用表2的共培養(yǎng)培養(yǎng)基，加入0. Sg水解酪蛋白酶、20g蔗糖和 3. OmL 2，4-D (濃度lmg/mL)，配成IL溶液，調(diào)pH至5. 6，加入7g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。使用之前加入20mL 50%的葡萄糖和ImL AS(IOOmM)。步驟5:篩選培養(yǎng)共培養(yǎng)3天后，將愈傷組織轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中，25°C暗培養(yǎng)2周，篩選兩次。篩選培養(yǎng)基采用表3的篩選培養(yǎng)基，加入0. 6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2. 5mL 2，4-D (濃度lmg/mL)，配成IL溶液，調(diào)pH至6. 0，加入7g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。使用之前加入 ImLHn 和 ImL Cn(IOOppm)。步驟6:分化培養(yǎng)挑取胚性愈傷組織接入分化培養(yǎng)基，24V，16h/8h光暗培養(yǎng)誘導(dǎo)分化芽周)。分化培養(yǎng)基采用表3的分化培養(yǎng)基，加入2. Omg/L 6_BA、2. Omg/L KT,0. 2mg/L ΝΑΑ、0· 2mg/L ΙΑΑ、1. Og水解酪蛋白酶和30g蔗糖，配成IL溶液，調(diào)pH至6. 0，加入7g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。步驟7:生根培養(yǎng)待芽長(zhǎng)至2cm左右時(shí)，將幼芽切下，插入生根培養(yǎng)基中，25°C左右，1 / 光暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)生根。生根培養(yǎng)基采用表3的生根培養(yǎng)基，加入30g蔗糖，配成IL溶液，調(diào)pH至5. 8， 加入7g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。步驟8:轉(zhuǎn)化植株培養(yǎng)待根系發(fā)達(dá)后，打開(kāi)試管口，加入無(wú)菌水煉苗2-3天后，將植株取出，用無(wú)菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開(kāi)始遮蔭避風(fēng)，待植株健壯后進(jìn)行常規(guī)田間或溫室管
理培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分如表2和表3所示。表2培養(yǎng)基成分
權(quán)利要求
1.水稻0sI2蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID No. 1所示，或該序列經(jīng)替換、 缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述水稻0sI2蛋白的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列與SEQIDNo. 2所示的從 89-364位的核苷酸序列具有至少70%的同源性；或者其核苷酸序列與SEQ ID NO. 2中從 89-364位的核苷酸序列雜交。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列為SEQIDNo. 2所示的從 89-364位的核苷酸序列。
5.一種核酸探針?lè)肿樱涮卣髟谟?，其由?quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述水稻0sI2基因序列的8-100個(gè)連續(xù)核苷酸組成。
6.含有權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述基因的載體。
7.含有權(quán)利要求6所述載體的宿主細(xì)胞。
8.含有權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述基因的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
9.權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述基因在提高植物抗逆性中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述基因在縮短水稻穗一次枝梗和二次枝梗，調(diào)節(jié)水稻穗型使之緊湊化中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種與水稻抗逆性相關(guān)的OsI2蛋白及編碼具有水稻OsI2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ IDNO.2中第89-364位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能與SEQ ID NO.2中第89-364位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明提供的水稻OsI2基因在增強(qiáng)植物(水稻、擬南芥、煙草等)抗逆性(包括但不限于抗旱、耐低溫、耐高鹽等非生物逆境脅迫)方面具有明顯的作用，具有很大的應(yīng)用價(jià)值，能夠明顯減少農(nóng)作物在干旱、半干旱或者高鹽、低溫等條件下生物產(chǎn)量的損失；另外，水稻OsI2基因在縮短小穗枝梗長(zhǎng)度，調(diào)節(jié)水稻果穗形態(tài)等方面作用明顯。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102250230SQ20111021676
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者劉三雄, 劉灶長(zhǎng), 劉運(yùn)華, 周立國(guó), 孔德艷, 段梅, 秦建英, 羅利軍 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心