專利名稱：光滑爪蟾抗腫瘤多肽制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)藥物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
癌癥是威脅人類健康的主要疾病之一，現(xiàn)有癌癥治療藥物最大的局限是在于缺乏選擇性，在清除癌細胞的同時也會殺傷正常細胞。晚期腫瘤傳統(tǒng)的治療方法是放療或化療， 然而無論是放療還是化療都不可避免地會造成血系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的損害，對免疫系統(tǒng)造成進一步的打擊，并且不能完全消除殘存的腫瘤細胞。一般認為，抗癌肽僅作用于原核細胞和發(fā)生病變的真核細胞，而對正常體細胞無不良影響。抗腫瘤多肽的這一特性可能是由于真核細胞膜上有大量的膜蛋白和膽固醇，使細胞膜結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。隨著抗腫瘤藥物的不斷出現(xiàn)，臨床治療水平的提高，抗腫瘤藥物的應(yīng)用越來越廣泛。臨床應(yīng)用時既要注意抗腫瘤藥物的治療作用，也不可忽視它的副作用的發(fā)生率、嚴重度及可逆性?？鼓[瘤藥物的毒副作用就象一把“雙刃劍”，治療劑量等毒性劑量十分接近，即安全系數(shù)低等特點。(一 )消化系統(tǒng)1.惡性嘔吐這是腫瘤化療最常見的副作用之一。發(fā)生率65-85%，這不但影響病人的情緒和進食，甚至造成營養(yǎng)、代謝障礙和其他并發(fā)癥。2. 口腔炎局部或全因素均可引起口腔粘膜的炎癥反應(yīng)，在頰、唇粘膜、顎、舌、口底及齒齦出現(xiàn)紅斑、潰瘍、出血和疼痛。(二)、骨髓抑制多數(shù)抗腫瘤藥可引起不同程度的骨髓抑制。對骨髓造血細胞的抑制，依次為白細胞、血小板，最后影響血紅蛋白，出現(xiàn)全血性減少。(三)、其它器官毒性1.皮膚毒性最常見的是脫發(fā)，也可能引起血管外滲所致的局部皮膚壞死，色素沉著及皮疹等。2.肝臟毒性表現(xiàn)為血清轉(zhuǎn)氨酶和膽紅質(zhì)暫時升高，也可伴有臨床和病理改變。 引起肝臟損害的藥物多為直接的毒性作用，少數(shù)藥物如DTIC可能是過敏反應(yīng)。常見的肝損害組織學(xué)改變有脂肪浸潤、肝細胞壞死、肝內(nèi)膽汁淤積，甚至肝硬變。3.胰腺毒性較少見。皮質(zhì)類固醇、雌激素、6-MP、L-ASP等有時可導(dǎo)致胰腺炎。4.心臟毒性蒽環(huán)類化合物如ADR和DRN，表現(xiàn)為暫時性心電圖改變，或遲發(fā)性心肌病，伴有心力衰竭，與應(yīng)用劑量密切相關(guān)。有些藥物致心肌壞死，心絞痛等。5.肺毒性BLM可引起肺纖維化，嚴重時可導(dǎo)致壞死。其發(fā)生率與累積劑量密切相關(guān)。有慢性呼吸功能減退、年齡較大的患者易發(fā)生。6.腎毒性某些抗腫瘤藥物對腎臟的損害是腎小管壞死和沉淀。防止的方法主要是適當水化與利尿和尿液堿化。常規(guī)檢查腎功能，足量補充水份，采用聯(lián)合化療水減少單一藥物劑量。7.神經(jīng)毒性神經(jīng)毒性有時可導(dǎo)致功能喪失，還要區(qū)別由于藥物的作用，還是腫瘤的作用。VCR對周圍神經(jīng)有明顯的毒性，可引起無力，指(趾)感覺異常、腱反射減退或消崐失、腸麻痹、體位性低血壓等。5-Fu可引起急性小腦共濟失調(diào)。鞘內(nèi)注射MIX可發(fā)生慢性腦病。Pcz和L-ASP可引起中樞神經(jīng)癥狀，如嗜睡。幻覺和抑郁等。DDP可導(dǎo)致第8對腦神經(jīng)損害。8.對生殖器官的影響抗腫瘤藥可影響睪丸、卵巢功能，引起不育。男性生殖腺功能不全，表現(xiàn)有陽萎、精子減少、活力減退。女性生殖腺過早衰退，表現(xiàn)為月經(jīng)不規(guī)律或閉經(jīng)。若在妊娠崐前三個月，可引起染色體退行性變，有致畸胎作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種光滑爪蟾抗腫瘤多肽制備方法及用途，以光滑爪蟾為實驗材料，通過電刺激的方法獲得皮膚分泌物，利用凝膠過濾層析和反相高壓液相層析，分離純化出一種抗腫瘤多肽，該多肽特別對大腸癌細胞SW480有抑制作用。本發(fā)明的抗腫瘤多肽是經(jīng)測序得知序列為Phe-Leu-Gly-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Gly-Leu-Lys-Ile-Gly-Ala-Asn-Met-Leu-G ly-Gly-Ala-Pro-Gln-Gln，經(jīng)質(zhì)譜測定其分子量為2沘3. 39OTa，命名為P-1。本發(fā)明的抗腫瘤多肽有抗腫瘤活性當樣品濃度達到256 μ g/ml時，P_1對人大腸癌細胞SW480的抑制率達到84. 2%。 且呈現(xiàn)量效關(guān)系。本發(fā)明的制備方法是以光滑爪蟾材料源，用電刺激法取得光滑爪蟾皮膚分泌物，通過兩步分離純化，凝膠過濾層析和反相高效液相色譜層析，分離并獲得抗癌活性峰。本發(fā)明的有益效果是抗腫瘤多肽在相同劑量下，只能殺死腫瘤細胞，對正常細胞無毒副作用。目前，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些對于抗腫瘤多肽的抗腫瘤活性具有重要作用的影響因素(1)具有疏水的氨基酸殘基和帶正電的氨基酸殘基；(2)兩親特性，在疏水環(huán)境中，可以使疏水的氨基酸殘基和帶正電的氨基酸殘基分別處于分子的兩側(cè)；(3) 一定的二級結(jié)構(gòu)，即可誘導(dǎo)的或預(yù)先形成的α -螺旋或β折疊結(jié)構(gòu)；(4) 一定的疏水性?？鼓[瘤多肽的抗腫瘤機制也處于研究中，當前許多研究表明，抗腫瘤多肽抑殺腫瘤細胞機制可以歸納為如下兩個方面一方面，抗腫瘤多肽可以通過調(diào)動機體免疫機能， 從體液免疫方面來抵抗癌細胞的入侵；另一方面，它直接接觸性抑殺腫瘤細胞，主要從細胞膜、線粒體、核膜等方面來達到抑殺腫瘤細胞的效果。在胞膜攻擊作用方面，目前趨向認為抗腫瘤多肽的抗腫瘤作用機制與抗菌作用機制是類似的，即抗腫瘤多肽分子通過靜電及疏水特性與細胞膜相互作用并破壞胞膜的完整性。與正常真核細胞膜相比，腫瘤細胞的細胞膜含有更高成分的磷脂酰絲氨酸和糖基化成分，因此，具有更高的負電性，流動性和表面積，這有利于提高兩親α-螺旋陽離子抗腫瘤多肽對腫瘤細胞的選擇性和趨向性。本發(fā)明的抗腫瘤多肽P-I與Cecropin類抗菌肽結(jié)構(gòu)相似，都是通過其兩親α -雙螺旋上的正電荷與胞膜磷脂分子上負電荷之間的靜電吸引而結(jié)合，隨后抗菌肽的疏水端(酰胺基)插入到疏水的胞膜中央，雙親的α-雙螺旋留在質(zhì)膜表面，打亂質(zhì)膜上蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的原有秩序， 使膜外正電荷增多，導(dǎo)致膜去極化。由于其α-螺旋結(jié)構(gòu)的親水、疏水兩親性的特點，抗腫瘤多肽分子可相互聚集形成離子通道，導(dǎo)致內(nèi)容物外泄，最后導(dǎo)致細胞滲透壓喪失而死亡。 此外，國內(nèi)外科學(xué)家也多次觀察到抗腫瘤多肽對腫瘤細胞細胞器的破壞線粒體腫脹、空泡化和排列不規(guī)則，提示抗腫瘤多肽的作用機制可能與抑制腫瘤細胞呼吸相關(guān)。線粒體是細胞賴以生存的“動力工廠”，抗腫瘤多肽破壞線粒體的結(jié)構(gòu)，使細胞無法獲得能量，最終導(dǎo)致細胞死亡。也有學(xué)者認為，細胞骨架和核染色質(zhì)DNA損傷是抗菌肽導(dǎo)致腫瘤細胞死亡的重要原因。各種不同結(jié)構(gòu)的抗腫瘤多肽可能存在有不同的作用機制，同一種抗腫瘤多肽也可能通過多種途徑發(fā)揮作用，了解不同抗菌腫瘤多肽的作用機制，有助于對抗腫瘤多肽的臨床應(yīng)用前景及可能產(chǎn)生的問題有的認識，使研究開發(fā)更具有針對性。由于本發(fā)明的抗腫瘤多肽屬于小分子蛋白，與抗菌肽相似，與其他抗腫瘤藥物相比，抗腫瘤多肽P-I的毒副作用更小，具有更高的安全性，由于其抗腫瘤機制的特殊性，臨床上不會出現(xiàn)耐藥性，將來有望開發(fā)成為無毒副作用的抗腫瘤藥物。


圖1利用kphadexG-25分子篩分離光滑爪蟾皮膚分泌物示意圖。圖2利用反相高效液相色譜分離kphadexG-25分子篩的活性峰的示意圖。圖3抗腫瘤多肽P-I對大腸癌細胞SW480抑制率的示意圖，其中縱坐標為大腸癌細胞SW480抑制率，橫坐標為P-I濃度。
具體實施例方式實施例1 光滑爪蟾抗腫瘤活性多肽P-I的制備1取光滑爪蟾100只，利用電刺激(30V恒壓)的方法獲得光滑爪蟾皮膚分泌物， 12000r/min離心20min,收集上清，再過0. 45 μ m濾膜，IOK超濾管5000g/min離心Ih,真空
離心濃縮樣品。2利用GE公司AKTA純化系統(tǒng)和S^hadex G-25 (2. 6 X 100cm)分子篩分離光滑爪蟾電刺激皮膚分泌液濃縮樣品，調(diào)整泵的流速恒流以PBS(PH8. 0)為緩沖液，恒流:3ml/ min,以215nm吸光度檢測峰值，得到三個峰(圖1)，以人大腸癌細胞為抗癌肽活性檢測細胞株，將三個峰的物質(zhì)濃縮后進行抗癌活性實驗檢測，其中第三個峰為活性峰，并將其凍干濃縮。3將上述經(jīng)G-25層析柱分離得到的活性峰凍干樣品用超純水溶解，并用0. 22 μ m 濾器過濾。利用制備型反相高效液相色譜Preparative High Performance Liquid Chromatography)，ACE公司的C18_3(1(1半制備反相柱分離純化，柱高250mm，直徑10mm。超純水(含0. 05% TFA)平衡后，Iml濾過液上樣，進行0-80%梯度洗脫，流速aiil/min，利用自動收集的方法收集分離后的樣品，從第6分鐘開始收集樣品，每一分鐘收集一次樣品(圖2)，共收集50管。濃縮后進行抗癌活性檢測，其中第14管具有抗腫瘤活性。光滑爪蟾抗腫瘤多肽的測序本發(fā)明所提供的光滑爪蟾抗腫瘤多肽用Edman降解法進行測序。Edman降解法是一種對蛋白質(zhì)進行測序的化學(xué)方法，是從肽鏈游離的N末端測定氨基酸殘基序列的過程。N 末端氨基酸殘基被苯異硫氰酸酯修飾，然后從多肽鏈上切下修飾的殘基，再經(jīng)層鑒定，余下的多肽鏈(少一個殘基)被收回再驚醒下一輪降解循環(huán)。Edman降解測序的主要涉及偶聯(lián)、 水解、萃取和轉(zhuǎn)換等4個過程。首先使用苯異硫氰酸酯(PITC)在PH9. 0的堿性條件下對多肽進行處理，PITC與肽鏈的N-端的氨基酸反應(yīng)，形成苯氨基甲酰(PTC)衍生物，即PTC-肽。 然后PTC-肽用TFA處理，N-端氨基酸殘基被有選擇地切斷，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下來將衍生物用氯丁烷從反應(yīng)液中萃取出來，而切掉了一個N-端氨基酸殘基的肽仍留在溶液中。萃取出來的噻唑啉酮苯胺衍生物不穩(wěn)定，經(jīng)酸作用，再一步環(huán)化， 形成一個穩(wěn)定的苯乙內(nèi)酰硫脲(PTH)的衍生物，即PTH-氨基酸。留在溶液中的減少了一個氨基酸殘基的肽再重復(fù)進行上述反應(yīng)過程。整個過程現(xiàn)在都是通過測序儀自動進行。每個循環(huán)獲得一個PTH-氨基酸，經(jīng)HPLC可鑒定出是哪一種氨基酸。本發(fā)明所提供的多肽經(jīng) Edman 降解法測序，序列為 Phe-Leu-Gly-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Gly-Leu-Lys-Ile-Gly-Al a__Asn_Met_Leu_Gly_Gly__Ala_Pro_Gln_Gln0抗腫瘤多肽的固相合成1抗腫瘤多肽的合成合成反應(yīng)從C端到N端逐個進行，由合成固相合成儀自動控制。首先稱量0. Immol 的結(jié)合了第一個氨基酸的樹脂，裝柱，再用20%哌啶二甲基甲酰胺溶液脫保護，二甲基甲酰胺清洗，9-笏甲氧羰基(Fmoc)保護的游離氨基酸溶解于并啶并三氮唑四甲基六氟磷酸鹽 (HATU)P 二異丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液在柱上循環(huán)偶合反應(yīng)30min，二甲基甲酰胺清洗重復(fù)以上脫保護到偶合反應(yīng)步驟直到制備結(jié)束。2合成后的多肽的制備和分析取下反應(yīng)后的樹脂，加入剪切液5mL(88%三氟乙酸，5 %苯酚，5 %水，2%三異丙基硅烷)，室溫反應(yīng)2h，過濾，濾出液中加入10倍體積的預(yù)冷無水乙醚(_20°C )50mL,4000r/min離心lOmin，收集沉淀。用預(yù)冷無水乙醚洗滌沉淀3 次后室溫干燥。稱量一定量干燥后的多肽，溶于0.05% TFA的水溶液中，樣品經(jīng)過孔徑為 0. 22 μ m的濾膜過濾后，經(jīng)C18反向柱(IOmmX 250mm)分離(洗脫液為A液含0. 05% TFA 的水溶液；B液含0. 05% TFA的乙氰溶液；洗脫條件為O 60% B液30min)，收集洗脫峰， 冷凍干燥。利用質(zhì)譜MALDI-T0F將定其分子量和純度備用。光滑爪蟾抗腫瘤多肽對腫瘤細胞的抑制作用1.細胞培養(yǎng)將大腸癌細胞SW480的單細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；培養(yǎng)Mh，利用細胞計數(shù)板計數(shù)并用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞濃度，使細胞濃度達到IO3-IO4細胞/孔，培養(yǎng)24h后，待細胞貼壁后，用0. 22 μ m的濾器過濾不同濃度的抗腫瘤肽樣品P-1，然后將其加入到稀釋好的細胞懸液中，繼續(xù)培養(yǎng)48h。加入20 μ L MTT溶液(5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。然后將孔內(nèi)培養(yǎng)液吸出，再加入DMSO溶液100 μ 1。用酶標儀檢測各孔OD值(檢測波長為490nm)。2. MTT比色法測定光滑爪蟾抗腫瘤多肽對大腸癌細胞SW480增殖的影響?？鼓[瘤多肽P-I以不同濃度0、2、4.、8、16、32、64、Κ8、256μ g/ml處理大腸癌細胞SW480,作用M小時后加入MTT，4小時后將孔內(nèi)培養(yǎng)液吸出，再加入DMSO溶液100 μ 1，用酶標儀檢測細胞抑制率。如圖3所示，結(jié)果顯示經(jīng)48小時作用，除對照組外，P-I濃度在達到16μ g/ml的時候開始對腫瘤細胞有抑制作用，對大腸癌細胞SW480的抑制率達到7. 7%, 其他濃度組對腫瘤細胞的抑制率依次是16. 4%,44. 3%,79. 6%,84. 2% .從以上結(jié)果可以看出，光滑爪蟾抗腫瘤多肽對于人大腸癌細胞SW480有抑制作用，且有量效關(guān)系?？鼓[瘤多肽P-I的體內(nèi)抗腫瘤活性測定50只健康的BALB/c小白鼠，體重20士2克，平均分五組，每組10只，全部為雌鼠。 將已接種SW480肉瘤的荷瘤小鼠處死，無菌操作抽取其腹水，按1 3比例稀釋，配置成細胞懸液，于每只實驗用小鼠的右前肢腋窩皮下注射0. 2ml瘤細胞懸液，腫瘤細胞大約在106， 植瘤M小時后，給藥組分別以不同劑量進行靜脈注射，以生理鹽水作為陰性對照組，CTX為陽性對照組，連續(xù)注射7天后，于停藥3天時處死小鼠，剖取皮下瘤塊，稱瘤重，計算抑瘤率。
權(quán)利要求
1.一種光滑爪蟾抗腫瘤多肽，其特征是以光滑爪蟾皮膚分泌物為原材料提取，由Phe-Leu-Gly-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Gly-Leu-Lys-Ile-Gly-Ala-Asn-Met-Leu-Gly-G Iy-Ala-Pro-Gln-Gln組成的二十三肽，其分子量為2沘3. 395Da0
2.如權(quán)利要求1所述的一種光滑爪蟾抗腫瘤多肽的用途，其用途是該多肽具有抗腫瘤作用，對大腸癌細胞SW480的增殖與生長具有抑制作用，可作為在制備抗腫瘤藥中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1所述的一種光滑爪蟾抗腫瘤多肽的制備方法，其方法是以光滑爪蟾材料源，用電刺激法取得光滑爪蟾皮膚分泌物，通過兩步分離純化，凝膠過濾層析和反相高效液相色譜層析，分離并獲得抗癌活性峰。
全文摘要
一種光滑爪蟾抗腫瘤多肽制備方法及用途，屬于生物化學(xué)藥物技術(shù)領(lǐng)域，其特征是以光滑爪蟾皮膚分泌物為原材料提取，由Phe-Leu-Gly-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Gly-Leu-Lys-Ile-Gly-Ala-Asn-Met-Leu-Gly-Gly-Ala-Pro-Gln-Gln，經(jīng)質(zhì)譜測定其分子量為2283.395Da。該多肽具有抗腫瘤作用，對大腸癌細胞SW480的增殖與生長具有抑制作用，可作為在制備抗腫瘤藥中的應(yīng)用。有益效果是抗腫瘤多肽在相同劑量下，只能殺死腫瘤細胞，對正常細胞無毒副作用。具有疏水的氨基酸殘基和帶正電的氨基酸殘基；兩親特性，在疏水環(huán)境中，可以使疏水的氨基酸殘基和帶正電的氨基酸殘基分別處于分子的兩側(cè)；即可誘導(dǎo)的或預(yù)先形成的α-螺旋或β折疊結(jié)構(gòu)；有一定的疏水性。
文檔編號C07K1/20GK102304178SQ20111027073
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者楊陽, 白曉強 申請人:楊陽, 白曉強