專(zhuān)利名稱(chēng)：Vista調(diào)節(jié)性t細(xì)胞介體蛋白、vista結(jié)合劑及其用途的制作方法
VISTA調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介體蛋白、VISTA結(jié)合劑及其用途簡(jiǎn)介本專(zhuān)利申請(qǐng)要求2010年3月26日提交的美國(guó)專(zhuān)利序列N0.12/732，371、2010年10月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.61/390，434、2011年I月26日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.61/436，379以及2011年3月7日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.61/449，882的優(yōu)先權(quán)。所有這些專(zhuān)利申請(qǐng)均以應(yīng)用方式全文并入本文。本專(zhuān)利申請(qǐng)涉及我們發(fā)現(xiàn)、表征及確定了功能的新型、造血限制性、結(jié)構(gòu)不同的Ig超家族抑制性配體，被稱(chēng)為T(mén)細(xì)胞活化的V區(qū)含免疫球蛋白抑制劑(VISTA)或ro-L3。其胞外域具有與B7家族配體ro-Ll的同源性，并且像ro-Ll —樣，VISTA對(duì)免疫具有深刻的影響。然而，不同于ro-Ll的是，VISTA的表達(dá)僅位于造血室內(nèi)。表達(dá)最常見(jiàn)于骨髓抗原呈遞細(xì)胞(APC)，但是在⑶4+T細(xì)胞上和Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)亞群上的表達(dá)也具有重要意義?？扇苄訴ISTA-1g融合蛋白或APC上的VISTA表達(dá)強(qiáng)效抑制體外T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生并誘導(dǎo)T細(xì)胞中的Foxp3表達(dá)。相反，新開(kāi)發(fā)的抗VISTA單克隆抗體在體外通過(guò)VISTA+APC干擾T細(xì)胞應(yīng)答的VISTA誘導(dǎo)型免疫抑制。此外，體內(nèi)抗VISTA加強(qiáng)了 T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病實(shí)驗(yàn)性過(guò)敏性腦脊髓炎(EAE)的發(fā)展，并促進(jìn)保護(hù)性腫瘤特異性免疫應(yīng)答的發(fā)展，繼而緩解腫瘤。VISTA-/-小鼠的初步研究正在揭露自發(fā)性炎性疾病的早期征象，并將確定它們的最終病理學(xué)命運(yùn)。不同于所有其他H)配體相關(guān)分子(如B7-H3、H4、H6)，VISTA的造血限制與其充分的抑制活性和獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征一起表明VISTA是一種新型、功能非冗余的核心的免疫負(fù)調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)主要限制在骨髓。
背景技術(shù)：
誘導(dǎo)免疫應(yīng)答需要T細(xì)胞擴(kuò)增、分化、收縮和建立T細(xì)胞記憶。T細(xì)胞必需遇到抗原呈遞細(xì)胞(APC)，并通過(guò)APC上的T細(xì)胞受體(TCR)/主要組織相容性復(fù)合體(MHC)相互作用而通信。建立起TCR/MHC相互作用后，需要T細(xì)胞與APC之間其他組的受體-配體接觸，即，通過(guò)⑶154/⑶40和⑶28/B7.1-B7.2協(xié)同刺激。已表明，這些接觸之間的協(xié)同作用會(huì)在體內(nèi)導(dǎo)致能夠清除病原體和腫瘤并在一些情況下能夠誘導(dǎo)自身免疫的富有成效的免疫應(yīng)答。已經(jīng)鑒定了另一控制水平，即調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)。T細(xì)胞的該特定亞群在胸腺中生成、傳遞到外周，并且能夠在體外和體內(nèi)恒定地和可誘導(dǎo)地控制T細(xì)胞應(yīng)答(Sakaguchi (2000)Cell 101 (5):455-8 ；Shevach(2000)Annu.Rev.1mmunol.18:423-49 ；Bluestone 和 Abbas (2003) Nat.Rev.1mmunol.3 (3): 253-7)。Treg 由 CD4+CD25+ 表型表現(xiàn)，還表達(dá)高水平的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(CTLA-4)、0X-40.4-1BB和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型 TNF 受體相關(guān)蛋白(GITR) (McHugh,等(2002) Immunity 16(2):311-23 ；Shimizu,等(2002) Nat.1mmun.3 (2): 135-42)。通過(guò)5天新生兒胸腺切除術(shù)或使用抗CD25去除抗體而消除Treg細(xì)胞，導(dǎo)致誘導(dǎo)自身免疫病變以及加劇T細(xì)胞對(duì)外源和自體抗原的應(yīng)答，包括提高的抗腫瘤應(yīng)答(Sakaguchi,等(1985) J.Exp.Med.161 (I): 72-87 ；Sakaguchi,等(1995)J.1mmunol.155 (3): 1151-64 ; Jones,等(2002) Cancer Immun.2:1)。此外，Treg 還牽涉在了移植耐受的誘導(dǎo)和維持中(Hara,等(2001) J.1mmunol.166 (6): 3789-3796 ;Wood 和Sakaguchi (2003) Nat.Rev.1mmunol.3:199-210)，因?yàn)橛每?CD25 單克隆抗體去除 Treg 導(dǎo)致移植耐受的消除以及快速移植排斥(Jarvinen，等(2003)Transplantation 76:1375-9)。在通過(guò)Treg表達(dá)的受體中，GITR似乎是一種重要的成分，因?yàn)樵隗w外或體內(nèi)用激動(dòng)性單克隆抗體連接Treg表面上的GITR導(dǎo)致Treg活性的快速終止(McHugh，等(2002)同上；Shimizu,等(2002)同上)，還導(dǎo)致自身免疫病變(Shimizu，等(2002)同上)和移植耐受的消除。協(xié)同剌激和協(xié)同抑制性配體與受體不僅提供T細(xì)胞活化的“第二信號(hào)”，還提供正負(fù)信號(hào)的平衡網(wǎng)絡(luò)，從而最大化針對(duì)感染的免疫應(yīng)答，同時(shí)限制自身免疫。得到最清楚表征的協(xié)同剌激配體為B7.1和B7.2，它們由專(zhuān)職性APC表達(dá)，并且其受體為⑶28和 CTLA-4 (Greenwald, R.J.，F(xiàn)reeman, G.J.，和 Sharpe，A.H.(2005).AnnuRev Immunol23，515-548 ;Sharpe，Α.H.，和 Freeman，G.J.(2002)NatRev Immunol 2，116-126)。CD28由首次接觸試驗(yàn)的和活化的T細(xì)胞表達(dá)，且對(duì)最佳的T細(xì)胞活化起著關(guān)鍵作用。相比之下，CTLA-4在T細(xì)胞活化時(shí)誘導(dǎo)，并通過(guò)結(jié)合到B7.1/B7.2而抑制T細(xì)胞活化，從而損害⑶28-介導(dǎo)的協(xié)同剌激。CTLA-4還通過(guò)其胞質(zhì)ITIM基序而轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)信號(hào)(Teft，W.A.，Kirchhof，M.G.，和 Madrenas，J.(2006).Annu RevImmunol 24，65-97 ；Teft，W.Α.，Kirchhof，Μ.G.，和 Madrenas, J.(2006).Annu Rev Immunol 24，65—97)。Β7.1/B7.2敲除小鼠在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中受損(Borriello, F.，Sethnaj P.，Boyd, S.D.，Schweitzer, A.N.，Tivolj E.A.，Jacoby, D.，Strom, T.B.，Simpson, E.M.，F(xiàn)reeman, G.J.，和 Sharpe，A.H.(1997)) Immunity 6，303-313 ;Freeman，G.J.，Borriello，F(xiàn).，Hodes，R.J.，Reiser, H.，Hathcockj K.S.，Laszloj G.，McKnightj A.J.，Kimj J.，Duj L.，Lombard, D.B.，等(1993).Science 262，907-909)，而CTLA-4敲除小鼠無(wú)法充分控制炎癥并發(fā)展出系統(tǒng)性自身免疫疾病(Chambers, C.A., Sullivan, T.J.,和 Allison，J.P.(1997) Immunity7，885-895 ；Tivol, E.A.，Borriello, F.，Schweitzer, A.N.，Lynch, W.P.，Bluestonej J.A.，和 Sharpe，A.H.(1995) Immunity 3，541-547 ；Waterhouse, P.，Penningerj J.M.，Timms, E.，Wakehamj A.，Shahinianj A.，Lee, K.P.，Thompson, C B.，Griesserj H.，和 Mak，T.W.(1995).Science 270，985-988)0B7家族配體已擴(kuò)展到包括協(xié)同剌激性B7-H2 (IC0S配體)和B7-H3以及協(xié)同抑制性 B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H4(B7S1 或 B7x)和 B7-H6(fcandt，C.S.，Baratinj Μ.，Yij E.C.，Kennedy, J.，Gaoj Z.，F(xiàn)ox, B.，Haldemanj B.，Ostrander, C.D.，Kaifu，T.，Chabannon，C.，等(2009)J Exp Med 206，1495-1503 ;Greenwald，R.J.，F(xiàn)reeman，G.J.，和 Sharpe，A.H.(2005) Annu Rev Immunol 23，515-548)?？烧T導(dǎo)協(xié)同剌激(ICOS)分子在活化的T細(xì)胞上表達(dá)并結(jié)合到B7-H2 (Yoshinaga, S.K.，Whoriskeyj J.S.，Kharej S.D.，Sarmientoj U.，Guoj J.，Horan，T.，Shihj G.，Zhang, M.，Cocciaj M.A.，Kohnoj T.，等(1999).Nature 402，827-832)。ICOS對(duì)T細(xì)胞活化、分化 及功能起著重要意義，對(duì)T-輔助細(xì)胞誘導(dǎo)的B細(xì)胞活化、Ig類(lèi)別轉(zhuǎn)換以及生發(fā)中心(GC)形成必不可少(Dong，C.，Juedesj A.E.，Temannj U.A.，Shresta，S.，Al I i son，J.P.，Ruddle, N.H.，和 Flavel I, R.A.(200 I) Nature409，97-101 ;Tafuri，A.，Shahinianj A.，Bladtj F.，Yoshinaga, S.K.，Jordanaj M.，Wakeham，A.，Boucher, L M.，Bouchard, D.，Chan, V.S.，Duncan, G.，等(2001) Nature 409，105-109 ；Yoshinaga, S.K., ffhoriskey, J.S., Khare, S.D., Sarmiento, U., Guo, J., Horan, T., Shih,G.，Zhang, M.，Coccia, M.A.，Kohno, T.，等(1999) Nature 402，827-832)。在另一方面，程序性死亡i (PD-1)負(fù)調(diào)節(jié)τ細(xì)胞應(yīng)答。ro-1敲除小鼠根據(jù)遺傳背景發(fā)展出狼瘡樣自身免疫疾病或自身免疫擴(kuò)張型心肌病(Nishimura, H., Nose, M., Hiai, H., Minato, N.,和 Hon jo, Τ.(1999) Immunity 11, 141-151 ；Nishimura, Η., Okazaki, Τ., Tanaka, Y., Nakatani, Κ., Hara, Μ., Matsumori, A., Sasayama, S., Mizoguchi, A., Hiai, H., Minato, N.,和 Honjo, Τ.(2001) Science 291,319-322)。自身免疫最可能因PD-L1和TO-L2兩種配體的信號(hào)傳導(dǎo)丟失所致。最近，CD80已被確定為將抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)T細(xì)胞的ro-Li的第二受體(Butte, M.J., Keir, Μ.Ε., Phamduy, Τ.B., Sharpe, A.H.,和 Freeman, G.J.(2007) Immunity27，111-122)。B7-H3和B7-H4的受體仍不得而知。得到最清楚表征的協(xié)同刺激性配體為B7.1和B7.2，并且它們屬于由許多關(guān)鍵性的免疫調(diào)節(jié)因子(諸如B7家族配體和受體)組成的Ig超家族。Ig超家族成員在專(zhuān)職抗原呈遞細(xì)胞(APC)上表達(dá)，并且它們的受體為⑶28和CTLA-4。⑶28由首次接觸試驗(yàn)的和活化的T細(xì)胞表達(dá)，并對(duì)最佳的T細(xì)胞活化起著關(guān)鍵作用。相比之下，CTLA-4在T細(xì)胞活化后誘導(dǎo)，并通過(guò)結(jié)合到B7.1/B7.2而抑制T細(xì)胞活化，從而損害⑶28-介導(dǎo)的協(xié)同刺激。B7.1和B7.2敲除(KO)小鼠在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中受損，而CTLA-4敲除小鼠無(wú)法充分控制炎癥并發(fā)展出系統(tǒng)性自身免疫疾病。隨著時(shí)間推移，B7家族配體已擴(kuò)展到包括協(xié)同刺激配體諸如B7-H2 (ICOS配體)和B7-H3以及協(xié)同抑制性配體諸如B7-H1 (PD-L I)、B7_DC (PD-L2)、B7-H4(B7S1或B7x)和B7-H6。因此，已鑒定了另外的⑶28家族受體。ICOS在活化的T細(xì)胞上表達(dá)，并結(jié)合到B7-H2。ICOS為正協(xié)同調(diào)節(jié)因子，對(duì)T-細(xì)胞活化、分化和功能起著重要作用。在另一方面，程序性死亡i(pd-1)負(fù)調(diào)節(jié)τ細(xì)胞應(yīng)答。ro-1敲除小鼠發(fā)展出了狼瘡樣自身免疫疾病或擴(kuò)張型心肌病。與VISTA(為本發(fā)明焦點(diǎn)的免疫抑制性分子)相比，PD-Ll和TO-L2這兩種抑制性B7家族配體具有不同的表達(dá)模式。PD-L2在DC和巨噬細(xì)胞上誘導(dǎo)性表達(dá)，而ro-Ll在造血細(xì)胞和非造血細(xì)胞類(lèi)型上均泛表達(dá)。與ro-1受體的免疫抑制作用一致，使用ro-Ll-/-和ro-L2-/-小鼠的研究已表明，兩種配體在抑制τ細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生方面具有重疊作用。PD-Ll缺乏在自身免疫性糖尿病的非肥胖型糖尿病(NOD)模型以及多發(fā)性硬化癥(實(shí)驗(yàn)性自 身免疫性腦脊髓炎，EAE)的鼠模型中均會(huì)加速疾病進(jìn)展。PD-L1-/-T細(xì)胞在兩種疾病模型中均產(chǎn)生升高水平的促炎性細(xì)胞因子。此外，在NOD小鼠中的研究已表明，PD-Ll的組織表達(dá)(即，在胰腺內(nèi))對(duì)其區(qū)域性控制炎癥的能力有獨(dú)特的貢獻(xiàn)。PD-Ll還在胎盤(pán)合體滋養(yǎng)細(xì)胞上高表達(dá)，這些細(xì)胞關(guān)鍵性地控制對(duì)同種異體胎兒的母體免疫應(yīng)答。鑒于這一分子家族對(duì)調(diào)節(jié)免疫的強(qiáng)大作用，在癌癥鼠模型中作出的巨大努力已表明通過(guò)靶向這一分子家族可以誘導(dǎo)保護(hù)性抗腫瘤免疫。涉及抗CTLA-4的研究已記述了在鼠模型和黑素瘤臨床試驗(yàn)中的治療有益效果。用B16-GM-CSF(Gvax)接種疫苗的小鼠當(dāng)與CTLA-4的抗體阻斷相結(jié)合時(shí)促進(jìn)B16黑素瘤的排斥。I3D-1以及I3D-Ll的抗體也在多種鼠腫瘤模型中證實(shí)了增強(qiáng)的抗腫瘤免疫和宿主存活。最后，雖然CTLA-4和ro-1屬于同一協(xié)同抑制性分子家族，但是有證據(jù)表明，它們使用不同的非冗余機(jī)制抑制T細(xì)胞活化，并且在抗CTLA-4和抗ro-1/Ll結(jié)合使用時(shí)在鼠黑素瘤中增強(qiáng)宿主存活的能力方面存在協(xié)同作用?；谇笆稣f(shuō)明，鑒于這些家族成員在調(diào)節(jié)免疫特別是T細(xì)胞免疫方面的重要作用，闡明另一種新型B7型家族成員和配體及其調(diào)節(jié)因子將會(huì)是有用的。發(fā)明概述本發(fā)明涉及治療方法，其調(diào)節(jié)活性和/或特異性結(jié)合或阻斷特定調(diào)節(jié)性T細(xì)胞蛋白與其反受體的結(jié)合。這種名為ro-L3 OR VISTA的蛋白是一種新型的且結(jié)構(gòu)不同的Ig超家族抑制性配體，其胞外域具有與B7家族配體ro-Li的同源性。這種分子在本文可互換地稱(chēng)為ro-L3 OR VISTA或稱(chēng)為T(mén)細(xì)胞活化的V結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白抑制劑(VISTA)。VISTA的表達(dá)主要位于造血室內(nèi)，并在骨髓APC和T細(xì)胞上受高度調(diào)節(jié)。VISTA抑制性途徑的治療性干預(yù)提出了一種調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫以治療多種癌癥的新方法。本發(fā)明特別涉及VISTA或TO-L3的特異性抗體用于治療特定癌癥(包括膀胱癌、卵巢癌和黑素瘤)的用途。此外，本發(fā)明特別涉及ro-L3 OR VISTA蛋白的用途，特別是多聚體VISTA蛋白以及表達(dá)其的病毒載體(如腺病毒)的用途，以治療其中在治療學(xué)上需要免疫抑制的病癥，諸如過(guò)敏、自身免疫和炎性病癥。如下文所公開(kāi)，VISTA的表達(dá)似乎僅存在于造血室內(nèi)，且這種蛋白在成熟骨髓細(xì)胞(⑶I Ibtoight)上高表達(dá)，在⑶4+T細(xì)胞、Tlreg和⑶8+T細(xì)胞上的表達(dá)水平較低?？扇苄訴ISTA蛋白，如可溶性VISTA-1g融合蛋白，或APC上的VISTA表達(dá)在體外抑制⑶4+和⑶8+T細(xì)胞增殖以及細(xì)胞因子產(chǎn)生。還觀察到，抗VISTA抗體，如抗VISTA mab(13F3)在體外通過(guò)VISTA+APC阻斷T細(xì)胞應(yīng)答的VISTA誘導(dǎo)型抑制。另外，已發(fā)現(xiàn)，抗VISTA mab加重了 EAE并在體內(nèi)增加了致腦炎Thl7的頻率。再者，如下文詳細(xì)公開(kāi)，已發(fā)現(xiàn)，抗VISTAmab在多種(4)鼠腫瘤模型中誘導(dǎo)腫瘤緩解。在這些模型中的髓源性抑制細(xì)胞(MDSC)上的VISTA表達(dá)極其高，表明VISTA+MDSC抑制腫瘤特異性免疫。如本文所示，VISTA在小鼠體內(nèi)和體外以及人(僅體夕卜)中對(duì)T細(xì)胞有免疫抑制活性，是控制自身免疫發(fā)展以及對(duì)癌癥免疫應(yīng)答的重要介體。具體地講，數(shù)據(jù)表明:
(I)VISTA是Ig超家族的新成員，并包含具有與ro-Ll遙遠(yuǎn)的序列相似性的Ig-V結(jié)構(gòu)域。我們?cè)诒疚墓_(kāi)，當(dāng)作為Ig融合蛋白而產(chǎn)生時(shí)或在人工APC上過(guò)表達(dá)時(shí)，VISTA抑制小鼠和人兩者的CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子產(chǎn)生。(2) VISTA在骨髓APC上的表達(dá)在體外對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答具有抑制性。在腫瘤微環(huán)境中VISTA在MDSC上的表達(dá)極高。許多細(xì)胞表面分子的表型和功能分析之前已表明它們牽涉在MDSC介導(dǎo)的T細(xì)胞抑制中:⑶115、⑶124、⑶80、PD-Ll和TO-L2由MDSC表達(dá)，但是在MDSC與缺乏免疫抑制活性的無(wú)腫瘤小鼠的細(xì)胞之間，未發(fā)現(xiàn)它們表達(dá)水平或陽(yáng)性細(xì)胞比例的差異。因此，我們預(yù)測(cè)，VISTA將是MDSC上的主要B7負(fù)調(diào)節(jié)因子。(4)抗體介導(dǎo)的VISTA阻斷誘導(dǎo)對(duì)自體腫瘤的保護(hù)性免疫?；谏衔乃?，VISTA似乎是MDSC上的一種主要的、負(fù)免疫調(diào)節(jié)分子，其干擾保護(hù)性抗腫瘤免疫的發(fā)展。因此，通過(guò)抗VISTA抗體阻斷此分子的活性將允許人和其他哺乳動(dòng)物中保護(hù)性抗腫瘤免疫的發(fā)展。因此，本發(fā)明涉及使用可溶性VISTA蛋白，如融合蛋白和包含VISTA胞外域或其片段的多個(gè)拷貝的多聚體VISTA蛋白，以及VISTA結(jié)合劑，如小分子和抗體或其片段，其結(jié)合或調(diào)節(jié)(激動(dòng)或拮抗)VISTA的活性，作為免疫調(diào)節(jié)劑以及用于治療不同的癌癥，如膀胱癌、卵巢癌和淋巴瘤、自身免疫疾病、過(guò)敏、感染和炎性病癥，如多發(fā)性硬化和關(guān)節(jié)炎。
如下文詳細(xì)描述，此蛋白是一種新型的抑制性配體，其胞外Ig-V結(jié)構(gòu)域具有與兩種已知的B7家族配體即程序性死亡配體I和2(PD-L1和TO-L2)的同源性，并表現(xiàn)出獨(dú)特的序列特征以及在APC和T細(xì)胞亞群上在體外體內(nèi)與眾不同的表達(dá)模式(從而將PD-L30RVISTA與其他B7家族配體區(qū)別開(kāi)來(lái))。已表明，此蛋白對(duì)CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖與分化具有功能影響(抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖以及細(xì)胞因子產(chǎn)生)?；谄浔磉_(dá)模式以及對(duì)T細(xì)胞的抑制性影響，PD-L30R VISTA顯然作為調(diào)節(jié)性配體發(fā)揮作用，其在T細(xì)胞與髓源性APC之間的同種相互作用期間負(fù)調(diào)節(jié)T細(xì)胞應(yīng)答。雖然TO-L3 OR VISTA似乎為配體B7家族的成員，但不同于其他B7家族配體，此分子僅含有Ig-V結(jié)構(gòu)域而無(wú)Ig-C結(jié)構(gòu)域，并在系統(tǒng)發(fā)生上更接近B7家族受體程序性死亡-1 (PD-1)?；谏衔乃?，PD-L3 OR VISTA及其特異性激動(dòng)劑或拮抗劑可用于調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化和分化，并更廣泛地用于調(diào)節(jié)控制免疫應(yīng)答的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。具體地，PD-L3 OR VISTA蛋白以及H)-L3 OR VISTA激動(dòng)劑或拮抗劑，優(yōu)選地為H)-L3 OR VISTA的特異性抗體，可用于調(diào)節(jié)自身免疫、炎性反應(yīng)和疾病、過(guò)敏、癌癥、感染性疾病和移植中的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的一部分涉及例如治療性、診斷性或免疫調(diào)節(jié)性用途的組合物，其包含:分離的可溶性ro-L3 OR VISTA蛋白或融合蛋白，如可溶性VISTA-1g融合蛋白或多聚體VISTA蛋白，這些蛋白包含與如SEQ ID NO:2、4或5所示的人或鼠H)-L3 OR VISTA多肽優(yōu)選地至少70-90%相同的氨基酸序列，或其直系同源體或片段，它們由特異性雜交到在體內(nèi)調(diào)節(jié)VISTA的SEQ ID NO:1或3的基因進(jìn)行編碼；以及包含藥學(xué)上可接受的載體。在一些實(shí)施方案中，可溶性或多聚體VISTA蛋白可以直接或間接連接到異源(非VISTA)蛋白或可以由病毒載體或細(xì)胞表達(dá)，包括例如轉(zhuǎn)染的免疫細(xì)胞，諸如T細(xì)胞。本發(fā)明還提供表達(dá)載體，其包含編碼VISTA蛋白或其片段或直系同源體的分離核酸，所述VISTA蛋白與如SEQ ID NO: 2、4或5所示的人或鼠VISTA的氨基酸序列至少70-90%相同，其任選地融合到編碼另一種蛋白諸如Ig多肽(如Fe區(qū)或報(bào)告分子)的序列；以及提供包含所述載體的宿主細(xì)胞。

本發(fā)明還具體涉及分離的結(jié)合劑，優(yōu)選地為抗體或抗體片段，其特異性結(jié)合到包含如SEQ ID N0:2、4或5所示的氨基酸序列的H)-L30R VISTA蛋白或其變體、片段或直系同源體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該結(jié)合劑在體外或體內(nèi)調(diào)節(jié)(激動(dòng)或拮抗)VISTA活性。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，該結(jié)合劑為激動(dòng)性或拮抗性抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞應(yīng)答的方法，方式是在體外或體內(nèi)將免疫細(xì)胞與VISTA蛋白或其特異性結(jié)合劑在在存在初級(jí)信號(hào)的情況下接觸，使得免疫細(xì)胞應(yīng)答得到調(diào)節(jié)。(r VISTA或其調(diào)節(jié)劑的相互作用將信號(hào)傳遞給免疫細(xì)胞，從而調(diào)控免疫應(yīng)答。PD-L3OR VISTA蛋白在骨髓抗原呈遞細(xì)胞(包括髓系樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)和巨噬細(xì)胞)上以高水平表達(dá)，在⑶4+和⑶8+T細(xì)胞上以低密度表達(dá)。免疫活化后，PD-L3 OR VISTA表達(dá)在骨髓APC上上調(diào)，但在⑶4+T細(xì)胞上下調(diào))。因此，本發(fā)明的H)-L3 OR VISTA核酸和多肽及其激動(dòng)劑或拮抗劑可用于例如調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。在另一方面，本發(fā)明提供編碼VISTA多肽，優(yōu)選地編碼可溶性融合蛋白和多聚體VISTA蛋白的分離的核酸分子以及核酸片段，其適合作為引物或雜交探針用于檢測(cè)編碼PD-L3 OR VISTA的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的H)-L3 OR VISTA核酸分子與編碼如本文所示的SEQ ID NO:1或3中的TO-L3 OR VISTA的核苷酸序列(例如，整個(gè)長(zhǎng)度的核苷酸序列)或其互補(bǔ)序列至少約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高程度相同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，PD-L3 OR VISTA核酸分子包含編碼下述多肽的核苷酸序列，所述多肽的氨基酸序列具有與SEQ ID N0:2、4或5的氨基酸序列特定的百分比同一性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，PD-L30R VISTA核酸分子包含編碼下述多肽的核苷酸序列,所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID N0:2、4或5的氨基酸序列的整個(gè)長(zhǎng)度或與其胞外域至少約71%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高程度相同。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的核酸分子編碼人或鼠VISTA或其中的保守區(qū)或功能結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該核酸分子包含編碼具有SEQID N0:2、4或5的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該核酸分子為至少約 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150或更多個(gè)核苷酸長(zhǎng)。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，該核酸分子為至少約 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150或更多個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并編碼具有PD-L3 OR VISTA活性或調(diào)節(jié)H)-L30R VISTA功能(如本文所述)的多肽。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案的特征在于核酸分子，優(yōu)選地為H)-L30R VISTA核酸分子，其特異性檢測(cè)相對(duì)于編碼非ro-L3 OR VISTA多肽的核酸分子的ro-L3 OR VISTA核酸分子。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的核酸分子為至少約880、900、950、1000、1050、1100、1150或更多個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并在嚴(yán)格條件下雜交到編碼如SEQ ID N0:2、4或5所示的多肽的核酸分子或其互補(bǔ)序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的核酸分子為至少20、30、40、50、100、150、200、250、300或更多個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并在嚴(yán)格條件下雜交到編碼H)-L3 ORVISTA片段的核酸分子，如包含至少 20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或更多個(gè)核苷酸長(zhǎng)，包含編碼SEQ ID N0:2、4或5所示的PD-L3 OR VISTA多肽的以SEQ ID NO:1和3公開(kāi)的核酸序列或其互補(bǔ)序列的至少15個(gè)(SP15個(gè)連續(xù)的)核苷酸，并在嚴(yán)格條件下雜交到包含如SEQ ID NO:1或3所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的核酸分子。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，該核酸分子編碼包含SEQ ID N0:2或4或5的氨基酸序列的多肽的天然存在的等位變體，其中該核酸分子在嚴(yán)格雜交條件下雜交到包含SEQ IDNO:1或3或其互補(bǔ)序列的核酸分子的互補(bǔ)序列。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供分離的核酸分子，其為H)-L30RVISTA核酸分子的反義分子，如，與SEQ ID NO:1或3所示的H)-L30R VISTA核酸分子的編碼鏈反義。本發(fā)明的另一方面提供包含TO-L3 OR VISTA核酸分子的載體。在某些實(shí)施方案中，該載體為重組表達(dá)載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明核酸分子的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供產(chǎn)生多肽，優(yōu)選地ro-L3OR VISTA多肽的方法，方式是在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含重組表達(dá)載體的本發(fā)明的宿主細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，諸如非人哺 乳動(dòng)物細(xì)胞，以使得產(chǎn)生所述多肽。本發(fā)明的另一方面的特征在于分離的或重組的H)-L3 OR VISTA多肽(如蛋白、多肽、肽或其片段或部分)。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的ro-L3 OR VISTA多肽或ro-L3 ORVISTA融合蛋白包含以下結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)或多個(gè):信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域、IgV結(jié)構(gòu)域、胞外域、跨膜域和胞質(zhì)域。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，PD-L3 OR VISTA多肽包含以下結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)或多個(gè):信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域、IgV結(jié)構(gòu)域、胞外域、跨膜域和胞質(zhì)域，并具有與SEQ ID N0:2或4或5的氨基酸序列至少約 71%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高程度相同的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，PD-L3 OR VISTA多肽包含以下結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)或多個(gè):信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域、IgV結(jié)構(gòu)域、胞外域、跨膜域和胞質(zhì)域，并具有VISTA或TO-L3活性(如本文所述)。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，PD-L3多肽包含以下結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)或多個(gè):信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域、IgV結(jié)構(gòu)域、胞外域、跨膜域和胞質(zhì)域，并由具有下述核苷酸序列的核酸分子編碼，所述核苷酸序列在嚴(yán)格雜交條件下雜交到包含SEQ ID N0:1或3的核苷酸序列的核酸分子的互補(bǔ)序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于具有SEQ ID N0:2或4或5的氨基酸序列的多肽的片段或部分，其中該片段包含SEQ IDN0:2或4的氨基酸序列的至少15個(gè)氨基酸(即連續(xù)氨基酸)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，PD-L3 OR VISTA多肽包含SEQ ID N0:2、4或5的氨基酸序列或由其組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于由下述核酸分子編碼的TO-L3 OR VISTA多肽，所述核酸分子由與SEQID NO:1或3的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列至少約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高程度相同的核苷酸序列組成。本發(fā)明的進(jìn)一步特征在于由下述核酸分子編碼的ro-L3 OR VISTA多肽，所述核酸分子由這樣的核苷酸序列組成，所述核苷酸序列在嚴(yán)格雜交條件下雜交到包含SEQ IDNO:1或3的核苷酸序列的核酸分子的互補(bǔ)序列。本發(fā)明的多肽或其部分，如其生物活性部分，可有效連接到非H)-L3 OR VISTA多肽(如異源氨基酸序列)以形成融合多肽。本發(fā)明的進(jìn)一步特征在于抗體，諸如單克隆或多克隆抗體，其特異性結(jié)合本發(fā)明的多肽，優(yōu)選地為人ro-L3 OR VISTA多肽。本發(fā)明還涉及基于所需的功能特性從針對(duì)此蛋白或H)-L3 ORVISTA-1g融合蛋白產(chǎn)生的單克隆抗體組中選擇具有所需功能特性的抗ro-L3 OR VISTA抗體的方法，所需功能特性例如為調(diào)節(jié)H)-L30R VISTA對(duì)免疫的特定作用，諸如蛋白對(duì)TCR活化的抑制作用、蛋白對(duì)CD4T細(xì)胞針對(duì)抗CD3的增殖應(yīng)答的抑制作用、抑制對(duì)同種CD4T細(xì)胞的抗原特異性增殖應(yīng)答、PD-L3 OR VISTA對(duì)特定細(xì)胞因子諸如IL-2和Y干擾素表達(dá)的抑制作用等等。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，將選擇用作治療劑的抗TO-L3 OR VISTA抗體，其在體外在存在可溶性PD-L3 OR VISTA蛋白(如PD-L3 OR VISTA-1g融合蛋白)的情況下增強(qiáng)PD-L3 ORVISTA-1g對(duì)TO-L3 OR VISTA相關(guān)免疫功能的抑制作用。這是優(yōu)選的，因?yàn)樘貏e出人意料地(下文所示)，這些抗體在體內(nèi)的表現(xiàn)與預(yù)期它們?cè)隗w外對(duì)免疫的作用相反，即這些抗-或VISTA單克隆抗體為免疫抑制性的。此外，PD-L3 OR VISTA多肽(或其生物活性部分)或者H)-L3 ORVISTA分子的調(diào)節(jié)劑，即抗體，諸如使用前述方法選擇的抗體，可結(jié)合到藥物組合物中，該藥物組合物任選地包含藥學(xué)上可接受的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將TO-L3 OR VISTA蛋白用作抑制或降低免疫細(xì)胞活化的抑制性信號(hào)。在此實(shí)施方案中， 該抑制性信號(hào)結(jié)合到免疫細(xì)胞上的抑制性受體(如CTLA-4或PD-1)，從而拮抗結(jié)合到活化受體的初級(jí)信號(hào)(如通過(guò)TCR、⑶3、BCR或Fe多肽)。抑制包括例如抑制第二信使生成；抑制增殖；抑制免疫細(xì)胞中的效應(yīng)子功能，如減弱吞噬作用、減少抗體產(chǎn)生、降低細(xì)胞毒性、使免疫細(xì)胞無(wú)法產(chǎn)生介體(諸如細(xì)胞因子(如IL-2)和/或變應(yīng)性反應(yīng)介體)；或發(fā)展無(wú)能。在特定的實(shí)施方案中，初級(jí)信號(hào)為結(jié)合TCR并引發(fā)初級(jí)刺激信號(hào)的配體(如CD3或抗⑶3)。此類(lèi)TCR配體易于從商業(yè)來(lái)源獲得，并且具體的實(shí)例包括抗⑶3抗體0KT3 (由得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)的雜交瘤細(xì)胞制得)和抗CD3單克隆抗體G19-4。在一個(gè)替代性的實(shí)施方案中，初級(jí)信號(hào)通過(guò)其他機(jī)制傳遞給T細(xì)胞，這些機(jī)制包括蛋白激酶C活化劑諸如佛波酯(如豆蘧酰佛波醇乙酯)和鈣離子載體(如離子霉素，其升高胞質(zhì)鈣濃度)等。使用此類(lèi)試劑繞過(guò)TCR/CD3復(fù)合體但向T細(xì)胞遞送刺激信號(hào)。其他作為初級(jí)信號(hào)發(fā)揮作用的試劑包括天然和合成的配體。天然配體可包括具有或不具有呈遞的肽的MHC。其他配體可包括但不限于肽、多肽、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子、糖肽、可溶性受體、留體化合物、激素、促分裂原諸如PHA或其他超抗原、肽-MHC四聚體(Altman,等(1996) Science 274 (5284): 94-6)和可溶性 MHC 二聚體(DalPorto,等(1993) Proc Natl.Acad.Sc1.USA 90:6671-5)。根據(jù)本發(fā)明方法活化的免疫細(xì)胞隨后可體外擴(kuò)增并用于治療和預(yù)防多種疾??；如，已克隆并體外擴(kuò)增的人T細(xì)胞可維持其調(diào)節(jié)活性(Groux,等(1997) Nature389(6652):737_42)。在擴(kuò)增前，從受試者(如，哺乳動(dòng)物諸如人、狗、貓、小鼠、大鼠或其轉(zhuǎn)基因物種)中獲得T細(xì)胞源。T細(xì)胞可得自許多來(lái)源，包括外周血單核細(xì)胞、骨髓、淋巴結(jié)組織、臍帶血、胸腺組織、來(lái)自感染部位的組織、脾臟組織、腫瘤或T細(xì)胞系。T細(xì)胞可得自使用技術(shù)人員已知的多種技術(shù)諸如ficoll 分離從受試者采集的一單位血。在另一方面，本發(fā)明提供檢測(cè)生物樣品中TO-L3 OR VISTA核酸分子、蛋白或多肽存在性的方法，方式是將生物樣品與能夠檢測(cè)ro-L3 OR VISTA核酸分子、蛋白或多肽的試劑接觸，使得在生物樣品中檢測(cè)ro-L3 OR VISTA核酸分子、蛋白或多肽的存在性。此PD-L30R VISTA表達(dá)可用于檢測(cè) 某些疾病部位，諸如炎癥部位。在另一方面，本發(fā)明提供檢測(cè)生物樣品中H)-L3 OR VISTA活性的存在性的方法，方式是將生物樣品與能夠檢測(cè)ro-L3 OR VISTA活性的指標(biāo)的試劑接觸，使得在生物樣品中檢測(cè)ro-L3 OR VISTA活性的存在性。在另一方面，本發(fā)明提供用于調(diào)節(jié)ro-L3 OR VISTA活性的方法，包括將能夠表達(dá)ro-L3 OR VISTA的細(xì)胞與調(diào)節(jié)ro-L3 0RVISTA活性的試劑接觸，優(yōu)選地為抗ro-L3 ORVISTA抗體，使得細(xì)胞中的ro-L3 OR VISTA活性得到調(diào)節(jié)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑抑制ro-L3 OR VISTA活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑刺激ro-L30R VISTA活性。在又一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑干擾或增強(qiáng)ro-L3 0RVISTA多肽與其天然結(jié)合伴侶之間的相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑為特異性結(jié)合到ro-L3 OR VISTA多肽的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑為結(jié)合到ro-L3 OR VISTA多肽的肽、擬肽物或其他小分子。在再一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑調(diào)節(jié)ro-L3 OR VISTA的表達(dá)，方式是通過(guò)調(diào)節(jié)ro-L3OR VISTA基因的轉(zhuǎn)錄、PD-L3 OR VISTAmRNA的翻譯或PD-L3 OR VISTA多肽的轉(zhuǎn)錄后修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑為下述核酸分子，其核苷酸序列為ro-L3 OR VISTAmRNA或TO-L3 OR VISTA基因的編碼鏈的反義序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于治療患有疾病或病癥的受試者，所述疾病或病癥的特征在于異常、不足或不需要的ro-L3 0RVISTA多肽或核酸表達(dá)或活性，方式是向所述受試者施用為ro-L30R VISTA調(diào)節(jié)劑的試劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，PD-L30RVISTA調(diào)節(jié)劑為ro-L3 OR VISTA多肽，優(yōu)選地為可溶性融合蛋白或多聚體VISTA蛋白或抗VISTA抗體，如下文所述。在另一個(gè)實(shí)施方案中，PD-L3 OR VISTA調(diào)節(jié)劑為T(mén)O-L3 ORVISTA核酸分子，如在腺病毒載體中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供用另外的調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的試劑治療受試者。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含抗原和調(diào)節(jié)(增強(qiáng)或抑制)PD_L3 OR VISTA活性的試劑的疫苗。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該疫苗抑制ro-L3 OR VISTA與其天然結(jié)合伴侶之間的相互作用。本發(fā)明還提供用于鑒定遺傳變異存在與否的診斷性檢測(cè)分析法，所述遺傳變異的特征在于以下至少一者:(i)編碼H)-L30R VISTA多肽的基因的異常修飾或突變；(ii)基因的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)；以及(iii)PD-L30R VISTA多肽的異常轉(zhuǎn)錄后修飾，其中基因的野生型形式編碼具有PD-L3 OR VISTA活性的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供用于鑒定下述化合物的方法，所述化合物結(jié)合到TO-L3OR VISTA多肽或調(diào)節(jié)其活性，方式是:提供包含具有TO-L3 OR VISTA活性的TO-L3 ORVISTA多肽的指標(biāo)組合物，使指標(biāo)組合物與測(cè)試化合物接觸，以及確定測(cè)試化合物對(duì)指標(biāo)組合物中ro-L3 OR VISTA活性的影響，從而鑒定調(diào)節(jié)ro-L3 OR VISTA多肽的活性的化合物。在一個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞上H)-L3 0RVISTA與其天然結(jié)合伴侶之間的相互作用的方法，包括將表達(dá)ro-L30R VISTA的抗原呈遞細(xì)胞與選自由下列組成的組的試劑接觸:一種形式的ro-L3 OR VISTA、或調(diào)節(jié)ro-L3 OR VISTA與其天然結(jié)合伴侶之間的相互作用的試劑，使得免疫細(xì)胞上ro-L3 OR VISTA與其天然結(jié)合伴侶之間的相互作用得到調(diào)節(jié)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)ro-L3 OR VISTA與其天然結(jié)合伴侶之間的相互作用的試劑為特異性結(jié)合到ro-L3 OR VISTA的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，PD-L3 ORVISTA與其天然結(jié)合伴侶之間的相互作用受到上調(diào)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，PD-L3 OR VISTA與其天然結(jié)合伴侶之間的相互作用受到下調(diào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將免疫細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的另外試劑接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，接觸步驟在體外進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，接觸步驟在體內(nèi)進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞選自由下列組成的組:T細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、B細(xì)胞和骨髓細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明涉及抑制或增強(qiáng)免疫細(xì)胞中活化的方法，包括增強(qiáng)或抑制細(xì)胞中ro-L3 OR VISTA的活性或表達(dá)，使得免疫細(xì)胞活性得到抑制或增強(qiáng)。在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含抗原以及抑制H)-L3 OR VISTA與其天然結(jié)合伴侶之間相互作用的試劑的疫苗。在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含抗原以及促進(jìn)ro-L3 OR VISTA與其天然結(jié)合伴侶之間相互作用的試劑的疫苗。在另一方面，本發(fā)明涉及治 療患有將會(huì)受益于免疫應(yīng)答上調(diào)的病癥的受試者的方法，包括施用抑制受試者免疫細(xì)胞上ro-L3 0RVISTA與其天然結(jié)合伴侶之間相互作用的試齊U，使得將會(huì)受益于免疫應(yīng)答上調(diào)的病癥得到治療。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該試劑包含結(jié)合到ro-L3 OR VISTA并抑制ro-L3 OR VISTA與其天然結(jié)合伴侶之間相互作用的阻斷性抗體或小分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包含向受試者施用上調(diào)免疫應(yīng)答的第二試劑。在另一方面，本發(fā)明涉及治療患有將會(huì)受益于免疫應(yīng)答下調(diào)的病癥的受試者的方法，包括施用刺激受試者細(xì)胞上ro-L3 OR VISTA與其天然結(jié)合伴侶之間相互作用的試劑，使得將會(huì)受益于免疫應(yīng)答下調(diào)的病癥得到治療。例如，用TO-L3 OR VISTA蛋白或結(jié)合劑治療的病癥選自由下列組成的組:腫瘤、病原體感染、炎性免疫應(yīng)答或病癥，優(yōu)選地為不太明顯的炎性病癥，或免疫抑制性疾病。具體實(shí)例包括多發(fā)性硬化、甲狀腺炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、II型和I型糖尿病和癌癥(晚期和早期形式)，包括轉(zhuǎn)移癌，諸如膀胱癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌以及其中VISTA抑制有效抗腫瘤應(yīng)答的其他癌癥。在一些情況下，可向個(gè)體施用表達(dá)下述核酸的細(xì)胞或病毒載體，所述核酸編碼抗VISTA抗體或VISTA融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑包括刺激H)-L3 OR VISTA與其天然結(jié)合伴侶之間相互作用的抗體或小分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括向受試者施用下調(diào)免疫應(yīng)答的第二試劑，諸如ro-L!、PD-L2或CTLA-4融合蛋白或其特異性抗體?？墒褂酶鶕?jù)本發(fā)明的TO-L3 OR VISTA蛋白、結(jié)合劑或H)-L30R VISTA拮抗劑或激動(dòng)劑治療的示例性病癥以舉例的方式包括移植、過(guò)敏、感染性疾病、癌癥和炎性或自身免疫疾病，如炎性免疫疾病。前述的示例性實(shí)例包括I型糖尿病、多發(fā)性硬化、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕性疾病、過(guò)敏癥、哮喘、過(guò)敏性鼻炎、皮膚病、腸胃疾病諸如克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎、移植排斥、鏈球菌感染后和自身免疫性腎衰竭、敗血性休克、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)和毒液螯入；自身炎癥性疾病以及退行性骨和關(guān)節(jié)疾病(包括骨關(guān)節(jié)炎、結(jié)晶性關(guān)節(jié)炎和囊炎以及其他關(guān)節(jié)病)。另夕卜，該方法和組合物可用于治療肌腱炎、韌帶炎和創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)損傷。在另一方面，本發(fā)明涉及篩選調(diào)節(jié)H)-L3 OR VISTA活性的化合物的基于細(xì)胞的檢測(cè)分析法，包括將表達(dá)ro-L3 OR VISTA目標(biāo)分子的細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸，并確定測(cè)試化合物調(diào)節(jié)ro-L3 OR VISTA目標(biāo)分子的活性的能力。在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及篩選調(diào)節(jié)TO-L3 OR VISTA與目標(biāo)分子結(jié)合的化合物的無(wú)細(xì)胞的檢測(cè)分析法，包括將ro-L3 OR VISTA多肽或其生物活性部分與測(cè)試化合物接觸，并確定測(cè)試化合物結(jié)合到ro-L3 OR VISTA多肽或其生物活性部分的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及鑒定在第一和第二抗原濃度下調(diào)節(jié)TO-L3 ORVISTA對(duì)T細(xì)胞活化或細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響的化合物的方法，所述化合物如抗ro-L3 ORVISTA抗體，所述方法包括將表達(dá)TO-L3 OR VISTA目標(biāo)分子的T細(xì)胞與測(cè)試化合物在第一抗原濃度下接觸，確定測(cè)試化合物在第一抗原濃度下調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖或細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力，將表達(dá)ro-L3 OR VISTA目標(biāo)分子的T細(xì)胞與測(cè)試化合物在第二抗原濃度下接觸，以及確定測(cè)試化合物在第二抗原濃度下調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖或細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力，從而鑒定在第一和第二抗原濃度下調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化或細(xì)胞因子產(chǎn)生的化合物。在其他具體實(shí)施方案中， 篩選抗H)-L3 OR VISTA抗體以及H)-L3 OR VISTA蛋白組，從中選出在體外或體內(nèi)抑制或促進(jìn)ro-L30R VISTA對(duì)⑶4+和⑶8+T細(xì)胞分化、增殖和/或細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用的那些。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將受試者H)-L3 OR VISTA蛋白、核酸以及TO-L3 OR VISTA特異性配體，優(yōu)選地為對(duì)ro-L3 OR VISTA的功能具有所需作用的抗體，用于治療諸如下述病癥:癌癥、自身免疫疾病、過(guò)敏、炎性疾病或感染，更具體地講為免疫系統(tǒng)疾病，諸如重癥聯(lián)合免疫缺陷、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、I型糖尿病、淋巴增生綜合征、炎性腸病、過(guò)敏、哮喘、移植物抗宿主病和移植排斥；對(duì)感染性病原體諸如細(xì)菌和病毒的免疫應(yīng)答；以及免疫系統(tǒng)癌癥，諸如淋巴瘤和白血病。附圖詳述

圖1.序列分析。A.鼠PD-L3 OR VISTA的全長(zhǎng)氨基酸序列。B.鼠PD-L3 OR VISTA與所選B7家族配體之間的胞外Ig結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列比對(duì)，所述配體包括B7-H1 (PD-Ll)、B7-DC(PD-L2)、B7-H3 和 B7-H4。C.PD-L3 OR VISTA Ig 結(jié)構(gòu)域與 B7 家族受體的比對(duì)，所述受體包括 PD-U CTLA-4、CD28、BTLA 和 ICOS0 Ig-v 結(jié)構(gòu)域，“....” ；Ig-c 結(jié)構(gòu)域，比對(duì)使用MUSCLE算法(通過(guò)Log-Expectation的多序列比較)進(jìn)行。D.PD-L3 OR VISTA與其他B7家族配體和受體之間的Ig-V結(jié)構(gòu)域的序列同一'丨生(%)使用ClustalW2程序計(jì)算。E.人和鼠H)-L3 OR VISTA之間的序列同源性。相同的殘基以黑色陰影表示。高度保守和半保守殘基分別以深淺灰色陰影表示。圖2.小鼠PD-L3 OR VISTA與其他免疫球蛋白(Ig)超家族成員的系統(tǒng)發(fā)生分析。小鼠 PD-L3 OR VISTA 和其他 Ig 超家族成員(包括 CD28、CTLA-4、I COS、BTLA、PD-UB7-H1 (PD-Ll)、B7-DC (PD-L2)、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-1、B7-2、BTNL2、BTN3A3、BTN2A2 和BTN1A1)的全長(zhǎng)序列使用PhyML算法(系統(tǒng)發(fā)育最大可能性)進(jìn)行了分析。分支距離在三個(gè)分支節(jié)點(diǎn)示處。圖3.PD-L3 OR VISTA的組織表達(dá)和造血細(xì)胞表達(dá)模式A.小鼠組織中全長(zhǎng)TO-L3OR VISTA的RT-PCR。泳道:⑴肌肉⑵心臟(3)眼睛(4)胸腺(5)脾臟(6)小腸(7)腎臟⑶肝臟(9)腦(10)乳腺(11)肺(12)卵巢(13)骨髓。B.經(jīng)純化的造血細(xì)胞類(lèi)型中全長(zhǎng)TO-L3 OR VISTA的RT-PCR。泳道⑴腹腔巨噬細(xì)胞⑵脾⑶Ilb+單核細(xì)胞(3)脾⑶llc+DC(4)脾⑶4+T細(xì)胞(5) 脾⑶8+T細(xì)胞(6)脾B細(xì)胞。C-E.對(duì)來(lái)自胸腺和脾臟的脾⑶4+和⑶8+T細(xì)胞上(C)、⑶IIb+單核細(xì)胞上(D)以及脾臟和腹腔的⑶llc+DC亞群上(E)的H)-L30R VISTA表達(dá)的流式細(xì)胞分析。F.還分析了脾B細(xì)胞、NK細(xì)胞和粒細(xì)胞。G.來(lái)自不同組織部位的造血細(xì)胞上H)-L3 OR VISTA的差異表達(dá)，所述部位包括腸系膜淋巴結(jié)、外周淋巴結(jié)、脾臟、血液和腹腔。示出了得自至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。圖 4.得自 GNF (Genomics Institute of Novartis ResearchFoundation)基因陣列數(shù)據(jù)庫(kù)以及NCBI GEO(gene expression omnibus)數(shù)據(jù)庫(kù)的Η)- 3 OR VISTA的基因陣列數(shù)據(jù)。圖5.PD-L3 OR VISTA倉(cāng)鼠單克隆抗體的特異性。過(guò)表達(dá)融合到RFP的TO-Ll或者ro-L3 OR VISTA的小鼠EL4細(xì)胞系使用雜交瘤培養(yǎng)物的上清液進(jìn)行了染色，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行了分析。示出了兩個(gè)代表性陽(yáng)性克隆。圖6.在體外培養(yǎng)的脾細(xì)胞上H)-L3 OR VISTA表達(dá)與其他B7家族配體的比較。比較了在多種造血細(xì)胞類(lèi)型上PD-L3 OR VISTA和其他B7家族配體(即PD-Ll、PD_L2、B7_H3和B7-H4)的表達(dá)，所述造血細(xì)胞類(lèi)型包括⑶4+T細(xì)胞、⑶Ilbhi單核細(xì)胞和⑶llc+DC。細(xì)胞為新分離的或在體外培養(yǎng)了 24小時(shí)，被活化以及未活化。CD4+T細(xì)胞用結(jié)合平板的□ CD3 (5 μ g/ml)活化，CDllbhi 單核細(xì)胞和 CDllc+DC 用 IFNa (20ng/ml)和 LPS (200ng/ml)活化。示出了得自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。圖7.在免疫過(guò)程中H)-L3 OR VISTA和其他B7家族配體的體內(nèi)表達(dá)模式的比較。在D011.10 TCR轉(zhuǎn)基因小鼠側(cè)腹用在完全弗氏佐劑(CFA)中乳化的雞卵清白蛋白(OVA)免疫。在免疫后24小時(shí)采集了引流區(qū)和非引流區(qū)淋巴結(jié)細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析了 TO-L3ORVISTA、PD-Ll和TO-L2的表達(dá)。示出了得自至少四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。A.在免疫后24小時(shí)用CFA/0VA誘導(dǎo)了表達(dá)高水平H)-L30R VISTA的⑶Ilb+細(xì)胞群，但在引流區(qū)淋巴結(jié)內(nèi)不只是使用了 CFA。這些細(xì)胞具有F4/80+巨噬細(xì)胞和⑶IIC+樹(shù)突狀細(xì)胞的混合表型。B.在免疫后24小時(shí)分析了 PD-L3 OR VISTA、PD_L1和PD-L2在CDllbhi單核細(xì)胞、⑶llc+DC和⑶4+T細(xì)胞上的表達(dá)。圖8.PD-L3 OR VISTA在活化CD4+T細(xì)胞上的表達(dá)響應(yīng)免疫而喪失。D011.10小鼠側(cè)腹用在完全弗氏佐劑(CFA)中乳化的雞卵清蛋白(OVA)免疫。在免疫后48小時(shí)采集了引流區(qū)和非引流區(qū)淋巴結(jié)細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析了 TO-L3 OR VISTA表達(dá)。示出了得自2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。圖9.固定的H)-L3 OR VISTA-1g融合蛋白抑制了 CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖。A.CFSE標(biāo)記的⑶4+和⑶8+T細(xì)胞通過(guò)結(jié)合平板的口⑶3(具有或不具有共吸收的H)-L3 ORVISTA-1g)刺激。對(duì)低CFSE細(xì)胞的百分比進(jìn)行了定量，并在B圖中顯示。C.TO-1敲除小鼠中CD4+T細(xì)胞也被TO-L3 OR VISTA-1g抑制。D.PD-L3 OR VISTA-1g介導(dǎo)的抑制具有持久性，并可晚發(fā)。CD4+T細(xì)胞在存在ro-L30RVISTA-1g或?qū)φ誌g的情況下活化72小時(shí)(i)或24小時(shí)和iv)。收獲24小時(shí)預(yù)活化的細(xì)胞，在規(guī)定的條件下再刺激另外48小時(shí)。在72小時(shí)培養(yǎng)結(jié)束時(shí)分析了細(xì)胞增殖。(ii)用TO-L3 OR VISTA-1g預(yù)活化并用抗⑶3再刺激；(iii)用抗 CD3 預(yù)活化并用 PD-L30RVISTA-1g 再刺激。(iv)用 PD-L3 OR VISTA-1g預(yù)活化并用TO-L3 ORVISTA-1g再刺激。對(duì)于所有條件分析了平行孔。示出了得自至少四個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。圖10.PD-Ll-1g和H)-L3 OR VISTA-1g融合蛋白對(duì)CD4+T細(xì)胞增殖具有類(lèi)似的抑制作用。將粗純化的⑶4+T細(xì)胞用CFSE標(biāo)記，用結(jié)合平板的口⑶3與滴定量的I3D-Ll-1g或TO-L3 OR VISTA-1g融合蛋白一起進(jìn)行刺激。在72小時(shí)時(shí)分析了 CFSE稀釋度，并對(duì)低CFSE的細(xì)胞的百分比進(jìn)行了定量。對(duì)于所有條件分析了平行孔。示出了得自2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。圖ll.ro-L3 OR VISTA-1g對(duì)首次接觸試驗(yàn)的和記憶⑶4+T細(xì)胞增殖的抑制性作用。A.對(duì)首次接觸試驗(yàn)的(CD25-CD441owCD62Lhi)和記憶(CD25_CD44hiCD62Llow)CD4+T細(xì)胞亞群進(jìn)行分選、CFSE標(biāo)記以及用結(jié)合平板的抗CD3 (2.5 μ g/ml)與TO-L3 OR VISTA-1g或?qū)φ誌g —起以指定的比率進(jìn)行刺激。通過(guò)研究CFSE分割特征在72小時(shí)時(shí)分析了細(xì)胞增殖。計(jì)算了通過(guò)低CFSE細(xì)胞的百分比確定的增殖細(xì)胞百分比，并在B圖中示出。對(duì)于所有條件分析了平行孔。示出了得自?xún)蓚€(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。圖12.PD-L3 OR VISTA-1g融合蛋白抑制了早期TCR活化和細(xì)胞增殖，但不直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。將粗純化的⑶4+T細(xì)胞用結(jié)合平板的抗⑶3與TO-L3 OR VISTA-1g或者對(duì)照Ig—起以1:2的比率(分別為2.5μ g/ml和5μ g/ml)進(jìn)行刺激。在24小時(shí)和48小時(shí)時(shí)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析了細(xì)胞的⑶69、 ⑶62L和⑶44表達(dá)。還針對(duì)早期細(xì)胞凋亡標(biāo)志物膜聯(lián)蛋白V和細(xì)胞死亡標(biāo)志物7-氨基放線菌素D (7-AAD)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了染色。示出了得自?xún)蓚€(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。圖13.PD-L3 OR VISTA-1g抑制了 CD4+和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。A-B.將粗純化的⑶4+T細(xì)胞用結(jié)合平板的抗⑶3和H)-L30R VISTA-1g或者對(duì)照Ig —起以規(guī)定的比率進(jìn)行刺激。24小時(shí)和48小時(shí)后采集了培養(yǎng)物上清液。通過(guò)ELISA分析了 IL-2和IFN □的水平。C-D.將⑶4+T細(xì)胞分選成首次接觸試驗(yàn)的(⑶25-⑶441ow⑶62Lhi)和記憶(CD25-CD44hiCD62Llow)細(xì)胞群。將細(xì)胞用結(jié)合平板的□ CD3和PD-L30R VISTA-1g或者對(duì)照Ig以1:2的比率進(jìn)行刺激。在48小時(shí)時(shí)收集了培養(yǎng)物上清液，并通過(guò)ELISA分析了IL-2和IFN □水平。E.將粗純化的⑶8+T細(xì)胞用結(jié)合平板的口⑶3和PD-L3 OR VISTA-1g或者對(duì)照Ig以指定的比率進(jìn)行刺激。通過(guò)ELISA分析了培養(yǎng)物上清液中的IFN 口。對(duì)于所有條件，合并了 6個(gè)平行孔的上清液進(jìn)行ELISA分析。示出了得自至少三個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。圖14.PD-L30R VISTA-1g介導(dǎo)的抑制可對(duì)抗⑶28提供的中等水平的協(xié)同刺激，但被高水平的協(xié)同刺激完全逆轉(zhuǎn)，以及通過(guò)外源性IL-2部分補(bǔ)救。A-B.CD4+T細(xì)胞通過(guò)結(jié)合平板的口⑶3與H)-L30RVISTA-1g或者對(duì)照Ig —起以1:1和1:2的比率活化。對(duì)于細(xì)胞因子補(bǔ)救，將可溶性mIL-2、mIL7、mIL15和mDL_23 (均為40ng/ml)加到細(xì)胞培養(yǎng)物中(A)。為了研究協(xié)同刺激作用，將口 CDZS(IygAil)用□ CD3和Ig蛋白以指定的比率一起固定(B)。通過(guò)研究CFSE分割特征，在72小時(shí)時(shí)分析了細(xì)胞增殖。C-D.為了研究在存在較低水平的協(xié)同刺激下H)-L30R VISTA的抑制活性，將滴定量的口⑶28用抗⑶3 (2.5 μ g/ml)和PD-L30R VISTA-1g融合蛋白或者對(duì)照Ig融合蛋白(10 μ g/ml) 一起包被，以刺激⑶4+T細(xì)胞增殖。在72小時(shí)時(shí)分析了細(xì)胞增殖。對(duì)增殖的低CFSE細(xì)胞的百分比進(jìn)行了定量，并在D圖中示出。對(duì)于所有條件分析了平行孔。示出了得自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性CFSE曲線。圖15.在抗原呈遞細(xì)胞上表達(dá)的H)-L30R VISTA抑制了⑶4T細(xì)胞增殖。A_C.將穩(wěn)定表達(dá)MHC II分子1-Ad和協(xié)同刺激分子B7-2的CHO細(xì)胞系用作親本細(xì)胞系。將細(xì)胞用表達(dá)H)-L30R VISTA-RFP或者RFP對(duì)照分子的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。分選轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)均一的表達(dá)水平。為了測(cè)試它們作為抗原呈遞細(xì)胞的能力，將CH0-PD-L30R VISTA或CHO-RFP細(xì)胞用絲裂霉素C處理，并與OVA特異性轉(zhuǎn)基因⑶4+T細(xì)胞D011.10在存在滴定量OVA肽的情況下混合。在72小時(shí)時(shí)通過(guò)CFSE分割特征(A-B)或通過(guò)氚摻入(C)分析了 DOll細(xì)胞的增殖。D.將骨髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞在10天的培養(yǎng)期中用RFP或B7B-H5-RFP逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)的CDllc+RFP+DC和非轉(zhuǎn)導(dǎo)的CDllc+RFP-DC進(jìn)行分選，并用于在滴定量的OVA肽存在下刺激OVA特異性轉(zhuǎn)基因⑶4+T細(xì)胞OT II。通過(guò)研究CFSE分割在第3天時(shí)分析了細(xì)胞增殖。對(duì)于所有實(shí)驗(yàn)，針對(duì)所有條件分析了平行孔，并示出了得自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。圖16.在逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的骨髓源性DC中H)-L30R VISTA的表面表達(dá)水平。將骨髓源性DC(BMDC)在存在GM-CSF(20ng/mml)的情況下培養(yǎng)，并用RFP或者ro_L30RVISTA-RFP逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，如在“方法”中所述。在第10天，對(duì)培養(yǎng)的BMDC分析了 ro_L30RVISTA的表面表達(dá)水平，并與新分離的腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行了比較。圖17顯示了抗roL3mAb在被動(dòng)轉(zhuǎn)移EAE模型中表現(xiàn)出療效。在此過(guò)繼轉(zhuǎn)移EAE模型中，將供體SJL小鼠用CFA和PLP肽免疫。在第10天，分離了引流區(qū)淋巴結(jié)的總淋巴細(xì)胞，在體外用PLP肽、 IL-23 (20ng/ml)和抗IFNg(10ng/ml)培養(yǎng)了 4天。然后純化擴(kuò)增后的⑶4T細(xì)胞，過(guò)繼轉(zhuǎn)移至首次接觸試驗(yàn)的受體小鼠。監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展，并按以下評(píng)分:0 無(wú)疾?。?.5:喪失尾調(diào)；1:尾無(wú)力；2:尾無(wú)力+后肢麻痹；2.5:單后肢癱瘓；3:雙后肢癱瘓；
3.5:前肢虛弱；4:后肢癱瘓+單側(cè)前肢癱瘓。當(dāng)疾病評(píng)分達(dá)到4時(shí)將小鼠處死。*，表示小鼠被處死。圖18顯示了抗H)-L30R VISTA抗體在膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中表現(xiàn)出療效(減輕關(guān)節(jié)炎癥狀)。圖19顯示了在抗原呈遞細(xì)胞上表達(dá)的VISTA抑制了⑶4+T細(xì)胞增殖。圖20顯示了抗VISTA抗體在移植有MB49腫瘤細(xì)胞的小鼠中抑制了腫瘤生長(zhǎng)。圖21顯示了在四個(gè)不同的小鼠抗腫瘤模型中VISTA mab的抗腫瘤作用。圖22顯示了 VISTA mab對(duì)⑶40/TLR激動(dòng)劑疫苗的療效具有潛在作用。圖23顯示了在CNS細(xì)胞上的VISTA表達(dá)。圖24顯示了 VISTA在EAE模型中對(duì)T細(xì)胞命運(yùn)和功能的影響。發(fā)明詳述 * 定義在更詳細(xì)描述本發(fā)明前，提供以下定義。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“免疫細(xì)胞”包括具有造血起源并在免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用的細(xì)胞。免疫細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞，諸如B細(xì)胞和T細(xì)胞；自然殺傷細(xì)胞；以及骨髓細(xì)胞，諸如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和粒細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“T細(xì)胞”包括⑶4+T細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“T細(xì)胞”還包括T輔助細(xì)胞I型T細(xì)胞和T輔助細(xì)胞2型T細(xì)胞兩者。術(shù)語(yǔ)“抗原呈遞細(xì)胞”包括專(zhuān)職性抗原呈遞細(xì)胞(如B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和朗格漢斯細(xì)胞)以及其他抗原呈遞細(xì)胞(如角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和少突細(xì)胞)。術(shù)語(yǔ)“抗原”在本文是指其中對(duì)其免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)可能是治療所需的抗原。就所需的對(duì)所關(guān)注的特定抗原的增強(qiáng)免疫應(yīng)答而言，此類(lèi)抗原包括但不限于示例性的，可對(duì)其引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的感染性疾病抗原。例如，所考慮的Hiv抗原為蛋白gag、env、pol、tat、rev, nef、逆轉(zhuǎn)錄酶和其他HIV成分。得自人乳頭狀瘤病毒的E6和E7蛋白也在考慮之內(nèi)。此外，得自單純性皰疹病毒的EBNAl抗原也在考慮之內(nèi)?？紤]的其他病毒抗原為肝炎病毒抗原，諸如乙肝病毒的S、M和L蛋白、乙肝病毒的前S抗原以及其他肝炎(如甲肝、乙肝、丙肝)病毒成分，諸如丙肝病毒RNA;流感病毒抗原，諸如血凝素、神經(jīng)氨酸酶、核蛋白、M2和其他流感病毒成分；麻疹病毒抗原，諸如麻疹病毒融合蛋白和其他麻疹病毒成分；風(fēng)疫病毒抗原，諸如蛋白El和E2以及其他風(fēng)疫病毒成分；輪狀病毒抗原，諸如VP7sc以及其他輪狀病毒成分；巨細(xì)胞病毒抗原，諸如包膜糖蛋白B以及其他巨細(xì)胞病毒抗原成分；呼吸道合胞病毒抗原，諸如RSV融合蛋白、M2蛋白以及其他呼吸道合胞病毒抗原成分；單純皰疹病毒抗原，諸如即刻早期蛋白、糖蛋白D以及其他單純皰疹病毒抗原成分；水痘-帶狀皰疫病毒抗原，諸如gp1、gpii以及其他水痘-帶狀皰疫病毒抗原成分；日本腦炎病毒抗原，諸如蛋白E、M-E、M-E-NSl、NS 1、NS 1-NS2A,80%E以及其他日本腦炎病毒抗原成分；狂犬病毒抗原，諸如狂犬病毒糖蛋白、狂犬病毒核蛋白以及其他狂犬病毒抗原成分；西尼羅河病毒prM和E蛋白；以及埃博拉病毒包膜蛋白。有關(guān)病毒抗原的附加實(shí)例，參見(jiàn)FundamentalVirology,第二版，編者 Knipe, D.M.和 Howley P.M.(Lippincott ffilliams&ffilkins, NewYork, 2001) 0此外，還公開(kāi)了細(xì)菌抗原?？捎糜诒景l(fā)明的組合物和方法中的細(xì)菌抗原包括但不限于百日咳細(xì)菌抗原，諸如百日咳毒素、絲狀血凝素、百日咳桿菌粘附素、FM2、FM3、腺苷酸環(huán)化酶以及其他百日咳細(xì)菌抗原成分；白喉細(xì)菌抗原，諸如白喉毒素或類(lèi)毒素以及其他白喉細(xì)菌抗原成分；破傷風(fēng)細(xì)菌抗原，諸如破傷風(fēng)毒素或類(lèi)毒素以及其他破傷風(fēng)細(xì)菌抗原成分；鏈球菌抗原，諸如M蛋白以及其他鏈球菌抗原成分；葡萄球菌抗原，諸如IsdA、IsdB, SdrD和SdrE ;革蘭氏陰性桿菌抗原，諸如脂多糖、鞭毛蛋白以及其他革蘭氏陰性菌抗原成分；結(jié)核分枝桿菌抗原，諸如分枝菌酸、熱休克蛋白65(HSP65)、30kDa主要分泌蛋白、抗原85A、ESAT-6以及其他分支桿菌抗原成分；幽門(mén)螺旋桿菌抗原成分；肺炎球菌抗原，諸如肺炎球菌溶血素、肺炎球菌莢膜多糖以及其他肺炎球菌抗原成分；流感嗜血桿菌抗原，諸如莢膜多糖以及其他流感嗜血桿菌抗原成分；炭疽桿菌抗原，諸如炭疽保護(hù)性抗原、炭疽致死因子以及其他炭疽桿菌抗原成分 ’得自鼠疫耶爾森氏菌的FI和V蛋白；立克次氏體細(xì)菌抗原，諸如romps以及其他立克次氏體細(xì)菌抗原成分。本文所述的細(xì)菌抗原還包括任何其他細(xì)菌、分枝桿菌、支原體、立克次氏體或衣原體抗原。原生動(dòng)物和其他寄生蟲(chóng)抗原的實(shí)例包括但不限于惡性瘧原蟲(chóng)抗原，諸如裂殖子表面抗原、子孢子表面抗原、環(huán)子孢子抗原、配子體/配子表面抗原、紅內(nèi)期抗原pf 155/RESA以及其他瘧原蟲(chóng)抗原成分；弓形蟲(chóng)抗原，諸如SAG-1、p30以及其他弓形蟲(chóng)抗原成分；血吸蟲(chóng)抗原，諸如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、副肌球蛋白以及其他血吸蟲(chóng)抗原成分；利什曼原蟲(chóng)主要和其他利什曼原蟲(chóng)抗原，諸如gp63、磷脂多糖及其相關(guān)蛋白以及其他利什曼原蟲(chóng)抗原成分；以及克氏錐蟲(chóng)抗原，諸如75-77kDa抗原、56kDa抗原以及其他錐蟲(chóng)抗原成分。真菌抗原的實(shí)例包括但不限于得自假絲酵母屬(Candida species)、曲霉屬(Aspergillus species)、芽生菌屬(Blastomycesspecies)、組織胞楽■菌屬(Histoplasma species)、球抱子菌屬(Coccidiodomycosis species)、糖批馬拉色菌(Malassezia furfur)及其他屬、威尼克外瓶霉(Exophiala werneckii)及其他屬、霍塔氏毛孢子菌(Piedraia hortai)及其他屬、白氏毛孢子菌(Trichosporum beigelii)及其他屬、小孢子癖菌屬(Microsporum species)、毛癖菌屬(Trichophytonspecies)、表皮癖菌屬(Epidermophyton species)、申克氏抱子絲菌(Sporothrix schenckii)及其他屬、裴氏著色霉(Fonsecaea pedrosoi)及其他屬、皮炎萬(wàn)氏霉(Wangiella dermatitidis)及其他屬、波氏假阿利什菌( Pseudallescheria boydii)及其他屬、灰馬杜拉分枝菌(Madurella grisea)及其他屬、根霉屬(Rhizopus species)、犁頭霉屬(Absidia species)以及毛霉菌屬(Mucor species)的抗原。朊病毒病抗原的實(shí)例包括PrP、β -淀粉樣蛋白以及其他朊病毒相關(guān)蛋白。除了上文提及的感染原和寄生蟲(chóng)原外，所需的對(duì)非感染性原的增強(qiáng)免疫原性的另一領(lǐng)域?yàn)樵鲋钞惓?dysproliferative)疾病領(lǐng)域,包括但不限于癌癥,其中表達(dá)癌抗原的細(xì)胞有利地從體內(nèi)消除?？捎糜诒景l(fā)明的組合物和方法中的腫瘤抗原包括但不限前列腺特異性抗原(PSA)、乳腺、膀胱、卵巢、睪丸、黑素瘤、端粒酶；多藥抗性蛋白，諸如P-糖蛋白；MAGE-U α-甲胎蛋白、癌胚抗原、突變體P53、乳頭瘤病毒抗原、神經(jīng)節(jié)苷脂或者黑素瘤或其他腫瘤細(xì)胞的其他含碳水化合物成分。本發(fā)明設(shè)想得自任何類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞的抗原均可用于本文所述的組合物和方法?？乖梢允前┘?xì)胞或從癌細(xì)胞分離的致免疫物質(zhì)，諸如膜蛋白。其包括生存素和端粒酶通用抗原以及睪丸癌抗原的MAGE家族。已證明涉及在自身免疫中并可用于本發(fā)明的方法以誘導(dǎo)耐性的抗原包括但不限于髓鞘堿性蛋白、髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白以及多發(fā)性硬化的蛋白脂質(zhì)蛋白和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的C II膠原蛋白。作為非限制性實(shí)例，抗原可以是感染原諸如HZV-1、EBV、HBV、流感病毒、SARS病毒、痘病毒、瘧疾或HSV的一部分，而需要針對(duì)其的調(diào)動(dòng)強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞)的疫苗。術(shù)語(yǔ)“腫瘤”是指至少一個(gè)細(xì)胞或組織贅生物形式的細(xì)胞團(tuán)塊，尤其是內(nèi)源性組織的自發(fā)、自主和不可逆的或多或少脫抑制的過(guò)度生長(zhǎng)形式，所述生長(zhǎng)通常與或多或少的特定細(xì)胞和組織功能明顯喪失相關(guān)。此細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)塊通過(guò)自身或通過(guò)宿主生物(如黑素瘤或淋巴瘤)的調(diào)節(jié)機(jī)制在其生長(zhǎng)方面無(wú)有效抑制。腫瘤抗原不僅包括存在于惡性腫瘤細(xì)胞本身中或其上的抗原，還包括存在于腫瘤的基質(zhì)支持組織(包括內(nèi)皮細(xì)胞和其他血管成分)上的抗原。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答”包括受T細(xì)胞協(xié)同刺激的調(diào)節(jié)影響的T細(xì)胞介導(dǎo)的和/或免疫B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。示例性免疫應(yīng)答包括B細(xì)胞應(yīng)答(如抗體產(chǎn)生)、T細(xì)胞應(yīng)答(如細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞毒性)以及細(xì)胞因子應(yīng)答細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)的活化。如本文所用，關(guān)于免疫應(yīng)答的術(shù)語(yǔ)“下調(diào)”包括任何一種或多種免疫應(yīng)答的降低，而關(guān)于免疫應(yīng)答的術(shù)語(yǔ)“上調(diào)”則包括任何一種或多種免疫應(yīng)答的升高。應(yīng)當(dāng)理解，一種類(lèi)型的免疫應(yīng)答的上調(diào)可導(dǎo)致另一種類(lèi)型的免疫應(yīng)答的相應(yīng)下調(diào)。例如，產(chǎn)生某些細(xì)胞因子(如IL-10)的上調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞免疫應(yīng)答的下調(diào)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“協(xié)同刺激受體”包括將協(xié)同刺激信號(hào)傳遞給免疫細(xì)胞的受體，如CD28或IC0S。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抑制性受體”包括將負(fù)信號(hào)傳遞給免疫細(xì)胞的受體。如本文所用，關(guān)于活化的免疫細(xì)胞的術(shù)語(yǔ)“協(xié)同刺激”包括協(xié)同刺激分子提供第二、非活化、受體介導(dǎo)的信號(hào)(“協(xié)同刺激信號(hào)”)的能力，所述信號(hào)誘導(dǎo)增殖或效應(yīng)子功能。例如，協(xié)同刺激信號(hào)可導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌，如在收到了 T細(xì)胞受體介導(dǎo)的信號(hào)的T細(xì)胞中。收到了細(xì)胞受體介導(dǎo)的信號(hào)(如通過(guò)活化受體)的免疫細(xì)胞在本文中稱(chēng)為“活化的免疫細(xì)胞”。通過(guò)抑制性受體轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制性信號(hào)即使協(xié)同刺激受體(諸如CD28或IC0S)不存在于免疫細(xì)胞上時(shí)也可發(fā)生，并因此不只是取決于抑制性受體與協(xié)同刺激受體之間對(duì)協(xié)同刺激分子結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)(Fallarino等(1998) J.Exp.Med.188:205)。抑制性信號(hào)向免疫細(xì)胞的傳遞可導(dǎo)致免疫細(xì)胞無(wú)應(yīng)答性、無(wú)能或程序性細(xì)胞死亡。優(yōu)選地，抑制性信號(hào)的傳遞通過(guò)不涉及細(xì)胞凋亡的機(jī)制運(yùn)行。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞凋亡”包括可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)表征的程序性細(xì)胞死亡。凋亡細(xì)胞死亡可例如通過(guò)細(xì)胞萎縮、膜起泡以及以細(xì)胞壁破壁而終結(jié)的染色質(zhì)凝聚來(lái)表征。發(fā)生細(xì)胞凋亡的細(xì)胞還顯示出核內(nèi)核小體DNA裂解的特征性模式。本文的術(shù)語(yǔ)“自身免疫”或“自身免疫疾病或病癥”是由個(gè)體自身組織引起或針對(duì)個(gè)體自身組織的疾病或失調(diào)，或其共分離(co-segregate)或表現(xiàn),或由其產(chǎn)生的病癥。自身免疫疾病或失調(diào)的實(shí)例包 括但不限于:關(guān)節(jié)炎(類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎諸如急性關(guān)節(jié)炎、慢性類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、急性痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎、慢性炎癥性關(guān)節(jié)炎、退化性關(guān)節(jié)炎、感染性關(guān)節(jié)炎、萊姆關(guān)節(jié)炎、增生性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、椎關(guān)節(jié)炎、幼年型類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)炎(arthritis chronica progrediente)、變形性關(guān)節(jié)炎、原發(fā)慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎(polyarthritis chronica primaria)、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎)、炎癥性增生性皮膚疾病、銀屑病如斑塊型銀屑病、滴狀銀屑病、膿皰型銀屑病和指甲銀屑病、皮炎(包括接觸性皮炎、慢性接觸性皮炎、過(guò)敏性皮炎、過(guò)敏性接觸性皮炎、皰疹樣皮炎和特應(yīng)性皮炎)、X連鎖高IgM綜合征、蕁麻疹如慢性過(guò)敏性蕁麻疹和慢性特發(fā)性蕁麻疹(包括慢性自身免疫性蕁麻疹)、多發(fā)性肌炎/皮肌炎、幼年型皮肌炎、中毒性表皮壞死松解癥、硬皮病(包括系統(tǒng)性硬皮病)、硬化癥諸如系統(tǒng)性硬化癥、多發(fā)性硬化癥(MS)諸如視神經(jīng)脊髓型MS(spino-optical MS)、原發(fā)性進(jìn)展型MS(PPMS)和復(fù)發(fā)緩解型MS(RRMS)、進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥、動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈硬化、播散性硬化和共濟(jì)失調(diào)硬化癥、炎癥性腸道疾病(IBD)(例如克羅恩病、自身免疫介導(dǎo)的胃腸疾病、結(jié)腸炎諸如潰瘍性結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、顯微鏡性結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎、息肉狀結(jié)腸炎、壞死性小腸結(jié)腸炎、和透壁性結(jié)腸炎和自身免疫性炎癥性腸道疾病)、壞疽性膿皮病、結(jié)節(jié)性紅斑、原發(fā)性硬化性膽管炎、表層鞏膜炎、呼吸窘迫綜合征(包括成人或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS))、腦膜炎、全部或部分葡萄膜的炎癥、虹膜炎、脈絡(luò)膜炎、一種自身免疫性血液疾病、、類(lèi)風(fēng)濕性脊柱炎、突發(fā)性聽(tīng)力喪失、IgE介導(dǎo)的疾病諸如過(guò)敏反應(yīng)和過(guò)敏性和特應(yīng)性鼻炎、腦炎諸如拉斯馬森腦炎、和邊緣葉和/或腦干腦炎、葡萄膜炎諸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、顆粒性葡萄膜炎、非顆粒性葡萄膜炎、晶狀體抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎、伴有及不伴有腎病綜合征的腎小球腎炎(GN)諸如慢性或急性腎小球腎炎諸如原發(fā)性GN、免疫介導(dǎo)的GN、膜性GN (膜性腎病)、特發(fā)性膜性GN或特發(fā)性膜性腎病、膜或膜性增生性GN(MPGN)(包括I型和II型)、和快速進(jìn)展性GN、過(guò)敏性疾病、過(guò)敏反應(yīng)、濕疹(包括過(guò)敏性或特應(yīng)性濕疹)、哮喘諸如支氣管哮喘和自身免疫哮喘、涉及T細(xì)胞浸潤(rùn)和慢性炎癥反應(yīng)的病癥、慢性肺部炎性疾病、自身免疫性心肌炎、白細(xì)胞粘附缺陷病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)諸如皮膚紅斑性狼瘡、亞急性皮膚型紅斑狼瘡、新生兒狼瘡綜合征(NLE)、播散性紅斑狼瘡、狼瘡(包括腎炎、腦炎、小兒、非腎性、腎外、盤(pán)狀、脫發(fā))、幼年型(I型)糖尿病(包括小兒胰島素依賴(lài)型糖尿病(IDDM))、成年型糖尿病(II型糖尿病)、自身免疫性糖尿病、特發(fā)性尿崩癥、與細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)性超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫應(yīng)答、結(jié)核病、結(jié)節(jié)病、肉芽腫病(包括淋巴瘤樣肉芽腫病、韋格納氏肉芽腫病)、粒細(xì)胞缺乏癥、血管炎病(包括血管炎(包括大血管炎(包括風(fēng)濕性多肌痛和巨細(xì)胞(大動(dòng)脈炎)動(dòng)脈炎)、中血管炎(包括川崎病和結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎)、顯微鏡下多動(dòng)脈炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管炎、壞死性、皮膚性或過(guò)敏性血管炎、系統(tǒng)性壞死 性血管炎、ANCA相關(guān)性血管炎，諸如變應(yīng)性肉芽腫性血管炎或綜合征(CSS)))、顳動(dòng)脈炎、再生障礙性貧血、自身免疫再生障礙性貧血、庫(kù)氏試驗(yàn)陽(yáng)性貧血、先天性純紅細(xì)胞再生障礙性貧血、溶血性貧血或免疫性溶血性貧血(包括自身免疫性溶血性貧血(AIHA)、惡性貧血(anemia pemiciosa)、阿狄森氏病、純紅細(xì)胞性貧血和再生障礙(PRCA))、第八因子缺乏癥、甲型血友病、自身免疫性中性粒細(xì)胞減少癥、全血細(xì)胞減少癥、白細(xì)胞減少癥、涉及白細(xì)胞滲出的疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病、多器官損傷綜合征諸如繼發(fā)于敗血癥、創(chuàng)傷或出血的那些、抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病、抗腎小球基底膜疾病、抗磷脂抗體綜合征、過(guò)敏性神經(jīng)炎、白塞病、Castleman綜合征、肺出血-腎炎綜合征、雷諾氏綜合征、干燥綜合征、史帝文-強(qiáng)生癥候群、類(lèi)天皰瘡諸如大皰性類(lèi)天皰瘡和皮膚類(lèi)天皰瘡、天皰瘡(包括尋常型天皰瘡、落葉型天皰瘡、天皰瘡粘膜類(lèi)天皰瘡和紅斑型天皰瘡)、自身免疫性多內(nèi)分泌腺病、賴(lài)特病或綜合征、免疫復(fù)合物性腎炎、抗體介導(dǎo)的腎炎、視神經(jīng)脊髓炎、多發(fā)性神經(jīng)病、慢性神經(jīng)病變諸如IgM多發(fā)性神經(jīng)病或IgM介導(dǎo)的神經(jīng)病變、血小板減少(例如，由心肌梗塞患者發(fā)生的)(包括血栓性血小板減少性紫癜(TTP)和自身免疫或免疫介導(dǎo)的血小板減少諸如特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)(包括慢性或急性ITP))、睪丸和卵巢自身免疫疾病(包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎)、原發(fā)性甲狀腺功能減退癥、甲狀旁腺功能減退癥、自身免疫性?xún)?nèi)分泌疾病(包括甲狀腺炎諸如自身免疫性甲狀腺炎)、橋本氏病、慢性甲狀腺炎(橋本甲狀腺炎)；或亞急性甲狀腺炎、自身免疫性甲狀腺疾病、特發(fā)性甲狀腺功能減退癥、格雷夫斯病、多腺體綜合征諸如自身免疫性多腺體綜合征(或腺體內(nèi)分泌綜合征)、副腫瘤綜合征(包括神經(jīng)系統(tǒng)副腫瘤性綜合征諸如蘭伯特-伊頓肌無(wú)力綜合征或伊頓-蘭伯特綜合征)、僵人綜合征、腦脊髓炎諸如過(guò)敏性腦脊髓炎或過(guò)敏型腦脊髓炎和實(shí)驗(yàn)性過(guò)敏性腦脊髓炎(EAE)、重癥肌無(wú)力諸如胸腺瘤相關(guān)重癥肌無(wú)力、小腦變性、神經(jīng)性肌強(qiáng)直、斜視眼陣攣或眼陣攣-肌陣攣綜合征(OMS)、和感覺(jué)神經(jīng)病變、多灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病變、席漢氏綜合征、自身免疫性肝炎、慢性肝炎、狼瘡樣肝炎、巨細(xì)胞肝炎、慢性活動(dòng)性肝炎或自身免疫性慢性活動(dòng)性肝炎、淋巴細(xì)胞性間質(zhì)性肺炎、閉塞性細(xì)支氣管炎(非移植)與NSIP、格林-巴利綜合征、伯杰疾病(IgA腎病)、特發(fā)性IgA腎病、線狀I(lǐng)gA皮膚病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肺硬變、自身免疫性腸病綜合征、脂瀉病、乳糜瀉、口炎性腹瀉(麥膠性腸病)、頑固性口炎性腹瀉、特發(fā)性口炎性腹瀉、冷球蛋白血癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS ;葛雷克氏癥)、冠狀動(dòng)脈疾病、自身免疫性耳部疾病諸如自身免疫性?xún)?nèi)耳病(AGED)、自身免疫性聽(tīng)力損失、眼陣攣-肌陣攣綜合征(OMS)、多軟骨炎諸如難治性或復(fù)發(fā)性多軟骨炎、肺泡蛋白沉積癥、淀粉樣變性、鞏膜炎、一種非癌性原發(fā)性淋巴細(xì)胞增多，一種原發(fā)性淋巴細(xì)胞增多癥(包括單克隆B細(xì)胞淋巴細(xì)胞增多癥(例如，良性單克隆丙種球蛋白病和意義未明的單克隆丙種球蛋白病，MGUS))、周?chē)窠?jīng)病變、副腫瘤綜合征、離子通道病諸如癲癇、偏頭痛、心律不齊、肌肉疾病、耳聾、失明、周期性麻痹、和中樞神經(jīng)系統(tǒng)離子通道病、自閉癥、炎癥性肌病、局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)、內(nèi)分泌性眼病、葡萄膜視網(wǎng)膜炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、自身免疫性血液病、纖維肌痛、多發(fā)性?xún)?nèi)分泌失調(diào)、施密特綜合征、腎上腺炎、胃萎縮、早老性癡呆 、脫髓鞘性疾病諸如自身免疫性脫髓鞘性疾病、糖尿病性腎病、心肌梗塞后綜合征、圓形脫毛癥、CREST綜合征(鈣質(zhì)沉著，雷諾氏現(xiàn)象、食管運(yùn)動(dòng)功能障礙、指硬皮病和毛細(xì)血管擴(kuò)張癥)、男性和女性自身免疫性不育、混合性結(jié)締組織病、恰加斯氏病、風(fēng)濕熱，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、農(nóng)民肺、多形性紅斑、心臟切開(kāi)后綜合征、庫(kù)欣綜合征、養(yǎng)鳥(niǎo)人肺、變應(yīng)性肉芽腫血管炎、良性淋巴細(xì)胞性脈管炎、Alport綜合征、肺泡炎諸如過(guò)敏性肺泡炎及纖維化肺泡炎、間質(zhì)性肺病、輸血反應(yīng)、麻風(fēng)病、痕疾、利什曼病、kypanosomiasis、血吸蟲(chóng)病、蛔蟲(chóng)病、曲霉病、Sampter綜合征、卡普蘭綜合征、登革熱、心內(nèi)膜炎、心內(nèi)膜心肌纖維化、彌漫性肺間質(zhì)纖維化、肺間質(zhì)纖維化、特發(fā)性肺纖維化、囊性纖維化、眼內(nèi)炎、持久性隆起性紅斑(erythema elevatum et diutinum)、胎兒成紅細(xì)胞增多病、嗜酸性筋膜炎、舒爾曼綜合征、Felly綜合征、絲蟲(chóng)病、睫狀體炎諸如慢性睫狀體炎、異色性睫狀體炎、虹膜睫狀體炎或Fuch睫狀體炎、過(guò)敏性紫癜、人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)感染、?？刹《靖腥尽⑿募〔?、阿爾茨海默氏病、細(xì)小病毒感染、風(fēng)疹病毒感染、接種后綜合征、先天性風(fēng)疹感染、EB病毒感染、腮腺炎、Evan綜合征、自身免疫性腺衰竭、西德納姆舞蹈病、鏈球菌感染后腎炎、血栓閉塞性脈管炎、甲狀腺毒癥、脊髓癆、絨膜炎、巨細(xì)胞性多肌痛、內(nèi)分泌性眼疾、慢性過(guò)敏性肺炎、干燥性角結(jié)膜炎、流行性角結(jié)膜炎、特發(fā)性腎病綜合征、微小病變性腎病、良性家族性和缺血-再灌注損傷、視網(wǎng)膜自身免疫性疾病、關(guān)節(jié)炎、支氣管炎、慢性阻塞性氣道疾病、矽肺、口瘡、阿弗他口炎、動(dòng)脈硬化性疾病、aspermiogenese,自身免疫性溶血、Boeck病、冷沉球蛋白血癥、杜普伊特倫攣縮、水晶體過(guò)敏性?xún)?nèi)眼球炎(endophthalmiaphacoanaphyIactica)、過(guò)敏性腸炎(enteritisallergica)、麻風(fēng)結(jié)節(jié)性紅斑、特發(fā)性面神經(jīng)癱瘓、慢性疲勞綜合征、風(fēng)濕性發(fā)熱(febris rheumatica)、Hamman-Rich病、感音神經(jīng)性耳聾、血紅素尿癥發(fā)作(haemoglobinuria paroxysmatica)、性腺機(jī)能減退、區(qū)域性回腸炎(ileitis regionalis)、白細(xì)胞減少、傳染性單核細(xì)胞增多癥、橫貫性脊髓炎、原發(fā)性特發(fā)性粘液水腫、腎病、交感神經(jīng)性眼炎(ophthalmia symphatica)、肉芽腫性睪丸炎(orchitisgranulomatosa)、胰腺炎、急性多神經(jīng)根炎(polyradiculitis acuta)、壞疽性膿皮病、Quervain甲狀腺炎、獲得性脾萎縮、因抗精原細(xì)胞抗體導(dǎo)致的不育、非惡性胸腺瘤、白癜風(fēng)、SCID和EB病毒相關(guān)疾病、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、寄生蟲(chóng)病諸如利什曼蟲(chóng)病、中毒性休克綜合征、食物中毒、涉及T細(xì)胞浸潤(rùn)的病癥、白細(xì)胞粘附缺陷、與細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)性超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫應(yīng)答、涉及白細(xì)胞滲出的疾病、多器官損傷綜合征、抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病、抗腎小球基底膜疾病、過(guò)敏性神經(jīng)炎、自身免疫性多內(nèi)分泌腺病、卵巢炎、原發(fā)性粘液性水腫、自身免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎、風(fēng)濕性疾病、混合性結(jié)締組織病、腎病綜合征、胰島炎、多內(nèi)分泌不良、周?chē)窠?jīng)病變、自身免疫多腺體綜合征I型、成年發(fā)病型特發(fā)性甲狀旁腺功能減退癥(AOIH)、全禿、擴(kuò)張型心肌病、獲得性大皰性表皮松解癥(EBA)、血色沉著病、心肌病、腎病綜合征、原發(fā)性硬化性膽管炎、化膿性鼻竇炎或非化膿性鼻竇炎、急性或慢性鼻竇炎、篩竇、額竇、上頜竇或蝶竇炎、嗜酸性粒細(xì)胞相關(guān)疾病諸如嗜酸性粒細(xì)胞增多、肺嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)癥、嗜酸性粒細(xì)胞增多-肌痛綜合征、呂弗勒氏綜合征、慢性嗜酸性粒細(xì)胞性肺炎、熱帶肺嗜酸性粒細(xì)胞增多、支氣管肺曲霉病、曲霉腫或含嗜酸性粒細(xì)胞的肉芽腫、過(guò)敏性癥、血清陰性脊柱關(guān)節(jié)病、多內(nèi)分泌自身免疫性疾病、硬化性膽管炎、鞏膜、鞏膜外層、慢性皮膚粘膜念珠菌病、Bruton綜合征、嬰兒短暫性低丙種球蛋白血癥、Wiskott-Aldrich綜合征、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、與膠原疾病相關(guān)的自身免疫紊亂、膠原性疾病、風(fēng)濕病、神經(jīng)性疾病、缺血性再灌注障礙、血壓反應(yīng)降低、血管功能障礙、脈管擴(kuò)張(antgiectasis)、組織損傷、心血管缺血、痛覺(jué)過(guò)敏、腦缺血、以及伴隨血管化的疾病、過(guò)敏性超敏反應(yīng)紊亂、腎小球性腎炎、再灌注損傷、心肌或其他組織再灌注損傷、含急性炎癥成分的皮膚病、急性化膿性腦膜炎或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥疾病、眼睛和眼眶炎性疾病、粒細(xì)胞輸注相關(guān)綜合征、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的毒性、急性嚴(yán)重炎癥、慢性頑固性炎癥、腎盂炎、肺硬變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病大動(dòng)脈疾病、子宮內(nèi)膜增生、消化性潰瘍、心瓣炎和子宮內(nèi)膜異位。術(shù)語(yǔ)“癌癥”和“癌性”是指或描述哺乳動(dòng)物中特征通常在于不受調(diào)控的細(xì)胞生長(zhǎng)的生理狀況。癌癥的實(shí)例包括但不限于惡性腫瘤、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。此類(lèi)癌癥的更具體實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和肺鱗癌)、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃癌(包括胃腸癌)、胰腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝惡 性腫瘤和各種類(lèi)型的頭頸癌以及B細(xì)胞淋巴瘤(包括低級(jí)/濾泡非霍奇金淋巴瘤(NHL);小淋巴細(xì)胞性(SL)NHL沖級(jí)/濾泡NHL沖級(jí)彌散性NHL ;高級(jí)免疫母細(xì)胞NHL ;高級(jí)淋巴母細(xì)胞NHL ;高級(jí)小無(wú)裂細(xì)胞NHL ;腫塊性NHL ;套細(xì)胞淋巴瘤；AIDS相關(guān)淋巴瘤；和瓦氏巨球蛋白血癥)；慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL);急性淋巴母細(xì)胞性白血病(ALL);毛細(xì)胞白血??；慢性髓性白血病；多發(fā)性骨髓瘤和移植后淋巴細(xì)胞增殖性疾病(PTLD)。短語(yǔ)“過(guò)敏性疾病”是指涉及過(guò)敏反應(yīng)的疾病。更具體地講，“過(guò)敏性疾病”定義為鑒定了其過(guò)敏原的疾病，其中在暴露于該過(guò)敏原與發(fā)生病理變化之間存在強(qiáng)相關(guān)性，并且其中已證實(shí)該病理變化具有免疫學(xué)機(jī)制。在本文中，免疫學(xué)機(jī)制是指白細(xì)胞對(duì)免疫原刺激表現(xiàn)出免疫應(yīng)答。過(guò)敏原的實(shí)例包括螨蟲(chóng)抗原和花粉抗原。代表性過(guò)敏性疾病包括支氣管哮喘、過(guò)敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎以及花粉和昆蟲(chóng)過(guò)敏。過(guò)敏體質(zhì)是會(huì)由過(guò)敏父母的孩子繼承的遺傳因素。家族過(guò)敏性疾病也稱(chēng)為特應(yīng)性疾病，而致病的遺傳因素為特應(yīng)性體質(zhì)。“特應(yīng)性皮炎”是特應(yīng)性疾病，特別是伴有皮炎癥狀的疾病的一般性術(shù)語(yǔ)。優(yōu)選的實(shí)例包括選自由濕疹、過(guò)敏性鼻炎、枯草熱、蕁麻疹和食物過(guò)敏組成的組的過(guò)敏病癥。過(guò)敏病癥包括濕疹、過(guò)敏性鼻炎、枯草熱、支氣管哮喘、蕁麻疹和食物過(guò)敏以及其他特應(yīng)性病癥?！跋笔侵柑卣髟谟谘装Y、呼吸道變窄以及呼吸道對(duì)吸入物的反應(yīng)性增加的呼吸系統(tǒng)疾病。哮喘較為常見(jiàn)，但不僅僅與特應(yīng)性或過(guò)敏性癥狀相關(guān)。本文的短語(yǔ)“炎性病癥或炎性疾病”包括慢性或急性炎性疾病，包括選自由下列組成的組的疾病或病癥:風(fēng)濕性疾病(包括但不限于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎)、脊椎關(guān)節(jié)病(包括但不限于強(qiáng)直性脊柱炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和賴(lài)特綜合征)、結(jié)晶性關(guān)節(jié)病(包括但不限于痛風(fēng)、假痛風(fēng)、焦磷酸鈣沉著癥)、萊姆病、風(fēng)濕性多肌痛；結(jié)締組織疾病(包括但不限于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥、多肌炎、皮肌炎、干燥綜合征)；血管炎病(包括但不限于結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、韋格納氏肉芽腫病、變應(yīng)性肉芽腫性血管炎)；炎性病癥(包括創(chuàng)傷或局部缺血的結(jié)果、結(jié)節(jié)病)；血管疾病(包括粥樣硬化血管疾病、動(dòng)脈硬化和血管阻塞性疾病(包括但不限于動(dòng)脈硬化、缺血性心臟病、心肌梗塞、中風(fēng)、外周血管疾病)以及血管支架再狹窄)；眼病(包括葡萄膜炎、角膜疾病、虹膜炎、虹膜睫狀體炎和白內(nèi)障)。適合由本發(fā)明治療的術(shù)語(yǔ)“癌癥”包括但不限于惡性腫瘤、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴惡性腫瘤。此類(lèi)癌癥的更具體實(shí)例包括膀胱癌、卵巢癌、黑素瘤、鱗狀細(xì)胞癌、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和肺鱗癌)、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃癌(包括胃腸癌)、胰腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝惡性腫瘤和各種類(lèi)型的頭頸癌以及B細(xì)胞淋巴瘤(包括低級(jí)/濾泡非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴細(xì)胞性(SL)NHL沖級(jí)/濾泡NHL ;中級(jí)彌散性NHL ;高級(jí)免疫母細(xì)胞NHL ;高級(jí)淋巴母細(xì)胞NHL ;高級(jí)小無(wú)裂細(xì)胞NHL ;腫塊性NHL ;套細(xì)胞淋巴瘤；AIDS相關(guān)淋巴瘤；和瓦氏巨球蛋白血癥)；慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL);急性淋巴母細(xì)胞性白血病(ALL);毛細(xì)胞白血??；慢性髓性白血病；和移植后淋巴細(xì)胞增殖性疾病(PTLD)以及與瘢痣病相關(guān)的異常血管增殖、浮腫(諸如與腦瘤相關(guān))和梅格斯綜合征。優(yōu)選地，癌癥選自由下列組成的組:乳腺癌、結(jié)直腸癌、直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、腎細(xì)胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、軟組織肉瘤、卡波西氏肉瘤、良性腫瘤、惡性腫瘤、頭頸癌、黑素瘤、卵巢癌、間皮瘤和多發(fā)性骨髓瘤。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中(參見(jiàn)工作實(shí)施例)，癌癥為早晚期(包括轉(zhuǎn)移性)膀胱癌、卵巢癌或黑素瘤。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥為結(jié)直腸癌。適合由本發(fā)明治療的癌性病癥包括轉(zhuǎn)移癌，其中通過(guò)髓源性抑制細(xì)胞的VISTA表達(dá)抑制抗腫瘤應(yīng)答和抗侵襲免疫應(yīng)答。本發(fā)明的方法尤其適合用于治療血管化腫瘤。本發(fā)明還適于與化療或放療或其他生物療法相結(jié)合來(lái)治療癌癥以及增強(qiáng)它們的活性，即，在其中髓源性抑制細(xì)胞的VISTA表達(dá)抑制抗腫瘤應(yīng)答以及化療或放療或生物療法療效的個(gè)體中。根據(jù)本發(fā)明可使用任何表現(xiàn)出抗癌活性的化療劑。優(yōu)選地，化療劑選自由下列組成的組:烷化劑、抗代謝物、葉酸類(lèi)似物、嘧啶類(lèi)似物、嘌呤類(lèi)似物及相關(guān)抑制劑、長(zhǎng)春花生物堿、表鬼白毒素、抗生素、L-天冬酰胺酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、干擾素、鉬配位復(fù)合物、蒽二酮取代的脲、甲肼衍生物、腎上腺皮質(zhì)抑制劑、腎上腺皮質(zhì)激素、孕酮、雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素和促性腺素釋放激素類(lèi)似物。更優(yōu)選地，化療劑選自由下列組成的組:5_氟尿嘧啶(5-FU)、亞葉酸(LV)、伊立替康、奧沙利鉬、卡培他濱、紫杉醇和多西紫杉醇?？膳c抗VEGF抗體的施用相結(jié)合，以“混合物(cocktail) ”方式施用兩種或更多種化療齊U。一種優(yōu)選的聯(lián)合化療基于氟尿嘧啶，包括5-FU和一種或多種其他化療劑。聯(lián)合化療的合適的給藥方案在本領(lǐng)域中是已知的，并在例如Saltz等(1999)Proc ASCO 18:233a和Douillard等(2000)Lancet355:1041-7中有所描述。生物制品可以是另一種免疫增強(qiáng)劑，諸如抗ro-Ll、ro-L2、CTLA-4抗體和ro-Ll、ro-L2、CTLA-4融合蛋白以及細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子拮抗劑和激動(dòng)劑、激素以及抗抗細(xì)胞因子抗體。取決于結(jié)合到受體的H)-L30R VISTA分子的形式，信號(hào)可以被傳遞(例如，通過(guò)導(dǎo)致受體交聯(lián)的多價(jià)形式的ro-L30R VISTA分子，或通過(guò)結(jié)合到抗原呈遞細(xì)胞上的Fe受體的可溶形式的H)-L30RVISTA)或抑制(例如，通過(guò)可溶、單價(jià)形式的H)-L30R VISTA分子，或使用本領(lǐng)域已知的方法改變以使得不結(jié)合到抗原呈遞細(xì)胞上的Fe受體的可溶形式的PD-L30R VISTA)，例如通過(guò)與活化形式的H)-L30R VISTA分子競(jìng)爭(zhēng)與受體的結(jié)合。然而，存在其中可溶性分子能起刺激作用的情況。各種調(diào)節(jié)劑的作用可使用本文所述的常規(guī)篩選檢測(cè)分析法容易地證實(shí)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“活化受體”包括結(jié)合抗原、復(fù)合抗原(如，在MHC分子的背景下)或抗體的免疫細(xì)胞受體。 此類(lèi)活化受體包括T細(xì)胞受體(TCR)、B細(xì)胞受體(BCR)、細(xì)胞因子受體、LPS受體、互補(bǔ)序列受體和Fe受體。例如，T細(xì)胞受體存在于T細(xì)胞上并與⑶3分子相關(guān)。T細(xì)胞受體在MHC分子的背景下受抗原刺激(以及受多克隆T細(xì)胞活化試劑刺激)。通過(guò)TCR發(fā)生的T細(xì)胞活化導(dǎo)致許多變化，如蛋白磷酸化、膜脂質(zhì)變化、離子流、環(huán)核苷酸改變、RNA轉(zhuǎn)錄變化、蛋白合成變化以及細(xì)胞容積變化。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“B細(xì)胞受體” (BCR)包括存在于B細(xì)胞上的膜Ig(mlg)與其他跨膜多肽(如Iga和IgP)之間的復(fù)合物。mlg的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能通過(guò)寡聚抗原或多聚抗原由受體分子的交聯(lián)觸發(fā)。B細(xì)胞也可通過(guò)抗免疫球蛋白抗體活化。在BCR活化時(shí)，在B細(xì)胞中將發(fā)生許多變化，包括酪氨酸磷酸化。術(shù)語(yǔ)“Fe受體”(FcR)包括免疫球蛋白分子(Ig)的Fe部分的細(xì)胞表面受體。Fe受體存在于許多參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞上。在迄今為止已鑒定的人FcR中，為識(shí)別IgG(命名為Fe Y R)、IgE (Fe ε Rl)、IgA(FcaR)和多聚 IgM/A(Fe μ / a R)的那些。FcR 存在于以下細(xì)胞類(lèi)型中:Fc ε RI (肥大細(xì)胞)、Fc ε R II (許多白細(xì)胞)、Fc a R(中性粒細(xì)胞)和Fe μ a R(腺上皮、肝細(xì)胞)(Hogg, N.(1988) Immunol.Today 9:185-86)。得到廣泛研究的Fe Y R在細(xì)胞免疫防御中處于核心地位，并負(fù)責(zé)刺激自身免疫疾病發(fā)病中涉及到的炎癥和水解酶的介體的釋放(Unkeless, J.C (1988) Annu.Rev.1mmunol.6:251-87) Fe y R 在效應(yīng)細(xì)胞與分泌 Ig的淋巴細(xì)胞之間提供重要的聯(lián)系，因?yàn)榫奘杉?xì)胞/單核細(xì)胞、多形核白細(xì)胞以及自然殺傷(NK)細(xì)胞Fe Y R賦予IgG介導(dǎo)的特異性識(shí)別的元件。人白細(xì)胞具有IgG的至少三個(gè)不同的受體:hFc Y RI (存在于單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞上)、hFc yRII(存在于單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、血小板、可能有B細(xì)胞和K562細(xì)胞系上)以及Fe Y III (存在于NK細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上)。關(guān)于T細(xì)胞，協(xié)同刺激信號(hào)向T細(xì)胞的傳遞涉及不受環(huán)孢菌素A抑制的信號(hào)通路。此外，協(xié)同刺激信號(hào)可在T細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌(如IL-2和/或IL-10)和/或可在T細(xì)胞中防止誘導(dǎo)對(duì)抗原的無(wú)應(yīng)答性、誘導(dǎo)無(wú)能或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抑制性信號(hào)”是指通過(guò)免疫細(xì)胞上的抑制性受體分子傳遞的信號(hào)。這樣的信號(hào)通過(guò)活化受體(如通過(guò)TCR、CD3、BCR或Fe分子)拮抗信號(hào)并可導(dǎo)致例如以下方面的抑制:第二信使產(chǎn)生；增殖；或免疫細(xì)胞中的效應(yīng)子功能，如減弱吞噬作用、減少抗體產(chǎn)生、降低細(xì)胞毒性或使免疫細(xì)胞無(wú)法產(chǎn)生介體(諸如細(xì)胞因子(如IL-2)和/或變應(yīng)性反應(yīng)介體)；或發(fā)展無(wú)能。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“無(wú)應(yīng)答性”包括免疫細(xì)胞對(duì)刺激(例如，通過(guò)活化受體或細(xì)胞因子的刺激)的折射性。無(wú)應(yīng)答性可例如由于暴露于免疫抑制劑或高劑量的抗原而發(fā)生。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“無(wú)能”或“耐受”包括對(duì)活化受體介導(dǎo)的刺激的折射性。這種折射性通常為抗原特異性的，并在停止 暴露于耐受抗原后仍然存在。例如，T細(xì)胞中的無(wú)能(與無(wú)應(yīng)答性相對(duì))的特征在于缺乏細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如IL-2。T細(xì)胞無(wú)能在T細(xì)胞暴露于抗原并在不存在第二信號(hào)(協(xié)同刺激信號(hào))的情況下收到第一信號(hào)(T細(xì)胞受體或CD-3介導(dǎo)的信號(hào))時(shí)發(fā)生。在這些條件下，再次將細(xì)胞暴露于相同的抗原(即便再次暴露在存在協(xié)同刺激分子的情況下發(fā)生)將導(dǎo)致不能產(chǎn)生細(xì)胞因子，并因此不能增殖。然而，無(wú)能T細(xì)胞可發(fā)生對(duì)不相關(guān)抗原的應(yīng)答，并可在用細(xì)胞因子(如IL-2)培養(yǎng)時(shí)增殖。例如,T細(xì)胞無(wú)能也可通過(guò)T淋巴細(xì)胞缺乏IL-2的產(chǎn)生而觀察到，如通過(guò)ELISA或通過(guò)使用指示細(xì)胞系的增殖檢測(cè)分析法測(cè)量?？蛇x地，可使用報(bào)告基因構(gòu)建體。例如，無(wú)能T細(xì)胞不能引發(fā)通過(guò)異源啟動(dòng)子在5’ IL-2基因增強(qiáng)子控制下或通過(guò)可存在于增強(qiáng)子內(nèi)的API序列的多聚體誘導(dǎo)的 IL-2 基因轉(zhuǎn)錄(Kang 等(1992) Science 257:1134)。協(xié)同刺激信號(hào)的調(diào)節(jié)導(dǎo)致免疫細(xì)胞效應(yīng)子功能的調(diào)節(jié)。因此，術(shù)語(yǔ)“PD-L30RVISTA活性”包括H)-L30R VISTA多肽結(jié)合到其天然結(jié)合伴侶的能力、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞協(xié)同刺激性或抑制性信號(hào)的能力以及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的能力。免疫細(xì)胞中抑制性信號(hào)的調(diào)節(jié)導(dǎo)致免疫細(xì)胞增殖和/或免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子受到調(diào)節(jié)。如本文所用，“天然存在的”核酸分子是指具有存在于自然界中的核苷酸序列(例如，編碼天然蛋白)的RNA或DNA分子。如本文所用，“反義”核酸分子包含與編碼蛋白的“有義”核酸互補(bǔ)的核苷酸序列，例如與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補(bǔ)、與mRNA序列互補(bǔ)或與基因的編碼鏈互補(bǔ)。因此，反義核酸分子可通過(guò)氫鍵結(jié)合到有義核酸分子。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“編碼區(qū)”是指包含翻譯成氨基酸殘基的密碼子的核苷酸序列區(qū)域，而術(shù)語(yǔ)“非編碼區(qū)”是指不翻譯成氨基酸的核苷酸序列區(qū)域(例如，5’和3'非翻譯區(qū))。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)其所連接到的另一核酸分子的核酸分子。一種類(lèi)型的載體為“質(zhì)?！?，它是指可向其中連接另外的DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類(lèi)型的載體為病毒載體，其中可將另外的DNA片段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在它們所引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其他載體(如非附加型哺乳動(dòng)物載體)在引入宿主細(xì)胞中時(shí)整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組，并因而隨宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)它們有效連接的基因的表達(dá)。此類(lèi)載體在本文稱(chēng)為“重組表達(dá)載體”或簡(jiǎn)稱(chēng)為“表達(dá)載體”。一般來(lái)講，在重組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體通常為質(zhì)粒的形式。在本說(shuō)明書(shū)中，“質(zhì)粒”和“載體”可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明旨在包括此類(lèi)發(fā)揮等同功能的其他形式的表達(dá)載體，諸如病毒載體(如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”意指已向其中引入了本發(fā)明的核酸分子諸如本發(fā)明的重組表達(dá)載體的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”可在本文互換使用。應(yīng)當(dāng)理解，此類(lèi)術(shù)語(yǔ)不僅指代特定的受試者細(xì)胞，還指代這樣的細(xì)胞的子代或潛在子代。由于某些修飾可能會(huì)因突變或環(huán)境影響而在后代中發(fā)生，因此這種子代事實(shí)上可以不與親代細(xì)胞相同，但仍包括在如本文所用的術(shù)語(yǔ)的范圍內(nèi)。如本文所用，“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”是指其中動(dòng)物細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)包含“轉(zhuǎn)基因”的非人動(dòng)物，優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地為小鼠。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”是指整合進(jìn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物發(fā)育細(xì)胞的基因組中并保留在成熟動(dòng)物基因組中的外源DNA，例如指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物一種或多種細(xì)胞類(lèi)型或組織中所編碼基因產(chǎn)物的表達(dá)。如本文所用，“同源重組動(dòng)物”是指一種類(lèi)型的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地為小鼠，其中內(nèi)源性基因已通過(guò)內(nèi)源性基因與動(dòng)物發(fā)育前引入動(dòng)物細(xì)胞(例如動(dòng)物胚胎細(xì)胞)中的外源性DNA分子之間的同源重組而改變。如本文所用，“分離的蛋白”是指當(dāng)從細(xì)胞中分離或通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生時(shí)基本上不含其他蛋白、細(xì)胞物質(zhì)和培養(yǎng)基的蛋白或當(dāng)通過(guò)化學(xué)方法合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)的蛋白?！胺蛛x的”或“純化的”蛋白或其生物活性部分基本上不含H)-L30R VISTA蛋白所來(lái)源的細(xì)胞或組織源中的細(xì)胞物質(zhì)或其他污染蛋白，或當(dāng)通過(guò)化學(xué)方法合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)。用語(yǔ)“基本上不含細(xì)胞物質(zhì)”包括這樣的ro-L30R VISTA蛋白制品，其中該蛋白與其從中分離的細(xì)胞的細(xì)胞成分相分離或通過(guò)重組法產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，用語(yǔ)“基本上不含細(xì)胞物質(zhì)”包括具有低于約30%(按干重計(jì))非H)-L30R VISTA蛋白(在本文也稱(chēng)為“污染蛋白”)，更優(yōu)選地低于約20%非H)-L30R VISTA蛋白，還更優(yōu)選地低于約10%非PD-L30R VISTA蛋白以及最優(yōu)選地低于約5%非PD-L30RVISTA蛋白的PD-L30RVISTA蛋白制品。當(dāng)H)-L30R VISTA蛋白或其生物活性部分通過(guò)重組法產(chǎn)生時(shí)，還優(yōu)選的是基本上不含培養(yǎng)基，即，培養(yǎng)基占蛋白制品的體積小于約20%，更優(yōu)選地小于約10%以及最優(yōu)選地小于約5%。用語(yǔ)“基本上不含化學(xué)前 體或其他化學(xué)物質(zhì)”包括其中將蛋白與蛋白合成中涉及到的化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)相分離的H)-L30RVISTA蛋白制品。在一個(gè)實(shí)施方案中，用語(yǔ)“基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)”包括具有低于約30%(按干重計(jì))化學(xué)前體或非PD-L30R VISTA化學(xué)物質(zhì)，更優(yōu)選地低于約20%化學(xué)前體或非H)-L30RVISTA化學(xué)物質(zhì)，還更優(yōu)選地低于約10%化學(xué)前體或非ro-L30RVISTA化學(xué)物質(zhì)以及最優(yōu)選地低于約5%化學(xué)前體或非H)-L30RVISTA化學(xué)物質(zhì)的H)-L30R VISTA蛋白制劑。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”包括抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡(jiǎn)稱(chēng)為“抗體部分”)以及整個(gè)抗體分子。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合部分”是指保留特異性結(jié)合到抗原(如PD-L30R VISTA)的能力的抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。已表明，抗體的抗原結(jié)合功能可通過(guò)全長(zhǎng)抗體的片段執(zhí)行。術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”所涵蓋的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)Fab片段，其為由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii) F (ab’)2片段，其為包含由鉸鏈區(qū)的二硫橋連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(V) dAb片段(Ward等(1989) Nature341:544-546)，其由VH結(jié)構(gòu)域組成；以及(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)。此外，雖然Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域VL和VH由單獨(dú)的基因編碼，但是它們可通過(guò)合成接頭使用重組方法而接合，所述合成接頭使得它們能夠制備成單條蛋白鏈，其中VL和VH區(qū)配對(duì)形成單價(jià)分子(稱(chēng)為單鏈 Fv(scFv);參見(jiàn)例如 Bird 等(1988) Science 242:423-426 ;Huston 等(1988)ProcNatl.Acad.Sc1.USA 85:5879-5883 ；以及 Osbourn 等 1998Nat.Biotechnol.16:778)。此類(lèi)單鏈抗體也旨在包括在術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”的范圍內(nèi)。特定scFv的任何VH和VL序列均可連接到人免疫球蛋白恒定區(qū)cDNA或基因組序列，以便生成編碼完整IgG分子或其他同種型的表達(dá)載體。VH和Vl也可使用蛋白化學(xué)或重組DNA技術(shù)用于生成Fab、Fv或免疫球蛋白的其他片段。其他形式的單鏈抗體，諸如雙體也包括在內(nèi)。雙體是二價(jià)雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域在單條多肽鏈上表達(dá)，但使用太短而不能在同一鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的接頭，從而迫使這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)并形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見(jiàn)例如 Holliger, P.等(1993)Proc Natl.Acad.Sc1.USA 90:6444-6448 ；Poljak, R.J.等(1994) Structure 2:1121-1123)。更進(jìn)一步地，抗體或其抗原結(jié)合部分可以是通過(guò)抗體或抗體部分與一個(gè)或多個(gè)其他蛋白或肽的共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合而形成的更大免疫粘附分子的一部分。此類(lèi)免疫粘附分子的實(shí)例包括使用鏈霉親和素核心區(qū)制備四聚scFv分子(Kipriyanov, S.M.等(1995)Hum.AntibodiesHybridomas 6:93-101)以及使用半胱氨 酸殘基、標(biāo)記肽和C端多組氨酸標(biāo)簽制備二價(jià)和生物素化 scFv 分子(Kipriyanov, S.Μ.等(1994)Mol Immunol.31:1047-1058)。諸如Fab和F(ab’) 2片段的抗體部分可由整個(gè)抗體使用常規(guī)技術(shù)(諸如分別通過(guò)整個(gè)抗體的木瓜酶或胃蛋白酶消化)制成。此外，抗體、抗體部分和免疫粘附分子可使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)獲得，如本文所述?？贵w可以是多克隆或單克隆的；異種的、同種異體的或同基因的；或其修飾形式，例如人源化的、嵌合的等等。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合或基本上特異性結(jié)合到PD-L30R VISTA分子。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”和“單克隆抗體組合物”是指這樣一組抗體分子，其只含一種能夠與抗原的特定表位免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合位點(diǎn)，而術(shù)語(yǔ)“多克隆抗體”和“多克隆抗體組合物”是指這樣一組抗體分子，其含有多種能夠與特定抗原相互作用的抗原結(jié)合位點(diǎn)。單克隆抗體組合物通常顯示出對(duì)與其發(fā)生免疫反應(yīng)的特定抗原的單一結(jié)合親和力。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”旨在包括通過(guò)具有可變區(qū)和恒定區(qū)的非人細(xì)胞制成的抗體，所述可變區(qū)和恒定區(qū)已發(fā)生改變從而與將通過(guò)人細(xì)胞制備的抗體更加高度相似。例如，通過(guò)改變非人抗體氨基酸序列以整合存在于人種系免疫球蛋白序列中的氨基酸。本發(fā)明的人源化抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(如，通過(guò)體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變或通過(guò)體內(nèi)體細(xì)胞突變所引入的突變)，例如在CDR中。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”還包括這樣的抗體，其中已將衍生自另一種哺乳動(dòng)物物種(諸如小鼠)種系的CDR序列移植到人構(gòu)架序列上。如本文所用的“分離的抗體”意指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如，特異性結(jié)合H)-L30R VISTA的分離的抗體基本上不含與除H)-L30R VISTA以外的抗原特異性結(jié)合的抗體)。此外，分離的抗體可以基本上不含其他細(xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)物質(zhì)?！肮丫刍Y(jié)構(gòu)域”在本文是指當(dāng)連接到VISTA胞外域或其片段時(shí)有利于寡聚化的結(jié)構(gòu)域。所述寡聚化結(jié)構(gòu)域包含自締合α-螺旋，例如亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，其可通過(guò)另外的二硫鍵進(jìn)一步穩(wěn)定。這些結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)為與跨膜的矢量折疊(vectorial folding)相容,這一過(guò)程被認(rèn)為有利于多肽體內(nèi)折疊成功能性結(jié)合蛋白。其實(shí)例在本領(lǐng)域中是已知的，并以舉例的方式包括卷曲GCN4以及C0MP。α -螺旋型卷曲螺旋可能是存在于蛋白中的最廣泛的亞單位寡聚化。相應(yīng)地，卷曲螺旋發(fā)揮許多不同的功能。在轉(zhuǎn)錄活化因子的多個(gè)家族中，例如，短亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)在DNA上布置DNA結(jié)合區(qū)中發(fā)揮著重要作用(Ellenberger等，1992，Cell 71:1223-1237)。卷曲螺旋還用于形成中間絲蛋白的寡聚物。卷曲螺旋蛋白此外似乎還在囊泡和病毒膜融合兩者中發(fā)揮著重要作用(Skehel和Wiley, 1998，Cell95:871-874)。在兩種情況中，嵌入待融合的膜中的疏水序列位于由一束長(zhǎng)α螺旋 構(gòu)成的桿狀復(fù)合體的同一端。此分子排列據(jù)信會(huì)在組裝復(fù)合體以進(jìn)行膜融合時(shí)導(dǎo)致親密的膜并列。卷曲螺旋通常用于控制寡聚化。其存在于許多類(lèi)型的蛋白中，包括轉(zhuǎn)錄因子，諸如但不限于GCN4、病毒融合肽、SNARE復(fù)合體以及某些tRNA合成酶等等。許多長(zhǎng)的卷曲螺旋存在于諸如原肌球蛋白、中間絲蛋白和紡錘極體成分的蛋白中。卷曲螺旋涉及許多α -螺旋，它們圍繞彼此以高度組織化形式(以平行或反平行取向締合)形成超螺旋。但二聚體和三聚體是最常見(jiàn)的。螺旋可以來(lái)自相同的或來(lái)自不同的蛋白。卷曲螺旋由匯合在一起以埋藏它們的疏水縫的組成螺旋形成。由于疏水縫圍繞每個(gè)螺旋扭曲，因此螺旋也繞彼此扭曲成圈，從而埋藏疏水縫并形成超螺旋。它是相鄰螺旋之間側(cè)鏈的特征性交錯(cuò)接合，稱(chēng)為結(jié)節(jié)入洞堆積(knobs-1nto-holes packing),其將結(jié)構(gòu)限定為卷曲螺旋。對(duì)于發(fā)生這種類(lèi)型的相互作用，螺旋不必以相同的方向行進(jìn)，但平行構(gòu)象是最常見(jiàn)的。反平行構(gòu)象在三聚體中非常罕見(jiàn)，在五聚體中未知，但在分子內(nèi)二聚體中更常見(jiàn)，其中兩個(gè)螺旋通常通過(guò)短環(huán)連接。在細(xì)胞外間隙中，異源三聚卷曲螺旋蛋白層粘蛋白在基底膜的形成中起著重要作用。其他實(shí)例為血小板反應(yīng)素和軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)，其中連接了三條(血小板反應(yīng)素I和2)或五條(血小板反應(yīng)素3、4和C0MP)鏈。這些分子具有花束樣外觀，并且它們的寡聚結(jié)構(gòu)的原因可能是C端結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞受體的多價(jià)相互作用。酵母轉(zhuǎn)錄活化因子GCN4是超過(guò)30種已鑒定的含堿性區(qū)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(bZIP)DNA結(jié)合基序的真核蛋白中的I種(Ellenberger等，1992，Cell 71:1223-1237)。bZIP 二聚體是一對(duì)連續(xù)的α螺旋，它們?cè)谄漪然┒?4個(gè)殘基上方形成平行的卷曲螺旋并朝其氨基末端逐漸分開(kāi)以通過(guò)DNA結(jié)合位點(diǎn)的大溝。卷曲螺旋二聚化接口幾乎垂直于DNA軸線取向，從而使復(fù)合體具有字母T外觀。bZIP包含疏水非極性殘基的4-3七肽重復(fù)區(qū)域，這些殘基以平行的α螺旋型卷曲螺旋堆疊在一起(Ellenberger等，1992，Cell71:1223-1237)。二聚體的穩(wěn)定性由以下方面產(chǎn)生:亮氨酸以及七肽重復(fù)區(qū)域a和d位的非極性殘基的并列型堆積(side-by-side packing)以及有限數(shù)量的螺旋內(nèi)和螺旋間鹽橋,如在GCN4亮氨酸拉鏈肽的晶體結(jié)構(gòu)中所示(Ellenberger等，1992，Cell 71:1223-1237)。另一個(gè)實(shí)例為從牛氣管軟骨中作為Mr 52, OOO亞單位的同源三聚體而分離的CMP(母系蛋白-1) (Paulsson和 Heinegard, 1981, Biochem J.197:367-375)，其中每個(gè)亞單位由一個(gè) vffFAl 模塊、單個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域、一個(gè)vWFA2模塊以及跨五個(gè)七肽的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域組成(Kiss等，1989，J.Biol.Chem.264:8126-8134 ；Hauser 和 Paulsson, 1994，J.Biol.Chem.269:25747-25753)。經(jīng)純化的CMP的電子顯微鏡分析顯示出花束樣三聚體結(jié)構(gòu)，其中每個(gè)亞單位形成從對(duì)應(yīng)于卷曲螺旋的共同點(diǎn)顯露出來(lái)的橢圓體(Hauser和Paulsson, 1994，J.Biol.Chem.269:25747-25753) 0母系蛋白-1中的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域已得到了廣泛的研究。三聚體結(jié)構(gòu)在非變性條件下完全還原鏈間二硫鍵后得以保持(Hauser和Paulsson, 1994，J.Biol.Chem.269:25747-25753)。又一個(gè)實(shí)例為軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)。非膠原性糖蛋白COMP最初在膠原中鑒定出(Hedbom 等，1992，J.Biol.Chem.267:6132-6136)。該蛋白為 524kDa的五個(gè)亞單位的同源五聚體，其由一個(gè)N端七肽重復(fù)區(qū)(cc)接著四個(gè)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)域(EF)、七個(gè)鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域(T3)和一個(gè)C端球狀結(jié)構(gòu)域(TC)組成。根據(jù)此結(jié)構(gòu)域的組織化，COMP屬于血小板反應(yīng)素家族。在位置a和d具有優(yōu)先疏水性殘基的七肽重復(fù)區(qū)(abcdefg) η 形成螺旋型卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(Cohen和 ParTy, 1994, Science 263:488-489)。近來(lái)，得到了 COMP的重組五鏈卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(COMPcc)的晶體，并以0.2nm的解析度對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析(Malashkevich 等,1996, Science274:761-765)。術(shù)語(yǔ)“家族”當(dāng)涉及本發(fā)明的多肽和核酸分子時(shí)旨在表示具有共同結(jié)構(gòu)域或基序并具有如本文所定義的充分的氨基酸或核苷酸序列同一性的兩種或更多種多肽或核酸分子。此類(lèi)家族成員可以是天然或非天然存在的，并可來(lái)自相同的或不同的物種。例如，一個(gè)家族可包含第一種人源多肽以及其他不同的人源多肽，或者作為另外一種選擇可包含非人源同系物，如猴多肽。家族成員還可以具有共同的功能特性。例如，本發(fā)明的H)-L30R VISTA多肽的家族優(yōu)選地包含至少一個(gè)“信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域”。如本文所用，“信號(hào)序列”或“信號(hào)肽”包括這樣的肽，其包含約15個(gè)或更多個(gè)出現(xiàn)在分泌性和膜結(jié)合多肽N端的氨基酸并且包含大量的疏水性氨基酸殘基。例如，信號(hào)序列包含至少約10-30個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選地約15-25個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選地約18-20個(gè)氨基酸殘基，甚至更優(yōu)選地約19個(gè)氨基酸殘基，并具有至少約35-65%，優(yōu)選地約38-50%，更優(yōu)選地約40-45%的疏水性氨基酸殘基(如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或苯丙氨酸)。這樣的“信號(hào)序列”在本領(lǐng)域中也稱(chēng)為“信號(hào)肽”，其作用是指導(dǎo)包含這樣的序列的多肽形成脂質(zhì)雙層，并在分泌性和膜結(jié)合多肽中裂解。如下文所述，信號(hào)序列在天然人H)-L30R VISTA的氨基酸序列中得到了鑒定，還在天然小鼠H)-L30R VISTA的氨基酸序列中得到了鑒定。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的H)-L30R VISTA多肽基于“跨膜結(jié)構(gòu)域”的存在而鑒定。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“跨膜結(jié)構(gòu)域”包括長(zhǎng)度為約15個(gè)氨基酸殘基的跨越質(zhì)膜的氨基酸序列。更優(yōu)選地，跨膜結(jié)構(gòu)域包含約至少20、25、30、35、40或45個(gè)氨基酸殘基并跨越質(zhì)膜?？缒そY(jié)構(gòu)域在疏水性殘基中富含， 并通常具有α-螺旋結(jié)構(gòu)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸中的至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多為疏水性的，如亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸或色氨酸?？缒そY(jié)構(gòu)域在例如Zagotta，W.N.等(1996) Annu.Rev.Neurosc1.19:235-263中有所描述，該文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用方式并入本文。TOL3的跨膜結(jié)構(gòu)域區(qū)在本文中進(jìn)行了鑒定(參見(jiàn)例如圖1)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的H)-L30R VISTA分子基于多肽或相應(yīng)核酸分子中“IgC結(jié)構(gòu)域”的不存在以及“IgV結(jié)構(gòu)域”的存在而鑒定。如本文所用，IgV和IgC結(jié)構(gòu)域在本領(lǐng)域中被認(rèn)為是Ig超家族成員結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于具有不同折疊模式(稱(chēng)為Ig折疊)的結(jié)構(gòu)單元。Ig折疊由兩個(gè)β片層的夾心結(jié)構(gòu)構(gòu)成，每個(gè)片層由5-10個(gè)氨基酸的反平行β鏈與大多數(shù)但非全部結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)片層之間的保守二硫鍵組成。Ig、TCR和MHC分子的IgC結(jié)構(gòu)域共有相同類(lèi)型的序列模式并稱(chēng)為Ig超家族內(nèi)的Cl組。其他IgC結(jié)構(gòu)域落在其他組內(nèi)。IgV結(jié)構(gòu)域也共有序列模式并稱(chēng)為V組結(jié)構(gòu)域。IgV結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)于C結(jié)構(gòu)域并形成另外一對(duì)β鏈。構(gòu)成IgV結(jié)構(gòu)域的天然人和鼠ro-L30R VISTA多肽的氨基酸殘基可見(jiàn)于圖1。IgV結(jié)構(gòu)域的存在可能為ro-L30R VISTA結(jié)合到其天然結(jié)合伴侶所必需。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的H)-L30R VISTA分子基于多肽或相應(yīng)核酸分子中“胞外域”的存在而鑒定。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“胞外域”表示從細(xì)胞表面作為尾部延伸的N端氨基酸。本發(fā)明的胞外域包括IgV結(jié)構(gòu)域并可以包括信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域。(參見(jiàn)圖1)。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的H)-L30R VISTA分子基于多肽或相應(yīng)核酸分子中“胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域”的存在而鑒定。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域”表示作為尾部延伸進(jìn)預(yù)計(jì)包含胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的C端氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的H)-L30R VISTA分子包含至少一個(gè)或多個(gè)以下結(jié)構(gòu)域:信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域、IgV結(jié)構(gòu)域、胞外域、跨膜域和胞質(zhì)域。本發(fā)明的分離的多肽，優(yōu)選地為H)-L30R VISTA多肽，具有與SEQ ID N0:2或4或5的氨基酸序列足夠相同的氨基酸序列并由與SEQ ID NO:1或3或其片段或互補(bǔ)序列足夠相同的核苷酸序列編碼。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“足夠相同”是指包含與第二氨基酸或核苷酸序列足夠或最少數(shù)量的相同或等同(如具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基)氨基酸殘基或核苷酸以使得第一和第二氨基酸或核苷酸序列享有共同的結(jié)構(gòu)域或基序和/或共同的功能活性的第一氨基酸或核苷酸殘基。例如，享有共同結(jié)構(gòu)域的氨基酸或核苷酸序列在該結(jié)構(gòu)域的整個(gè)氨基酸序列上具有至少30%、40%或50%的同源性，優(yōu)選地60%的同源性，更優(yōu)選地70%-80%，甚至更優(yōu)選地90-95%的同源性，并包含至少一個(gè)、優(yōu)選兩個(gè)結(jié)構(gòu)域或基序，則在本文中定義為足夠相同。此外，享有至少30%、40%或50%，優(yōu)選地60%，更優(yōu)選地70-80%或90-95%同源性并享有共同功能活性的氨基酸或核苷酸序列在本文中定義為足夠相同。如本文中可以互換使用，“PD-L30R VISTA活性”、“PD-L30RVISTA的生物活性”或“H)-L30R VISTA的功能活性”是指H)-L30RVISTA蛋白、多肽或核酸分子對(duì)H)-L30R VISTA應(yīng)答細(xì)胞或組織或?qū))-L30R VISTA多肽結(jié)合伴侶發(fā)揮的活性，如根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在體內(nèi)或體外測(cè)定。這些活性包括調(diào)節(jié)CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖以及細(xì)胞因子產(chǎn)生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，PD-L30R VISTA活性為直接活性，諸如與H)-L30R VISTA結(jié)合伴侶的締合。如本文所用，“目標(biāo)分子”或“結(jié)合伴侶”是天然的(即，在T細(xì)胞上表達(dá)的)ro-L30RVISTA多肽所結(jié)合或相互作用以便實(shí)現(xiàn)H)-L30R VI STA介導(dǎo)的功能的分子?？蛇x地，PD-L30RVISTA活性為間接活性，諸如H)-L30R VISTA多肽介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)活性。PD-L30R VISTA的生物活性在本文有所描述。例如，本發(fā)明的ro-L30R VISTA多肽以及ro-L30R VISTA激動(dòng)劑或拮抗劑可具有以下活性中的一種或多種:(1)抑制或促進(jìn)CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖，(2)抑制或促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生，(3)用作調(diào)節(jié)性配體，調(diào)節(jié)性配體負(fù)調(diào)節(jié)T細(xì)胞與骨髓源性APC之間的同種相互作用期間的T細(xì)胞應(yīng)答，(4)通過(guò)抑制早期TCR活化并阻止細(xì)胞分裂而負(fù)調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞應(yīng)答，但對(duì)細(xì)胞凋亡具有微弱的直接影響，(5)抑制或促進(jìn)APC與T細(xì)胞之間的同種相互作用期間的抗原特異性T細(xì)胞活化，和/或(6)抑制或促進(jìn)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答；(7)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞(如T淋巴細(xì)胞)的活化，以及(8)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，如生物體(如小鼠或人生物體)的炎性免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案的特征在于調(diào)節(jié)一種或多種H)-L30R VISTA活性的分離的ro-L30R VISTA蛋白和多肽。這些多肽將包括具有以下結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)的H)-L30R VISTA多肽:信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域、IgV結(jié)構(gòu)域、胞外域、跨膜域和胞質(zhì)域，并優(yōu)選地為PD-L30R VISTA 活性。另外優(yōu)選的H)-L30R VISTA多肽可具有至少一個(gè)胞外域以及信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域、IgV結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)，并優(yōu)選地由下述核酸分子編碼，所述核酸分子具有的核苷酸序列在嚴(yán)格雜交條件下雜交到包含本文SEQ ID NO:1或3核苷酸序列的互補(bǔ)序列的核酸分子。示例性分離的人和鼠H)-L30R VISTA cDNA的核苷酸和氨基酸序列以及預(yù)測(cè)的人H)-L30R VISTA多肽的氨基酸序列包含在本文的序列表中。人VISTA或H)-L30R VISTA在T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜篩選中被鑒定為上調(diào)的分子。我們對(duì)從鼠CD4+T細(xì)胞cDNA文庫(kù)中回收的相同的930bp基因產(chǎn)物的表征確認(rèn)了大小和序列。電子延伸序列和結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè)出成熟時(shí)309個(gè)氨基酸的I型跨膜蛋白。其胞外域包含136個(gè)氨基酸的單個(gè)胞外Ig-V結(jié)構(gòu)域，其連接到23個(gè)氨基酸的莖區(qū)、21個(gè)殘基的跨膜片段以及97氨基酸的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。VISTA的胞質(zhì)尾部不含任何信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。通過(guò)VISTA Ig-V結(jié)構(gòu)域的BLAST序列檢索鑒定出B7家 族的I3D-Ll為最接近的進(jìn)化相關(guān)蛋白，其具有邊緣顯著性e值得分。VISTA與B7家族成員H)-L1、PD-L2, B7-H3和B7-H4基于結(jié)構(gòu)的序列比對(duì)突出了在所有Ig-V結(jié)構(gòu)域蛋白中系統(tǒng)性保守的若干氨基酸。本發(fā)明的各個(gè)方面在下面的小節(jié)中進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明:1.PD-L30R VISTA分離的核酸分子本發(fā)明的一個(gè)方面涉及編碼H)-L30R VISTA多肽或其生物活性部分的分離的核酸分子，以及足以用作雜交探針以鑒定編碼ro-L30R VISTA的核酸分子(如ro-L30R VISTAmRNA)的核酸片段以及用作PCR引物以擴(kuò)增或突變H)-L30R VISTA核酸分子的片段。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“核酸分子”旨在包括DNA分子(如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(如mRNA)以及使用核苷酸類(lèi)似物生成的DNA或RNA類(lèi)似物。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但優(yōu)選地為雙鏈DNA。術(shù)語(yǔ)“分離的核酸分子”包括從存在于核酸天然源中的其他核酸分子中分離而得的核酸分子。例如，相對(duì)于基因組DNA，術(shù)語(yǔ)“分離的”包括從基因組DNA與其天然相關(guān)的染色體中分離而得的核酸分子。優(yōu)選地，“分離的”核酸分子不含在該核酸分子所來(lái)源的生物體基因組DNA中天然位于核酸側(cè)翼的序列(即，位于核酸分子5’和3’末端的序列)。例如，在多個(gè)實(shí)施方案中，分離的H)-L30R VISTA核酸分子可包含低于約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb,0.5kb或0.1kb的在該核酸分子所來(lái)源的生物體基因組DNA中天然位于核酸分子側(cè)翼的核苷酸序列。此外，“分離的”核酸分子，諸如cDNA分子，可基本上不含其他細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基(當(dāng)通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí))或基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)(當(dāng)通過(guò)化學(xué)方法合成時(shí))。本發(fā)明的核酸分子，例如具有SEQ ID NO: 1、3的核苷酸序列的核酸分子,或其部分，可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)和本文提供的序列信息分離。使用SEQ ID N0:1或3的核酸序列的全部或一部分作為雜交探針時(shí)，PD-L30R VISTA核酸分子可使用標(biāo)準(zhǔn)雜交和克隆技術(shù)而分離(例如，如在 Sambrook, J.等 Molecular Cloning:A LaboratoryManual.第 2版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold SpringHarbor, N.Y.，1989 中所述)。此外，涵蓋SEQ ID NO: 1、3的全部或一部分的核酸分子，或直系同源體或變體可使用基于SEQ ID NO: 1、2、3、4或5的序列而設(shè)計(jì)的合成寡核苷酸引物通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分尚。本發(fā)明的核酸分子可使用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板以及合適的寡核苷酸引物根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)而擴(kuò)增。如此擴(kuò)增的核酸分子可克隆進(jìn)合適的載體并通過(guò)DNA序列分析而表征。此外，對(duì)應(yīng)于TO-L3核苷酸序列的寡核苷酸可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)而制備，例如使用自動(dòng)化DNA合成儀。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的編碼H)-L30RVISTA的核酸分子包含SEQ ID NO:1或3所不的核苷酸序列，或其片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包括作為SEQ ID NO:1或3所示的核苷酸序列的互補(bǔ)序列或任何這些核苷酸序列的一部分的核酸分子。與SEQ ID NO:1或3所不的核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子為這樣的核酸分子，其與SEQ ID N0:1或3所示的核苷酸序列充分互補(bǔ)，以使得其可分別雜交到SEQ ID NO:1或3所示的核苷酸序列，從而形成穩(wěn)定的復(fù)合體。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的分離的核酸分子包含與SEQID N0:1或3所示的核苷酸序列的整個(gè)長(zhǎng)度至少 約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%,99%或更高程度相同的核苷酸序列，或任何這些核苷酸序列的一部分。此外，本發(fā)明的核酸分子可只包含SEQ ID NO:1或3的核酸序列的一部分，例如可用作探針或引物的片段或編碼H)-L30R VISTA多肽的一部分(例如H)-L30R VISTA多肽的生物活性部分)的片段。通過(guò)克隆人ro-L2基因確定的核苷酸序列允許生成設(shè)計(jì)用于鑒定和/或克隆其他ro-L2家族成員以及得自其他物種的ro-L30R VISTA同系物的探針和引物。探針/引物通常包含基本上純化的寡核苷酸。寡核苷酸通常包含在嚴(yán)格雜交條件下雜交到SEQ ID NO:1或3的有義序列；SEQ ID NO: 1,3的反義序列；或SEQ ID NO:1或3的天然存在的等位變體或突變體的至少約12或15，優(yōu)選約20或25，更優(yōu)選約30、35、40、45、50、55、60、65或75個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含長(zhǎng)度大于約50-100、100-150、150-200,200-250,250-300,300-350,350-400,400-450,450-500,500-550,550-600,600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950 或更多個(gè)核苷酸的核苷酸序列，并在嚴(yán)格雜交條件下雜交到SEQ ID N0:1或3或其互補(bǔ)序列的核酸分子。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含長(zhǎng)度大于約880-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、1100-1150或更多個(gè)核苷酸的核苷酸序列，并在嚴(yán)格雜交條件下雜交到SEQ IDNO:1或3或其互補(bǔ)序列的核酸分子。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含長(zhǎng)度大于約50-100、100-150、150-200、200-250、250-300或更多個(gè)核苷酸的核苷酸序列，并在嚴(yán)格雜交條件下雜交到包含SEQ IDNO:1或3或其互補(bǔ)序列中的編碼區(qū)的核酸分子。在再進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含長(zhǎng)度大于約50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、850-900、900-950或更多個(gè)核苷酸的核苷酸序列，包含構(gòu)成SEQ ID NO:1或3的編碼區(qū)的序列或其互補(bǔ)序列的至少約15個(gè)(即，15個(gè)連續(xù)的)核苷酸，并在嚴(yán)格雜交條件下雜交到包含SEQ ID N0:1或3所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的核酸分子?；赑D-L30R VISTA核苷酸序列的探針可用于檢測(cè)轉(zhuǎn)錄物或編碼相同或同源多肽的基因組序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，探針進(jìn)一步包含連接到其上的標(biāo)簽組，例如，標(biāo)簽組可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子。此類(lèi)探針可用作診斷測(cè)試試劑盒的一部分，以鑒定誤表達(dá)H)-L30R VISTA多肽的細(xì)胞或組織，諸如通過(guò)測(cè)量受試者細(xì)胞樣品中編碼H)-L30R VISTA的核酸的水平，如檢測(cè)H)-L30R VISTA mRNA水平或確定基因組ro_L30RVISTA基因是否已突變或缺失。編碼“PD-L30R VISTA多肽的生物活性部分”的核酸片段可通過(guò)以下方法制備:分離編碼具有TO-L30R VISTA生物活性(如，結(jié)合到其天然結(jié)合伴侶和/或調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性的能力)的多肽的SEQ IDN0:1或3的核苷酸序列的一部分，表達(dá)PD-L30R VISTA多肽的編碼部分(如通過(guò)體外重組表達(dá))，以及評(píng)價(jià)H)-L30R VISTA多肽的編碼部分的活性。本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋下述核酸分子，其與SEQ ID N0:1或3所示的核苷酸序列因遺傳密碼簡(jiǎn)并性而不同并因此編碼與SEQ ID NO:1或3所示的核苷酸序列編碼的那些相同的PD-L30R VISTA多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子具有編碼下述多肽的核苷酸序列，所述多肽具有SEQ ID N0:2、4或5所示的氨基酸序列。除了 SEQ ID NO:1和3所示的H)-L30R VISTA核苷酸序列外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，導(dǎo)致H)-L30R VISTA多肽的氨基酸序列發(fā)生變化的DNA序列多態(tài)性也可存在于種群(例如人種群)中。在H)-L30R VISTA基因中的這種遺傳多態(tài)性可因天然等位變異而存在于種群的個(gè)體之中。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因”和“重組基因”是指包含編碼ro-L30RVISTA多肽，優(yōu)選哺乳動(dòng)物H)-L30R VISTA多肽的開(kāi)放閱讀框的核酸分子，并可進(jìn)一步包含非編碼調(diào)控性序列和內(nèi)含子。人或小鼠ro-L30R VISTA的等位變體包括功能性和非功能性H)-L30R VISTA多肽兩者。功能性等位變體是人或小鼠H)-L30RVISTA多肽的天然存在的氨基酸序列變體，其維持結(jié)合天然H)-L30R VISTA結(jié)合伴侶和/或調(diào)節(jié)CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生以及淋巴細(xì)胞活化的能力。功能性等位變體將通常只含SEQ IDN0:2、4或5的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的保守取代，或多肽非關(guān)鍵區(qū)中非關(guān)鍵殘基的取代、缺失或插入。非功能性等位變體是人或小鼠H)-L30R VISTA多肽的天然存在的氨基酸序列變體，其不具有結(jié)合天然ro-L30R VISTA結(jié)合伴侶和/或調(diào)節(jié)本文所述的任何ro-L30R VISTA活性的能力。非功能性等位變體將通常包含SEQ ID NO:2、4或5的氨基酸序列的非保守取代、缺失或插入或提前截短 ，或多肽的關(guān)鍵殘基或關(guān)鍵區(qū)(如IgV結(jié)構(gòu)域中)的取代、插入或缺失。本發(fā)明進(jìn)一步提供人或小鼠H)-L30R VISTA多肽的非人、非小鼠直系同源體。人或小鼠ro-L30R VISTA多肽的直系同源體是從非人非小鼠生物體中分離而得并具有與本文所公開(kāi)的人和鼠H)-L30RVISTA多肽相同的結(jié)合活性和/或淋巴細(xì)胞活化-調(diào)節(jié)活性以及調(diào)節(jié)CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力的多肽。人或小鼠TO-L3多肽的直系同源體可作為包含與SEQ ID N0:2、4或5基本上相同的氨基酸序列而容易地鑒定。此外，編碼其他PD-L30R VISTA家族成員并因此具有與SEQ IDN0:1或3的PD-L30RVISTA序列不同的核苷酸序列的核酸分子也旨在落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，另一種PD-L30R VISTA cDNA可基于小鼠或人H)-L30R VISTA的核苷酸序列而鑒定。此外，編碼來(lái)自不同物種的TO-L30R VISTA多肽并因此具有與SEQ ID NO:1或3的TO-L30RVISTA序列不同的核苷酸序列的核酸分子也旨在落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，猴H)-L30R VISTA cDNA可基于小鼠或人H)-L30R VISTA的核苷酸序列而鑒定。對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的H)-L30R VISTA cDNA的天然等位變體和同系物的核酸分子可基于它們與本文所公開(kāi)的ro-L2核酸的同源性使用本文所公開(kāi)的CDNA或其部分作為雜交探針根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)在嚴(yán)格雜交條件下分離。對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的H)-L30R VISTA cDNA的天然等位變體和同系物的核酸分子可進(jìn)一步通過(guò)作為H)-L30R VISTA基因?qū)ο嗤娜旧w或基因座作圖而分離。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子為至少15、20、25、30或更多個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并在嚴(yán)格雜交條件下雜交到包含SEQ ID N0:1或3的核苷酸序列的編碼區(qū)的核酸分子。在其他實(shí)施方案中，核酸分子的長(zhǎng)度為至少700、750、800、850、880-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、1100-1150 或更多個(gè)核苷酸。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“在嚴(yán)格條件下雜交”旨在描述彼此顯著相同或同源的核苷酸序列保持彼此雜交所處的雜交和 洗滌條件。優(yōu)選地，該條件使得至少約70%，更優(yōu)選地至少約80%，甚至更優(yōu)選至少約85%或90%彼此相同的序列保持彼此雜交。此類(lèi)嚴(yán)格雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并可見(jiàn)于Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel等編者，John ffiley&Sons, Inc (1995),第2、4和6節(jié)。另外的嚴(yán)格條件可見(jiàn)于MolecularCloning:A Laboratory Manual, Sambrook 等，Cold Spring Harbor Press, Cold SpringHarbor, N.Y.(1989)，第7、9和11章。嚴(yán)格雜交條件的優(yōu)選非限制性實(shí)例包括:在4倍或6倍氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在約65-70°C下雜交(或在4倍SSC加50%甲酰胺中在約42-50°C下雜交)，然后在I倍SSC中在約65-70°C下洗滌一次或多次。嚴(yán)格雜交條件的進(jìn)一步優(yōu)選的非限制實(shí)例包括:在6倍SSC中在45°C雜交，然后在0.2倍SSC、0.1%SDS中在65°C下洗滌一次或多次。高度嚴(yán)格雜交條件的優(yōu)選非限制性實(shí)例包括:在I倍SSC中在約65-70°C雜交(或在I倍SSC加50%甲酰胺中在約42_50°C雜交)，然后在0.3倍SSC中在約65-70°C下洗滌一次或多次。降低的嚴(yán)格雜交條件的優(yōu)選非限制性實(shí)例包括:在4倍或6倍SSC中在約50-60°C下雜交(或在6倍SSC加50%甲酰胺中在約40-45°C下雜交)，然后在2倍SSC中在約50-60°C下洗滌一次或多次。上面列舉的值中間的范圍，如在65-70°C下或在42-50°C下，也旨在包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在雜交和洗滌緩沖液中可以用SSPE(1倍SSPE為 0.15M NaCl、IOmM NaH2P04 和 1.25mM EDTA，pH 7.4)代替 SSC (I 倍 SSC 為 0.15M NaCl 和15mM朽1檬酸鈉)；洗漆在每次完成雜交后進(jìn)行15分鐘。對(duì)于預(yù)期長(zhǎng)度短于50個(gè)堿基對(duì)的雜交體而言，雜交溫度應(yīng)低于雜交體的熔融溫度(Tm)5-10°C，其中Tm根據(jù)以下公式確定:對(duì)于長(zhǎng)度短于18個(gè)堿基對(duì)的雜交體，Tm (°C ) -2 (A+T堿基數(shù))+4 (G+C堿基數(shù))。對(duì)于長(zhǎng)度介于18 和 49 個(gè)堿基對(duì)之間的雜交體，Tm (°C )=81.5+16.6 (1glO [Na+])+0.41 (%G+C) - (600/N)，其中N為雜交體的堿基數(shù)，而[Na+Ι]為雜交緩沖液中鈉離子的濃度(I倍SSC的[Na+]=0.165M)。技術(shù)人員還將認(rèn)識(shí)到，可將另外的試劑加到雜交和/或洗滌緩沖液中以降低核酸分子與膜(例如硝化纖維或尼龍膜)的非特異性雜交，包括但不限于封閉劑(如BSA或硅魚(yú)或鯡魚(yú)精子載體DNA)、洗滌劑(如SDS)、螯合劑(如EDTA)、Ficoll、PVP等。當(dāng)使用尼龍膜時(shí)，具體地講，嚴(yán)格雜交條件的另外優(yōu)選的非限制性實(shí)例為在0.25-0.5M NaH2P04、7%SDS中在約65°C雜交，然后在0.02MNaH2P04、1%SDS中在約65 °C洗滌一次或多次，參見(jiàn)例如Church和 Gilbert (1984) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 81:1991-1995 (或可選地，0.2 倍 SSC, 1%SDS)。優(yōu)選地，本發(fā)明在嚴(yán)格雜交條件下雜交到SEQ ID NO:1或3的序列的分離的核酸分子對(duì)應(yīng)于天然存在的核酸分子。如本文所用，“天然存在的”核酸分子是指具有存在于自然界中的核苷酸序列的RNA或DNA分子(即編碼天然多肽)。除了可存在于種群中的H)-L30R VISTA序列的天然存在的等位變體外，技術(shù)人員將進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到，可通過(guò)突變將變化引入SEQ IDN0:1或3的核苷酸序列，從而導(dǎo)致所編碼的H)-L30R VISTA多肽的氨基酸序列發(fā)生變化，而不改變H)-L30R VISTA多肽的功能能力。例如，可在SEQ ID N0:1或3的序列中進(jìn)行將導(dǎo)致“非必需”氨基酸殘基處的氨基酸取代的核苷酸取代?！胺潜匦琛卑被釟埢强蓮腍)-L30R VISTA的野生型序列(如，SEQ ID N0:2、4或5的序列)中變化而不改變生物活性的殘基，而“必需”氨基酸殘基則為生物活性所必需。例如，在本發(fā)明的H)-L30R VISTA多肽中保守的氨基酸殘基，如那些存在于胞外域中的殘基，預(yù)計(jì)尤其不適合改變。此外，在本發(fā)明的H)-L30R VISTA多肽與H)-L30R VISTA家族的其他成員之間保守的另外氨基酸殘基不大可能適合改變。因此，本發(fā)明的另一方面涉及下述核酸分子，其編碼在對(duì)活性非必需的氨基酸殘基中含有變化的ro-L30R VISTA多肽。此類(lèi)ro-L30R VISTA多肽不同于SEQ ID N0:2、4或5的氨基酸序列，而仍保留生物活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸分子包含編碼多肽的核苷酸序列，其中該多肽含有與SEQ ID N0:2、4或5至少約71%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高程度相同的氨基酸序列。

編碼與SEQ ID N0 :2、4或5的多肽相同的H)-L30R VISTA多肽的分離的核酸分子可通過(guò)以下方式創(chuàng)建:將一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代、添加或缺失引入SEQ ID N0:1或3的核苷酸序列，使得將一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、添加或缺失引入編碼的多肽。突變可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，諸如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變，而引入SEQ ID NO:1或3。優(yōu)選地，在一個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基處進(jìn)行保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中將氨基酸殘基替換為具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族在本領(lǐng)域中已有定義。這些家族包括:具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β -分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，預(yù)測(cè)的H)-L30R VISTA多肽中的非必需氨基酸殘基優(yōu)選地被替換為來(lái)自相同側(cè)鏈家族的另一氨基酸殘基?？蛇x地，在另一個(gè)實(shí)施方案中，突變可沿著PD-L30R VISTA編碼序列的全部或一部分而隨機(jī)弓I入，諸如通過(guò)飽和誘變弓I入，然后可篩選所得突變體的H)-L30RVISTA生物活性，以鑒定保留活性的突變體。在SEQ ID NO:1或3的誘變后，可通過(guò)重組方法表達(dá)編碼的多肽，并可確定多肽的活性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可測(cè)定突變體H)-L30R VISTA多肽以下方面的能力:結(jié)合到天然PD-L30R VISTA結(jié)合伴侶和/或調(diào)節(jié)其活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞活化和/或調(diào)節(jié)生物體免疫應(yīng)答。本發(fā)明的又一個(gè)方面涉及編碼PD-L30R VISTAPD-L30RVISTA OR VISTA融合蛋白的分離的核酸分子。此類(lèi)至少包含有效連接到編碼非H)-L30R VISTA蛋白、多肽或肽的第二核苷酸序列的編碼H)-L30R VISTAPD-L30R VISTA OR VISTA蛋白、多肽或肽的第一核苷酸序列的核酸分子可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制備。除了上述編碼TO-L30R VISTA多肽的核酸分子外，本發(fā)明的另一方面涉及與其反義的分尚的核酸分子?！胺戳x”核酸分子包含與編碼多肽的“有義”核酸互補(bǔ)的核苷酸序列，例如與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補(bǔ)或與mRNA序列互補(bǔ)。因此,反義核酸可通過(guò)氫鍵結(jié)合到有義核酸。反義核酸可與整個(gè)ro-L30R VISTA編碼鏈互補(bǔ)或只與其一部分互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義核酸分子與編碼H)-L30R VISTA的核苷酸序列的編碼鏈的“編碼區(qū)”反義。術(shù)語(yǔ)“編碼區(qū)”是指包含翻譯成氨基酸殘基的密碼子的核苷酸序列區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義核酸分子與編碼ro-L的核苷酸序列的編碼鏈的“非編碼區(qū)”反義。術(shù)語(yǔ)“非編碼區(qū)”是指不翻譯成氨基酸的位于編碼區(qū)側(cè)翼的5’和3’序列(也稱(chēng)為5’和3'非翻譯區(qū))。給定編碼本文所公開(kāi)的人或小鼠ro-L30RVISTAro-L30R VISTA OR VISTA的編碼鏈序列，可根據(jù)沃森克里克堿基配對(duì)原則設(shè)計(jì)本發(fā)明的反義核酸。反義核酸分子可與H)-L30R VISTA mRNA的整個(gè)編碼區(qū)互補(bǔ)，但更優(yōu)選地為寡核苷酸，其只與H)-L30R VISTA mRNA的編碼或非編碼區(qū)的一部分反義。例如，反義寡核苷酸可與圍繞H)-L30R VISTA OR VISTA mRNA的反義起始位點(diǎn)的區(qū)域互補(bǔ)。反義寡核苷酸的長(zhǎng)度可以為例如約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個(gè)核苷酸。本發(fā)明的反義核酸分子可使用化學(xué)合成和酶連接反應(yīng)使用本領(lǐng)域已知的步驟構(gòu)建。例如，反義核酸分子(如反義寡核苷酸)可使用天然存在的核苷酸或各種經(jīng)設(shè)計(jì)以增強(qiáng)分子生物穩(wěn)定性或增強(qiáng)反義與有義核酸間形成的雙鏈體物理穩(wěn)定性的修飾核苷酸通過(guò)化學(xué)方法合成，例如，可以使用硫代磷酸衍生物和吖啶取代的核苷酸?？捎糜谏煞戳x核酸的修飾核苷酸的實(shí)例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧、5-(羧羥基甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿卩密唳、二氫尿卩密唳、β -D-半乳糖基Q核苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6_異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥(niǎo)嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥(niǎo)嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥(niǎo)嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥(niǎo)嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫脲卩密唳、β -D-甘露糖基Q核苷(beta-D-mannosylqueosine)、5’ -甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(V)、wybutoxosine、假尿卩密唳、Q核苷(queosine)、2_巰基胞卩密唳、5-甲基_2_硫尿卩密唳、2_硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基脲嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(V)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3_氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤?？蛇x地，反義核酸可使用已按反義取向(即，從插入的核酸轉(zhuǎn)錄的RNA將具有與所關(guān)注的靶核酸的反義取向，這將在下面的小節(jié)中進(jìn)一步描述) 將核酸亞克隆進(jìn)其中的表達(dá)載體通過(guò)生物學(xué)方法產(chǎn)生。
本發(fā)明的反義核酸分子通常施用給受試者或原位生成，使得它們與編碼ro_L30RVISTAPD-L30R VISTA OR VISTA多肽的細(xì)胞mRNA和/或基因組DNA雜交或與之結(jié)合，從而抑制多肽的表達(dá)，例如通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。雜交可以通過(guò)常規(guī)核苷酸互補(bǔ)性以形成穩(wěn)定雙鏈體，或例如，就結(jié)合到DNA雙鏈體的反義核酸分子而言，通過(guò)雙螺旋的大溝中的特定相互作用。施用本發(fā)明的反義核酸分子的途徑的實(shí)例包括在組織部位直接注射。可選地，可對(duì)反義核酸分子進(jìn)行修飾以靶向所選的細(xì)胞，然后進(jìn)行全身性施用。例如，對(duì)于全身施用，可對(duì)反義分子進(jìn)行修飾，使得它們特異性結(jié)合到在所選細(xì)胞表面表達(dá)的受體或抗原，例如通過(guò)將反義核酸分子連到結(jié)合到細(xì)胞表面受體或抗原的肽或抗體。反義核酸分子還可使用本文所述的載體遞送到細(xì)胞。為了實(shí)現(xiàn)反義分子足夠的細(xì)胞內(nèi)濃度，其中在強(qiáng)pol II或pol III啟動(dòng)子的控制下放置核酸分子的載體構(gòu)建體是優(yōu)選的。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義核酸分子為α-異頭物核酸分子。α-異頭物核酸分子與互補(bǔ)的RNA形成特異性雙鏈雜交體，其中與通常的β單元相反，鏈的走向彼此平行(Gaultier 等(1987) NucleicAcids Res.15:6625-6641)。反義核酸分子還可以包含 2，-ο-甲基核糖核苷酸(Inoue 等(1987)Nucleic Acids Res.15:6131-6148)或嵌合RNA-DNA 類(lèi)似物(Inoue 等(1987) FEBS Lett.215:327-330)。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義核酸為核糖酶。核糖酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，它們能夠裂解與其具有互補(bǔ)區(qū)的單鏈核酸，諸如mRNA。因此，核糖酶(如錘頭核糖酶(在Haseloff和Gerlach(1988)Nature 334:585-591中有所描述))可用于催化裂解PD-L30R VISTA mRNA轉(zhuǎn)錄物從而抑制PD-L30R VISTA ORVISTA mRNA的翻譯。具有針對(duì)編碼H)-L30R VISTA的核酸的特異性的核糖酶可基于本文所公開(kāi)的H)-L30R VISTAcDNA的核苷酸序列(即SEQ ID NO:1或3)而設(shè)計(jì)。例如，可構(gòu)建四膜蟲(chóng)L-19IVS RNA的衍生物，其中活性位點(diǎn)的核苷酸序列與編碼ro-L30RVISTAPD-L30R VISTA OR VISTA的mRNA中待裂解的核苷酸序列互補(bǔ)。參見(jiàn)例如Cech等人的美國(guó)專(zhuān)利N0.4，987，071以及Cech等人的美國(guó)專(zhuān)利N0.5，116，742。可選地，PD-L30R VISTA mRNA可用于從RNA分子庫(kù)中選擇具有特定核糖核酸酶活性的催化性RNA。參見(jiàn)例如Bartel, D.和Szostak，J.W.(1993) Science261:1411-1418?？蛇x地，PD-L30R VISTA基因表達(dá)可通過(guò)以下方法抑制:靶向與PD-L30R VISTA的調(diào)節(jié)區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列(例如ro-L30RVISTA啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)以形成防止靶細(xì)胞中PD-L3基因轉(zhuǎn)錄的三螺旋結(jié)構(gòu)。通?？蓞⒁?jiàn)Helene, C(1991)Anticancer DrugDes.6 (6): 569-84 ；Helene, C 等(1992) Ann.N.Y.Acad.Sc1.660: 27-36 ；和 Maher, L.J.(1992)Bioessays 14(12):807-15。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的H)-L30R VISTA核酸分子可在堿基部分、糖部分或磷酸主鏈中修飾，以改善例如分子的穩(wěn)定性、雜交或可溶性。例如，核酸分子的脫氧核糖磷酸主鏈可進(jìn)行修飾以生成肽核酸(參見(jiàn)Hyrup, B.和Nielsen, P.E.(1996)Bioorg.Med.Chem.4 (I): 5-23)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“肽核酸”或“PNA”是指核酸模擬物，如DNA模擬物，其中脫氧核糖磷酸主鏈被偽肽主鏈替換，并且只有四個(gè)天然核堿基得以保留。已表明，PNA的中性主鏈允許在低離子強(qiáng)度條件下特異性雜交到DNA和RNA。PNA寡聚物的合成可使用標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成方案進(jìn)行，如在H yrup和Nielsen (1996)同上和Perry-0’ Keefe等(1996)Proc Natl.Acad.Sc1.USA 93:14670-675 中所述。
PD-L30R VISTA核酸分子的PNA可用于治療和診斷應(yīng)用。例如，PNA可用作反義或有義劑用于序列特異性調(diào)節(jié)基因表達(dá)，例如通過(guò)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄或翻譯阻止或通過(guò)抑制復(fù)制。PD-L30R VISTA核酸分子的PNA還可用于基因中單一堿基對(duì)突變的分析(例如，通過(guò)PNA指導(dǎo)的PCR發(fā)夾技術(shù))；作為與其他酶聯(lián)合使用時(shí)的“人工限制酶”(例如，S I核酸酶(Hyrup和Nielsen (1996)同上))；或作為探針或引物用于DNA測(cè)序或雜交(Hyrup和Nielsen (1996)同上；Perry-0’Keefe 等(1996)同上)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，H)-L30R VISTA的PNA可進(jìn)行修飾(例如以增強(qiáng)它們的穩(wěn)定性或細(xì)胞攝取)，方式是通過(guò)將親脂性或其他輔助基團(tuán)連接到PNA，通過(guò)形成PNA-DNA嵌合體或通過(guò)使用脂質(zhì)體或本領(lǐng)域已知的其他藥物遞送技術(shù)。例如，能生成可結(jié)合PNA和DNA的有利特性的H)-L30R VISTA核酸分子的PNA-DNA嵌合體。此類(lèi)嵌合體允許DNA識(shí)別酶(如RNA酶H和DNA聚合酶)與DNA部分相互作用，同時(shí)PNA部分將提供高結(jié)合親和力和特異性。PNA-DNA嵌合體可使用根據(jù)堿基堆積、核堿基之間的鍵合數(shù)以及取向選擇的合適長(zhǎng)度的連接基連接(Hyrup和Nielsen (1996)同上)。PNA-DNA嵌合體的合成可如Hyrup和Nielsen (1996)同上和Finn P J.^ (1996)Nucleic Acids Res.24 (17): 3357-63 中所述進(jìn)行。例如，DNA鏈可在固相載體上使用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺偶聯(lián)化學(xué)而合成，而修飾的核苷類(lèi)似物，如5’ -(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5’ -脫氧胸苷亞磷酰胺，可用作PNA與DNA 5’末端之間的橋(Mag, Μ.等(1989) Nucleic Acids Res.17:5973-88)。PNA 單體然后按逐步方式偶聯(lián)，以與5’PNA片段和3’DNA片段產(chǎn)生嵌合分子(Finn P.J.等(1996)同上)?？蛇x地，嵌合分子可用 5’ DNA 片段和 3’ PNA 片段合成(Peterser, K.H.等(1975) Bioorganic Med.Chem.Lett.5:1119-11124)。在其他實(shí)施方案中，寡核苷酸可以包含其他附加基團(tuán)，諸如肽(如，用于體內(nèi)靶向宿主細(xì)胞受體)或利于跨細(xì)胞膜(參見(jiàn)例如Letsinger等(1989)Proc Natl.Acad.Sc1.USA86:6553-6556 ；Lemaitre 等(1987) Proc Natl.Acad.Sc1.USA 84:648-652 ；PCT 公開(kāi) N0.WO88/09810)或血腦屏障(參見(jiàn)例如PCT公開(kāi)N0.WO 89/10134)轉(zhuǎn)運(yùn)的試劑。此外，寡核苷酸可用雜交觸發(fā)裂解劑(參見(jiàn)例如Krol等(1988)Biotechniques6:958-976)或嵌入劑(參見(jiàn)例如Zon(1988)Pharm.Res.5:539-549)進(jìn)行修飾。為此，可將寡核苷酸偶聯(lián)到另一分子(如肽、雜交觸發(fā)交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運(yùn)劑或雜交觸發(fā)裂解劑)?？蛇x地，細(xì)胞系或微生物中的內(nèi)源性H)-L30R VISTA基因的表達(dá)特性可通過(guò)以下方式修飾:將異源DNA調(diào)節(jié)元件插入穩(wěn)定細(xì)胞系或克隆微生物的基因組，使得插入的調(diào)節(jié)元件與內(nèi)源性H)-L30RVISTA基因有效連接。例如，通常為“轉(zhuǎn)錄沉默”的內(nèi)源性H)-L30RVISTA基因(即，在細(xì)胞系或微生物中通常不表達(dá)，或僅以非常低的水平表達(dá)的PD-L30R VISTA基因)可通過(guò)以下方式活化:插入能夠促進(jìn)在該細(xì)胞系或微生物中通常所表達(dá)的基因產(chǎn)物進(jìn)行表達(dá)的調(diào)節(jié)元件。可選地，轉(zhuǎn)錄沉默的內(nèi)源性H)-L30R VISTA基因可以通過(guò)插入在所有細(xì)胞類(lèi)型中都有效的混雜調(diào)節(jié)元件。異源性調(diào)節(jié)元件可以使用諸如靶向同源重組的技術(shù)插入穩(wěn)定的細(xì)胞系或克隆的微生物，使得其與內(nèi)源性H)-L30R VISTA基因有效連接，這些技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的并例如在Chappel的美國(guó)專(zhuān)利N0.5，272，071和1991年5月16日公布的PCT公開(kāi)N0.W091/06667中有所描述。I1.分離的 PD-L30R VISTA 多肽和抗 PD-L30R VISTA 抗體
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及分離的TO-L30R VISTA多肽及其生物活性部分以及適合用作免疫原以提高抗H)-L30R VISTA抗體的多肽片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，天然ro-L30RVISTA多肽可通過(guò)合適的純化方案使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白純化技術(shù)從細(xì)胞或組織源中分離而得。在另一個(gè)實(shí)施方案中，H)-L30R VISTA多肽通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。作為重組表達(dá)的另外一種選擇，PD-L30R VISTA蛋白或多肽可使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)通過(guò)化學(xué)方法合成?！胺蛛x的”或“純化的”多肽或其生物活性部分基本上不含H)-L30R VISTA多肽所來(lái)源的細(xì)胞或組織源中的細(xì)胞物質(zhì)或其他污染蛋白，或當(dāng)通過(guò)化學(xué)方法合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)。用語(yǔ)“基本上不含細(xì)胞物質(zhì)”包括這樣的ro-L30R VISTA多肽制品，其中該多肽與從中分離的細(xì)胞的細(xì)胞成分相分離或通過(guò)重組法產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，用語(yǔ)“基本上不含細(xì)胞物質(zhì)”包括具有低于約30%(按干重計(jì))非H)-L30R VISTA蛋白(在本文也稱(chēng)為“污染蛋白”)，更優(yōu)選地低于約20%非H)-L30R VISTA蛋白，還更優(yōu)選地低于約10%非PD-L30R VISTA蛋白以及最優(yōu)選地低于約5%非PD-L30RVISTA蛋白的PD-L30RVISTA多肽制品。當(dāng)H)-L30R VISTA多肽或其生物活性部分通過(guò)重組法產(chǎn)生時(shí)，還優(yōu)選的是基本上不含培養(yǎng)基，即，培養(yǎng)基占蛋白制品的體積小于約20%，更優(yōu)選地小于約10%以及最優(yōu)選地小于約5%。用語(yǔ)“基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)”包括其中將多肽與多肽合成中涉及到的化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)相分離的H)-L30RVISTA多肽制品。在一個(gè)實(shí)施方案中，用語(yǔ)“基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)”包括具有低于約30%(按干重計(jì))化學(xué)前體或非PD-L30R VISTA化學(xué)物質(zhì)，更優(yōu)選地低于約20%化學(xué)前體或非H)-L30RVISTA化學(xué)物質(zhì)，還更優(yōu)選地低于約10%化學(xué)前體或非ro-L30RVISTA化學(xué)物質(zhì)以及最優(yōu)選地低于約5%化學(xué)前體或非H)-L30RVISTA化學(xué)物質(zhì)的H)-L30R VISTA多肽制劑。如本文所用，H)-L30R VISTA多肽的“生物活性部分”包括參與H)-L30R VISTA分子與非TO-L30R VISTA分子(如H)-L30RVISTA的天然配體)之間的相互作用的ro_L30RVISTA多肽片段。H)-L30R VISTA多肽的生物活性部分包括含有以下氨基酸序列的肽，所述序列與H)-L30R VISTA多肽的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2、4或5所示的氨基酸序列)足夠相同或由其衍生而來(lái) ，所述肽包含比全長(zhǎng)H)-L30R VISTA多肽更少的氨基酸并表現(xiàn)出PD-L30RVISTA多肽的至少一種活性。通常，生物活性部分包括具有H)-L30RVISTA多肽的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序，這些活性例如為調(diào)節(jié)(抑制)CD4T細(xì)胞對(duì)抗CD3的增殖應(yīng)答，以抗原特異性方式抑制同種CD4T細(xì)胞的增殖應(yīng)答，作用于特定細(xì)胞因子的表達(dá)等等。PD-L30RVISTA多肽的生物活性部分可以是長(zhǎng)度例如為25、50、75、100、125、150、175、200、225或更多個(gè)氨基酸的多肽。H)-L30RVISTA多肽的生物活性部分可用作開(kāi)發(fā)調(diào)節(jié)ro_L30RVISTA介導(dǎo)的活性(如免疫細(xì)胞活化)的試劑的靶標(biāo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，H)-L30R VISTA多肽的生物活性部分包含胞外域的至少一部分。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的ro-L30R VISTA多肽的優(yōu)選生物活性部分可包含胞外域的至少一部分(例如包含IgV)以及以下結(jié)構(gòu)域中的一者或多者:信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。此外，其中多肽的其他區(qū)域發(fā)生缺失的其他生物活性部分可通過(guò)重組技術(shù)制備，并對(duì)其評(píng)估天然H)-L30R VISTA多肽的一種或多種功能活性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，PD-L30R VISTA多肽具有SEQ IDNO:2、4或5所示的氨基酸序列。在其他實(shí)施方案中，H)-L30RVISTA多肽基本上與SEQ ID N0:2、4或5相同，并保留SEQ ID N0:2、4或5多肽的功能活性，但在氨基酸序列中因天然等位變異或誘變而不同，如上所述。本發(fā)明的核酸和多肽序列可以進(jìn)一步用作“查詢(xún)序列”來(lái)對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，例如用來(lái)鑒定其他家族成員或相關(guān)序列。此類(lèi)檢索可以用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)進(jìn)行。BLAST核苷酸檢索可以用NBLAST程序進(jìn)行，得分=100，字長(zhǎng)=12，以獲得與本發(fā)明的H)-L30R VISTA核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)檢索可以用XBLAST程序進(jìn)行，得分=100，字長(zhǎng)=3，以獲得與本發(fā)明的PD-L30R VISTA多肽分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的空位比對(duì)，可以采用如 Altschul 等(1997)Nucleic Acids Res.25 (17): 3389-3402 所述的空位 BLAST。當(dāng)采用BLAST和空位BLAST程序時(shí)，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。參見(jiàn)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)的互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)站。本發(fā)明還提供H)-L30R VISTA嵌合或融合蛋白。如本文所用，PD-L30R VISTA “嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含有效連接到非ro-L30R VISTA多肽的ro-L30R VISTA多肽。"PD-L30R VISTA多肽”是指具有對(duì)應(yīng)于H)-L30R VISTA分子的氨基酸序列的多肽，而“非PD-L30R VISTA多肽”是指具有對(duì)應(yīng)于與TO-L30R VISTA多肽不基本同源的多肽(例如與PD-L30R VISTA多肽不同并衍生自相同或不同生物體的多肽)的氨基酸序列的多肽。在PD-L30R VISTA融合蛋白內(nèi)，PD-L30R VISTA多肽可對(duì)應(yīng)于TO-L30R VISTA多肽的全部或一部分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，H)-L30R VISTA融合蛋白包含H)-L30R VISTA多肽的至少一個(gè)生物活性部分。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，PD-L30R VISTA融合蛋白包含ro-L30RVISTA多肽的至少兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。在融合蛋白內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“有效連接”旨在表示H)-L30R VISTA多肽以及非H)-L30R VISTA多肽彼此框內(nèi)融合。非H)-L30R VISTA多肽可融合到ro_L30RVISTA多肽的N端或C端，并對(duì) 應(yīng)于改變H)-L30R VISTA多肽的溶解性、結(jié)合親和力、穩(wěn)定性或價(jià)態(tài)的部分。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白為GST-PD-L30R VISTA融合蛋白，其中ro_L30RVISTA序列融合到GST序列的C端。此類(lèi)融合蛋白可有利于重組H)-L30R VISTA的純化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白為在其N(xiāo)端包含異源信號(hào)序列的H)-L30R VISTA多肽。在某些宿主細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞)中，PD-L30R VISTA的表達(dá)和/或分泌可通過(guò)使用異源信號(hào)序列而增強(qiáng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，融合蛋白為Ig_PD-L30R VISTA融合蛋白，其中H)-L30RVISTA序列融合到Ig分子的一部分。融合蛋白的Ig部分可包含免疫球蛋白恒定區(qū)，如人C Y I結(jié)構(gòu)域或C Y 4結(jié)構(gòu)域(例如人IgC Y I或人IgC Y 4的鉸鏈、CH2和CH3區(qū))(參見(jiàn)例如Capon等人的美國(guó)專(zhuān)利N0.5，116，964,5, 580，756,5, 844，095等，它們以引用方式并入本文)。所得的融合蛋白可以具有改變的H)-L30R VISTA溶解性、結(jié)合親和力、穩(wěn)定性和/或價(jià)態(tài)(即，每個(gè)分子的結(jié)合位點(diǎn)數(shù))并可提高蛋白純化的效率。尤其優(yōu)選的H)-L30R VISTA Ig融合蛋白包含偶聯(lián)到免疫球蛋白恒定區(qū)(如Fe區(qū))的H)-L30R VISTA的胞外域部分。免疫球蛋白恒定區(qū)可以包含降低或消除免疫球蛋白結(jié)構(gòu)中固有的效應(yīng)子活性的遺傳修飾。例如，編碼H)-L30R VISTA多肽的胞外域的DNA可接合到編碼通過(guò)定點(diǎn)誘變修飾的人IgG Y I和/或IgG Y 4的鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的DNA，例如，如WO 97/28267中所教導(dǎo)。本發(fā)明的H)-L30R VISTA融合蛋白可摻入到藥物組合物中并體內(nèi)施用給受試者。ro-L30R VISTA融合蛋白可用于影響ro-L30R VISTA結(jié)合伴侶的生物利用率。使用ro-L30R VISTA融合蛋白可在治療學(xué)上用于治療將會(huì)受益于免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的病癥或疾病。此外，本發(fā)明的H)-L30RVISTA融合蛋白可用作免疫原，以在受試者中產(chǎn)生抗H)-L30RVISTA抗體，以純化H)-L30R VISTA結(jié)合蛋白，以及在篩選檢測(cè)分析中鑒定抑制PD-L30R VISTA與其天然結(jié)合伴侶間的相互作用的分子。優(yōu)選地，本發(fā)明的H)-L30R VISTA嵌合或融合蛋白通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及起H)-L30R VISTA激動(dòng)劑(模擬物)或H)-L30RVISTA拮抗劑作用的ro-L30R VISTA多肽的變體。ro-L30R VISTA多肽的變體可通過(guò)誘變生成，例如ro_L30RVISTA多肽的不連續(xù)點(diǎn)突變或截短。H)-L30R VISTA多肽的激動(dòng)劑可保持與天然存在形式的H)-L30R VISTA多肽的生物活性基本上相同或保持所述生物活性的子集。PD-L30R VISTA多肽的拮抗劑可抑制天然存在形式的H)-L30R VISTA多肽的活性中的一種或多種，例如通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性調(diào)節(jié)H)-L30R VISTA多肽的H)-L30R VISTA介導(dǎo)的活性。因此，特定的生物效應(yīng)可通過(guò)用有限功能的變體進(jìn)行治療而引起。在一個(gè)實(shí)施方案中，用具有天然存在形式的多肽的生物活性的子集的變體治療受試者相對(duì)于用天然存在形式的H)-L30R VISTA多肽進(jìn)行治療將在受試者中具有更少的副作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，起H)-L30R VISTA激動(dòng)劑(模擬物)或H)-L30R VISTA拮抗劑作用的ro-L30R VISTA多肽的變體可通過(guò)以下方式鑒定:篩選ro-L30R VISTA多肽變體(如截短變體)的組合文庫(kù)的H)-L30R VISTA多肽激動(dòng)劑或拮抗劑活性。在一個(gè)實(shí)施方案中,PD-L30R VISTA變體的多樣化文庫(kù)(variegated library)通過(guò)核酸水平的組合誘變生成并通過(guò)多樣化基因文庫(kù)編碼。PD-L30R VISTA變體的多樣化文庫(kù)可通過(guò)以下方式產(chǎn)生，例如將合成寡核苷酸的混合物通過(guò)酶法連接到基因序列中，使得潛在H)-L30R VISTA序列的簡(jiǎn)并組可作為單獨(dú)的多肽表達(dá)，或者作為在其中包含H)-L30R VISTA序列的一組的較大融合蛋白組(例如對(duì)于噬菌體展示而言)表達(dá)。有多種方法可用于由簡(jiǎn)并寡核苷酸序列產(chǎn)生潛在H)-L30R VISTA變體的文庫(kù)。簡(jiǎn)并基因序列的化學(xué)合成可在自動(dòng)DNA合成儀中進(jìn)行，且合成基因隨后連接到合適的表達(dá)載體中。使用基因的簡(jiǎn)并組允許在一種混合物中提供編碼所需的潛在H)-L30R VISTA序列組的所有序列。用于合成簡(jiǎn)并寡核苷酸的方法在本領(lǐng)域中是已知的(參見(jiàn)例如 Narang, S.A.(1983)Tetrahedron 39:3 ;Itakura 等(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323 ;Itakura 等(1984)Science 198:1056 ;Ike 等(1983)Nucleic AcidsRes.11:477)。此外，ro-L30R VISTA多肽編碼序列的片段的文庫(kù)可用于生成ro-L30R VISTA片段的多樣化群體，以篩選及隨后選擇H)-L30RVISTA多肽的變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼序列片段的文庫(kù)可通過(guò)以下方法生成:用核酸酶在其中每個(gè)分子只出現(xiàn)大約一次切口的條件下處理H)-L30R VISTA編碼序列的雙鏈PCR片段，使雙鏈DNA變性，使DNA復(fù)性以形成可包含來(lái)自不同的帶切口產(chǎn)物的有義/反義對(duì)的雙鏈DNA，通過(guò)SI核酸酶從重新形成的雙鏈體中移除單鏈部分，以及將所得的片段文庫(kù)連接到表達(dá)載體中。通過(guò)此方法，可衍生出編碼PD-L30R VISTA多肽的各種大小的N端、C端和內(nèi)部片段的表達(dá)文庫(kù)。用于篩選通過(guò)點(diǎn)突變或截短制得的組合文庫(kù)的基因產(chǎn)物以及用于篩選cDNA文庫(kù)中具有所選特性的基因產(chǎn)物的若干技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的。此類(lèi)技術(shù)適于快速篩選通過(guò)PD-L30R VISTA多肽的組合誘變生 成的基因文庫(kù)。適于高通量分析的用于篩選大型基因文庫(kù)的最廣泛使用的技術(shù)通常包括:將基因文庫(kù)克隆進(jìn)可復(fù)制的表達(dá)載體，將合適的細(xì)胞用所得的載體文庫(kù)轉(zhuǎn)化，以及在下述條件下表達(dá)組合基因，其中檢測(cè)所需的活性有利于分離編碼檢測(cè)其產(chǎn)物的基因的載體。遞歸總體誘變(Recursive ensemble mutagenesis,REM)是一種提高文庫(kù)中功能性突變體頻率的新技術(shù)，可與篩選檢測(cè)分析法聯(lián)合使用以鑒定PD-L30R VISTA 突變體(Arkin 和 Youvan(1992)Proc Natl.Acad.Sc1.USA 89:7811-7815 ；Delagrave 等(1993)Protein Eng.6 (3):327-331) 除了只由天然存在的氨基酸組成的H)-L30R VISTA多肽外，還提供了 ro_L30RVISTA擬肽。肽類(lèi)似物通常用于制藥行業(yè)，作為具有與模板肽相似性質(zhì)的非肽類(lèi)藥物。這些類(lèi)型的非肽類(lèi)化合物稱(chēng)為“肽模擬物”或“擬肽”(FauChere，J.(1986)Adv.Drug Res.15:29 ；Veber 和 Freidinger (1985) TINS 第 392 頁(yè)；以及 Evans 等(1987) J.Med.Chem 30:1229，它們以引用方式并入本文)并通常在計(jì)算機(jī)分子建模的輔助下開(kāi)發(fā)。與治療學(xué)上有用的肽結(jié)構(gòu)相似的肽模擬物可用于產(chǎn)生等同的治療或預(yù)防作用。一般來(lái)講，擬肽與范式多肽(即，具有生物學(xué)或藥理學(xué)活性的多肽)諸如人或小鼠H)-L30R VISTA在結(jié)構(gòu)上相似，但具有一個(gè)或多個(gè)可選地被選自由下列組成的組的鍵合代替的肽鍵:-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH.dbd.CH-(順式和反式)、-C0CH2-、-CH(OH) CH2-和-CH2S0-,其中通過(guò)本領(lǐng)域已知的并在以下參考文獻(xiàn)中進(jìn)一步描述的方法進(jìn)行:Spatola, A.F.于ChemistryandBiochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins Weinstein,B., ed., MarcelDekker, New York, p.267 (1983) ；Spatola, A.F., Vega Data (March 1983) ,Vol.1, Issue3，"Peptide Backbone Modifications" ;Morley, J.S.(1980)Trends.Pharm.Sc1.第 463-468 頁(yè)；Hudson, D.等(1979) Int.J.Pept.Prot.Res.14:177-185 (-CH2NH-、CH2CH2-) ；Spatola,A.F.等(1986)Life.Sc1.38:1243-1249 (-CH2-S) ；Hann,M.M.(1982) J.Chem.SoC Perkin.Trans.1 307-314 (-CH-CH-，順式和反式)；Almquist, R.G.等(1980) J.Med.Chem.23:1392-1398 (-C0CH2-) Jennings-White, C 等(1982)Tetrahedron Lett.23:2533 (-C0CH2-) ；Szelke, M.等人的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng) N0.EP45665(1982)CA:97:39405(-CH(OH)CH2-) ；Holladay, M.W.等(1983) Tetrahedron.Lett.24:4401-4404 (-C(0H)CH2-)；以及 Hruby, V.J.(1982) Life Sc1.31:189-199 (-CH2-S-);這些參考文獻(xiàn)的每一份都以引用方式并入本文。尤其優(yōu)選的非肽鍵合為-CH2NH-。此類(lèi)肽模擬物可具有明顯優(yōu)于多肽實(shí)施方案的優(yōu)勢(shì)，包括例如:更經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)、更高的化學(xué)穩(wěn)定性、增強(qiáng)的藥理學(xué)性質(zhì)(半衰期、吸收、效能、功效等)、改變的特異性(例如廣譜生物活性)、降低的抗原性等等。標(biāo)記擬肽通常涉及將一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽直接地或通過(guò)間隔物(如酰胺基)共價(jià)連接到通過(guò)定量結(jié)構(gòu)-活性數(shù)據(jù)和/或分子建模而預(yù)測(cè)的擬肽上的非干擾位置。此類(lèi)非干擾位置通常為與擬肽所結(jié)合的以產(chǎn)生治療效果的大分子不形成直接接觸的位置。擬肽的衍生化(如，標(biāo)記)應(yīng)基本上不干擾擬肽的所需生物學(xué)或藥理學(xué)活性。PD-L30R VISTA氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸用相同類(lèi)型的D-氨基酸進(jìn)行系統(tǒng)性取代(如D-賴(lài)氨酸取代L-賴(lài)氨酸)可用于生成更穩(wěn)定的肽。此外，包含H)-L30R VISTA氨基酸序列或基本上相同的序列變異性的限制性肽可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法生成(Rizo和Gierasch(1992)Annu.Rev.Biochem.61:387,以引用方式并入本文);例如，通過(guò)添加能夠形成使肽環(huán)化的分子內(nèi)二硫橋的內(nèi)部半胱氨酸殘基。本文鑒定的H)-L30R VISTA多肽的氨基酸序列將使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于ro-L30R VISTA肽序列及其序列變體的多肽。此類(lèi)多肽可在原核或真核宿主細(xì)胞中通過(guò)表達(dá)編碼H)-L30RVISTA肽序列(通常為較大多肽的一部分)的多核苷酸而產(chǎn)生。可選地，此類(lèi)多肽可通過(guò)化學(xué)方法合成。在重組宿主中表達(dá)異源多肽、化學(xué)合成多肽以及體外翻譯的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。某些氨基末端和/或羧基末端修飾和/或肽延伸到核心序列可提供有利的物理、化學(xué)、生物化學(xué)和藥理學(xué)特性，諸如:增強(qiáng)的穩(wěn)定性、增強(qiáng)的效能和/或療效、血清蛋白酶抗性、所需的藥動(dòng)學(xué)特性等等。肽可在治療學(xué)上用于治療疾病，例如通過(guò)改變患者中的協(xié)同刺激。分離的H)-L30R VISTA多肽或者其部分或片段可用作免疫原以使用多克隆和單克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)制備技術(shù)生成結(jié)合ro-L30R VISTA的抗體?？墒褂萌L(zhǎng)ro-L30R VISTA多肽，或者可選地，本發(fā)明提供H)-L30R VISTA的抗原肽片段以用作免疫原。在一個(gè)實(shí)施方案中，PD-L30R VISTA的抗原肽包含SEQ ID NO: 2、4或5所示氨基酸殘基的至少8個(gè)氨基酸殘基，并涵蓋H)-L30R VISTA的表位，使得針對(duì)該肽提高的抗體與H)-L30R VISTA多肽形成特異性免疫復(fù)合體。優(yōu)選地，抗原肽包含至少10個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少15個(gè)氨基酸殘基，甚至更優(yōu)選地至少20個(gè)氨基酸殘基，以及最優(yōu)選地至少30個(gè)氨基酸殘基?？乖乃w的優(yōu)選表位是位于多肽胞外域中的H)-L30R VISTA區(qū)域，如，親水區(qū)以及具有高抗原性的區(qū)域。PD-L30R VISTA免疫原通常用于通過(guò)使用該免疫原使合適的受試者(如兔、山羊、小鼠或其他哺乳動(dòng)物)免疫而制備抗體。合適的免疫原性制劑可包含例如重組表達(dá)的PD-L30R VISTA多肽或化學(xué)合成的H)-L30R VISTA多肽。制劑可進(jìn)一步包含佐劑，諸如弗氏完全佐劑或不完全佐劑，或類(lèi)似的免疫刺激劑。用免疫原性H)-L30RVISTA制劑使合適的受試者免疫將誘導(dǎo)多克隆抗ro-L30R VISTA抗體應(yīng)答。

因此，本發(fā)明的另一方面涉及抗H)-L30R VISTA抗體。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，所述分子即包含特異性結(jié)合(與之發(fā)生免疫反應(yīng))抗原(諸如ro-L30R VISTA)的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的實(shí)例包括可通過(guò)用諸如胃蛋白酶的酶處理抗體而生成的F(ab)和F(ab’)2片段。本發(fā)明提供結(jié)合H)-L30R VISTA分子的多克隆和單克隆抗體。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指這樣一組抗體分子，其只含一種能夠與H)-L30RVISTA的特定表位發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。因此，單克隆抗體組合物通常顯示出針對(duì)與其發(fā)生免疫反應(yīng)的特定H)-L30R VISTA多肽的單一結(jié)合親和力。多克隆抗H)-L30R VISTA抗體可如上所述通過(guò)用H)-L30RVISTA免疫原(如PD-L30R VISTA-1g融合蛋白)使合適的受試者免疫而制備。免疫受試者中抗ro_L30RVISTA抗體的滴度可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)隨時(shí)間而監(jiān)測(cè)，諸如通過(guò)使用固定的ro-L30R VISTA的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)。如果需要，可將針對(duì)H)-L30R VISTA的抗體分子從哺乳動(dòng)物中(例如，從血液中)分離，并通過(guò)熟知的技術(shù)諸如蛋白A層析進(jìn)一步純化，以得至IJ IgG組分。在免疫后的合適時(shí)間，例如，當(dāng)抗H)-L30R VISTA抗體滴度最高時(shí)，可從受試者中獲得產(chǎn)抗體的細(xì)胞，并用于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備單克隆抗體，諸如最初由Kohler和 Milstein (1975)Nature 256:495-497 描述的雜交瘤技術(shù)(另見(jiàn) Brown 等(1981)J.1mmunol.127:539-46 ；Brown 等(1980)J.Biol.Chem.255:4980-83 ；Yeh 等(1976)ProcNatl.Acad.Sc1.USA 76:2927-31 ;以及 Yeh 等(1982) Int.J.Cancer 29:269-75)，最近的人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等(1983) Immunol.Today 4:72), EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, Inc.,第 77-96 頁(yè))或三瘤體技術(shù)。產(chǎn)生單克隆抗體雜交瘤的技術(shù)是熟知的(通?？蓞⒁?jiàn)Kenneth, R.H.1nMonoclonal Antibodies:A NewDimension In Biological Analyses, Plenum PublishingCorp.，New York, N.Y.(1980) ；Lemer, E.A.(1981) Yale J.Biol.Med.54:387-402 ；Gefter, M.L.等(1977) Somatic Cell Genet.3:231-36)。簡(jiǎn)而言之，將永生細(xì)胞系(通常為骨髓瘤)融合到得自如上所述用H)-L30R VISTA免疫原免疫的哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞(通常為脾細(xì)胞)，并篩選所得雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液以鑒定產(chǎn)生結(jié)合H)-L30R VISTA的單克隆抗體的雜交瘤。用于融合淋巴細(xì)胞和永生化細(xì)胞系的許多熟知方案的任何一種均適用于生成抗H)-L30R VISTA單克隆抗體的目的(參見(jiàn)例如Galfre，G.等(1977)Nature266:55052 ;Gefter 等(1977)同上；Lemer (1981)同上；和 Kenneth(1980)同上)。此外，普通技術(shù)人員將會(huì)知道此類(lèi)方法存在許多也會(huì)有用的變型形式。通常，永生細(xì)胞系(如，骨髓瘤細(xì)胞系)衍生自與淋巴細(xì)胞相同的哺乳動(dòng)物物種。例如，鼠雜交瘤可通過(guò)將得自用本發(fā)明的免疫原制劑免疫的小鼠的淋巴細(xì)胞與永生化小鼠細(xì)胞系進(jìn)行融合而制備。優(yōu)選的永生細(xì)胞系為對(duì)含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基(“HAT培養(yǎng)基”)敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。多種骨髓瘤細(xì)胞系中的任何一種均可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用作融合伴侶，例如P3-NSl/l-Ag4-l、P3-x63-Ag8.653或Sp2/0_Agl4骨髓瘤細(xì)胞系。這些骨髓瘤細(xì)胞系可得自ATCC0通常，將HAT敏感型小鼠骨髓瘤細(xì)胞使用聚乙二醇(〃PEG〃)融合到小鼠脾細(xì)胞。融合所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞然后使用HAT培養(yǎng)基選擇，該培養(yǎng)基將殺死未融合的以及非生產(chǎn)性融合的雜交瘤細(xì)胞(未融合的脾細(xì)胞在幾天后死亡，因?yàn)樗鼈兾崔D(zhuǎn)化)。生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞通過(guò)例如使用標(biāo)準(zhǔn)ELISA檢測(cè)分析法篩選雜交瘤培養(yǎng)物上清液中結(jié)合H)-L30RVISTA的抗體而檢測(cè)。生產(chǎn)結(jié)合H)-L30R VISTA的抗體的具體方法可使用本領(lǐng)域已知的以及如實(shí)施例中所述的方法實(shí)現(xiàn)。作為制備分泌單克隆抗體的雜交瘤的另外一種選擇，可鑒定單克隆抗PD-L3抗體，并通過(guò)用ro-L30R VISTA篩選重組組合免疫球蛋白文庫(kù)(例如抗體噬菌體展示文庫(kù))而分離，從而分離結(jié)合H)-L30R VISTA的免疫球蛋白文庫(kù)成員。生成和篩選噬菌體展示文庫(kù)的試劑盒可商購(gòu)獲得。如所述，再次篩選這些抗體，以鑒定結(jié)合H)-L30R VISTA的特定表位(如在IgV結(jié)構(gòu)域或其他特定結(jié)構(gòu)域中)的那些抗體和/或選擇對(duì)ro-L30R VISTA蛋白具有高親和力與親合力的抗體。此外，篩選這些抗體以鑒定能在體外和體內(nèi)調(diào)節(jié)H)-L30R VISTA對(duì)免疫力和免疫細(xì)胞的特定功能和作用的那些抗體。例如，可進(jìn)行檢測(cè)分析以確定特定抗ro-L30RVISTA抗體對(duì)由H)-L30R VISTA負(fù)調(diào)節(jié)的免疫功能的調(diào)節(jié)作用(若有)，這些功能包括⑶4+或⑶8+T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子、⑶28協(xié)同刺激、⑶4+T細(xì)胞增殖以及首次接觸試驗(yàn)的和記憶CD4+T細(xì)胞增殖等等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，進(jìn)行檢測(cè)分析以鑒定潛在的治療性抗PD-L30R VISTA抗體，其在體外當(dāng)存在PD-L30R VISTA-1g時(shí)可增強(qiáng)PD-L30R VISTA-1g的抑制作用，因?yàn)檫@些抗H)-L30R VISTA抗體在體內(nèi)的表現(xiàn)相反，S卩，它們是免疫抑制性的。本發(fā)明涵蓋特異性結(jié)合到136個(gè)氨基酸胞外域(如，結(jié)合到氨基酸1-50、50-100、100-136)的抗VISTA抗體及其用途，特異性結(jié)合IgV的抗體，特異性結(jié)合莖區(qū)的抗體，特異性結(jié)合跨膜區(qū)的抗體以及特異性結(jié)合VISTA的胞質(zhì)區(qū)的抗體。 這些特定區(qū)域在本申請(qǐng)中進(jìn)行了鑒定。
另外，可使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制備的包含人和非人部分兩者的重組抗ro_L30RVISTA抗體，諸如嵌合和人源化單克隆抗體，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此類(lèi)嵌合和人源化單克隆抗體可通過(guò)本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)而產(chǎn)生,例如使用Robinson等人的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)N0.PCT/US86/02269 ；Akira等人的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)184，187 ；Taniguchi, M.的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)171, 496 ；Morrison等人的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)173, 494 ；Neuberger等人的PCT國(guó)際公布N0.WO 86/01533 ；Cabilly等人的美國(guó)專(zhuān)利N0.4，816，567 ；Cabilly等人的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)125，023 ;Better 等(1988)Science 240:1041-1043 ;Liu 等(1987)Proc Natl.Acad.Sc1.USA 84:3439-3443 ;Liu 等(1987)J.1mmunol.139:3521-3526 ;Sun 等(1987)Proc Natl.Acad.Sc1.USA 84:214-218 ;Nishimura等(1987)Cancer Res.47:999-1005 ;Wood等(1985)Nature 314:446-449 ;Shaw 等(1988)J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559 ；Morrison, S.L.(1985)Science 229:1202-1207 ;0i 等(1986)Biotechniques 4:214 ；ffinter,美國(guó)專(zhuān)利 N0.5，225，539 Jones 等(1986)Nature 321:552-525 ；Verhoeyen 等(1988)Science239:1534 ;以及 Beidler 等(1988) J.1mmunol.141:4053-4060 中所述的方法?？笻)-L30R VISTA抗體(如單克隆抗體)可用于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離ro_L30RVISTA，諸如親和層析或免疫沉淀。抗H)-L30R VISTA抗體可有利于細(xì)胞中天然ro-L30RVISTA以及宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組產(chǎn)生的H)-L30R VISTA的純化。此外，抗H)-L30R VISTA抗體可用于檢測(cè)H)-L30R VISTA多肽(如，細(xì)胞裂解物或細(xì)胞上清液中)以便評(píng)價(jià)ro-L30RVISTA多肽的豐度和表達(dá)模式?？笻)-L30RVISTA抗體可在診斷學(xué)上用于監(jiān)測(cè)組織中的多肽水平例如作為臨床檢驗(yàn)程序的一部分，以便例如確定給定治療方案的療效。檢測(cè)可通過(guò)將抗體偶聯(lián)(即，物理連接)到可檢測(cè)物質(zhì)而更容易進(jìn)行?？蓹z測(cè)物質(zhì)的實(shí)例包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性材料。合適的酶的實(shí)例包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β -半乳醣苷酶識(shí)別或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物的實(shí)例包括鏈霉親和素/生物素和親和素/生物素；合適的熒光材料的實(shí)例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、二氯三嗪基氨基熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的實(shí)例包括魯米諾；生物發(fā)光材料的實(shí)例包括熒光素酶、蟲(chóng)熒光素和水母發(fā)光蛋白，以及合適的放射性材料包括 1251、1311、35S 或 3H。II1.重組表達(dá)載體和 宿主細(xì)胞本發(fā)明的另一方面涉及包含編碼H)-L30R VISTA多肽的核酸分子(或其部分)的載體，優(yōu)選地為表達(dá)載體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)其所連接到的另一核酸分子的核酸分子。一種類(lèi)型的載體為“質(zhì)粒”，它是指可向其中連接另外的DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類(lèi)型的載體為病毒載體，其中可將另外的DNA片段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在它們所引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其他載體(如非附加型哺乳動(dòng)物載體)在引入宿主細(xì)胞中時(shí)整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組，并因而隨宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)它們有效連接的基因的表達(dá)。此類(lèi)載體在本文稱(chēng)為“表達(dá)載體”。一般來(lái)講，在重組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體通常為質(zhì)粒的形式。在本說(shuō)明書(shū)中，“質(zhì)粒”和“載體”可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明旨在包括此類(lèi)發(fā)揮等同功能的其他形式的表達(dá)載體，諸如病毒載體(如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。本發(fā)明的重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的核酸，其形式適于核酸在宿主細(xì)胞中的表達(dá)，這意味著該重組表達(dá)載體包含一個(gè)或多個(gè)基于將用于表達(dá)的宿主細(xì)胞而選擇的調(diào)控序列，其有效連接到待表達(dá)的核酸序列。在重組表達(dá)載體內(nèi)，“有效連接”旨在表示所關(guān)注的核苷酸序列連接到調(diào)節(jié)序列，其方式允許該核苷酸序列的表達(dá)(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中或?qū)⑤d體引入宿主細(xì)胞時(shí)則在宿主細(xì)胞中)。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)序列”旨在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件(如聚腺苷酸化信號(hào))。此類(lèi)調(diào)節(jié)序列例如在Goeddel (1990) MethodsEnzymol.185:3-7中有所描述。調(diào)節(jié)序列包括在許多類(lèi)型的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列組成型表達(dá)的那些以及只在某些宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的那些(例如，組織特異性調(diào)節(jié)序列)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可取決于諸如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所需的蛋白表達(dá)水平等等因素。本發(fā)明的表達(dá)載體可引入宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生通過(guò)如本文所述的核酸編碼的蛋白或肽(包括融合蛋白或肽)(例如H)-L30R VISTA多肽、PD-L30R VISTA多肽的突變體形式、融合蛋白等等)?？稍O(shè)計(jì)本發(fā)明的重組表達(dá)載體以在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)H)-L30R VTSTA多肽。例如，PD-L30R VTSTA多肽可在細(xì)菌細(xì)胞(諸如大腸桿菌)、昆蟲(chóng)細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。合適的宿主細(xì)胞在Goeddel (1990)同上中有進(jìn)一步討論?？蛇x地，可例如使用T7啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯重組表達(dá)載體。純化的融合蛋白可用于ro-L30RVISTA活性檢測(cè)分析(如下文將詳細(xì)描述的直接檢測(cè)分析或競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)分析)或例如生成H)-L30R VISTA多肽的特異性抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，H)-L30R VISTA表達(dá)載體為酵母表達(dá)載體。在釀酒酵母(S.cerevisiae)中表達(dá)的載體的實(shí)例包括pY印Secl (Baldari等(1987) EMBO J.6:229-234)、pMFa (Kuijan 和 Herskowitz (1982) Cel 130:933-943) > pJRY88 (Schultz 等(1987) Gene54:113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)和 picZ(InvitrogenCorp, SanDiego1Calif.) 0可選地，PD-L30R VISTA多肽可使用桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)?？捎糜谠谂囵B(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如Sf9細(xì)胞)中表達(dá)多肽的桿狀病毒載體包括 pAc 系列(Smith 等(1983)Mol.ell Biol.3:2156-2165)和 pVL 系列(Lucklow 和Summers (1989) Virologyl70:31-39)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸使用哺乳動(dòng)物表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的實(shí)例包括PCDM8 (Seed，B.(1987)Nature 329:840)和 pMT2PC(Kaufman 等(1987)EMBO J.6:187-195) 當(dāng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，表達(dá)載體的控制功能通常由病毒調(diào)節(jié)元件提供。例如，常用的啟動(dòng)子衍生自多瘤病毒、2型腺病毒、巨細(xì)胞病毒和猿猴病毒40。對(duì)于適合原核和真核細(xì)胞兩者的其他表達(dá)系統(tǒng)，參見(jiàn)Sambrook, J.等，Molecular Cloning:ALaboratory Manual.第 2 版，Cold Spring HarborLaboratory, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.，1989 中的第16和17章。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組哺乳動(dòng)物表達(dá)載體能夠指導(dǎo)優(yōu)先在特定細(xì)胞類(lèi)型中的核酸表達(dá)(如，組織特異性調(diào)節(jié)元件用于表達(dá)核酸)。組織特異性調(diào)節(jié)元件在本領(lǐng)域中是已知的。合適的組織特異性啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包括白蛋白啟動(dòng)子(肝特異性；Pinkert 等(1987) Genes Dev.1:268-277)、淋巴特異性啟動(dòng)子(Calame 和 Eaton (1988)Adv.1mmunol.43:235-275)、T 細(xì)胞受體的特定啟動(dòng)子(Winoto 和 Baltimore (1989)EMBO J.8:729-733)和免疫球蛋白(Baneiji 等(1983)Cell33:729-740 ;Queen 和Baltimore (1983)Cell 33:74 1-748)、神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子(如，神經(jīng)絲啟動(dòng)子；Byrne和 Ruddle (1989) Proc Natl.Acad.Sc1.USA 86:5473-5477)、胰腺特異性啟動(dòng)子(Edlund等(1985) SCienCe230:912-916)和乳腺特異性啟動(dòng)子(如乳清啟動(dòng)子；美國(guó)專(zhuān)利N0.4，873，316和歐洲專(zhuān)利公布N0.264，166)。發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子也包括在內(nèi)，例如通過(guò)鼠hox 啟動(dòng)子(Kessel 和 Gruss (1990) Science 249:374-379)和 α-甲胎蛋白啟動(dòng)子(Campes和 Tilghman(1989)Genes Dev.3:537-546)。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含本發(fā)明DNA分子的重組表達(dá)載體，所述分子以反義取向克隆進(jìn)表達(dá)載體。也就是說(shuō)，DNA分子有效連接到調(diào)節(jié)序列，其方式允許H)-L30R VISTA mRNA的反義RNA分子的表達(dá)(通過(guò)DNA分子的轉(zhuǎn)錄)?？蓪?duì)有效連接到以反義取向克隆的核酸分子的調(diào)節(jié)性序列進(jìn)行選擇，其指導(dǎo)多種細(xì)胞類(lèi)型中反義RNA分子的連續(xù)表達(dá)，例如病毒啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，或者可對(duì)調(diào)節(jié)序列進(jìn)行選擇，其指導(dǎo)反義RNA的組成型、組織特異性或細(xì)胞類(lèi)型特異性表達(dá)。反義表達(dá)載體的形式可以為重組質(zhì)粒、噬菌粒和減毒病毒，其中反義核酸分子在高效調(diào)節(jié)區(qū)的控制下產(chǎn)生，其活性可通過(guò)載體所引入的細(xì)胞類(lèi)型而決定。有關(guān)使用反義基因調(diào)節(jié)基因表達(dá)的討論，參見(jiàn)Weintraub, H.等，Antisense RNA as amolecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol.1(I) 1986。本發(fā)明的另一方面涉及將本發(fā)明的H)-L30R VISTA核酸分子引入其中的宿主細(xì)胞，例如重組表達(dá)載體內(nèi)的ro-L30R VISTA核酸分子，或包含允許其同源重組到宿主細(xì)胞基因組特定位點(diǎn)中的序列的H)-L30R VISTA核酸分子。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”可在本文互換使用。應(yīng)當(dāng)理解，此類(lèi)術(shù)語(yǔ)不僅指代特定的受試者細(xì)胞，還指代這樣的細(xì)胞的子代或潛在子代。由于某些修飾可能會(huì)因突變或環(huán)境影響而在后代中發(fā)生，因此這種子代事實(shí)上可以不與親代細(xì)胞相同，但仍包括在如本文所用的術(shù)語(yǔ)的范圍內(nèi)。宿主細(xì)胞可以是任何原核或真核細(xì)胞。載體DNA可通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)引入原核或真核細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”意指多種本領(lǐng)域公認(rèn)的用于將外源核酸(如DNA)引入宿主細(xì)胞的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電穿孔。合適的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的方法 可見(jiàn)于Sambrook等(Molecular Cloning:ALaboratoryManual.第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)以及其他實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)。為了鑒定和選擇這些要素，通常將編碼選擇性標(biāo)記(如抗生素抗性)的基因與所關(guān)注的基因一起引入宿主細(xì)胞。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記包括對(duì)藥物(諸如G418、潮霉素和甲氨蝶呤)賦予抗性的那些。本發(fā)明的宿主細(xì)胞，諸如培養(yǎng)中的原核或真核宿主細(xì)胞，可用于產(chǎn)生(即，表達(dá))PD-L30R VISTA多肽。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供使用本發(fā)明的宿主細(xì)胞產(chǎn)生H)-L30R VISTA多肽的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(已向其中引入了編碼PD-L30R VISTA多肽的重組表達(dá)載體)，使得產(chǎn)生H)-L30R VISTA多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞中分離H)-L30R VISTA多肽。本發(fā)明的宿主細(xì)胞還可用于產(chǎn)生非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞為已向其中引入了 H)-L30R VISTA編碼序列的受精卵或胚胎干細(xì)胞。此類(lèi)宿主細(xì)胞然后可用于創(chuàng)建非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中已將外源H)-L30R VISTA序列引入它們的基因組；或同源重組動(dòng)物，其中已改變了內(nèi)源H)-L30R VISTA序列。此類(lèi)動(dòng)物可用于研究H)-L30R VISTA的功能和/或活性以及用于鑒定和/或評(píng)價(jià)H)-L30R VISTA活性的調(diào)節(jié)因子。如本文所用，“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”是非人動(dòng)物，優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地為嚙齒動(dòng)物諸如大鼠或小鼠，其中動(dòng)物細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)包含轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的其他實(shí)例包括非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、綿羊、狗、牛、山羊、雞、兩棲動(dòng)物等等。轉(zhuǎn)基因是整合進(jìn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物發(fā)育細(xì)胞的基因組中并保留在成熟動(dòng)物基因組中的外源DNA，從而指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一種或多種細(xì)胞類(lèi)型或組織中編碼基因產(chǎn)物的表達(dá)。如本文所用，“同源重組動(dòng)物”是非人動(dòng)物，優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地為小鼠，其中內(nèi)源性H)-L30RVISTA基因已通過(guò)內(nèi)源性基因與動(dòng)物發(fā)育前引入動(dòng)物細(xì)胞(例如動(dòng)物胚胎細(xì)胞)中的外源性DNA分子之間的同源重組而改變。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可通過(guò)以下方式創(chuàng)建:將編碼H)-L30R VISTA的核酸引入受精卵的精核，例如通過(guò)顯微注射、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，然后讓受精卵在假孕雌性暫養(yǎng)動(dòng)物中發(fā)育。SEQ ID N0:1或4的H)-L30R VISTAcDNA序列可作為轉(zhuǎn)基因引入非人動(dòng)物的基因組?？蛇x地，人H)-L30R VISTA基因的非人同系物，諸如猴或大鼠H)-L30R VISTA基因，可用作轉(zhuǎn)基因?？蛇x地，PD-L30R VISTA基因同系物，諸如另一種H)-L30R VISTA家族成員，可基于與SEQ ID NO:1或3的H)-L30RVISTA cDNA序列的雜交而分離(在上文的第I小節(jié)中進(jìn)一步描述)并用作轉(zhuǎn)基因。內(nèi)含子序列和聚腺苷酸化信號(hào)也可包含在轉(zhuǎn)基因中以提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)的效率。組織特異性調(diào)節(jié)序列可有效連接到H)-L30RVISTA轉(zhuǎn)基因以指導(dǎo)H)-L30R VISTA多肽在特定細(xì)胞中的表達(dá)。通過(guò)胚胎操作和顯微注射產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(尤其是諸如小鼠的動(dòng)物)的方法已成為本領(lǐng)域的常規(guī)方法，并例如在Leder等人的美國(guó)專(zhuān)利N0.4，736，866和
4,870, 009、Wagner 等人的美國(guó)專(zhuān)利 N0.4, 873, 191 中以及在 Hogan, B., Manipulating theMouse Embryo, (Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)中有所描述。類(lèi)似的方法用于產(chǎn)生其他轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因創(chuàng)始動(dòng)物可基于H)-L30R VISTA轉(zhuǎn)基因在其基因組中的存在性和/或H)-L30R VISTAmRNA在動(dòng)物組織或細(xì)胞中的表達(dá)而鑒定。轉(zhuǎn)基因創(chuàng)始動(dòng)物然后可 用于繁殖攜帶轉(zhuǎn)基因的另外動(dòng)物。此外，攜帶編碼H)-L30RVISTA多肽的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可進(jìn)一步繁殖成攜帶其他轉(zhuǎn)基因的其他轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。為了創(chuàng)建同源重組動(dòng)物，制備包含H)-L30R VISTA基因至少一部分的載體，已向所述基因中引入了缺失、添加或取代，從而改變例如在功能破壞上ro-L30R VISTA基因。PD-L30R VISTA基因可以是人或鼠基因(如SEQ ID NO:1或3的cDNA)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可產(chǎn)生這樣的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其包含允許轉(zhuǎn)基因的調(diào)節(jié)性表達(dá)的所選系統(tǒng)。這樣的系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例為Pl噬菌體的cre/loxP重組酶系統(tǒng)。有關(guān)cre/1xP 重組酶的描述，參見(jiàn)例如 Lakso 等(1992) Proc Natl.Acad.Sc1.USA 89:6232-6236。重組酶系統(tǒng)的另一個(gè)實(shí)例為釀酒酵母的FLP重組酶系統(tǒng)(O’Gorman等(1991) Science251:1351-1355)。如果將cre/loxP重組酶用于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，則需要包含編碼Cre重組酶和所選多肽兩者的轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物。此類(lèi)動(dòng)物可通過(guò)構(gòu)建“雙”轉(zhuǎn)基因動(dòng)物而提供，例如，通過(guò)交配兩個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，一者含有編碼所選多肽的轉(zhuǎn)基因，另一者包含編碼重組酶的轉(zhuǎn)基因。本文所述的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的克隆也可根據(jù)Wilmut, 1.等(1997)Nature385:810-813以及PCT國(guó)際公布N0.WO 97/07668和W097/07669中所述的方法產(chǎn)生。簡(jiǎn)而言之，可分離得自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞(例如體細(xì)胞)，然后進(jìn)行誘導(dǎo)以退出生長(zhǎng)周期并進(jìn)入GO期。靜止細(xì)胞然后可例如通過(guò)使用電脈沖而融合到得自與分離靜止細(xì)胞相同物種動(dòng)物的去核卵母細(xì)胞。重構(gòu)的卵母細(xì)胞然后進(jìn)行培養(yǎng)，使得發(fā)育到桑椹胚期或胚泡期，然后轉(zhuǎn)移到假孕雌性暫養(yǎng)動(dòng)物中。此雌性暫養(yǎng)動(dòng)物產(chǎn)生的子代將是分離細(xì)胞(如體細(xì)胞)的動(dòng)物的克隆。IV.藥物組合物本發(fā)明的PD-L30R VISTA 分子，如 PD-L30R VISTA 核酸分子、PD-L30R VISTA 多肽片段以及抗H)-L30R VISTA抗體(也稱(chēng)為“活性化合物”或“調(diào)節(jié)劑”)可摻入適合施用的藥物組合物中。此類(lèi)組合物通常包含核酸分子、多肽或抗體以及載體，例如藥學(xué)上可接受的載體。如本文所用，用語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”旨在包括與藥物施用相容的任何和所有溶齊 、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。將此類(lèi)介質(zhì)和試劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)是本領(lǐng)域熟知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容，否則均設(shè)想了其在組合物中的應(yīng)用。還可以向組合物中摻入補(bǔ)充性活性化合物。如所述，此類(lèi)組合物另外可包含所需的抗原(如腫瘤抗原)或另一種免疫調(diào)節(jié)化合物諸如Toll樣受體激動(dòng)劑、I型干擾素諸如α和β干擾素以及CD40激動(dòng)劑諸如激動(dòng)性CD40抗體和抗體片段，優(yōu)選地為抗人CD40激動(dòng)性抗體和抗體片段或其他免疫增強(qiáng)劑或抑制劑諸如ro-Ll、TO-L2、CTLA4融合蛋白及其特異性抗體。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物或基于H)-L30R VISTA的療法可進(jìn)一步包含抗原或其他免疫激動(dòng)劑。當(dāng)存在于組合物或療法中時(shí)，抗原可按結(jié)合其他組分時(shí)能有效產(chǎn)生對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的量施用。例如，抗原可按約100yg/kg至約100mg/kg的量施用。在一些實(shí)施方案中，抗原可按約10yg/kg至約10mg/kg的量施用。在一些實(shí)施方案中，抗原可按約lmg/kg至約5mg/kg的量施用。然而,構(gòu)成產(chǎn)生免疫應(yīng)答有效量的抗原的特定量在一定程度上取決于諸如以下的某些因素，例如所施用的特定抗原；所施用的特定激動(dòng)劑及其量；所施用的特定激動(dòng)劑及其量；免疫系統(tǒng)狀態(tài)；施用激動(dòng)劑和抗原的方法及順序；制劑施用給的物種；以及所需的治療結(jié)果。因此，一般而言，闡述構(gòu)成抗原有效量的量是不實(shí)際的。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可通過(guò)考慮此類(lèi)因素而容易地確定合適的量?？乖梢允悄軌蛱岣逿hl免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)，所述應(yīng)答可以包括例如CD8+T細(xì)胞應(yīng)答、NK T細(xì)胞應(yīng)答、Y/δ T細(xì)胞應(yīng)答或Thl抗體應(yīng)答中的一者或多者。合適的抗原包括但不限于肽、多肽、脂質(zhì)、糖脂、多糖、碳水化合物、多核苷酸、朊病毒、活或滅活細(xì)菌、病毒或真菌，以及細(xì)菌、病毒、真菌、原生動(dòng)物、腫瘤源性或生物體源性抗原、毒素或類(lèi)毒素。此外，某些目前實(shí)驗(yàn)性的不提高強(qiáng)免疫應(yīng)答的抗原，特別是諸如重組蛋白、糖蛋白和肽的物質(zhì)，可結(jié)合本發(fā)明的佐劑組合而使用。示例的實(shí)驗(yàn)性亞單位抗原包括與病毒性疾病相關(guān)的那些，諸如腺病毒、AIDS、水痘、巨細(xì)胞病毒、登革熱、貓白血病、禽類(lèi)瘟疫、甲肝、乙肝、HSV-U HSV-2、豬瘟、甲型流感、乙型流感、日本腦炎、麻疹、副流感病毒、狂犬病、呼吸道合胞病毒、輪狀病毒、撫和黃熱病。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原可以是癌抗原或腫瘤抗原。術(shù)語(yǔ)“癌抗原”和“腫瘤抗原”可互換使用并指由癌細(xì)胞差異表達(dá)的抗原。因此，癌抗原可用于差異靶向針對(duì)癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答。癌抗原可因此潛在地刺激腫瘤特異性免疫應(yīng)答。某些癌抗原由正常細(xì)胞編碼，但不一定由正常細(xì)胞表達(dá)。其中一些這樣的抗原可表征為在正常細(xì)胞中通常沉默(即，不表達(dá))、只在分化的某些階段表達(dá)的那些以及暫時(shí)表達(dá)的那些(如胚胎和胎兒抗原)。其他癌抗原可通過(guò)突變細(xì)胞基因編碼，諸如例如癌基因(如活化的ras癌基因)、抑制基因(如突變體P53)或通過(guò)內(nèi)部缺失或染色體易位而產(chǎn)生的融合蛋白。另外的其他癌抗原可通過(guò)病毒基因編碼，諸如RNA和DNA腫瘤病毒攜帶的那些基因。
腫瘤抗原的實(shí)例包括:MAGE、MART-1/Melan-A, gplOO、二肽基肽酶 IV (DPPUV)、腺苷脫氨酶結(jié)合蛋白(ADAbp)、親環(huán)素b、結(jié)直腸相關(guān)抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其抗原表位CAP-1和CAP-2、etv6、amll、前列腺特異性抗原(PSA)及其抗原表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、T細(xì)胞受體/⑶3- ζ鏈、腫瘤抗原MAGE 家族(如 MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-AlO, MAGE-AlU MAGE-A12、MAGE-Xp2 (MAGE-B2)、MAGE-Xp3 (MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C 1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、腫瘤抗原 GAGE 家族(如 GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC 家族、HER2/neu、p2Iras、RCASl、α -甲胎蛋白、ε - f丐粘蛋白、α -連環(huán)蛋白、β -連環(huán)蛋白、Y -連環(huán)蛋白、pl20ctn、gpl0.sup.Pmel 117、PRAME、NY-ESO-l、cdc27、腺瘤樣結(jié)腸息肉癌蛋白(APC)、胞襯蛋白、連接蛋白37、Ig獨(dú)特型、pl5、gp75、GM2和⑶2神經(jīng)節(jié)甘脂、病毒產(chǎn)物諸如人乳頭狀瘤病毒蛋白、腫瘤抗原Smad家族、Imp-U PIA、EBV編碼核抗原(EBNA)-1、腦糖原磷酸化酶、SSX-USSX-2 (H0M-MEL-40)、SSX-3、SSX-4、SSX-5、SCP-1 和 CT-7 以及 c-erbB-2。癌或腫瘤以及與此類(lèi)腫瘤相關(guān)(但不排他)的特異性腫瘤抗原包括:急性淋巴母細(xì)胞性白血病(6切6、8!1111、親環(huán)素13)、8細(xì)胞淋巴瘤(Ig獨(dú)特型)、膠質(zhì)瘤(E-鈣粘蛋白、α -連環(huán)蛋白、β -連環(huán)蛋白、Y -連環(huán)蛋白、pl20ctn)、膀胱癌(p21ras)、膽管癌(p21ras)、乳腺癌(MUC 家族、HER2/neu、c-erbB-2)、宮頸癌(p53、p21ras)、結(jié)腸癌(p21ras、HER2/neu、c-erbB-2、MUC家族)、結(jié)直腸癌(結(jié)直腸相關(guān)抗原(CRC)-C017-1A/GA733、APC)、絨毛膜癌(CEA)、上皮細(xì)胞癌(親環(huán)素b)、胃癌(HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白)、肝細(xì)胞癌(甲胎蛋白)、霍奇金淋巴瘤(Imp-1、EBNA-1)、肺癌(CEA、MAGE-3、NY-ES0-1)、淋巴細(xì)胞性白血病(親環(huán)素b)、黑素瘤(p5蛋白、gp75、癌胚抗原、GM2和⑶2神經(jīng)節(jié)苷脂、Melan-A/MART-1、cdc27、MAGE-3、p21ras、gplO0.sup.Pmel 117)、骨髓瘤(MUC 家族、p21ras)、非小細(xì)胞肺癌(HER2/neu、c-erbB-2)、鼻咽癌(Imp-1、EBNA-1)、卵巢癌(MUC 家族、HER2/neu、c-erbB-2)、前列腺癌(前列腺特異性抗原(PSA)及其抗原表位PSA-l、PSA-2和PSA-3、PSMA、HER2/neu、C-erbB-2、ga733糖蛋白)、腎癌(HER2/neu、C-erbB-2)、宮頸和食道鱗狀細(xì)胞癌(病毒產(chǎn)物，諸如人乳頭狀瘤病毒蛋白)、睪丸癌(NY-ES0-1)和T細(xì)胞白血病(HTLV-1表位)。本發(fā)明的藥物組合物配制成與預(yù)期施用途徑相容。施用途徑的實(shí)例包括胃腸外，如靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下、口腔(如吸入)、透皮(如外用)、粘膜和直腸施用。用于胃腸外、真皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液劑或混懸劑可包含以下組分:無(wú)菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、非揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，諸如芐醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩沖劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及調(diào)節(jié)張力的試劑，諸如氯化鈉或右旋糖。PH值可用酸或堿調(diào)節(jié)，諸如鹽酸或氫氧化鈉。胃腸外制劑可封裝在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多劑量西林瓶中。適于注射使用的藥物組合物包括無(wú)菌水溶液(如果為水溶性的)或分散劑以及適于臨時(shí)配制無(wú)菌注射溶液或分散劑的無(wú)菌粉末。對(duì)于靜脈內(nèi)施用，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL.TM.(BASF, Parsippany, NJ.)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物都必須為無(wú)菌 的，并且應(yīng)當(dāng)為達(dá)到易于注射程度的液體。其在生產(chǎn)和貯存條件下必須穩(wěn)定，并且必須防止微生物諸如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其合適混合物的溶劑或分散介質(zhì)。例如，通過(guò)使用諸如卵磷脂等包被材料，在分散液的情況下通過(guò)保持所需的粒度，以及通過(guò)使用表面活性劑，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。防止微生物作用可通過(guò)各種抗菌劑和抗真菌劑實(shí)現(xiàn)，例如尼泊金、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在很多情況下，組合物中優(yōu)選包含等滲劑，例如，糖、多元醇諸如甘露糖醇、山梨糖醇，以及氯化鈉?？赏ㄟ^(guò)在組合物中包含延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，來(lái)實(shí)現(xiàn)注射用組合物的延長(zhǎng)吸收。無(wú)菌注射溶液可通過(guò)以下方式配制:將活性化合物(如，調(diào)節(jié)劑，諸如ro_L30RVISTA 核酸分子、PD-L30R VISTA 多肽片段、抗 PD-L30R VISTA 抗體、或抗 PD-L30R VISTA 抗體與抗ro-Li抗體的組合)以所需的量摻入具有上列成分之一或組合(根據(jù)需要)的合適溶劑中，然后進(jìn)行除菌過(guò)濾。通常，通過(guò)將活性化合物摻入到含有基本分散介質(zhì)和上面所列其他所需成分的無(wú)菌媒介物中而制備分散劑。對(duì)于用于制備無(wú)菌注射溶液的無(wú)菌粉末而言，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，該方法由其預(yù)先無(wú)菌過(guò)濾的溶液得到活性成分加任何額外所需成分的粉末?？谇唤M合物通常包含惰性稀釋劑或可食用載體。它們可封裝在明膠膠囊中或壓制成片。對(duì)于口服治療施用的目的，活性化合物可與賦形劑復(fù)合并以片劑、錠劑或膠囊劑形式使用?？谇唤M合物還可使用液體載體制備以用作漱口水，其中液體載體中的化合物經(jīng)口腔應(yīng)用并漱洗和吐出或吞下。藥學(xué)上相容的粘合劑和/或佐劑材料可包含在內(nèi)作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊劑、錠劑等等可包含以下成分或具有類(lèi)似性質(zhì)的化合物中的任何一種:粘合劑，諸如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，諸如淀粉或乳糖；崩解劑，諸如藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑，諸如硬脂酸鎂或Sterotes ;助流劑,諸如膠態(tài)二氧化娃；甜味劑，諸如鹿糖或糖精；或矯味劑，諸如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或橙香精。

對(duì)于通過(guò)吸入施用，化合物從裝有合適推進(jìn)劑(如，諸如二氧化碳的氣體)的壓力容器或分配器中或噴霧器中以噴霧劑的形式遞送。全身性施用還可以通過(guò)經(jīng)粘膜或透皮方法進(jìn)行。對(duì)于經(jīng)粘膜或透皮施用，在制劑中使用適于待滲透的屏障的滲透劑。此類(lèi)滲透劑在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并包括例如用于經(jīng)粘膜施用的洗滌劑、膽汁鹽和夫西地酸衍生物。經(jīng)粘膜施用可通過(guò)使用鼻噴劑或栓劑而實(shí)現(xiàn)。對(duì)于透皮施用，將活性化合物配制成如本領(lǐng)域眾所周知的軟膏劑、藥膏、凝膠劑或乳膏劑?；衔镞€可配制成栓劑形式(如，通過(guò)常規(guī)栓劑基質(zhì)，諸如可可油和其他甘油酯)或灌腸劑用于直腸遞送。在一個(gè)實(shí)施方案中，將活性化合物與將避免化合物從體內(nèi)快速消除的載體一起制備，諸如控釋制劑，包括植入物和微囊化遞送系統(tǒng)?？梢允褂每缮锝到獾摹⑸锵嗳莸木酆衔?，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類(lèi)、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。用于配制此類(lèi)制劑的方法對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將顯而易見(jiàn)。這些材料還可從AlzaCorporation和NovaPharmaceuticals, Inc.商購(gòu)獲得。脂質(zhì)體混懸劑(包括含有針對(duì)病毒抗原的單克隆抗體的靶向感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)也可用作藥學(xué)上可接受的載體。這些均可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法而制備，例如，如美國(guó)專(zhuān)利N0.4，522，811中所述。特別有利的是將口腔或胃腸外組合物配制成容易施用并且劑量均勻的劑量單位形式。如本文所用的劑量單位形式是指適合作為單位劑量用于所治療的受試者的物理不連續(xù)單位；每個(gè)單位含有預(yù)定量的活性化合物，經(jīng)計(jì)算該預(yù)定量的活性化合物與所需的藥物載體組合產(chǎn)生所需的治療效果。對(duì)本發(fā)明劑量單位形式的具體說(shuō)明限定于且直接依賴(lài)于活性化合物的獨(dú)恃特性和要達(dá)到的特定治療效果，和本領(lǐng)域中固有的對(duì)于配制這種用于治療個(gè)體的活性化合物的限制。此類(lèi)化合物的毒性和治療療效可通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的標(biāo)準(zhǔn)制藥學(xué)方法而確定。從細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)分析和動(dòng)物研究中獲得的數(shù)據(jù)可用于配制一系列人用劑量。此類(lèi)化合物的劑量?jī)?yōu)選地位于包括具有低毒性或無(wú)毒性的ED50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。劑量可以在此范圍內(nèi)根據(jù)采用的劑型以及所用的施用途徑而變化。對(duì)于用于本發(fā)明方法中的任何化合物，治療有效劑量可最初通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)分析而估計(jì)?？梢栽趧?dòng)物模型中配制劑量，以達(dá)到包括在細(xì)胞培養(yǎng)中確定的IC50(即，達(dá)到癥狀的半最大抑制的測(cè)試化合物的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。此類(lèi)信息可用于更準(zhǔn)確地確定人體中的有用劑量。血漿中的水平可例如通過(guò)高效液相色譜法測(cè)量。如本文所定義，蛋白或多肽的治療有效量(即，有效劑量)在約0.001至30mg/kg體重，優(yōu)選約0.01至25mg/kg體重,更優(yōu)選約0.1至20mg/kg體重,甚至更優(yōu)選約I至IOmg/kg、2至9mg/kg、3至8mg/kg、4至7mg/kg或5至6mg/kg體重的范圍內(nèi)。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)至IJ，某些因素可影響有效治療受試者所需的劑量，包括但不限于疾病或失調(diào)的嚴(yán)重性、之前的治療、受試者的整體健康情況和/或年齡以及存在的其他疾病。此外，用治療有效量的蛋白、多肽或抗體治療受試者可包括單次治療，或優(yōu)選地可包括一系列治療。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例中，將受試者用約0.1至20mg/kg體重范圍內(nèi)的抗體、蛋白或多肽治療，每周一次，持續(xù)約I至10周，優(yōu)選地2至8周，更優(yōu)選地約3至7周，甚至更優(yōu)選地約4、5或6周。還將認(rèn)識(shí)到，用于治療的抗體、蛋白或多肽的有效劑量可隨著特定治療的過(guò)程而提高或降低。劑量變化可以產(chǎn)生，并通過(guò)本文所述的診斷檢測(cè)分析的結(jié)果而變得明顯。本發(fā)明涵蓋調(diào)節(jié)H)-L30R VISTA的表達(dá)或活性的試劑。試劑可以例如為小分子。例如，此類(lèi)小分子包括但不限于肽、擬肽、氨基酸、氨基酸類(lèi)似物、多核苷酸、多核苷酸類(lèi)似物、核苷酸、核苷酸類(lèi)似物、分 子量低于約10，000克每分子的有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物(即，包括混合有機(jī)和有機(jī)金屬化合物)、分子量低于約5，000克每分子的有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物、分子量低于約1，000克每分子的有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物、分子量低于約500克每分子的有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物以及此類(lèi)化合物的鹽、酯和其他藥學(xué)上可接受的形式。應(yīng)當(dāng)理解，小分子試劑的合適劑量取決于普通技術(shù)醫(yī)生、獸醫(yī)或研究人員知識(shí)范圍內(nèi)的多種因素。小分子的劑量將例如根據(jù)所治療的受試者或樣本的身份、大小和病癥而變化，進(jìn)一步根據(jù)組合物施用途徑(適用時(shí))以及醫(yī)師希望小分子對(duì)本發(fā)明的核酸或多肽產(chǎn)生的作用而變化。示例性劑量包括每千克受試者或樣本體重毫克或微克量的小分子(例如，每千克約I微克至每千克約500毫克，每千克約100微克至每千克約5毫克，或每千克約I微克至每千克約50微克)。還應(yīng)當(dāng)理解，小分子的合適劑量取決于小分子相對(duì)于待調(diào)節(jié)的表達(dá)或活性的效能。此類(lèi)合適的劑量可使用本文所述的檢測(cè)分析法確定。當(dāng)要將這些小分子中的一者或多者施用給動(dòng)物(如，人)以便調(diào)節(jié)本發(fā)明的多肽或核酸的表達(dá)或活性時(shí)，醫(yī)生、獸醫(yī)或研究人員可例如首先開(kāi)具相對(duì)低的劑量處方，然后增加劑量，直到獲得合適的響應(yīng)。此夕卜，應(yīng)當(dāng)理解，任何特定動(dòng)物受試者的具體劑量水平將隨多種因素而變化，包括所用具體化合物的活性，受試者年齡、體重、整體健康情況、性別和飲食、施用時(shí)間、施用途徑、排泄率、任何藥物組合，以及待調(diào)節(jié)的表達(dá)或活性的程度。進(jìn)一步地，抗體(或其片段)可偶聯(lián)到治療性部分諸如細(xì)胞毒素、治療劑或放射性金屬離子。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑包括對(duì)細(xì)胞有害的任何試劑。實(shí)例包括紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙啶、吐根堿、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、秋水仙素、阿霉素、柔紅霉素、二輕基蒽醌(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、l-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素以及它們的類(lèi)似物或同系物。治療劑包括但不限于抗代謝物(例如，甲氨喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥(niǎo)嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿喃唳、達(dá)卡巴嗪(decarbazine)),燒化劑(例如，氮芥、噻替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法侖、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、鏈唑霉素、絲裂霉素C和順-二氯二胺合鉬(II )(DDP)順鉬)、蒽環(huán)類(lèi)(例如，柔紅菌素(以前稱(chēng)為道諾霉素)和阿霉素)、抗生素類(lèi)(例如，放線菌素D (以前稱(chēng)為放線菌素)、博來(lái)霉素、光輝霉素和安曲霉素(AMC))，以及抗有絲分裂劑(例如，長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿)。本發(fā)明的偶聯(lián)物可以用來(lái)改變給定的生物學(xué)反應(yīng)，且藥物部分不應(yīng)理解為局限于經(jīng)典的化療劑。例如，藥物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白或多肽。此類(lèi)多肽可以包括例如毒素，諸如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白，諸如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β_干擾素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子、組織型纖溶酶原激活劑；或生物反應(yīng) 調(diào)節(jié)物，諸如淋巴因子、白介素-1 ("IL-1")、白介素-2 ("IL-2")、白介素-6(〃11^-6〃)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生長(zhǎng)因子。偶聯(lián)此類(lèi)治療性部分或抗體的技術(shù)是熟知的。本發(fā)明的核酸分子可插入載體中并用作基因治療載體?；蛑委熭d體可通過(guò)例如靜脈內(nèi)注射、局部施用(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利N0.5，328，470)或通過(guò)立體定位注射(參見(jiàn)例如Chen 等(1994)Proc Natl.Acad.Sc1.USA 91:3054-3057)而遞送給受試者?；蛑委熭d體的藥物制劑可包含合適的稀釋劑中的基因治療載體，或可包含基因遞送媒介物所嵌入的緩釋基質(zhì)?？蛇x地，如果整個(gè)基因遞送載體可完整地由重組細(xì)胞產(chǎn)生(如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)，則藥物制劑可包含產(chǎn)生基因遞送系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。藥物組合物可與用藥說(shuō)明一起裝在容器、包或分配器中。V.本發(fā)明的應(yīng)用和方法本文所述的H)-L30R VISTA分子，如H)-L30R VISTA核酸分子、多肽、多肽同系物和抗體及抗體片段可用于以下方法中的一種或多種:a)篩選檢測(cè)分析；b)預(yù)測(cè)醫(yī)學(xué)(如，診斷檢測(cè)分析、預(yù)后檢測(cè)分析和臨床試驗(yàn)監(jiān)測(cè))；以及c)治療方法(如，治療和預(yù)防，如通過(guò)上調(diào)或下調(diào)免疫應(yīng)答)。如本文所述，本發(fā)明的H)-L30R VISTA多肽具有以下活性中的一種或多種:1)結(jié)合到其天然結(jié)合伴侶和/或調(diào)節(jié)其天然結(jié)合伴侶的活性，2)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)，3)調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的活化，4)調(diào)節(jié)生物體的免疫應(yīng)答，如哺乳動(dòng)物生物體，諸如小鼠或人。本發(fā)明的分離的核酸分子可用于例如表達(dá)H)-L30R VISTA多肽(如，在基因療法應(yīng)用中通過(guò)宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體)、檢測(cè)H)-L30R VISTA mRNA(如，在生物樣品中)或H)-L30R VISTA基因中的遺傳變化以及調(diào)節(jié)H)-L30R VISTA活性，如下文進(jìn)一步所述。H)-L30R VISTA多肽可用于治療特征在于H)-L30R VISTA多肽的產(chǎn)生或ro_L30RVISTA抑制劑的產(chǎn)生不足或過(guò)量的病癥或疾病。此外，PD-L30R VISTA多肽可用于篩選天然存在的H)-L30RVISTA結(jié)合伴侶，篩選調(diào)節(jié)H)-L30R VISTA活性的藥物或化合物，以及治療特征在于H)-L30R VISTA多肽的產(chǎn)生或下述H)-L30RVISTA多肽形式的產(chǎn)生不足或過(guò)量的病癥或疾病，所述多肽形式與H)-L30R VISTA野生型多肽相比具有降低的、異常的或不需要的活性(例如，免疫系統(tǒng)疾病諸如重癥聯(lián)合免疫缺陷、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、I型糖尿病、淋巴增生綜合征、炎性腸病、過(guò)敏、哮喘、移植物抗宿主病和移植排斥；對(duì)感染性病原體諸如細(xì)菌和病毒的免疫應(yīng)答；以及免疫系統(tǒng)癌癥諸如淋巴瘤和白血病)。此外,本發(fā)明的抗ro-L30R VISTA抗體可用于檢測(cè)和分離PD-L30R VISTA多肽，調(diào)節(jié)PD-L30R VISTA多肽的生物利用率以及調(diào)節(jié)H)-L30R VISTA活性，例如通過(guò)調(diào)節(jié)H)-L30RVISTA與其天然結(jié)合伴侶之間的相互作用。A.篩選檢測(cè)分析:本發(fā)明提供鑒定下述調(diào)節(jié)劑，即候選或測(cè)試化合物或試劑(如，肽、擬肽、小分子或其他藥物)的方法(在本文中也稱(chēng)為“篩選檢測(cè)分析”)，所述調(diào)節(jié)劑結(jié)合到ro-L30RVISTA多肽，對(duì)例如H)-L30RVISTA表達(dá)或H)-L30R VISTA活性具有刺激或抑制作用，或?qū)D-L30R VISTA與其天然結(jié)合伴侶之間的相互作用具有刺激或抑制作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供篩選候選或測(cè)試化合物的檢測(cè)分析法，所述化合物結(jié)合到H)-L30R VISTA蛋白或多肽或其生物活性部分，例如調(diào)節(jié)H)-L30R VISTA多肽與其天然結(jié)合伴侶之間的相互作用的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供篩選候選或測(cè)試化合物的檢測(cè)分析法，所述化合物結(jié)合到H)-L30R VISTA蛋白或多肽或其生物活性部分或調(diào)節(jié)其活性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供篩選候選或測(cè)試化合物的檢測(cè)分析法，所述化合物對(duì)由諸如本文所鑒定的H)-L30R VISTA負(fù)調(diào)節(jié)的免疫功能具有刺激或抑制作用，或基于其對(duì)H)-L30R VISTA與其天然結(jié)合伴侶之間相互作用的影響。這些ro-L30RVISTA相關(guān)功能以舉例方式包括抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生(如T細(xì)胞產(chǎn)生的11-2，Y干擾素)、抑制適度的⑶28協(xié)同刺激、抑制⑶4+和⑶8+T細(xì)胞增殖、抑制首次接觸試驗(yàn)的和記憶⑶4+T細(xì)胞增殖以及抑制TCR活化而不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本發(fā)明的測(cè)試化合物可使用本領(lǐng)域已知的組合文庫(kù)方法中的任何多種途徑而獲得，包括:生物學(xué)文庫(kù)；空間可尋址平行固相或液相文庫(kù)；需要去卷積的合成文庫(kù)方法；“一珠一化”文庫(kù)方法；以及使用親和層析選擇的合成文庫(kù)方法。生物學(xué)文庫(kù)途徑不限于肽文庫(kù)，而其他四種途徑適用于肽、非肽寡聚物或化合物的小分子文庫(kù)(Lam, K.S.(1997)Anticancer Drug Des.12:145)。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)分析法為基于細(xì)胞的檢測(cè)分析法，其中將表達(dá)ro_L30RVISTA多肽或其生物活性部分的細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸，然后確定測(cè)試化合物調(diào)節(jié)ro-L30RVISTA活性的能力。確定測(cè)試化合物調(diào)節(jié)H)-L30R VISTA活性的能力可通過(guò)監(jiān)測(cè)例如PD-L30R VISTA結(jié)合其天然結(jié)合伴侶和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性的能力而實(shí)現(xiàn)。免疫細(xì)胞可以是例如T細(xì)胞、B細(xì)胞或骨髓細(xì)胞。確定測(cè)試化合物調(diào)節(jié)ro-L30R VISTA結(jié)合其反受體(待測(cè)定)的能力可例如通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn):將H)-L30R VISTA與放射性同位素或酶標(biāo)簽偶聯(lián)，以監(jiān)測(cè)測(cè)試化合物調(diào)節(jié)H)-L30R VISTA結(jié)合到表達(dá)H)-L30RVISTA反受體的T細(xì)胞的能力。確定測(cè)試化合物結(jié)合H)-L30RVISTA的能力可例如通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn):將化合物與放射性同位素或酶標(biāo)簽偶聯(lián)，使得化合物與H)-L30R VISTA的結(jié)合可通過(guò)檢測(cè)復(fù)合物中帶標(biāo)簽的PD-L30R VISTA化合物而確定。在不用任何作用物標(biāo)記的情況下測(cè)定化合物與ro-L30R VISTA相互作用的能力也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，微生理記錄儀可用于在不標(biāo)記化合物或ro-L30RVISTA的情況下檢測(cè)化合物與H)-L30RVISTA 的相互作用(McConnell, H.M.等(1992)Science257:1906-1912)。如本文所用微生理記錄儀”(如Cytosensor)是一種分析儀器，其使用光尋址電位傳感器(LAPS)測(cè)量細(xì)胞酸化其環(huán)境的速率。此酸化速率的變化可用作化合物與H)-L30R VISTA之間相互作用的指標(biāo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)分析法是基于細(xì)胞的檢測(cè)分析，其包括將表達(dá)ro_L30RVISTA結(jié)合伴侶的T細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸，并測(cè)定測(cè)試化合物調(diào)節(jié)(如刺激或抑制)PD-L30R VISTA結(jié)合伴侶活性的能力。測(cè)定測(cè)試化合物調(diào)節(jié)H)-L30R VISTA結(jié)合伴侶活性的能力可例如通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn):測(cè)定H)-L30R VISTA多肽結(jié)合到H)-L30R VISTA結(jié)合伴侶或與其相互作用的能力。測(cè)定H)-L30R VISTA多肽或其生物活性部分結(jié)合到H)-L30RVISTA結(jié)合伴侶或與其相互作用的能力可通過(guò)上文所述用于測(cè)定直接結(jié)合的方法之一而實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，測(cè)定H)-L30RVISTA多肽結(jié)合到H)-L30R VISTA結(jié)合伴侶或與其相互作用的能力可通過(guò)測(cè)定結(jié)合伴侶的活性而實(shí)現(xiàn)。例如，結(jié)合伴侶的活性可通過(guò)以下方法測(cè)定:檢測(cè)細(xì)胞第二信使(如，酪氨酸激酶或磷酸酶活性)的誘導(dǎo)，檢測(cè)合適底物的催化/酶活性，檢測(cè)報(bào)告基因(包括有效連接到編碼可測(cè)標(biāo)記的核酸的靶應(yīng)答調(diào)節(jié)元件)的誘導(dǎo)或檢測(cè)靶調(diào)節(jié)型細(xì)胞應(yīng)答。例如，測(cè)定H)-L30R VISTA多肽結(jié)合到天然H)-L30R VISTA結(jié)合伴侶或與其相互作用的能力可通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn):通過(guò)在增殖檢測(cè)分析中測(cè)量化合物調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞協(xié)同刺激或抑制的能力，或通過(guò)干擾H)-L30R VISTA多肽結(jié)合到識(shí)別H)-L30R VISTA多肽一部分的抗體的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化的化合物可通過(guò)測(cè)定化合物調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖或細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力而鑒定。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化的化合物可通過(guò)在不止一種抗原濃度下測(cè)定化合物調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖或細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力而鑒定。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的檢測(cè)分析法為基于細(xì)胞的檢測(cè)分析法，其中將PD-L30R VISTA多肽或其生物活性部分與測(cè)試化合物接觸，然后確定測(cè)試化合物結(jié)合到PD-L30R VISTA多肽或其生物活性部分的能力。待用于本發(fā)明檢測(cè)分析法中的ro_L30RVISTA多肽的優(yōu)選生物活性部分包括參與與非H)-L30R VISTA分子的相互作用的片段，例如，結(jié)合到H)-L30R VISTA結(jié)合伴侶的胞外域的至少一部分。測(cè)試化合物與H)-L30R VISTA多肽的結(jié)合可如上所述直接或間接地測(cè)定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)分析法為無(wú)細(xì)胞的檢測(cè)分析，其中將H)-L30R VISTA多肽或其生物活性部分與測(cè)試化合物接觸，然后確定測(cè)試化合物調(diào)節(jié)(如刺激或抑制)PD-L30R VISTA多肽或其生物活性部分的活性的能力。測(cè)定測(cè)試化合物調(diào)節(jié)H)-L30R VISTA多肽活性的能力可例如通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn):通過(guò)上文所述測(cè)定直接結(jié)合的方法之一測(cè)定PD-L30R VISTA多肽結(jié)合到H)-L30R VISTA結(jié)合伴侶的能力。本發(fā)明的無(wú)細(xì)胞檢測(cè)分析適用于多肽(如，H)-L30R VISTA多肽或其生物活性部分，或H)-L30R VISTA所結(jié)合的結(jié)合伴侶)的可溶和/或膜結(jié)合形式。就其中使用膜結(jié)合形式的多肽(如，細(xì)胞表面ro-L30RVISTA)的無(wú)細(xì)胞檢測(cè)分析法而言，可能有利的是利用增溶劑，使得將膜結(jié)合形式的多肽維持在溶液中。此類(lèi)增溶劑的實(shí)例包括非離子洗滌劑，諸如正辛基葡萄糖苷、正十二烷基葡萄糖苷、正十二烷基麥芽糖苷、辛?；?-N-甲基葡萄糖胺、癸?；?N-甲基葡萄糖胺、Triton.RTM.X-100,Triton.RTM.X_114、Thesit、異十三烷基聚(乙二醇醚)n、3_[3_(膽酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸內(nèi)鹽(0^ 幻、3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CHAPSO)或N-十二烷基.dbd.N，N- 二甲基-3-胺基-1-丙磺酸鹽。在本發(fā)明的上述檢測(cè)分析法的不止一個(gè)實(shí)施方案中，可能有利的是固定ro_L30RVISTA或其結(jié)合伴侶以利于所述多肽一者或兩者的復(fù)合形式與未復(fù)合形式的分離，以及適應(yīng)檢測(cè)分析的自動(dòng)化。在存在和不存在候選化合物的情況下測(cè)試化合物結(jié)合到ro-L30RVISTA多肽或者H)-L30R VISTA多肽與其結(jié)合伴侶的相互作用可在適于容納反應(yīng)物的任何容器中進(jìn)行。此類(lèi)容器的實(shí)例包括微量滴定板、試管和微量離心管。在一個(gè)實(shí)施方案中，可提供增添了以下結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，所述結(jié)構(gòu)域允許多肽的一者或兩者結(jié)合到基質(zhì)。例如，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/PD-L30R VISTA融合蛋白或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/結(jié)合伴侶融合蛋白可被吸附到谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠(Sigma Chemical, St.Louis, M0.)或谷胱甘肽衍生化微量滴定板，其隨后與測(cè)試化合物或測(cè)試化合物和未吸附的結(jié)合伴侶多肽或H)-L30R VISTA多肽相結(jié)合，再將混合物在有利于形成復(fù)合物的條件下溫育(例如，在鹽和PH的生理?xiàng)l件下)。在溫育后，將微珠或微量滴定板孔進(jìn)行洗滌，以移除任何未結(jié)合的組分，就微珠而言將基質(zhì)固定，然后直接或間接地測(cè)定復(fù)合物形成，例如，如上所述。可選地，可將復(fù)合物與基質(zhì)解離，并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定H)-L30R VISTA結(jié)合或活性的水平。用于在基質(zhì)上固定多肽的其他技術(shù)也可用于本發(fā)明的篩選檢測(cè)分析。在一個(gè)替代性的實(shí)施方案中，測(cè)定測(cè)試化合物調(diào)節(jié)H)-L30R VISTA多肽活性的能力可通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn):測(cè)定測(cè)試化合物調(diào)節(jié)起ro-L30RVISTA下調(diào)作用的分子的活性的能力，例如，通過(guò)與H)-L30R VISTA結(jié)合伴侶的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域相互作用。例如，第二信使的水平、相互作用分子對(duì)合適靶標(biāo)的活性或相互作用子與合適靶標(biāo)的結(jié)合可如之前所述而測(cè)定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在一種方法中鑒定H)-L30R VISTA表達(dá)的調(diào)節(jié)劑，其中將細(xì)胞與候選化合物接觸，并測(cè)定細(xì)胞中H)-L30RVISTA mRNA或多肽的表達(dá)。將存在候選化合物時(shí)H)-L30R VISTAmRNA或多肽的表達(dá)水平與不存在候選化合物時(shí)H)-L30R VISTAmRNA或多肽的表達(dá)水平進(jìn)行比較。然后 ，基于此比較，如果變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，則可將候選化合物確定為H)-L30R VISTA表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，H)-L30R VISTA多肽可在雙雜交檢測(cè)分析或三雜交檢測(cè)分析中用作“誘餌蛋白”(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利N0.5，283，317 ；Zervos等(1993)Cell 72:223-232 ;Madura 等(1993)J.Biol.Chem.268:12046-12054 ;Bartel 等(1993)Biotechniques 14:920-924 ;Iwabuchi 等(1993) Oncogene 8:1693-1696 ;以及 Brent WO94/10300)，以鑒定結(jié)合到H)-L30R VISTA或與其相互作用的并牽涉H)-L30RVISTA活性的其他多肽(“PD-L30R VISTA結(jié)合蛋白”、“PD-L30RVISTA結(jié)合伴侶”或“PD-L30R VISTA-bp”)。此類(lèi)H)-L30R VISTA結(jié)合蛋白還可能通過(guò)H)-L30R VISTA多肽或者H)-L30R VISTA靶標(biāo)牽涉信號(hào)的傳播，作為例如ro-L30R VISTA介導(dǎo)的信號(hào)通路的下游元件。可選地，此類(lèi)ro-L30RVISTA結(jié)合多肽可以為H)-L30RVISTA抑制劑。雙雜交系統(tǒng)基于大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子的模塊化性質(zhì)，這些轉(zhuǎn)錄因子由可分離的DNA結(jié)合和活化結(jié)構(gòu)域組成。簡(jiǎn)而言之，檢測(cè)分析法采用兩個(gè)不同的DNA構(gòu)建體。在一個(gè)構(gòu)建體中，將編碼H)-L30R VISTA多肽的基因融合到編碼已知轉(zhuǎn)錄因子(如GAL-4)的DNA結(jié)合域的基因。在另一個(gè)構(gòu)建體中，將編碼未鑒定的多肽(“獵物”或“樣品”)的得自DNA序列文庫(kù)的DNA序列融合到編碼已知轉(zhuǎn)錄因子的活化結(jié)構(gòu)域的基因。如果“誘餌”和“獵物”多肽能夠在體內(nèi)相互作用，從而形成H)-L30R VISTA依賴(lài)性復(fù)合物，則使轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合和活化結(jié)構(gòu)域靠近。此靠近允許有效連接到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)位點(diǎn)的報(bào)告基因(如LacZ)響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄?？蓹z測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)，并可分離包含功能性轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞集落并將其用于獲得編碼與H)-L30R VISTA多肽相互作用的多肽的克隆基因。在另一方面，本發(fā)明涉及本文所述的兩種或更多種檢測(cè)分析法的組合。例如，可使用基于細(xì)胞的或無(wú)細(xì)胞的檢測(cè)分析法鑒定調(diào)節(jié)劑，以及在體內(nèi)(例如動(dòng)物中，諸如細(xì)胞轉(zhuǎn)化和/或腫瘤發(fā)生的動(dòng)物模型中)確認(rèn)試劑調(diào)節(jié)H)-L30R VISTA多肽活性的能力。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)上文所述的篩選檢測(cè)分析法鑒定的新型試劑。因此，本發(fā)明的范圍包括在合適的動(dòng)物模型中進(jìn)一步使用如本文所述而鑒定的試劑。例如，如本文所述鑒定的試劑(如，PD-L30RVISTA調(diào)節(jié)劑、反義H)-L30R VISTA核酸分子、PD-L30R VISTA特異性抗體或H)-L30R VISTA結(jié)合伴侶)可用在動(dòng)物模型中以確定用這種試劑進(jìn)行治療的療效、毒性或副作用。可選地，如本文所述鑒定的試劑可用在動(dòng)物模型中以確定這種試劑的作用機(jī)理。此外，本發(fā)明涉及通過(guò)上述篩選檢測(cè)分析法鑒定的新型試劑用于如本文所述的治療。B.檢測(cè)分析本文鑒定的cDNA序列的部分或片段(以及相應(yīng)的完整基因序列)可按多種方式用作多核苷酸試劑。例如，這些序列可用于:(i)在染色體上繪制其各自的基因；并因此找到與遺傳疾病相關(guān)的基因區(qū)域；(ii)通過(guò)微量的生物樣品鑒定個(gè)體(組織分型)；以及
(iii)幫助生物樣品的法醫(yī)學(xué)鑒定。這些應(yīng)用將在下面的小節(jié)中描述。1.染色體作圖分離基因序列(或序列一部分)后，可將該序列用于繪制基因在染色體上的位置。此過(guò)程稱(chēng)為染色體作圖。因此 ，本文所述的ro-L30RVISTA核苷酸序列的部分或片段可用于繪制H)-L30R VISTA基因在染色體上的位置。H)-L30R VISTA序列對(duì)染色體的作圖是將這些序列與疾病相關(guān)基因相聯(lián)系的重要的第一步。簡(jiǎn)而言之，可通過(guò)由H)-L30R VISTA核苷酸序列制備PCR引物(優(yōu)選長(zhǎng)15-25bp)而將H)-L30R VISTA基因?qū)θ旧w作圖。ro_L30RVISTA序列的計(jì)算機(jī)分析可用于預(yù)測(cè)在基因組DNA中跨度不超過(guò)一個(gè)外顯子從而使擴(kuò)增過(guò)程復(fù)雜化的引物。這些引物然后可用于含單獨(dú)人染色體的體細(xì)胞雜種的PCR篩選。只有含有對(duì)應(yīng)于H)-L30R VISTA序列的人基因的那些雜種才會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增片段。體細(xì)胞雜種通過(guò)融合來(lái)自不同哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞(如，人和小鼠細(xì)胞)而制備。隨著人和小鼠細(xì)胞雜種的生長(zhǎng)和分裂，它們逐漸以隨機(jī)順序丟失人染色體，但保留小鼠染色體。通過(guò)使用小鼠細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)(由于它們?nèi)狈μ囟ǖ拿?而人細(xì)胞可以生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，將保留一個(gè)含有編碼所需酶的基因的人染色體。通過(guò)使用各種培養(yǎng)基，可建立起多組雜種細(xì)胞系。一組中的每個(gè)細(xì)胞系含有單個(gè)人染色體或低數(shù)量的人染色體以及全套小鼠染色體，從而允許容易地將各個(gè)基因?qū)μ囟ǖ娜巳旧w作圖(D’Eustachio, P.等(1983) Science 220:919-924)。只含人染色體片段的體細(xì)胞雜種還可通過(guò)使用具有易位和缺失的人染色體而產(chǎn)生。體細(xì)胞雜種的PCR作圖是將特定序列分配到特定染色體的快速過(guò)程。使用單臺(tái)熱循環(huán)儀每天可以分配三個(gè)或更多個(gè)序列。使用H)-L30R VISTA核苷酸序列設(shè)計(jì)寡核苷酸引物時(shí)，通過(guò)得自特定染色體的多組片段可以實(shí)現(xiàn)亞定位。可類(lèi)似地用于將H)-L30R VISTA序列對(duì)其染色體作圖的其他作圖策略包括原位雜交(見(jiàn)述于Fan，Y.等(1990)Proc Natl.Acad.Sc1.USA 87:6223-27)、通過(guò)帶標(biāo)記的流式分選染色體進(jìn)行預(yù)篩選以及通過(guò)雜交到染色體特異性cDNA文庫(kù)而預(yù)選。DNA序列與中期染色體涂片的熒光原位雜交(FISH)可進(jìn)一步用于以一步方式提供精確的染色體位置。染色體涂片可使用其分裂已在中期通過(guò)破壞有絲分裂紡錘體的化學(xué)試劑諸如秋水仙堿而阻斷的細(xì)胞制備。染色體可通過(guò)胰蛋白酶簡(jiǎn)單處理，并用吉姆薩染色。淺暗條帶的圖案在每個(gè)染色體上顯現(xiàn)，使得可單獨(dú)地鑒定染色體。FISH技術(shù)可用在短至500或600個(gè)堿基的DNA序列。然而，大于1，000個(gè)堿基的克隆具有較高的結(jié)合到獨(dú)特染色體位置的可能性，并具有足夠的信號(hào)強(qiáng)度，可容易地檢測(cè)。優(yōu)選地1，000個(gè)堿基，更優(yōu)選地2，000個(gè)堿基將足夠以合理的時(shí)長(zhǎng)獲得良好的結(jié)果。對(duì)于此技術(shù)的綜述，參見(jiàn)Verma等,Human Chromosomes:A Manual of basic Techniques(Pergamon Press, New York1988)。染色體作圖的試劑可單獨(dú)使用以標(biāo)記單一染色體或該染色體上的單個(gè)位點(diǎn)，或者多組試劑可用于標(biāo)記多個(gè)位點(diǎn)和/或多個(gè)染色體。實(shí)際上，對(duì)應(yīng)于基因非編碼區(qū)的試劑對(duì)作圖目的是優(yōu)選的。編碼序列在基因家族內(nèi)更可能是保守的，從而增加染色體作圖過(guò)程中交叉雜交的機(jī)會(huì)。對(duì)序列作圖到精確的染色體位置后，可將染色體上序列的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。最終，可執(zhí)行得自多個(gè)個(gè)體的基因的完整測(cè)序，以確認(rèn)突變的存在性以及區(qū)分突變與多態(tài)性。2.組織分型本發(fā)明的H)-L3 0R VISTA序列還可用于從微量的生物樣品鑒定個(gè)體。此外，本發(fā)明的序列可用于提供確定個(gè)體基因組中所選部分的實(shí)際堿基并堿基(base-by-base)DNA序列的替代技術(shù)。因此，本文所述的D-L3或VISTA核苷酸序列可用于從序列的5’和3’末端制備兩個(gè)PCR引物。這些引物然后可用于擴(kuò)增個(gè)體DNA，并隨后對(duì)其測(cè)序。以此方式制備的得自個(gè)體的多組相應(yīng)的DNA序列可提供唯一的個(gè)體識(shí)別，因?yàn)槊總€(gè)個(gè)體將由于等位差異而具有一組唯一的此類(lèi)DNA序列。本發(fā)明的序列可用于從個(gè)體以及從組織獲得此類(lèi)識(shí)別序列。本發(fā)明的H)-L30R VISTA核苷酸序列唯一地代表人基因組的部分。等位變異在這些序列的編碼區(qū)一定程度上發(fā)生，而在非編碼區(qū)的發(fā)生程度較高。據(jù)估計(jì)，各個(gè)人之間的等位變異以每500個(gè)堿基大約I次的頻率發(fā)生。本文所述的序列的每一個(gè)可在一定程度上用作標(biāo)準(zhǔn)，而得自個(gè)體的DNA可與之比較以用于識(shí)別目的。由于在非編碼區(qū)存在較大數(shù)量的多態(tài)性，因此需要較少的序列來(lái)區(qū)分個(gè)體。SEQ ID NO:1或4的非編碼區(qū)可容易地通過(guò)一組可能為10至1，000個(gè)的引物來(lái)提供陽(yáng)性個(gè)體識(shí)別，所述每個(gè)引物產(chǎn)生100個(gè)堿基的非編碼擴(kuò)增序列。若使用預(yù)測(cè)的編碼序列，諸如SEQ ID N0:3或6中的那些，則對(duì)于陽(yáng)性個(gè)體識(shí)別更合適的引物數(shù)量將為500-2000個(gè)。如果將得自本文所述的H)-L30R VISTA核苷酸序列的一組試劑用于生成個(gè)體的唯一識(shí)別數(shù)據(jù)庫(kù)，則那些相同的試劑隨后可用于識(shí)別該個(gè)體的組織。使用該唯一識(shí)別數(shù)據(jù)庫(kù)，活或死亡個(gè)體的陽(yáng)性識(shí)別可通過(guò)極小的組織樣品量而實(shí)現(xiàn)。3.PD-L30R VISTA序列在法醫(yī)生物學(xué)中的應(yīng)用基于DNA的鑒定技術(shù)還可用在法醫(yī)生物學(xué)中。本發(fā)明的序列可用于提供靶向人基因組中特定基因座的多核苷酸試劑，如PCR引物，其可通過(guò)例如提供另一“鑒定標(biāo)記”(即，對(duì)特定個(gè)體唯一的另一 DNA序列)而提高基于DNA的法醫(yī)學(xué)鑒定的可靠性。如上所述，實(shí)際的堿基序列信息可用于鑒定，作為限制性酶生成的片段所形成的模式的準(zhǔn)確替代。靶向SEQ ID N0:1或3非編碼區(qū)的序列尤其適合此用途，因?yàn)樵诜蔷幋a區(qū)存在較大數(shù)量的多態(tài)性，使得更易于使用此技術(shù)來(lái)區(qū)分個(gè)體。多核苷酸試劑的實(shí)例包括ro-L30R VISTA核苷酸序列或其部分，例如，衍生自SEQ ID NO:1或3的非編碼區(qū)的長(zhǎng)度為至少20個(gè)堿基，優(yōu)選至少30個(gè)堿基的片段。本文所述的H)-L30R VISTA核苷酸序列可進(jìn)一步用于提供多核苷酸試劑，例如可用于例如原位雜交技術(shù)的標(biāo)記探針或可加標(biāo)記探針，以鑒定特定的組織，如淋巴細(xì)胞。這在法醫(yī)病理學(xué)家面臨未知來(lái)源的組織時(shí)會(huì)非常有用。多組此類(lèi)ro-L30RVISTA探針可用于按物種和/或按器官類(lèi)型鑒定組織。以類(lèi)似的方式，這些試劑，如H)-L30R VISTA引物或探針可用于篩選組織培養(yǎng)物的污染情況(即，篩選培養(yǎng)物中不同類(lèi)型細(xì)胞的混合物的存在性)。C.預(yù)測(cè)醫(yī)學(xué)本發(fā)明還涉及預(yù)測(cè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，其中診斷檢測(cè)分析、預(yù)后檢測(cè)分析以及臨床試驗(yàn)監(jiān)測(cè)用于預(yù)后(預(yù)測(cè))目的從而預(yù)防性地治療個(gè)體。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于在生物樣品(如血液、血清、細(xì)胞或組織)背景下測(cè)定H)-L30R VISTA多肽和/或核酸表達(dá)以及PD-L30R VISTA活性的診斷檢測(cè)分析，從而確定個(gè)體是否受疾病或失調(diào)的困擾，或是否存在發(fā)展疾病的風(fēng)險(xiǎn)，所述疾病或失調(diào)與異常的或不需要的H)-L30R VISTA表達(dá)或活性相關(guān)。本發(fā)明還提供預(yù)后(或預(yù)測(cè))檢測(cè)分析法以確定個(gè)體是否有發(fā)展與H)-L30R VISTA多肽、核酸表達(dá)或活性相關(guān)的疾病的風(fēng)險(xiǎn)。例如，可測(cè)定生物樣品中H)-L30RVISTA基因的突變。此類(lèi)檢測(cè)分析法可用于預(yù)后或預(yù)測(cè)目的，從而在特征在于H)-L30R VISTA多肽、核酸表達(dá)或活性或與之相關(guān)的疾病發(fā)生之前預(yù)防性地治療個(gè)體。本發(fā)明的另一方面涉及在臨床試驗(yàn)中監(jiān)測(cè)試劑(如，藥物、化合物)對(duì)ro_L30RVISTA表達(dá)或活性的影響。這些試劑及其他試劑在下面的小節(jié)中將進(jìn)一步詳細(xì)描述。1.診斷檢測(cè)分析檢測(cè)生物樣品中H)-L30R VISTA多肽或核酸存在與否的示例性方法包括:從測(cè)試受試者中獲得生物樣品，將生物樣品與 能夠檢測(cè)H)-L30R VISTA多肽或編碼H)-L30R VISTA多肽的核酸(如，mRNA或基因組DNA)的化合物或試劑接觸，使得檢測(cè)該生物樣品中ro-L30RVISTA多肽或核酸的存在性。檢測(cè)H)-L30R VISTAmRNA或基因組DNA的優(yōu)選試劑為能夠雜交到H)-L30R VISTAmRNA或基因組DNA的標(biāo)記的核酸探針。核酸探針可以為例如SEQID NO:1或3所示的H)-L30R VISTA核酸或其部分，諸如長(zhǎng)度為至少15、30、50、100、250或500個(gè)核苷酸并足以在嚴(yán)格條件下特異性雜交到H)-L30R VISTA mRNA或基因組DNA的寡核苷酸。其他適用于本發(fā)明的診斷檢測(cè)分析的探針在本文進(jìn)行了描述。檢測(cè)H)-L30R VISTA多肽的優(yōu)選試劑為能夠結(jié)合到H)-L30R VISTA多肽的抗體，優(yōu)選地為帶有可檢測(cè)的標(biāo)記的抗體?？贵w可以是多克隆抗體，或更優(yōu)選地為單克隆抗體?？梢允褂猛暾目贵w或其片段(如Fab或F(ab’)2)。關(guān)于探針或抗體的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記的”旨在涵蓋通過(guò)將可檢測(cè)的物質(zhì)偶聯(lián)(即，物理連接)到探針或抗體而直接標(biāo)記探針或抗體，以及通過(guò)與直接標(biāo)記的另一試劑的反應(yīng)性而間接標(biāo)記探針或抗體。間接標(biāo)記的實(shí)例包括使用熒光標(biāo)記的二抗檢測(cè)一抗以及用生物素末端標(biāo)記DNA探針使得其可通過(guò)熒光標(biāo)記的鏈霉親和素檢測(cè)。術(shù)語(yǔ)“生物樣品”旨在包括從受試者中分離的組織、細(xì)胞和生物流體，以及存在于受試者內(nèi)的組織、細(xì)胞和流體。也就是說(shuō)，本發(fā)明的檢測(cè)方法可用于在體外以及體內(nèi)檢測(cè)生物樣品中的H)-L30R VISTA mRNA、多肽或基因組DNA。例如，體外檢測(cè)PD-L2 mRNA的技術(shù)包括Northern雜交和原位雜交。體外檢測(cè)PD-L30R VISTA多肽的技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、Western印跡、免疫沉淀和免疫熒光。體外檢測(cè)ro-L30R VISTA基因組DNA的技術(shù)包括Southern雜交。此外，體內(nèi)檢測(cè)PD-L30R VISTA多肽的技術(shù)包括向受試者引入標(biāo)記的抗H)-L30R VISTA抗體。例如，抗體可用放射性標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，其在受試者中的存在及位置可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物樣品包含得自測(cè)試受試者的多肽分子?？蛇x地，生物樣品可包含得自測(cè)試受試者的mRNA分子或得自測(cè)試受試者的基因組DNA分子。優(yōu)選的生物樣品為通過(guò)常規(guī)方法從受試者中分離的血清樣品。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步涉及:從對(duì)照受試者獲取對(duì)照生物樣品，將對(duì)照樣品與能夠檢測(cè)H)-L30R VISTA多肽、mRNA或基因組DNA的化合物或試劑接觸，使得檢測(cè)生物樣品中PD-L30RVISTA多肽、mRNA或基因組DNA的存在性，以及將對(duì)照樣品中H)-L30R VISTA多肽、mRNA或基因組DNA的存在性與測(cè)試樣品中ro_L30RVISTA多肽、mRNA或基因組DNA的存在性進(jìn)行比較。本發(fā)明還涵蓋檢測(cè)生物樣品中H)-L30R VISTA存在性的試劑盒。例如，該試劑盒可包含:能夠檢測(cè)生物樣品中ro-L30R VISTA多肽或mRNA的標(biāo)記化合物或試劑；測(cè)定樣品中PD-L30R VISTA的量的裝置；以及比較樣品與標(biāo)準(zhǔn)品中H)-L30R VISTA的量的裝置。該化合物或試劑可包裝在合適的容器中。試劑盒可進(jìn)一步包含使用試劑盒來(lái)檢測(cè)ro-L30R VISTA多肽或核酸的說(shuō)明。2.預(yù)后檢測(cè)分析本文所述的診斷方法另外可用于鑒定這樣的受試者，其患有與異常的或不需要的PD-L30R VISTA表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或失調(diào)或存在發(fā)展所述疾病或失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“異常的”包括偏離野生 型H)-L30R VISTA表達(dá)或活性的H)-L30R VISTA表達(dá)或活性。異常的表達(dá)或活性包括升高或降低的表達(dá)或活性，以及不遵循表達(dá)的野生型發(fā)展模式或表達(dá)的亞細(xì)胞模式的表達(dá)或活性。例如，異常的H)-L30R VISTA表達(dá)或活性旨在包括:其中H)-L30R VISTA基因的突變導(dǎo)致H)-L30R VISTA基因低表達(dá)或過(guò)表達(dá)的情況，以及其中此類(lèi)突變導(dǎo)致非功能性H)-L30R VISTA多肽或不以野生型方式發(fā)揮功能的多肽的情形，例如，不與H)-L30R VISTA結(jié)合伴侶相互作用的多肽，或與非H)-L30R VISTA結(jié)合伴侶相互作用的多肽。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“不需要的”包括生物應(yīng)答諸如免疫細(xì)胞活化中涉及到的不需要的現(xiàn)象。例如，術(shù)語(yǔ)“不需要的”包括受試者中不可取的H)-L30R VISTA表達(dá)或活性。本文所述的檢測(cè)分析法，諸如前述診斷檢測(cè)分析法或以下檢測(cè)分析法，可用于鑒定這樣的受試者，其患有與H)-L30R VISTA多肽活性或核酸表達(dá)誤調(diào)節(jié)相關(guān)的疾病或存在發(fā)展所述疾病的風(fēng)險(xiǎn)，諸如自身免疫疾病、免疫缺乏癥、免疫系統(tǒng)疾病諸如自身免疫、過(guò)敏或炎性疾病或癌癥。因此，本發(fā)明提供鑒定與異常的或不需要的H)-L30RVISTA表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或失調(diào)的方法，其中從受試者獲得試樣，并檢測(cè)H)-L30R VISTA多肽或核酸(如mRNA或基因組DNA)，其中H)-L30R VISTA多肽或核酸的存在對(duì)于受試者患有與異常的或不需要的H)-L30R VISTA表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或失調(diào)或存在發(fā)展所述疾病或失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)具有診斷意義。如本文所用，“試樣”是指從所關(guān)注的受試者獲得的生物樣品。例如，試樣可以使生物流體(如，腦脊髓液或血清)、細(xì)胞樣品或組織。此外，本文所述的預(yù)后檢測(cè)分析法可用于確定是否可向受試者施用試劑(如，激動(dòng)劑、拮抗劑、擬肽、多肽、肽、核酸、小分子或其他候選藥物)以治療與異常的或不需要的PD-L30R VISTA表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或失調(diào)。例如，此類(lèi)方法可用于確定用試劑是否能有效治療受試者的自身免疫疾病、免疫缺乏癥、免疫系統(tǒng)癌癥或過(guò)敏性或炎性疾病。因此，本發(fā)明提供確定用試劑是否能有效治療受試者的與異常的或不需要的ro-L30R VISTA表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或失調(diào)的方法，其中獲得試樣，并檢測(cè)H)-L30R VISTA多肽或核酸表達(dá)或活性(例如，其中H)-L30R VISTA多肽或核酸表達(dá)或活性的豐度對(duì)可向受試者施用試劑以治療與異常的或不需要的H)-L30R VISTA表達(dá)或活性相關(guān)的疾病具有診斷意義)。本發(fā)明的方法還可用于檢測(cè)H)-L30R VISTA基因中的遺傳改變，從而確定具有改變的基因的受試者是否存在特征在于H)-L30R VISTA多肽活性或核酸表達(dá)誤調(diào)節(jié)的疾病的風(fēng)險(xiǎn)，諸如自身免疫疾病、免疫缺乏癥、免疫系統(tǒng)癌癥、過(guò)敏性疾病或炎性疾病。本文所述的方法可例如通過(guò)利用預(yù)先包裝好的診斷試劑盒而進(jìn)行，所述試劑盒包含本文所述的至少一種探針核酸或抗體試劑，其可例如在臨床環(huán)境中便利地使用，以診斷表現(xiàn)出H)-L30R VISTA基因相關(guān)疾病或病情的癥狀或家族史的患者。此外，其中表達(dá)H)-L30R VISTA的任何細(xì)胞類(lèi)型或組織均可用于本文所述的預(yù)后檢測(cè)分析。3.監(jiān)測(cè)效果在臨床試驗(yàn)中，監(jiān)測(cè)試劑(如藥物)對(duì)H)-L30RVISTA多肽表達(dá)或活性的影響(如，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和/或遷移)不僅可適用于基本藥物篩選，也適用于臨床試驗(yàn)。例如，對(duì)于通過(guò)如本文所述的篩選檢測(cè)分析法確定的試劑增強(qiáng)ro-L30R VISTA基因表達(dá)、多肽水平或上調(diào)H)-L30R VISTA活性的效果，可在表現(xiàn)出降低的H)-L30R VISTA基因表達(dá)、多肽水平或下調(diào)的H)-L30R VISTA活性的受試者的臨床試驗(yàn)中進(jìn)行監(jiān)測(cè)?？蛇x地，對(duì)于通過(guò)篩選檢測(cè)分析法確定的試劑降低H)-L30R VISTA基因表達(dá)、多肽水平或下調(diào)H)-L30RVISTA活性的效果，可在表現(xiàn)出提高的H)-L30R VISTA基因表達(dá)、多肽水平或H)-L30R VISTA活性的受試者的臨床試驗(yàn)中進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如所述，H)-L30R VISTA在許多造血細(xì)胞類(lèi)型(包括APC (巨噬細(xì)胞和骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞)以及⑶4+T細(xì)胞)上表達(dá)，更具體地講在⑶llc+DCXD4+T細(xì)胞(包括Foxp3效應(yīng)T細(xì)胞以及Foxp3+nTreg兩者)、⑶8+T細(xì)胞和Grl+粒細(xì)胞上表達(dá)，以及在B細(xì)胞和NK細(xì)胞上低水平表達(dá)。在此類(lèi)臨床試驗(yàn)中，H)-L30R VISTA基因，更優(yōu)選地為在例如H)-L30R VISTA相關(guān)疾病中牽涉的其他基因的表達(dá)或活性可用作特定細(xì)胞表型的“讀出”(read out)或標(biāo)志物。例如但非限制性地，可鑒定在細(xì)胞中通過(guò)用調(diào)節(jié)H)-L30RVISTA活性(如，在本文所述的篩選檢測(cè)分析中鑒定的)的試劑(如化合物、藥物或小分子)治療而調(diào)節(jié)的基因，包括PD-L30R VISTA。因此，為了例如在臨床試驗(yàn)中研究試劑對(duì)H)-L30R VISTA相關(guān)疾病的作用，可分離細(xì)胞，制備RNA并分別分析H)-L30R VISTA相關(guān)疾病中涉及的H)-L30R VISTA以及其他基因的表達(dá)水平?；虮磉_(dá)水平(例如，基因表達(dá)模式)可通過(guò)如本文所述的Northern印跡分析或RT-PCR而定量,或者可選地,通過(guò)本文所述的方法之一測(cè)量所產(chǎn)生的多肽的量或通過(guò)測(cè)量H)-L30R VISTA或其他基因的活性水平而定量。以此方式，基因表達(dá)模式可用作標(biāo)志物，指示細(xì)胞對(duì)試劑的生理反應(yīng)。因此，此反應(yīng)狀態(tài)可在用試劑治療個(gè)體前以及在治療中的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行確定。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供監(jiān)測(cè)用試劑(如，通過(guò)本文所述的篩選檢測(cè)分析法鑒定的激動(dòng)劑、拮抗劑、擬肽、多肽、肽、核酸、小分子或其他候選藥物)治療受試者的效果的方法，包括以下步驟:(i)在施用試劑前從受試者獲得施用前樣品；(ii)檢測(cè)施用前樣品中H)-L30R VISTA多肽、mRNA或基因組DNA的表達(dá)水平；(iii)從受試者獲得一個(gè)或多個(gè)施用后樣品；(iv)檢測(cè)施用后樣品中ro-L30R VISTA多肽、mRNA或基因組DNA的表達(dá)或活性水平；(V) 將施用前樣品中H)-L30R VISTA多肽、mRNA或基因組DNA與施用后一個(gè)或多個(gè)樣品中H)-L30R VISTA多肽、mRNA或基因組DNA的表達(dá)或活性水平進(jìn)行比較；以及(Vi)相應(yīng)地改變向受試者的試劑施用。例如，增加試劑施用可能是所需的，以將ro-L30R VISTA的表達(dá)或活性提高到比所測(cè)水平更高的水平，即，增強(qiáng)試劑的效果?？蛇x地，減少試劑施用可能是所需的，以將ro-L30RVISTA的表達(dá)或活性降低到比所檢測(cè)水平更低的水平，即減弱試劑的效果。根據(jù)這樣的實(shí)施方案，PD-L30R VISTA表達(dá)或活性可以用作試劑效果的指標(biāo)，即使在不存在可觀察的表型反應(yīng)的情況下。D.治療方法本發(fā)明提供治療下述受試者的預(yù)防性和診斷性方法，所述受試者存在(或疑似有)特征在于H)-L30R VISTA蛋白的產(chǎn)生不足或過(guò)量或產(chǎn)生的H)-L30R VISTA蛋白形式與H)-L30R VISTA野生型相比具有降低或異常的活性的疾病的風(fēng)險(xiǎn)。此外，本發(fā)明的抗PD-L30RVISTA抗體可用于檢測(cè)和分離PD-L30R VISTA蛋白，調(diào)節(jié)PD-L30R VISTA蛋白的生物利用率以及調(diào)節(jié)H)-L30R VISTA活性，例如通過(guò)調(diào)節(jié)H)-L30R VISTA與其反受體之間的相互作用。1.預(yù)防方法在一個(gè)方面，本發(fā)明提供預(yù)防受試者與異常的或不需要的H)-L30R VISTA表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或病 癥的方法，方式是向受試者施用調(diào)節(jié)ro-L30R VISTA表達(dá)或至少一種H)-L30R VISTA活性的H)-L30R VISTA多肽或試劑。存在由異常的或不需要的H)-L30RVISTA表達(dá)或活性所致的或有助于所述表達(dá)或活性的疾病或病癥風(fēng)險(xiǎn)的受試者可通過(guò)例如如本文所述的診斷或預(yù)后檢測(cè)分析法的任何一種或組合而鑒定。施用預(yù)防劑可在PD-L30R VISTA異常所特有的癥狀顯現(xiàn)前進(jìn)行，使得疾病或失調(diào)得到預(yù)防或可選地，延遲其進(jìn)展。取決于H)-L30R VISTA異常的類(lèi)型，例如，PD-L30R VISTA多肽、PD-L30R VISTA激動(dòng)劑或H)-L30R VISTA拮抗劑(如抗H)-L30RVISTA抗體)可用于治療受試者。合適的試劑可基于本文所述的篩選檢測(cè)分析法而確定。2.治療方法本發(fā)明的一個(gè)重要方面涉及調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)H)-L30R VISTA表達(dá)或活性或與其天然結(jié)合伴侶的相互作用的方法。關(guān)于治療，已證明ro-L30R VISTA可抑制⑶28協(xié)同刺激、抑制免疫細(xì)胞的TCR活化、抑制活化免疫細(xì)胞(CD4+和CD8+T細(xì)胞)的增殖、抑制T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子(IL-2，Y干擾素)以及向免疫細(xì)胞傳遞抑制信號(hào)。因此，可調(diào)節(jié)T細(xì)胞上ro-L30RVISTA的活性和/或表達(dá)以及H)-L30R VISTA與其天然結(jié)合伴侶之間的相互作用以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。由于H)-L30RVISTA結(jié)合到抑制性受體(T細(xì)胞上)，因此上調(diào)H)-L30R VISTA活性應(yīng)導(dǎo)致免疫應(yīng)答的下調(diào)，而下調(diào)H)-L30R VISTA活性應(yīng)導(dǎo)致免疫應(yīng)答的上調(diào)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，PD-L30R VISTA結(jié)合到抑制性受體。如之前所述，申請(qǐng)人制備的在體外(在存在ro-L30RVISTA-1g的情況下)增強(qiáng)H)-L30R VISTA-1g融合蛋白抑制活性(即，這些抗體增強(qiáng)H)-L30R VISTA相關(guān)活性的抑制，諸如H)-L30RVISTA對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生、T細(xì)胞增殖、分化或活化以及之前所述的其他功能的影響)的H)-L30R VISTA抗體與體內(nèi)預(yù)計(jì)情況表現(xiàn)相反，即，已發(fā)現(xiàn)這些抗體在體內(nèi)為免疫抑制性的。本發(fā)明的調(diào)節(jié)性方法涉及將細(xì)胞與H)-L30R VISTA多肽或調(diào)節(jié)與細(xì)胞相關(guān)的PD-L30R VISTA多肽活性中的一種或多種的試劑相接觸，例如，調(diào)節(jié)ro_L30R VISTA的表達(dá)或活性和/或調(diào)節(jié)ro-L30R VISTA與其天然結(jié)合伴侶間的相互作用的試劑。調(diào)節(jié)PD-L30RVISTA多肽活性的試劑可以是如本文所述的試劑，諸如核酸或多肽、PD-L30R VISTA多肽的天然存在的結(jié)合伴侶、ro-L30R VISTA抗體、ro-L30R VISTA激動(dòng)劑或拮抗劑、PD-L30R VISTA激動(dòng)劑或拮抗劑的擬肽、PD-L30R VISTA擬肽、或其他小分子。PD-L30RVISTA的可溶形式還可用于干擾H)-L30R VISTA與其任何天然結(jié)合伴侶或配體任一者的結(jié)合。調(diào)節(jié)H)-L30R VISTA表達(dá)的試劑為例如反義核酸分子、三鏈寡核苷酸、核酶或表達(dá)PD-L30R VISTA多肽的重組載體。例如，可以合成與H)-L30R VISTA多肽翻譯起始位點(diǎn)周?chē)膮^(qū)域互補(bǔ)的寡核苷酸?？蓪⒁环N或多種寡核苷酸加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，通常為200μ g/ml，或施用給受試者以防止H)-L30R VISTA多肽的合成。反義寡核苷酸被細(xì)胞攝取并雜交到H)-L30R VISTA mRNA以防止翻譯。可選地，可以使用結(jié)合雙鏈DNA以形成三鏈構(gòu)建體從而防止DNA解旋和轉(zhuǎn)錄的寡核苷酸。作為任一種情況的結(jié)果，H)-L30R VISTA多肽的合成均被阻斷。當(dāng)調(diào)節(jié)H)-L30R VISTA表達(dá)時(shí)，優(yōu)選地，這種調(diào)節(jié)通過(guò)敲除H)-L30R VISTA基因之外的方法進(jìn)行?；诳刂萍?xì)胞中H)-L30R VISTA的量這一事實(shí)而調(diào)節(jié)表達(dá)的試劑也調(diào)節(jié)細(xì)胞中PD-L30R VISTA活性的總量。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)H)-L30R VISTA的試劑刺激一種或多種H)-L30R VISTA活性。此類(lèi)刺激劑的實(shí)例包括活性H)-L30R VISTA多肽以及已引入細(xì)胞中的編碼H)-L30R VISTA的核酸分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑抑制一種或多種PD-L30R VISTA活性。此類(lèi)抑制劑的實(shí)例包括反義H)-L30R VISTA核酸分子、抗ro_L30RVISTA抗體、PD-L30R VISTA抑制劑以及在受試者篩選檢測(cè)分析中鑒定的化合物。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，抑制劑為抗H)-L30R VISTA抗體以及抗I3D-Ll或抗TO-L2抗體的組合。這些調(diào)節(jié)性方法可在體外進(jìn)行(例如，通過(guò)將細(xì)胞與試劑接觸)，或者可選地，通過(guò)將試劑與細(xì)胞接觸而在體內(nèi)進(jìn)行(例如，通過(guò)將試劑施用給受試者)。這樣，本發(fā)明提供治療將會(huì)受益于H)-L30R VISTA多肽上調(diào)或下調(diào)的病癥或疾病困擾的個(gè)體的方法，例如，特征在于不想要的、不足的或異常的H)-L30R VISTA多肽或核酸分子表達(dá)或活性的疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法涉及施用一種試劑(例如，通過(guò)本文所述的篩選檢測(cè)分析鑒定的試劑)或調(diào)節(jié)(如，上調(diào)或下調(diào))PD-L30R VISTA表達(dá)或活性的試劑的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法涉及施用H)-L30R VISTA多肽或核酸分子作為治療方法以補(bǔ)償降低的、異常的或不想要的H)-L30R VISTA表達(dá)或 活性?？捎檬茉囌逪)-L30R VISTA結(jié)合劑治療的疾病在前文已有鑒定，并包括各種炎性、自身免疫、癌癥、過(guò)敏性和感染性疾病。尤其優(yōu)選的適應(yīng)癥為多發(fā)性硬化。刺激ro-L30R VISTA活性在其中H)-L30R VISTA異常下調(diào)和/或其中增強(qiáng)的PD-L30R VISTA活性可能具有有益效果的情形中是所需的。類(lèi)似地，抑制H)-L30R VISTA活性在其中H)-L30R VISTA異常上調(diào)和/或其中降低的H)-L30R VISTA活性可能具有有益效果的情形中是所需的。用于下調(diào)H)-L30R VISTA的示例性試劑(S卩，H)-L30R VISTA拮抗劑)包括例如反義核酸分子、識(shí)別和阻斷ro-L30R VISTA的抗體、識(shí)別和阻斷ro-L30R VISTA的抗體與識(shí)別和阻斷H)-L30R VISTA反受體的抗體的組合、以及阻斷免疫細(xì)胞上ro-L30RVISTA與其天然結(jié)合伴侶之間相互作用的化合物(如，可溶性、單價(jià)H)-L30R VISTA分子；不結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞上Fe受體的可溶形式的H)-L30R VISTA分子；可溶形式的ro_L30RVISTA結(jié)合伴侶；以及受試者篩選檢測(cè)分析中鑒定的化合物)。用于上調(diào)H)-L30R VISTA的示例性試劑(即，PD-L30R VISTA激動(dòng)劑)包括例如編碼H)-L30R VISTA多肽的核酸分子、多價(jià)形式的PD-L30R VISTAJ^S PD-L30R VISTA表達(dá)的化合物、增強(qiáng)PD-L30R VISTA與其天然結(jié)合伴侶間的相互作用的化合物以及表達(dá)ro-L30R VISTA的細(xì)胞。3.下調(diào)免疫應(yīng)答本發(fā)明有多種實(shí)施方案上調(diào)H)-L30R VISTA多肽的抑制性功能從而下調(diào)免疫應(yīng)答。下調(diào)可以是抑制或阻斷已在進(jìn)行中的免疫應(yīng)答的形式，或者可以涉及防止免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)?；罨拿庖呒?xì)胞的功能可通過(guò)下調(diào)免疫細(xì)胞應(yīng)答或通過(guò)抑制免疫細(xì)胞中的特異性無(wú)能或這兩者而抑制。例如，在其中ro-L30R VISTA結(jié)合到抑制性受體的實(shí)施方案中，結(jié)合到抑制性受體的H)-L30R VISTA形式，例如細(xì)胞表面上的多價(jià)H)-L30R VISTA，可用于下調(diào)免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用于刺激H)-L30R VISTA活性的活化抗體為雙特異性抗體。例如，這樣的抗體可以包含H)-L30R VISTA結(jié)合位點(diǎn)和靶向免疫細(xì)胞(如T細(xì)胞、B細(xì)胞或骨髓細(xì)胞)上的細(xì)胞表面受體的另一結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，除了包含PD-L30R VISTA結(jié)合位點(diǎn)外，這樣的抗體可進(jìn)一步包含結(jié)合到B細(xì)胞抗原受體、T細(xì)胞抗原受體或Fe受體的結(jié)合位點(diǎn)，以便將分子靶向特定的細(xì)胞群。選擇雙特異性抗體的該第二抗原可提供選擇待靶向以進(jìn)行抑制的細(xì)胞群的靈活性。促進(jìn)H)-L30R VISTA活性或增強(qiáng)PD-L30R VISTA與其天然結(jié)合伴侶(如H)-L30R VISTA活化抗體或H)-L30R VISTA活化小分子)之間的相互作用的試劑可通過(guò)它們抑制免疫細(xì)胞增殖和/或效應(yīng)子功能或加到體外檢測(cè)分析中時(shí)誘導(dǎo)無(wú)能的能力而鑒定。例如，細(xì)胞可在刺激通過(guò)活化受體發(fā)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的試劑存在下而培養(yǎng)。多種本領(lǐng)域公認(rèn)的細(xì)胞活化“讀出”可用于在活化劑存在下測(cè)量例如細(xì)胞增殖或效應(yīng)子功能(例如，抗體產(chǎn)生、細(xì)胞因子產(chǎn)生、吞噬作用)。測(cè)試試劑阻斷此活化的能力可容易地通過(guò)測(cè)量該試劑實(shí)現(xiàn)所測(cè)量的增殖或效應(yīng)子功能降低的能力而測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，在低抗原濃度下，PD-L30R VISTA免疫細(xì)胞相互作用抑制強(qiáng)B7-⑶28信號(hào)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在高抗原濃度下，PD-L30R VISTA免疫細(xì)胞相互作用可減少細(xì)胞因子的產(chǎn)生但不抑制T細(xì)胞增殖。因此，測(cè)試化合物阻斷活化的能力可通過(guò)在不同抗原濃度下測(cè)量細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或增殖而測(cè)定。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)與H)-L30R VISTA激動(dòng)劑共施用抗原而誘導(dǎo)對(duì)特異性抗原的耐受性。例如，可誘導(dǎo)對(duì)特異性多肽的耐受。在一個(gè)實(shí)施方案中，若對(duì)過(guò)敏原或外源性多肽的免疫應(yīng)答是不可取的，則可抑制對(duì)該過(guò)敏原或外源性多肽的免疫應(yīng)答。例如，接受VDI因子的患者經(jīng)常產(chǎn)生針對(duì)此凝血因子的抗體。與重組因子VDI共施用刺激ro-L30RVISTA活性或與其天然結(jié)合伴侶間的相互作用的試劑(或?qū))-L30R VISTA物理連接到VDI因子，如通過(guò)交聯(lián))可導(dǎo)致免疫應(yīng)答下調(diào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，H)-L30R VISTA激動(dòng)劑和可阻斷免疫細(xì)胞上協(xié)同刺激受體活性的另一種試劑可用于下調(diào)免疫應(yīng)答。示例性分子包括:激動(dòng)劑形式的其他ro配體、可溶形式的CTLA-4、抗B7-1抗體、抗B7-2抗體或它們的組合?？蛇x地，兩種單獨(dú)的肽(例如，PD-L30R VISTA多肽與阻斷形式的B7-2和/或B7-1多肽)或抗體的組合(例如，針對(duì)H)-L30R VISTA多肽的活化抗體與阻斷性抗B7-2和/或抗B7-1單克隆抗體)可聯(lián)合用作單一組合物或單獨(dú)施用(同時(shí)地或順序地)以下調(diào)受試者中免疫細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。此外，治療有效量的具有H)-L30R VISTA多肽活性的一種或多種肽與具有B7-1和/或B7-1活性的一種或多種多肽一起可聯(lián)合其他下調(diào)試劑用于影響免疫應(yīng)答。其他免疫調(diào)節(jié)試劑的實(shí)例包括阻斷協(xié)同刺激信號(hào)(如，針對(duì)⑶28或IC0S)的抗體、通過(guò)CTLA4活化抑制性信號(hào)的抗體和/或針對(duì)其他 免疫細(xì)胞標(biāo)志物(如，針對(duì)CD40、CD40配體或細(xì)胞因子)的抗體、融合蛋白(如CTLA4-Fc或ro-1-Fc)以及免疫抑制藥物(如雷帕霉素、環(huán)孢霉素A或FK506)。H)-L30R VISTA多肽也可用于構(gòu)造通過(guò)破壞細(xì)胞而阻斷免疫細(xì)胞功能的治療劑。例如，PD-L30R VISTA多肽的一些部分可連接到毒素，以制備能夠觸發(fā)其結(jié)合的細(xì)胞發(fā)生破壞的細(xì)胞毒性劑。對(duì)于制備細(xì)胞毒性劑，本發(fā)明的多肽可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)連接到或有效連接到毒素。可偶聯(lián)到本發(fā)明多肽或抗體的多種毒素是已知的。實(shí)例包括:多種有用的植物、真菌或甚至細(xì)菌源毒素，其以舉例的方式包括:各種A鏈毒素，尤其是蓖麻A鏈；核糖體失活蛋白，諸如肥皂草素或多花白樹(shù)毒蛋白；α帚曲毒蛋白；曲霉素；局限曲菌素；以及核糖核酸酶諸如胎盤(pán)核糖核酸酶、血管形成、白喉毒素或假單胞菌外毒素。與本發(fā)明結(jié)合使用的優(yōu)選毒素部分為已經(jīng)過(guò)處理以修飾或移除碳水化合物殘基的毒素A鏈，即去糖基化A鏈(美國(guó)專(zhuān)利 N0.5，776，427)。此類(lèi)細(xì)胞毒素劑(例如，PD-L30R VISTA蓖麻毒素(單獨(dú)地或與TO-Ll蓖麻毒素相結(jié)合))之一或組合融合進(jìn)患者可導(dǎo)致免疫細(xì)胞死亡，尤其是鑒于表達(dá)較高H)-L30R VISTA結(jié)合伴侶量的活化免疫細(xì)胞這一事實(shí)。例如，由于F1D-1在活化的淋巴細(xì)胞表面上誘導(dǎo)，因此H)-L30R VISTA多肽可用于通過(guò)Fc-R依賴(lài)性機(jī)制或通過(guò)將細(xì)胞毒性藥物(如蓖麻毒素、肥皂草素或卡奇霉素)偶聯(lián)到H)-L30R VISTA多肽的消融(ablation)而靶向這些特定細(xì)胞的去除。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將毒素偶聯(lián)到抗H)-L30R VISTA抗體以便靶向表達(dá)H)-L30R VISTA的抗原呈遞細(xì)胞死亡。在又一個(gè)實(shí)施方案中，H)-L30RVISTA抗體-毒素可以是雙特異性抗體。此類(lèi)雙特異性抗體可用于靶向特定細(xì)胞群，例如，使用只存在于某些類(lèi)型細(xì)胞上的標(biāo)志物，例如B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞或朗格漢斯細(xì)胞。通過(guò)活化H)-L30R VISTA活性或H)-L30R VISTA與免疫細(xì)胞的相互作用(并因而刺激ro_L30RVISTA的負(fù)信號(hào)傳導(dǎo)功能)來(lái)下調(diào)免疫應(yīng)答可用于下調(diào)例如組織、皮膚和器官移植情形中、移植物抗宿主病(GVHD)或過(guò)敏癥中或諸如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和多發(fā)性硬化的自身免疫疾病中的免疫應(yīng)答。例如，阻斷免疫細(xì)胞功能導(dǎo)致組織移植中減少的組織破壞。通常，在組織移植物中，移植物的排斥通過(guò)免疫細(xì)胞將其識(shí)別為外源物而引發(fā)，然后發(fā)生破壞移植物的免疫反應(yīng)。在移植前或移植 時(shí)單獨(dú)地或結(jié)合另一種下調(diào)劑而施用促進(jìn)免疫細(xì)胞上的ro-L30RVISTA活性或者H)-L30R VISTA與其天然結(jié)合伴侶間的相互作用的分子(諸如，可溶性、多聚物形式的H)-L30R VISTA多肽)可抑制協(xié)同刺激信號(hào)的產(chǎn)生。此外，促進(jìn)H)-L30R VISTA活性還可足以使免疫細(xì)胞無(wú)能，從而誘導(dǎo)受試者中的耐受性。為了在受試者中實(shí)現(xiàn)足夠的免疫抑制或耐受性，還可能所需的是阻斷其他分子的協(xié)同刺激功能。例如，可能所需的是阻斷B7-1和B7-2的功能，方式是在移植前或移植時(shí)施用可溶形式的具有這些抗原每一者的活性的肽的組合或針對(duì)這些抗原的阻斷性抗體(單獨(dú)地或合在單一組合物中)?？蛇x地，可能所需的是促進(jìn)H)-L30R VISTA的抑制活性并抑制B7-1和/或B7-2的協(xié)同刺激活性?？山Y(jié)合本發(fā)明的下調(diào)方法使用的其他下調(diào)劑包括例如:通過(guò)CTLA4傳遞抑制信號(hào)的試劑、可溶形式的CTLA4、通過(guò)CTLA4活化抑制信號(hào)的抗體、針對(duì)其他免疫細(xì)胞標(biāo)志物的阻斷性抗體、或可溶形式的其他受體配體對(duì)(例如，破壞CD40與CD40配體之間相互作用的試劑(例如，抗CD40配體抗體))、針對(duì)細(xì)胞因子的抗體或免疫抑制藥物。例如，活化H)-L30RVISTA活性或者H)-L30R VISTA與其天然結(jié)合伴侶間的相互作用可用于治療自身免疫疾病。許多自身免疫疾病是不當(dāng)?shù)拿庖呒?xì)胞活化的結(jié)果，這些免疫細(xì)胞對(duì)自體組織具有反應(yīng)性，并促進(jìn)疾病病理學(xué)中涉及到的細(xì)胞因子和自身抗體的產(chǎn)生。防止自體反應(yīng)性免疫細(xì)胞的活化可減輕或消除疾病癥狀。施用促進(jìn)ro-L30R VISTA的活性或ro-L30RVISTA與其天然結(jié)合伴侶間的相互作用的試劑可誘導(dǎo)能導(dǎo)致疾病長(zhǎng)期緩解的自體反應(yīng)性免疫細(xì)胞的抗原特異性耐受性。另外，共施用通過(guò)破壞B7分子與協(xié)同刺激受體的受體-配體相互作用而阻斷免疫細(xì)胞協(xié)同刺激的試劑可用于抑制免疫細(xì)胞活化，從而防止疾病過(guò)程中可能涉及到的自身抗體或細(xì)胞因子的產(chǎn)生。試劑在預(yù)防或緩解自身免疫疾病方面的療效可使用人自身免疫疾病的多種研究透徹的動(dòng)物模型來(lái)測(cè)定。實(shí)例包括鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎、MRL/lpr/lpr小鼠或NZB雜交小鼠中的系統(tǒng)性紅斑狼瘡、鼠自身免疫膠原性關(guān)節(jié)炎、NOD小鼠和BB大鼠中的糖尿病以及鼠實(shí)驗(yàn)性重癥肌無(wú)力(參見(jiàn)Paul編著，F(xiàn)undamental Immunology, Raven Press, New York, 1989,第 840-856 頁(yè))。抑制免疫細(xì)胞活化可用于在治療學(xué)上治療過(guò)敏癥和過(guò)敏反應(yīng)，例如通過(guò)抑制IgE的產(chǎn)生。促進(jìn)H)-L30R VISTA活性或者H)-L30RVISTA與其天然結(jié)合伴侶間的相互作用的試劑可施用給過(guò)敏受試者，以抑制受試者中免疫細(xì)胞介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)。刺激H)-L30R VISTA活性或與其天然結(jié)合伴侶間的相互作用可伴隨暴露于聯(lián)合合適的MHC分子的過(guò)敏原。過(guò)敏反應(yīng)在本質(zhì)上可以是全身性的或局部的，具體取決于過(guò)敏原的進(jìn)入途徑以及IgE在肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞上的沉積模式。因此，免疫細(xì)胞介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)可通過(guò)施用促進(jìn)PD-L30RVISTA活性或者H)-L30R VISTA與免疫細(xì)胞相互作用的試劑而局部地或全身性地抑制。通過(guò)刺激H)-L30 R VISTA活性或者H)-L30R VISTA與其天然結(jié)合伴侶間的相互作用而抑制免疫細(xì)胞活化在免疫細(xì)胞的病原性感染(如，通過(guò)病毒或細(xì)菌)中也可具有重要的治療學(xué)意義。例如，在獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)中，病毒復(fù)制由免疫細(xì)胞活化刺激。刺激ro-L30R VISTA活性可導(dǎo)致病毒復(fù)制受到抑制并因而延緩AIDS病程。通過(guò)刺激H)-L30R VISTA活性或者H)-L30R VISTA與其天然結(jié)合伴侶間的相互作用來(lái)下調(diào)免疫應(yīng)答還可用于治療對(duì)自體組織的自身免疫攻擊。因此，因自身免疫攻擊而導(dǎo)致的或加重的病癥(例如，心臟病、心肌梗塞或動(dòng)脈粥樣硬化)可通過(guò)增強(qiáng)ro-L30R VISTA活性或者H)-L30R VISTA與其天然結(jié)合伴侶的結(jié)合而緩解或改善。因此，通過(guò)刺激ro-L30RVISTA活性或者H)-L30R VISTA與其反受體間的相互作用而調(diào)節(jié)自身免疫攻擊所加重的病癥，諸如自身免疫疾病(以及諸如心臟病、心肌梗塞和動(dòng)脈粥樣硬化的病癥)，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。4.上調(diào)免疫應(yīng)答抑制H)-L30R VISTA活性或者H)-L30R VISTA與其天然結(jié)合伴侶間的相互作用作為上調(diào)免疫應(yīng)答的手段也可用于治療。上調(diào)免疫應(yīng)答可以是增強(qiáng)現(xiàn)有免疫應(yīng)答或弓I發(fā)初始免疫應(yīng)答的形式。例如，通過(guò)抑制ro-L30R VISTA活性而增強(qiáng)免疫應(yīng)答可用于微生物(如，細(xì)菌、病毒或寄生蟲(chóng))感染的情況或用于免疫抑制的情況。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制PD-L30R VISTA活性的試劑，例如針對(duì)H)-L30R VISTA的非活化抗體(即，阻斷性抗體)或可溶形式的ro-L30RVISTA，可在治療學(xué)上用于其中下調(diào)抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答(從而導(dǎo)致更快的或徹底的病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)清除)將是有益的情形。這些病癥包括病毒性皮膚疾病，諸如皰疹或帶狀皰疹，在這種情況下，這樣的試劑可在皮膚上外用。此外，全身性病毒疾病，諸如流感、感冒和腦炎可通過(guò)全身性施用此類(lèi)試劑而得到緩解。在某些情況下，可能所需的是進(jìn)一步使用上調(diào)免疫應(yīng)答的其他試劑，例如通過(guò)協(xié)同刺激受體轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的B7家族成員的形式，以便進(jìn)一步增強(qiáng)免疫應(yīng)答?？蛇x地，可在受感染的患者中通過(guò)以下方式增強(qiáng)免疫應(yīng)答:從患者體內(nèi)取出免疫細(xì)胞，將免疫細(xì)胞在體外與抑制H)-L30R VISTA活性或者H)-L30R VISTA與其天然結(jié)合伴侶間的相互作用的試劑接觸，以及將體外刺激的免疫細(xì)胞重新引入患者體內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法涉及:從患者體內(nèi)分離受感染的細(xì)胞(例如病毒感染的細(xì)胞)，將它們用編碼無(wú)法結(jié)合其天然結(jié)合伴侶的H)-L30R VISTA形式的核酸分子轉(zhuǎn)染使得細(xì)胞在其表面表達(dá)H)-L30R VISTA分子的全部或一部分，以及將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞重新引入患者體內(nèi)。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可能在體內(nèi)能防止向免疫細(xì)胞傳遞抑制信號(hào)，從而活化免疫細(xì)胞。抑制H)-L30R VISTA活性或者H)-L30R VISTA與其天然結(jié)合伴侶間的相互作用的試劑可在預(yù)防學(xué)上用于針對(duì)各種多肽(例如，衍生自病原體的多肽)的疫苗。針對(duì)病原體(例如病毒)的免疫力可通過(guò)用合適佐劑中的病毒多肽連同抑制ro-L30R VISTA活性的試劑進(jìn)行疫苗接種而誘導(dǎo)?？蛇x地，包含下述基因的載體可用于疫苗接種，所述基因編碼病原性抗原以及阻斷H)-L30R VISTA與免疫細(xì)胞間相互作用的H)-L30R VISTA形式這兩者。核酸疫苗可通過(guò)多種方式施用，例如通過(guò)注射(如肌內(nèi)注射、皮內(nèi)注射，或通過(guò)使用粒子加速器或壓縮氣體將粒子注入皮膚的基因槍將DNA包被的金微粒生物彈射(biolistic)進(jìn)表皮(Haynes等(1996) J.Biotechnol.44:37))?？蛇x地,核酸疫苗可通過(guò)非侵入性方式施用。例如，可將純的或脂質(zhì)配制的DNA遞送到呼吸系統(tǒng)或靶向別的地方，例如，經(jīng)口遞送DNA到派伊爾結(jié)(Schubbert (1997)Proc Natl.Acad.Sc1.USA 94:961)。減毒微生物可用于遞送到粘膜表面(Sizemore 等(1995) Science 270:29)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗中的抗原為自體抗原。這樣的疫苗可用于調(diào)節(jié)生物體中的耐受性。用自體抗原和阻斷H)-L30R VISTA活性或者H)-L30R VISTA與其天然結(jié)合伴侶間的相互作用的試劑進(jìn)行免疫會(huì)破壞耐受性(即，干擾自體抗原的耐受性)。這樣的疫苗還可以包含佐劑，諸如明礬或細(xì)胞因子(如GM-CSF、IL-12、B7-1或B7-2)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制H)-L30R VISTA活性或者H)-L30RVISTA與其天然結(jié)合伴侶間的相互作用的試劑可與I類(lèi)MHC多肽一起施用，例如通過(guò)經(jīng)轉(zhuǎn)染以共表達(dá)H)-L30R VISTA多肽或阻斷性抗體的細(xì)胞以及MHC I類(lèi)α鏈多肽和β 2微球蛋白，從而導(dǎo)致T細(xì)胞活化并提供對(duì)感染的免疫。例如，疫苗可用的病毒性病原體包括:乙肝、丙肝、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、HIV-l、HIV-2、結(jié)核、瘧疾和血吸蟲(chóng)病。在另一種應(yīng)用中，抑制H)-L30R VISTA活性或者H)-L30RVISTA與其結(jié)合伴侶間的相互作用可用于治療腫瘤免疫。腫瘤細(xì)胞(如肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、成神經(jīng)細(xì)胞瘤或淋巴瘤)可用抑制H)-L30R VISTA活性的核酸分子轉(zhuǎn)染。這些分子可以為例如PD-L30R VISTA的反義核酸分子或可編碼非活化抗H)-L30RVISTA抗體。這些分子還可以為抗ro-L30R VISTA抗體的可變區(qū)。如果需要，腫瘤細(xì)胞也可用活化協(xié)同刺激的其他多肽(如B7-1或B7-2)轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞返回患者，其導(dǎo)致H)-L30R VISTA活性受到抑制(例如，局部抑制)?？蛇x地，基因治療技術(shù)可用于靶向用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞。刺激對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答還可通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn):通過(guò)用抑制H)-L30R VISTA活性或者ro-L30R VISTA與其天 然結(jié)合伴侶間的相互作用的試劑治療受試者，從而抑制PD-L30R VISTA活性或者H)-L30R VISTA與其天然結(jié)合伴侶間的相互作用。此類(lèi)試劑的優(yōu)選實(shí)例包括例如反義核酸分子、識(shí)別并阻斷ro-L30R VISTA的抗體、以及阻斷免疫細(xì)胞上H)-L30R VISTA與其天然存在的結(jié)合伴侶間的相互作用的化合物(例如，可溶性、單價(jià)PD-L30R VISTA分子；不結(jié)合到抗原呈遞細(xì)胞上Fe受體的可溶形式的H)-L30R VISTA分子；可溶形式的H)-L30R VISTA結(jié)合伴侶；以及受試者篩選檢測(cè)分析中鑒定的化合物)。此夕卜，不含MHC I類(lèi)或MHC II類(lèi)分子的或不能表達(dá)足量MHC I類(lèi)或MHC II類(lèi)分子的腫瘤細(xì)胞可用編碼MHC I類(lèi)α鏈多肽和β 2微球蛋白多肽或MHC II類(lèi)α鏈多肽和MHC II類(lèi)β鏈多肽的全部或一部分(例如，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域截短部分)的核酸轉(zhuǎn)染，從而在細(xì)胞表面上表達(dá)MHC I類(lèi)或MHC II類(lèi)多肽。結(jié)合H)-L30R VISTA抑制性多肽或反義核酸而表達(dá)合適的I類(lèi)或II類(lèi)MHC可誘導(dǎo)針對(duì)轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。任選地，編碼阻斷MHC II類(lèi)相關(guān)多肽(諸如恒定鏈)表達(dá)的反義構(gòu)建體的基因，也可用編碼H)-L30R VISTA抑制性多肽或反義核酸的DNA共轉(zhuǎn)染，以促進(jìn)腫瘤相關(guān)抗原呈遞并誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫。已表明，通過(guò)B7陰性鼠腫瘤細(xì)胞表達(dá)B7-1可誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫，其伴隨腫瘤排斥以及對(duì)小鼠腫瘤挑戰(zhàn)的延長(zhǎng)保護(hù)(Chen, L.等(1992)Cell71:1093-1102 ；Townsend, S.E.和 Allison, J.P.(1993)Science259:368-370 ；Baskar, S.等(1993)Proc Natl.Acad.Sc1.90:5687-5690)。因此，誘導(dǎo)人體受試者中免疫細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答可足以克服受試者中的腫瘤特異性耐受性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答可通過(guò)抑制H)-L30R VISTA活性或者H)-L30R VISTA與其天然結(jié)合伴侶間的相互作用而刺激，使得克服預(yù)先存在的耐受性。例如，針對(duì)受試者無(wú)法對(duì)其發(fā)生顯著免疫應(yīng)答的抗原(例如，腫瘤特異性抗原)的免疫應(yīng)答可通過(guò)以下方式誘導(dǎo):施用抑制H)-L30R VISTA的活性或者H)-L30R VISTA結(jié)合到其天然結(jié)合伴侶的能力的試劑，可用作佐劑以在主動(dòng)免疫過(guò)程中提升對(duì)外源性抗原的應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，從受試者獲取免疫細(xì)胞，并在存在抑制H)-L30R VISTA活性或者ro-L30R VISTA與其天然結(jié)合伴侶間的相互作用的試劑下進(jìn)行體外培養(yǎng)，以擴(kuò)大免疫細(xì)胞群。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，然后將免疫細(xì)胞施用給受試者。可通過(guò)例如為免疫細(xì)胞提供初級(jí)活化信號(hào)和協(xié)同刺激信號(hào)而刺激免疫細(xì)胞體外增殖，如本領(lǐng)域所已知。各種形式的抑制H)-L30R VISTA活性的H)-L30RVISTA多肽或試劑均可用于協(xié)同刺激免疫細(xì)胞增殖。在一個(gè)實(shí)施方案中，將免疫細(xì)胞根據(jù)PCT申請(qǐng)N0.WO 94/29436中所述的方法體外培養(yǎng)。協(xié)同刺激分子可以為可溶性的，連接到細(xì)胞膜或連接到固體表面，諸如微珠。

在一個(gè)另外的實(shí)施 方案中，在執(zhí)行本文所述的任何方法時(shí)，通過(guò)施用一種或多種另外的試劑而上調(diào)免疫應(yīng)答也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，使用已知可刺激免疫應(yīng)答的其他試劑，諸如細(xì)胞因子、佐劑或刺激性形式的協(xié)同刺激分子或其配體可聯(lián)合抑制ro-L30RVISTA活性或者H)-L30R VISTA與其天然結(jié)合伴侶間的相互作用的試劑使用。E.因T細(xì)胞上H)-L30RVISTA活性或者H)-L30R VISTA與其反受體間相互作用的調(diào)節(jié)而受到調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子的鑒定本文所述的TO-L30R VISTA分子可用于鑒定下述細(xì)胞因子，其通過(guò)免疫細(xì)胞產(chǎn)生或其產(chǎn)生情況在免疫細(xì)胞響應(yīng)H)-L30R VISTA活性或者H)-L30R VISTA與其天然結(jié)合伴侶間的相互作用的調(diào)節(jié)中得到增強(qiáng)或受到抑制。免疫細(xì)胞可在體外通過(guò)初級(jí)活化信號(hào)非最優(yōu)地刺激，例如，T細(xì)胞可通過(guò)佛波酯、抗CD3抗體或優(yōu)選地抗原與MHC II類(lèi)分子聯(lián)合進(jìn)行刺激，以及給予協(xié)同刺激信號(hào)，例如通過(guò)刺激形式的B7家族抗原，例如通過(guò)用編碼B7多肽的核酸分子轉(zhuǎn)染并在其表面上表達(dá)肽的細(xì)胞，或通過(guò)可溶性、刺激形式的肽。然后，可將細(xì)胞與表達(dá)ro-L30R VISTA的細(xì)胞接觸(如，針對(duì)ro-L30RVISTA的抗體)。已知的釋放進(jìn)培養(yǎng)基的細(xì)胞因子可通過(guò)ELISA或通過(guò)阻斷細(xì)胞因子而抑制免疫細(xì)胞增殖或抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的其他細(xì)胞類(lèi)型增殖的抗體的能力而鑒定。例如，IL-4ELISA試劑盒可作為IL-7阻斷性抗體得自Genzyme (Cambridge, Mass.)。針對(duì)IL-9和IL-12的阻斷性抗體可得自GeneticsInstitute (Cambridge, Mass.)然后可確定刺激或阻斷 PD-L30R VISTA 活性或者 PD-L30RVISTA與其結(jié)合伴侶間的相互作用對(duì)細(xì)胞因子譜的作用。如上文所述并如實(shí)施例中所示，PD-L30R VISTA明顯抑制免疫細(xì)胞的IL-2和、干擾素表達(dá)。如上所述的體外免疫細(xì)胞協(xié)同刺激檢測(cè)分析法還可用在鑒定新型細(xì)胞因子的方法中，所述新型細(xì)胞因子可通過(guò)調(diào)節(jié)H)-L30RVISTA活性而受到調(diào)節(jié)。例如，其中⑶28/CTLA4途徑的刺激似乎增強(qiáng)IL-2分泌，ICOS途徑的刺激似乎增強(qiáng)IL-10分泌(Hutloff等(1999)Nature 397:263)。如果在協(xié)同刺激時(shí)誘導(dǎo)的特定活性(例如，免疫細(xì)胞增殖)無(wú)法通過(guò)添加已知細(xì)胞因子的阻斷性抗體而得到抑制，則活性可能由未知細(xì)胞因子的作用而產(chǎn)生。在協(xié)同刺激后，此細(xì)胞因子可通過(guò)常規(guī)方法從培養(yǎng)基中純化，以及其活性可通過(guò)其誘導(dǎo)免疫細(xì)胞增殖的能力而測(cè)量。要鑒定可能在耐受性的誘導(dǎo)中發(fā)揮作用的細(xì)胞因子，可使用如上所述的體外T細(xì)胞協(xié)同刺激檢測(cè)分析。在此情況下，將向T細(xì)胞給予初級(jí)活化信號(hào)，并將其與所選的細(xì)胞因子接觸，但不給予協(xié)同刺激信號(hào)。在洗滌并靜息免疫細(xì)胞后，將細(xì)胞用初級(jí)活化信號(hào)和協(xié)同刺激信號(hào)這兩者進(jìn)行再次挑戰(zhàn)。如果免疫細(xì)胞不響應(yīng)(例如，增殖或產(chǎn)生細(xì)胞因子)，則它們已變得耐受，細(xì)胞因子未阻止耐受性的誘導(dǎo)。然而，如果免疫細(xì)胞作出響應(yīng)，則細(xì)胞因子阻止了耐受性的誘導(dǎo)?？墒鼓切┠軌蜃柚鼓褪苄哉T導(dǎo)的細(xì)胞因子在體內(nèi)聯(lián)合阻斷B淋巴細(xì)胞抗原的試劑而靶向阻斷，以之作為更有效的手段誘導(dǎo)移植受體或自身免疫疾病受試者中的耐受性。例如，可以與促進(jìn)H)-L30R VISTA活性或者H)-L30R VISTA與其結(jié)合伴侶間的相互作用的試劑一起向受試者施 用細(xì)胞因子阻斷性抗體。因此，總而言之，現(xiàn)在已鑒定了通過(guò)Treg細(xì)胞表達(dá)的程序性死亡配體(TOL)家族的新成員。此新型蛋白已被命名為ro-L30RVISTA。此ro-ι家族的受體為包含單個(gè)IgV結(jié)構(gòu)域的I型跨膜蛋白，而配體為表達(dá)IgV和IgC胞外域兩者的I型跨膜蛋白。像其他PDL家族成員一樣，PD-L30R VISTA也在體外協(xié)同刺激T細(xì)胞的aCD3增殖。此外，PD-L30R VISTA的表達(dá)在α⑶3活化的Treg中升高，在存在a GITR的情況下降低。也已鑒定了在α⑶3/a GITR刺激時(shí)發(fā)生上調(diào)的第二種TNF樣蛋白。此蛋白已被命名為T(mén)reg-sTNF。這些蛋白可能牽涉在免疫的接觸依賴(lài)性和旁分泌抑制中，因而可用于調(diào)節(jié)(例如，抑制或刺激)免疫應(yīng)答以及治療涉及Treg信號(hào)傳導(dǎo)的疾病和病癥。例如，PD-L30R VISTA蛋白可用作協(xié)同刺激信號(hào)以刺激或增強(qiáng)免疫細(xì)胞活化。H)-L30RVISTA蛋白和H)-L30R VISTA結(jié)合劑和H)-L30R VISTA激動(dòng)劑及拮抗劑特別可用于治療免疫病癥，其中T細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)是所需的，例如，調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化、分化和增殖，尤其是調(diào)節(jié)CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生以及在T細(xì)胞與骨髓源性APC之間的同種相互作用期間的T細(xì)胞應(yīng)答。本發(fā)明進(jìn)一步用以下實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，這些實(shí)施例不應(yīng)理解為是對(duì)本發(fā)明的限制。本申請(qǐng)中引用的所有參考文獻(xiàn)、專(zhuān)利和公布的專(zhuān)利申請(qǐng)的內(nèi)容以及附圖和序列表均以引用方式并入本文。
實(shí)施例以下材料和方法用在下面的實(shí)施例中。材料和方法表達(dá)譜分析為了方便與既定的Treg細(xì)胞表達(dá)譜進(jìn)行比較，采用了標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)和活化條件(McHugh,等(2002)同上)。簡(jiǎn)而言之，將新分離的Treg細(xì)胞( 96%陽(yáng)性)以106個(gè)/mL接種到24孔板中補(bǔ)充了 10%胎牛血清和100單位IL-2的完整RPMI培養(yǎng)基中，所述平板用含或不含抗GITR(DTA-1)的抗CD3預(yù)包被(Shimizu，等(2002)同上)。將細(xì)胞在37°C培養(yǎng)O和12小時(shí)，純化RNA，隨后使用Affymetrix 小鼠基因組A430寡核苷酸芯片進(jìn)行了分析。通過(guò)比較得自靜息或活化⑶4+⑶25+T細(xì)胞組的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)模式與本領(lǐng)域中既定的那些相似(Gavin，等(2002)同上；McHUgh，等(2002)同上)。為了鑒定通過(guò)GIRT信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)的基因，在具有或不具有抗GITR處理的不同細(xì)胞群之間行了比較。編輯了已知以及未知基因的列表，包括以前未表征的H)-L30R VISTA和Treg-sTNF。小鼠 C57BL/6 小鼠和 OT II CD4 轉(zhuǎn)基因小鼠購(gòu)自 Jackson Laboratory。FoxP3_GFP報(bào)告小鼠如之前所述(Fontenot, J.D., Rasmussen, J.P., Williams, L.Μ., Dooley,J.L., Farr, A.G.,和 Rudensky, Α.Υ.(2005).Regulatory T cell lineage specificationby the forkhead transcriptionfactor foxp3.1mmunity 22，329-341),并由 AlexanderRudensky (University of Washington School of Medicine, Seattle, WA)懷概提供。PD-1敲除小鼠由 Tasuku Honjo 博士 (Kyoto University, Japan)慷概提供(Nishimura, H.,Nose, Μ., Hiai, H., Minato, N.,和 Honjo, Τ.(1999).Development of lupus-like autoimmunediseases by disruption of thePD—1 gene encoding an ITIM motif-carryingimmunorecepto r.1mmunitylI, 141 — 151 ；Nishimura,H., Okazaki, T., Tanaka, Y., Nakatani, K., Hara, M., Matsumori, A., Sasayama, S., Mizoguchi, A., Hiai, H., Minato, N.,和Honjο,T.(2001).Autoimmune dilated cardiomyopathy in PD-1 receptor-deficientmice.Science 291, 319-322)。所有動(dòng)物都養(yǎng)在 DartmouthMedical School 無(wú)病原體的籠舍中。Abs、細(xì)胞系和試劑:抗體aCD3(2Cll)、a CD28 (PV-1) , aCD4(GK1.5)、a CD8 (53-6.7)、a CDllb(Ml/70)、 a F4/80(BM8)、 a CDlIc(N418)、 a NKl.1(PK136)、 a Grl(RB6-8C5)、a PD-L I(MIN5)、aPD-L2 (TY25)、aB7-H3(M3.2D7)、aB7-H4(188)購(gòu)自 Ebioscience。LPS (Sigma)、重組鼠 IFN □ (Peprotech)、人 IL-2 (Peprotech)、可溶性 F1D-Ll-1g 融合蛋白(R&D systems)以指定的濃度使用。完全弗氏佐劑(CFA)和雞卵清蛋白(OVA)購(gòu)自Sigma。表達(dá)MHC II分子1-Ad和協(xié)同刺激分子B7-2的CHO細(xì)胞系由ArleneSharpe博士(HarvardMedical School)友情提供。PD-L30R VISTA的分子克隆、逆轉(zhuǎn)錄病毒的產(chǎn)生以及細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)從純化的鼠CD4+T細(xì)胞克隆全長(zhǎng)ro_L30R VISTA。使用Qiagen微量RNA提取試劑盒從CD4+T細(xì)胞中分離總RNA。使用Bio-RadiScriptTM cDNA合成試劑盒生成cDNA。擴(kuò)增全長(zhǎng)H)-L30R VISTA并克隆進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-1RES-GFP的ECorl-Xhol位點(diǎn)(Zhang, X.,和 Ren, R.(1998).Bcr-Abl efficiently induces amyeloproliferativedisease and production of excess interleukin-3andgranulocyte_macrophage colony-stimulating factor in mice:a novelmodel for chronic myelogenousleukemia.Blood 92，3829-3840)，其中將IRES-GFP片段用RFP替換，從而產(chǎn)生融合到RFP的N端的H)-L30RVISTA的融合蛋白。在HEK293T細(xì)胞中通過(guò)H)-L30R VISTA-RFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與親嗜性包裝載體PCL-EcoaMGENEX corp.) 一起的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染生成無(wú)輔助因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒。通過(guò)在8yg/ml的凝聚胺(Sigma)存在下在室溫以2000rpm離心感染(spininfection) 45分鐘,而進(jìn)行鼠T細(xì)胞系EL4細(xì)胞或骨髓原性DC的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。PD-L30R VISTA-1g融合蛋白的產(chǎn)生擴(kuò)增H)-L30R VISTA的胞外域(第32-190位氨基酸)并克隆進(jìn)親本載體CDM7B的 Spel-BamHI 位點(diǎn)(Hollenbaugh, D., Douthwright, J., McDonald, V.,和 Aruffo, A.(1995).J Immunol Methods 188,1-7)。此載體包含人IgGl的恒定區(qū)和鉸鏈區(qū)的突變形式，其與Fe受體的結(jié)合大大降低。將所得的載體CDM7B-PD-L30R VISTA用DHFR表達(dá)載體pSV-dhfr(Mclvor, R.S.,和 Simonsen, C.C.(1990).Nucleic AcidsRes 18，7025-7032)共轉(zhuǎn)染進(jìn)CHO(dhfr-)細(xì)胞系(ATCC#CRL-9096)。在無(wú)核苷酸的MEM-α培養(yǎng)基(Invitrogen)中選擇穩(wěn)定的表達(dá)ro-L30R VISTA-1g的CHO細(xì)胞克隆。用0.5_1 μ M甲氨蝶呤(SigmaM9929)進(jìn)一步擴(kuò)增產(chǎn)生了表達(dá)高水平的可溶性H)-L30R VISTA-1g融合蛋白的克隆。將融合蛋白從培養(yǎng)物上清液中用標(biāo)準(zhǔn)蛋白G柱親和層析進(jìn)一步純化。PD-L30R VISTA單克隆抗體的產(chǎn)生將亞美尼亞倉(cāng)鼠用過(guò)表達(dá)H)-L30R VISTA-RFP的EL4細(xì)胞每周免疫4次，然后用在CFA中乳化的H)-L30R VISTA-1g融合蛋白加強(qiáng)。加強(qiáng)后四周，將倉(cāng)鼠再次用可溶性PD-L30R VISTA-1g融合蛋白加強(qiáng)。最后一次加強(qiáng)后四天，收獲倉(cāng)鼠脾細(xì)胞，并使用標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤融合技術(shù)融合到骨髓瘤細(xì)胞系 SP2/0-Agl4(ATCC#CRL-1581) (Shulman, M.,Wilde, C.D.，和 Kohler, G.(1978).A better cell line formaking hybridomas secreting specificantibodies.Nature 276,269-270)。在有限稀釋后選擇分泌PD-L30R VISTA特異性抗體的雜交瘤克隆，并通過(guò)ELISA和流式細(xì)胞術(shù)兩種方法進(jìn)行篩選。RNA 和 RT-PCR通過(guò)使用TrizolTM(Invitrogen)方法根據(jù)廠商說(shuō)明采集各種小鼠組織樣品或純化的造血細(xì)胞類(lèi)型中的總RNA。cDNA通過(guò)使用iScriptTM cDNA合成試劑盒(Bio-Rad)而制備。使用等量的組織cDNA (IOng)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)以擴(kuò)增全長(zhǎng)H)-L30R VISTA。跑1%瓊脂糖凝膠后觀察PCR產(chǎn)物。流式細(xì)胞術(shù)在使用CellQuest軟件的FACSCAN(BD Bioscience)上進(jìn)行了流式細(xì)胞分析。使用FlowJo軟件(Treestar)分析了數(shù)據(jù)。細(xì)胞制備使用總CD4+T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi)從首次接觸試驗(yàn)的小鼠中分離了總CD4+T細(xì)胞。當(dāng)指定時(shí)，將富集的CD4+T細(xì)胞流式分選成首次接觸試驗(yàn)的(CD441OW⑶25-⑶62Lhi)和記憶(⑶44hi⑶25 -⑶62Llow)細(xì)胞群。對(duì)于體外增殖檢測(cè)分析，將⑶4+T細(xì)胞用5μΜ CFSE(Molecular Probes)在37°C標(biāo)記10分鐘，在刺激前洗滌兩次。
體外結(jié)合平板的T細(xì)胞活化檢測(cè)分析在指定的濃度比率下，在存在抗CD3(克隆2C11)以及ro_L30RVISTA_Ig或者對(duì)照Ig時(shí)將純化的⑶4+T細(xì)胞(100，000個(gè)細(xì)胞/孔)在平底96孔板中培養(yǎng)。例如，對(duì)于全程滴定，將 96 孔板用在 PBS 中與 1.25 48/!111(比率2:1)、2.5 4 8/1111(比率 1:1)、5 μ g/ml (比率1:2)或10 μ g/ml (比率1:4)PD-L30R VISTA-1g或者對(duì)照Ig蛋白一起混合的2.5 μ g/ml的α⑶3在4°C過(guò)夜包被。將孔用PBS洗滌3次，再添加⑶4+T細(xì)胞。在補(bǔ)充了 10%FBS、IOmM HEPES、50 μ M β-ME、青霉素/鏈霉素/L-谷氨酰胺的完全RPMI 1640培養(yǎng)基中平行培養(yǎng)。當(dāng)指定時(shí)，將100U/ml的人IL-2 (PeproTech)或滴定量的口 CD28 (克隆PV_l，Bio X細(xì)胞)與□⑶3—起包被，以補(bǔ)救H)-L30R VISTA-1g的抑制性作用。在第3天時(shí)分析培養(yǎng)物的CFSE譜，或根據(jù)指定的時(shí)間過(guò)程進(jìn)行。骨髓源性DC的培養(yǎng)、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)以及轉(zhuǎn)基因CD4+T細(xì)胞的刺激如所述生成了骨髓源性 DC (Lutz, M.B.，Kukutsch, N.，Ogilvie, A.L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N.,和 Schuler, G.(1999).An advancedculture methodfor generating large quantities of highly pure dendriticcells from mousebone marrow.J Tmmunol Methods 223, 77-92 ；Son, Y.1., Egawa, S., Tatsumi, T., Redlinger, R.E., Jr., Kalinski, P.,和 Kanto,T.(2002).A novel bulk-culture method forgenerating mature dendriticcells from mouse bone marrow cells J Tmmunol Methods262，145-157)，但作了一些改進(jìn)。簡(jiǎn)而言之，在第0天，通過(guò)用27號(hào)針頭沖洗從脛骨和股骨分離了骨髓細(xì)胞。紅細(xì)胞裂解后，在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Nunc，Inc.)中將l_2x 106個(gè)骨髓細(xì)胞重懸在Iml含20ng/ml GM-CSF(Peprotech Inc)的完全RPMI 1640培養(yǎng)基中。將含有RFP或者H)-L30R VISTA-RFP逆轉(zhuǎn)錄病毒的2ml上清液加到骨髓細(xì)胞中。還以8 μ g/ml的最終濃度加入了凝聚胺(Sigma)。通過(guò)在室溫下將平板以2000rpm離心45分鐘進(jìn)行感染。然后，將細(xì)胞再培養(yǎng)2小時(shí)，之后加入新鮮培養(yǎng)基。在第+1天、第+3天、第+5天以及第+7天重復(fù)類(lèi)似的感染操作。在第 +10天收集松散貼壁細(xì)胞(90%為⑶11c+)，分選⑶llc+RFP+雙陽(yáng)性細(xì)胞并用于刺激轉(zhuǎn)基因OT-1I CD4+T細(xì)胞。對(duì)于OT-1I T細(xì)胞增殖檢測(cè)分析，在存在滴定量的合成0VA323-339肽(Anaspec)的情況下，將100，000個(gè)CFSE標(biāo)記的OT-1I CD4+T細(xì)胞在具有30，000個(gè)分選的RFP+或者H)-L30R VISTA-RFP+BMDC的96孔圓底板中培養(yǎng)。通過(guò)檢查CFSE譜在72小時(shí)時(shí)分析了 OT-1I T細(xì)胞的增殖。PD-L30R VISTA響應(yīng)免疫的表達(dá)研究為了免疫轉(zhuǎn)基因小鼠D011.10，將 300μ g OVA(Sigma) ^ CFA (200 μ I)中乳化，皮下注射進(jìn)小鼠側(cè)腹。在指定的時(shí)間點(diǎn)收獲引流區(qū)和非引流區(qū)腹股溝淋巴結(jié)。制備單細(xì)胞懸液，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析了 H)-L30R VISTA以及其他表面標(biāo)志物的表達(dá)。PD-L30R VISTA 的抑制性活性。通過(guò)使用體外過(guò)表達(dá)I3D-Ll的抗原呈遞細(xì)胞與⑶4+和⑶8+T細(xì)胞抗原受體轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞和抗原刺激揭露了 PD-Ll的抑制活性(Carter，等(2002) Eur.J.1mmunol.32:634-43)。相似地，將本文公開(kāi)的表達(dá)全長(zhǎng)H)-L30R VISTA的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)表達(dá)II類(lèi)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)和I類(lèi)MHC的細(xì)胞系。根據(jù)既定的方法測(cè)定TEaTg或2C轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞對(duì)空白載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的或H)-L30R VISTA轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞所呈遞的抗原的應(yīng)答。
蛋白表達(dá)。淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞亞群以及非造血組織中的表達(dá)模式通過(guò)RT-PCR和western印跡分析使用標(biāo)準(zhǔn)方案結(jié)合本文所公開(kāi)的a TO-L30R VISTA抗體進(jìn)行測(cè)定。單克隆抗體的產(chǎn)生。H)-L30R VISTA在鼠B細(xì)胞系A(chǔ)20中過(guò)表達(dá)，并將重組細(xì)胞系用于免疫亞美尼亞倉(cāng)鼠。在5次細(xì)胞免疫后，用在CFA中乳化的純化H)-L30R VISTA-1g融合蛋白對(duì)倉(cāng)鼠進(jìn)行加強(qiáng)。四周后，用可溶性H)-L30R VISTA-1g提供最終加強(qiáng)。之后，在第4天，進(jìn)行倉(cāng)鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞的融合。通過(guò)ELISA鑒定了識(shí)別H)-L30R VISTA-1g融合蛋白的十六個(gè)不同的克隆，以及染色在鼠T細(xì)胞系EL4上過(guò)表達(dá)的H)-L30R VISTA但非ro-Li。其中十一個(gè)克隆被成功亞克隆和制備，用于評(píng)價(jià)它們?nèi)旧?xì)胞和組織上內(nèi)源性PD-L30R VISTA以及阻斷PD-L30R VISTA功能的能力。增殖檢測(cè)分析:設(shè)計(jì)了體外⑶4T細(xì)胞增殖檢測(cè)分析法以篩選H)-L30R VISTAmAb活性。在此檢測(cè)分析中，通過(guò)微板孔中的固定化抗CD3 (其與T細(xì)胞受體交聯(lián))刺激T細(xì)胞。使用ro-L30RVISTA-1g融合蛋白(由融合到人IgG的Fe部分的H)-L30R VISTA胞外域構(gòu)成)，以?xún)煞N不同的配置檢測(cè)了 H)-L30R VISTA mAb的活性。首先，當(dāng)將mAb與α⑶3共固定時(shí)，只在添加的可溶性TO-L30R VISTA-1g融合蛋白的存在下，其才強(qiáng)效抑制了 T細(xì)胞增殖。此活性取決于ro-L30RVISTA-1g結(jié)合到孔中的固定化mAb的能力。使用這種形式的檢測(cè)分析法，鑒定了具有高、中或低抑制活性的克隆。第二，當(dāng)將mAb作為可溶性試劑加到檢測(cè)分析中時(shí)，其通過(guò)固定的H)-L30R VISTA-1 g融合蛋白的協(xié)同增效對(duì)T細(xì)胞增殖產(chǎn)生了強(qiáng)效的抑制活性。在這種形式的檢測(cè)分析法中，鑒定了具有各種抑制活性的克隆。實(shí)施例1:PD_L30R VISTA的克隆和序列分析。通過(guò)靜息Treg、a CD3活化的Treg以及a CD3/ a GITR活化的Treg的整體轉(zhuǎn)錄譜分析鑒定了 ro-L30R VISTA和Treg-sTNF。選擇了 a GITR用于此分析，因?yàn)門(mén)reg上GITR的觸發(fā)已表明可壓制它們的接觸依賴(lài)性抑制活性(Shimizu，等(2002)同上)。在AFFIMETRIX DNA陣列上基于H)-L30R VISTA和Treg-sTNF的獨(dú)特表達(dá)模式對(duì)它們進(jìn)行了鑒定(表I)。H)-L30R VISTA在α⑶3活化的Treg中表現(xiàn)出表達(dá)增強(qiáng)，在存在a GITR時(shí)表達(dá)降低；以及Treg-sTNF表現(xiàn)出表達(dá)的α⑶3/ a GITR依賴(lài)性增強(qiáng)。通過(guò)無(wú)、α⑶3或α⑶3/ a GITR在過(guò)夜培養(yǎng)中刺激了純化的⑶4+⑶25+Τ細(xì)胞，并分離了 RNA用于實(shí)時(shí)PCR分析。列出的表達(dá)以肌動(dòng)蛋白為比較。表I
mRNA相對(duì)表達(dá)
E|aCD3|aCD3/aGITR----
PD-L3 OR VISTA 6107
Treg-STNF0.203L5活化的與靜息的CD25+CD4+nTreg的Affymetrix分析表明，基因產(chǎn)物(RIKEN cDNA4632428N05或4632428N05Rik)的表達(dá)具有未知的功能，但與Ig超家族具有序列同源性。
更具體地講，從⑶4+T細(xì)胞cDNA文庫(kù)克隆了 930bp基因產(chǎn)物，其與預(yù)測(cè)的大小和序列相符。電子延伸序列和結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè)成熟時(shí)309個(gè)氨基酸的跨膜蛋白，其具有159個(gè)氨基酸的胞外域、22個(gè)氨基酸的跨膜域以及95個(gè)氨基酸的胞質(zhì)域(圖1A)。氨基酸序列比對(duì)揭露了與B7家族配體諸如PD-Ll、PD-L2、B7-H3和B7-H4以及B7家族受體(S卩，PD-1、CTLA-4、CD28、BTLA、IC0S)同源的胞外免疫球蛋白(Ig)-V樣結(jié)構(gòu)域(圖1B-C)。雖然B7家族配體與受體之間Ig-V結(jié)構(gòu)域的序列同一性通常不是非常高(〈40%)，但是4632428N05Rik的Ig-V結(jié)構(gòu)域具有與B7家族配體I3D-Ll和TO-L2的最高同源性。序列比對(duì)還揭露出若干高度保守的半胱氨酸(圖1B)，它們對(duì)于鏈內(nèi)二硫鍵的形成具有重要意義，而鏈內(nèi)二硫鍵形成為 B7 家族配體所特有(Sica 等，(2003).1mmunity 18，849-861)。4632428N05Rik的胞外域只含Ig-V結(jié)構(gòu)域而無(wú)Ig-C結(jié)構(gòu)域(圖1B-C)。此獨(dú)特特征為B7家族受體所特有，并將4632428N05Rik與所有其他B7家族配體區(qū)分開(kāi)來(lái)，后者既包含 Ig-V 也包含 Ig-C 結(jié)構(gòu)域(Freeman, G.J.(2008).Proc Natl Acad Sci USA105，10275-10276 ;Lazar-Molnar等，(2008).Proc Natl Acad Sci USA 105，10483-10488 ；Lin 等，(2008)，Proc Natl Acad Sci USA 105，3011-3016 ;Schwartz 等，(2001)，Nature410，604-608 ；Stamper 等，(2001)，Nature 410, 608-61)。一致地，使用 PhyML 算法(系統(tǒng)發(fā)育最大可能性)的系統(tǒng)發(fā)生分析將4632428N05Rik放在了與B7家族受體、尤其是與F1D-1比與B7家族配體更近的進(jìn)化距離(圖2) (Guindon, S.,和Gascuel, 0.(2003).A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large phylogeniesby maximumlikelihood.Syst Biol 52,696-704)。然而，PD-L30R VISTA 的胞質(zhì)尾部不含任何信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(如ITIM、ITAM或ITSM)，其為B7家族受體的身份結(jié)構(gòu)域(signature domain)(Sharpe, A.Η.,和 Freeman, G.J.(2002).The B7-CD28superfamily.Nat Rev Immunol 2,116-126)。因此假設(shè)不管其與抑制性受體I3D-1的親密進(jìn)化關(guān)系，4632428N05Rik代表了 B7配體家族的新成員?；谶@些結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)生特性，將此分子命名為 PD-l-eXpressed as Ligand (PD-L30R VISTA)。PD-L30RVISTA 在小鼠與人直系同源體之間也高度保守，共有77%的序列同一性(圖1D)。編碼小鼠H)-L30R VISTA的核酸序列在本文如SEQ ID NO:1所示，小鼠ro_L30RVISTA蛋白序列如SEQ ID N O:2所示。PD-L30R VISTA的人同源物位于10號(hào)染色體上(72.9Mb)，并由6個(gè)外顯子構(gòu)成，從而產(chǎn)生編碼311個(gè)殘基蛋白的長(zhǎng)度為4689個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄物。人同源物mRNA編碼序列以GENBANK登錄號(hào)NM 022153提供，蛋白序列作為NP 071436給出。編碼人TO-L30RVISTA的核酸序列在本文如SEQ ID N0:3所示，人H)-L30R VISTA蛋白序列如SEQ ID N0:4所示。小鼠和人基因共有74%的同源性并且在蛋白水平上68%相同。還在褐家鼠第20號(hào)染色體(27.7Mb ;GENBANK登錄號(hào)BC098723)以及紅鰭東方豚和斑馬魚(yú)中鑒定了同源物。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的H)-L30R VISTA蛋白共有如SEQ ID NO:5所示的共同氨基酸序列。實(shí)施例2:通過(guò)RT-PCR分析和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行的H)-L30RVISTA表達(dá)研究如圖3中的實(shí)驗(yàn)所示，RT-PCR分析用于確定小鼠組織中H)-L30R VISTA的mRNA表達(dá)模式(圖3A)。PD-L30R VISTA主要在造血組織(脾臟、胸腺、骨髓)或具有豐富淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的組織(即，肺)上表達(dá)。在非造血組織(即，心臟、腎臟、腦和卵巢)中也檢測(cè)到了弱表達(dá)。若干造血細(xì)胞類(lèi)型的分析揭露了 H)-L30R VISTA在腹腔巨噬細(xì)胞、脾⑶Ilb+單核細(xì)胞、⑶llc+DC、⑶4+T細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞上表達(dá)，但在B細(xì)胞上表達(dá)水平較低(圖3B)。此表達(dá)模式還與 GNF(Genomics Institute of Novartis Research Foundation)基因陣列數(shù)據(jù)庫(kù)(Su 等，(2002)，Proc Natl Acad Sci USA 99, 4465-4470)以及 NCBIGEO (geneexpression omnibus)數(shù)據(jù)庫(kù)高度一致(圖 4A-D)。為了研究蛋白表達(dá)，產(chǎn)生了 H)-L30R VISTA特異性倉(cāng)鼠8D8和6E7單克隆抗體。通過(guò)過(guò)表達(dá)的H)-L30R VISTA的鼠EL4T細(xì)胞上的陽(yáng)性染色但在I3D-Ll過(guò)表達(dá)EL4的細(xì)胞上的負(fù)性染色證實(shí)了特異性(圖5)。針對(duì)H)-L30R VISTA的多克隆和單克隆抗體均得到提高。使用兔抗H)-L30R VISTA抗體，PD-L30R VISTA蛋白定位到淋巴器官并顯著存在于腦組織中。在這些鑒定的單克隆抗體中，進(jìn)一步評(píng)價(jià)了 aTO-L30R VISTA克隆8D8的特異性。在此分析中，測(cè)試了克隆8D8針對(duì)一組 PD-L 樣 Ig 融合蛋白分子(包括 CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、PD-L30RVISTA和hlg)的結(jié)合。此分析的結(jié)果表明，8D8aTOL-3對(duì)H)-L30R VISTA具有高度特異性。具體地講，使用抗H)-L30R VISTA mAb克隆8D8，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析了造血細(xì)胞上的ro-L30R VISTA表達(dá)。Foxp3GFP敲入報(bào)告小鼠用于區(qū)分CD4+nTreg(34)。在外周淋巴器官(脾臟和淋巴結(jié))中，在所有CD4+T細(xì)胞亞群中均觀察到了顯著的表達(dá)(參見(jiàn)總CD4+T細(xì)胞、或Foxp3首次接觸試驗(yàn)的T細(xì)胞和Foxp3+nTreg細(xì)胞，以及記憶CD4+T細(xì)胞)，而CD8+T細(xì)胞表達(dá)明顯低的表面H)-L30RVISTA量(圖3C)。在胸腺中，PD-L30R VISTA表達(dá)在⑶4+⑶8+雙陽(yáng)性胸腺細(xì)胞上為陰性，在⑶4單陽(yáng)性細(xì)胞上較低，在⑶8單陽(yáng)性細(xì)胞上可檢測(cè)。接下來(lái)，對(duì)于脾和腹膜細(xì)胞(包括F4/80巨噬細(xì)胞和骨髓CDllc+DC兩者)均可觀察到高H)-L30R VISTA表達(dá)與⑶Ilb標(biāo)志物的強(qiáng)關(guān)聯(lián)(圖3D-E)。在另一方面，B細(xì)胞和NK細(xì)胞對(duì)H)-L30R VISTA表達(dá)主要為陰性。小百分比的Gr-1+粒細(xì)胞也表達(dá)ro_L30RVISTA (圖 3F)。在來(lái)自不同淋巴器官的相同細(xì)胞譜系上顯示出差異表達(dá)模式(圖3G)。對(duì)于⑶4+T細(xì)胞和⑶Ilb中間單核細(xì)胞，表達(dá)水平遵循腸系膜淋巴結(jié) > 外周淋巴結(jié)和脾臟 > 腹腔和血液的模式。此模式對(duì)于⑶Ilbhi細(xì)胞不太明顯。該數(shù)據(jù)表明，某些細(xì)胞上H)-L30R VISTA表達(dá)可能受細(xì)胞成熟度和/或組織微環(huán)境的調(diào)節(jié)。除了新分離的細(xì)胞外，還在進(jìn)行活化以及無(wú)活化的體外培養(yǎng)后分析了脾CD4+T細(xì)胞、⑶Ilbhi單核細(xì)胞和⑶llc+DC細(xì)胞上的ro-L30R VISTA表達(dá)(圖6)。將脾細(xì)胞用培養(yǎng)基或用抗CD3(用于活化T細(xì)胞)或用IFN □和LPS (用于活化單核細(xì)胞和DC)培養(yǎng)24小時(shí)后，分析PD-L30R VISTA以及其他B7家族配體(如PD-L1、PD-L2、B7-H3和B7-H4)的表達(dá)。此比較揭露了這些分子之間差別性的表達(dá)模式。H)-L30R VISTA表達(dá)在體外培養(yǎng)時(shí)在所有細(xì)胞上均迅速喪失，而無(wú)論活化狀態(tài)如何。相比之下，PD-Ll表達(dá)在刺激時(shí)在⑶4+T細(xì)胞上、在僅培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)在⑶Ilbhi單核細(xì)胞和⑶llc+DC上上調(diào)，并在面對(duì)刺激時(shí)進(jìn)一步增強(qiáng)。H)-L2、B7-H3和B7-H4的表達(dá)在所用培養(yǎng)條件下不突出。H)-L30R VISTA表達(dá)在體外的喪失與其他B7家族配體相比是獨(dú)有的，但可能反映了未能模擬組織微環(huán)境的非最佳培養(yǎng)條件。為了弄清可如何在體內(nèi)調(diào)節(jié)H)-L30R VISTA表達(dá)，將CD4TCR轉(zhuǎn)基因小鼠D011.10用在完全弗氏佐劑(CFA)中乳化的同種 抗原雞卵清蛋白(OVA)免疫。免疫后24小時(shí)時(shí)，分析引流淋巴結(jié)中的細(xì)胞的H)-L30R VISTA表達(dá)(圖7A)。僅用抗原(CFA/0VA)而無(wú)佐劑免疫顯著增加了⑶llb+PD-L30R VISTA+骨髓細(xì)胞群，其包含F(xiàn)4/80+巨噬細(xì)胞與⑶llc+DC的混合細(xì)胞群。與ro-Li和ro-L2的進(jìn)一步比較揭露出，雖然ro-Li具有最高的組成型表達(dá)水平，但ro-L30R VISTA在這樣的炎癥免疫應(yīng)答期間受到了最高的上調(diào)(圖7B)。總而言之，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明，骨髓APC上H)-L30R VISTA的表達(dá)由免疫系統(tǒng)嚴(yán)格調(diào)節(jié)，其可能有助于在控制免疫應(yīng)答和調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫中的作用。與其在APC升高的表達(dá)相比，PD-L30R VISTA表達(dá)在活化的D011.10CD4+T細(xì)胞上在免疫后較晚的時(shí)間點(diǎn)降低(即，在48小時(shí)而非24小時(shí)時(shí))(圖8)。此結(jié)果表明，體內(nèi)⑶4T細(xì)胞上的H)-L30RVISTA表達(dá)可由其活化狀態(tài)以及活性免疫應(yīng)答期間的細(xì)胞因子微環(huán)境而調(diào)節(jié)。實(shí)施例3:PD-L30R VISTA信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的功能性影響產(chǎn)生了 PD-L30R VISTA-1g融合蛋白以研究PD-L30R VISTA對(duì)CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用。H)-L30R VISTA-1g融合蛋白包含融合到人IgGlFc區(qū)的H)-L30R VISTA的胞外域。當(dāng)固定在微板上時(shí)，PD-L30R VISTA-1g而非對(duì)照Ig抑制了粗純化⑶4+和⑶8+T細(xì)胞響應(yīng)結(jié)合平板的抗CD3刺激而發(fā)生的增殖，如通過(guò)受抑制的細(xì)胞分裂而確定(圖9A-B)。PD-L30R VISTA Ig融合蛋白不影響抗⑶3抗體吸收到塑料孔，如通過(guò)ELISA確定(未顯示數(shù)據(jù))，從而排除了非特異性抑制作用的可能性。PD-1K0 CD4+T細(xì)胞也受到抑制(圖9C)，從而表明PD-1不是PD-L30R VISTA的受體。還直接比較了 PD-Ll-1g和PD-L30R VISTA-1g的抑制作用(圖10)。當(dāng)使滴定量的Ig融合蛋白與口 CD3 —起吸收到微板以刺激CD4+T細(xì)胞時(shí)，PD-L30RVISTA-1g表 現(xiàn)出與TO-Ll-1g融合蛋白相似的抑制效果。由于粗純化的CD4+T細(xì)胞包含各種亞群，因此評(píng)價(jià)了 H)-L30RVISTA-1g對(duì)分選的首次接觸試驗(yàn)的(CD25-CD441owCD62Lhi)以及記憶(CD25_CD44hiCD62Llow) CD4+T 細(xì)胞亞群的影響(圖11)。據(jù)顯示，PD-L30R VISTA可抑制兩種亞群的增殖，雖然對(duì)記憶細(xì)胞的效果要弱得多。為了進(jìn)一步理解H)-L30R VISTA介導(dǎo)的抑制的機(jī)制，在存在或不存在ro_L30RVISTA-1g的情況下在T細(xì)胞活化后測(cè)量了早期TCR活化標(biāo)志物的表達(dá)以及細(xì)胞凋亡。與對(duì)細(xì)胞增殖的負(fù)影響一致，存在對(duì)早期活化標(biāo)志物⑶69、⑶44和⑶62L表達(dá)的全局性抑制(補(bǔ)充圖12A)。在另一方面，H)-L30R VISTA-1g融合蛋白未誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。相反，在存在ro-L30R VISTA或者VISTA-1g的情況下，在TCR活化的早期(24小時(shí))和晚期(48小時(shí))均觀察到了比對(duì)照Ig低的細(xì)胞凋亡(通過(guò)膜聯(lián)蛋白V+7AAD-細(xì)胞的百分比確定)(圖12B)。例如，在24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，在總“非分類(lèi)”細(xì)胞群中，約27%的細(xì)胞在存在PD-L30R VISTA或者VISTA-1g下凋亡，而對(duì)照細(xì)胞則有約39%的凋亡。當(dāng)在活細(xì)胞Rl分類(lèi)中研究細(xì)胞時(shí)，明顯的是，PD-L30RVISTA或者VISTA-1g強(qiáng)烈抑制了活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(ACID)，因?yàn)楫?dāng)用H)-L30R VISTA或者VISTA-1g處理時(shí)約72.6%的對(duì)照細(xì)胞變?yōu)榈蛲?而試驗(yàn)細(xì)胞只有43.5%凋亡。對(duì)于48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)也觀察到了相似的結(jié)果。因此，看來(lái)PD-L30R VISTA或者VISTA通過(guò)抑制早期TCR活化以及抑制細(xì)胞分裂而負(fù)調(diào)節(jié)⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答，但對(duì)細(xì)胞凋亡的直接影響極低。此抑制機(jī)制與B7-H4的類(lèi)似(Sica，G.L.，Choi, 1.H.，Zhuj G.，Tamadaj K.，Wang, S.D.，Tamuraj Η.，Chapovalj A.1.，F(xiàn)lies, D.B.，Bajorathj J.，和 Chen，L (2003).B7-H4, a molecule of theB7 family, negatively regulates T cellimmunity.1mmunity 18，849-861)。
開(kāi)發(fā)了兩步檢測(cè)分析法，以確定H)-L30R VISTA或者VISTA-1g能否抑制預(yù)活化的⑶4T細(xì)胞以及其抑制作用的持久性如何。據(jù)顯示，PD-L30R VISTA或者VISTA-1g融合蛋白的抑制作用持續(xù)到其撤去后24小時(shí)后活化(圖9D)。此外，首次接觸試驗(yàn)的和預(yù)活化CD4+T細(xì)胞均能被 PD-L30R VISTA 或者 VISTA-1g 抑制(圖 9D1、9Diii 和 9Div)。接下來(lái)，分析了 H)-L30R VISTA或者VISTA-1g對(duì)CD4+T細(xì)胞細(xì)胞因子產(chǎn)生情況的影響。ro-L30R VISTA或者VISTA-1g抑制了從粗純化的CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生Thl細(xì)胞因子IL-2以及IFNa (圖13A-B)。H)-L30R VISTA或者VISTA的影響在單獨(dú)的首次接觸試驗(yàn)的(⑶25-⑶441ow⑶62Lhi)和記憶(⑶25-⑶44hi⑶62Llow)⑶4+T細(xì)胞群中進(jìn)行了進(jìn)一步測(cè)試。據(jù)顯示，記憶⑶4+T細(xì)胞是⑶4+T細(xì)胞小室內(nèi)細(xì)胞因子產(chǎn)生的主要來(lái)源，而ro-L30RVISTA或者VISTA可抑制這種產(chǎn)生(圖13C-D)。還顯示了 PD-L30R VISTA或者VISTA對(duì)CD8+T細(xì)胞中IFNa產(chǎn)生情況具有類(lèi)似的抑制作用(圖13E)。H)-L30R VISTA或者VISTA對(duì)CD4+和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的這種抑制作用與H)-L30RVISTA或者VISTA是下調(diào)免疫應(yīng)答的抑制性配體的假設(shè)抑制。接下來(lái)，設(shè)計(jì)了多項(xiàng)研究以確定能夠克服H)-L30R VISTA或者VISTA的抑制作用的因子。鑒于ro-L30R VISTA或者VISTA抑制了 IL-2產(chǎn)生，并且IL-2對(duì)T細(xì)胞存活和增殖至關(guān)重要，我們假設(shè)IL-2可能避開(kāi)H)-L30R VISTA或者VISTA的抑制活性。如在圖14A中所示，外源性IL-2但非IL-15、IL-7或IL-23部分逆轉(zhuǎn)了 PD-L30RVISTA或者VISTA-1g對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。通過(guò)高水平IL-2的不完全補(bǔ)救表明，PD-L30R VISTA或者VISTA信號(hào)傳導(dǎo)比單純的IL-2產(chǎn)生靶向了更寬的T細(xì)胞活化途徑。在另一方面，通過(guò)抗CD28激動(dòng)性抗體提供的強(qiáng)效協(xié)同刺激完全逆轉(zhuǎn)了 H)-L30R VISTA或者VISTA-1g介導(dǎo)的抑制(圖14B)，而中等水平的協(xié)同刺激仍受到H)-L30R VISTA或者VISTA信號(hào)傳導(dǎo)的抑制(圖14C)。此結(jié)果表明，PD-L30R VISTA或者VISTA介導(dǎo)的免疫抑制將在較弱的炎癥條件下更有效，但必然會(huì)被強(qiáng)烈的正協(xié)同刺激信號(hào)推翻。就這一點(diǎn)而言，PD-L30R VISTA或者VISTA與其他抑制性B7 家族配體諸如 PD-Ll 和 B7-H4 都具有這一特征(Sica 等，(2003)，Immunity 18,849-861 ；Carter 等，(2002), Eur J Tmmunol 32, 634-643)。除了 H)-L30R VIS TA或者VISTA-1g融合蛋白外，還有必要確認(rèn)在APC上表達(dá)的PD-L30R VISTA或者VISTA能否抑制APC與T細(xì)胞同種相互作用期間的抗原特異性T細(xì)胞活化。為此，通過(guò)在穩(wěn)定表達(dá)MHC II和B7-2分子的人工抗原呈遞細(xì)胞系(CHO-APC)中的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)表達(dá)了 H)-L30R VISTA或者VISTA-RFP或RFP對(duì)照蛋白(Latchman等，(2001), Nat Immunol 2,261-268)。在 CHO 中表達(dá) PD-L30R VISTA 或 VISTA 的一個(gè)問(wèn)題在于，大部分H)-L30RVISTA或VISTA未能定位到細(xì)胞表面，這可能是由于對(duì)H)-L30RVISTA或VISTA表面定位缺乏支持的陌生環(huán)境所致(未顯示數(shù)據(jù))。雖然在H)-L30R VISTA或VISTA的胞質(zhì)尾部上不存在表明調(diào)節(jié)模式的明確基序，但我們推測(cè)該尾部可能在其細(xì)胞內(nèi)定位中發(fā)揮作用。因此，設(shè)計(jì)了無(wú)尾的H)-L30R VISTA或VISTA突變體，并發(fā)現(xiàn)其成功定位到CHO細(xì)胞表面(未顯示數(shù)據(jù))。為了刺激T細(xì)胞應(yīng)答，將CH0-PD-L30R VISTA或者VISTA或CHO-RFP細(xì)胞與D011.10⑶4+T細(xì)胞在存在抗原性O(shè)VA肽的情況下一起溫育。如圖15A-C所示，CH0-PD-L30RVISTA或者VISTA比CHO-RFP細(xì)胞誘導(dǎo)了較少的D011.10細(xì)胞增殖。此抑制作用在較低的肽濃度下更加顯著，與較強(qiáng)的刺激信號(hào)將會(huì)克服H)-L30RVISTA或VISTA的抑制影響的想法—致。此外，確認(rèn)了全長(zhǎng)H)-L30RVISTA或VISTA對(duì)天然APC的抑制作用。體外培養(yǎng)的骨髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞(BMDC)不表達(dá)高水平的H)-L30R VISTA或VISTA(圖16)。通過(guò)在10天培養(yǎng)期中的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)在BMDC中表達(dá)了 H)-L30R VISTA或者VISTA-RFP或RFP。將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞基于RFP表達(dá)分選均勻。PD-L30R VISTA或VISTA在轉(zhuǎn)導(dǎo)DC上的表達(dá)水平通過(guò)用抗H)-L30R VISTA或者VISTA mab染色而進(jìn)行了估計(jì)，并發(fā)現(xiàn)與新分離的腹腔巨噬細(xì)胞上的水平相似，因此在生理表達(dá)范圍內(nèi)(圖16)。然后將分選的BMDC在存在OVA肽的情況下用于刺激OVA特異性轉(zhuǎn)基因CD4+T細(xì)胞(0T II )(圖15D)。其中顯示，PD-L30R VISTA或VISTA對(duì)BMDC的表達(dá)抑制了同種CD4+T細(xì)胞增殖應(yīng)答。此結(jié)果與之前使用H)-L30RVISTA或者VISTA-1g融合蛋白以及CHO-APC細(xì)胞的結(jié)果一致，從而表明H)-L30R VISTA或VISTA可抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。實(shí)施例4:在多發(fā)性硬化動(dòng)物模型(EAE)中評(píng)價(jià)抗H)-L30RVISTA或VISTA抗體由于口 TO-L30R VISTA或者VISTA mAb在體內(nèi)似乎會(huì)抑制T細(xì)胞應(yīng)答，因此測(cè)試了 Dro-LSOR VISTA或VISTA以評(píng)價(jià)其是否能抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病。使用實(shí)驗(yàn)性過(guò)敏性腦脊髓炎(EAE)模型，確定了 DroL-LSmAb對(duì)炎性疾病的功能影響。EAE是廣泛使用的人自身免疫疾病多發(fā)性硬化的鼠模型。EAE可通過(guò)佐劑中的髓鞘抗原免疫或通過(guò)髓鞘特異性T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移而誘導(dǎo)，其導(dǎo)致各種效應(yīng)T細(xì)胞和B細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞的炎性浸潤(rùn)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘脫失。a PDL-L3mAb在被動(dòng)EAE模型中進(jìn)行了測(cè)試以避免誘導(dǎo)因注射大量作為外源抗原的mAb的過(guò)敏反應(yīng)。在此過(guò)繼轉(zhuǎn)移EAE模型中，將供體SJL小鼠用CFA和PLP肽免疫。在第10天，分離了引流淋巴結(jié)中的總淋巴細(xì)胞，并用PLP肽、IL-23 (20ng/ml)和抗IFNg (IOng/ml)體外培養(yǎng)4天。然后純化擴(kuò)增后的CD4T細(xì)胞，過(guò)繼轉(zhuǎn)移至首次接觸試驗(yàn)的受體小鼠。此分析表明，a PDL-L3mAb延遲了疾病發(fā)作，以及減輕了疾病嚴(yán)重性，從而大大偏移了疾病進(jìn)展曲線(圖17)。此外，其在大百分比的小鼠中降低了嚴(yán)重性，并大大提高了存活率，從約22%至超過(guò)75%。這證實(shí)了 aroL-L3mAb在EAE中的活性與體外數(shù)據(jù)一致，并證實(shí)了使用此試劑作為各種炎癥疾病中的新型免疫調(diào)節(jié)試劑。實(shí)施例5 =VISTA在CNS中的表達(dá)還實(shí)現(xiàn)了 VISTA在CNS中的表達(dá)。這些檢測(cè)分析揭露了，在患病小鼠中，VISTA表達(dá)在⑶Ilb+細(xì)胞(圖23)上顯著降低(從76%至33%)，與VISTA喪失可能會(huì)增強(qiáng)炎癥的假設(shè)一致。當(dāng)我們將本文中的炎癥骨髓細(xì)胞與表達(dá)極高水平VISTA的腫瘤中的MDSC進(jìn)行對(duì)比時(shí)，這一現(xiàn)象引人關(guān)注并可能在功能上具有重要意義。據(jù)報(bào)道，EAE小鼠在脾臟中具有提高數(shù)量的髓源性抑制細(xì)胞(CDllb+Ly-6ChighMDSC)，其對(duì)T細(xì)胞活化具有強(qiáng)抑制性并可緩和疾病32。我們的數(shù)據(jù)強(qiáng)烈支持VISTA可在EAE的骨髓介導(dǎo)的抑制中發(fā)揮作用。實(shí)施例6 =VISTA在EAE中對(duì)T細(xì)胞命運(yùn)和功能的影響。我們還進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，分析VISTA在EAE中對(duì)T細(xì)胞命運(yùn)和功能的作用。我們想評(píng)價(jià)VISTA是否會(huì)改變病原性致腦炎T細(xì)胞的發(fā)育、克隆性T細(xì)胞擴(kuò)增、T細(xì)胞極性、壽命以及Teff向Treg的轉(zhuǎn)化。我們研究了 VISTA阻斷在EAE中對(duì)T細(xì)胞命運(yùn)的影響。與較高的疾病評(píng)分一致，在病程結(jié)束時(shí)對(duì)CN S的分析確認(rèn)了在13F3( 口 VISTA)處理組中明顯更多的產(chǎn)IL17A的CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)(從0.66%至11%)(圖24)。
實(shí)施例7:PD-L30R VISTA或VISTA轉(zhuǎn)基因和敲除小鼠使用胚胎的慢病毒感染，產(chǎn)生了四只泛表達(dá)H)-L30R VISTA或VISTA的轉(zhuǎn)基因小鼠。這些小鼠在人延伸因子I啟動(dòng)子的控制下表達(dá)全長(zhǎng)H)-L30R VISTA或VISTA。這些小鼠使用慢病毒載體PWPT而產(chǎn)生。與其他ro-Ll家族成員相似(Appay，等(2002)J.1mmunol.168:5954-8)，預(yù)期H)-L30R VISTA或VISTA在體內(nèi)將作為負(fù)調(diào)控因子發(fā)揮作用而在體外則起到協(xié)同刺激α⑶3T細(xì)胞增殖的功能。在這一方面，預(yù)計(jì)這些小鼠會(huì)自然發(fā)生自身免疫，并評(píng)價(jià)了在H)-L30RVISTA或VISTA轉(zhuǎn)基因小鼠中的體內(nèi)免疫應(yīng)答(即，體液免疫應(yīng)答、T細(xì)胞啟動(dòng)等)以評(píng)估系統(tǒng)性自身免疫疾病發(fā)展。對(duì)于敲除小鼠，將PD-L30R VISTA或VISTA通過(guò)同源重組而滅活。含全長(zhǎng)PD-L30RVISTA 或 VISTA 序列的 BAC 克隆購(gòu)自 INVITROGEN (Carlsbad, CA)。PD-L30R VISTA 或 VISTA靶向載體通過(guò)將位于H)-L30R VISTA或VISTA基因的第二外顯子5’側(cè)的1.6kb片段插入新霉素基因上游，以及將位于H)-L30R VISTA或VISTA基因的第三外顯子3’側(cè)的5kb片段插入新霉素基因下游而生成。將B6源性胚胎干(ES)細(xì)胞用H)-L30R VISTA或VISTA靶向載體進(jìn)行電穿孔，并選擇重組克隆。然后將所選的克隆注射進(jìn)C57BL/6胚泡，將所得的嵌合雄性子代與FLP剔除小鼠交配以移除新霉素盒。通過(guò)基因組DNA的PCR確定靶向的等位基因在子代中的傳遞。第二和第三外顯子包含H)-L30R VISTA或VISTA結(jié)構(gòu)域，因此，所得的小鼠只具有滅活形式的H)-L30R VISTA或VISTA分子。PD-L30R VISTA或VISTA缺陷小鼠的總體免疫能力像其他I3D-L-/-小鼠一樣進(jìn)行確定，包括評(píng)價(jià)T細(xì)胞對(duì)抗原 的應(yīng)答、體液免疫原應(yīng)答、明顯的自身免疫(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎性腸病)以及對(duì)誘導(dǎo)的自身免疫疾病(實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎)增加的易感性(Chen (2004)同上)。實(shí)施例8:PD_L30R VISTA或VISTA特異性抗體在膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中測(cè)試如圖18中的實(shí)驗(yàn)所示，將雄性DBA/1 J小鼠用100 μ I在CFA中含100 μ g雞II型膠原(C II )的乳液(結(jié)核分枝桿菌3.5mg/ml)在尾根部進(jìn)行免疫,并在免疫后21天用100 μ g水性C-1I經(jīng)腹腔注射進(jìn)行加強(qiáng)。各治療組的小鼠(n=6)如所示分別為未處理(NT-黑色圓形)、注射300 μ g倉(cāng)鼠IgG (Ham Ig-黑色方形)或注射300 μ g單克隆抗體〃7c9〃 (紅色三角形)或〃 13F3〃(綠色三角形)注射。每2天進(jìn)行一次注射。在指定的天數(shù)以0-4的量表對(duì)每只小鼠各爪子的關(guān)節(jié)腫脹情況進(jìn)行評(píng)分。所示的關(guān)節(jié)評(píng)分為各處理組中小鼠所有爪子的總分除以該組中的小鼠只數(shù)。實(shí)施例9:特異性VISTA單克隆抗體阻斷VISTA在體外增強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答。鑒定了中和VISTA介導(dǎo)的抑制的VISTA特異性mab (13F3)(圖19)。從首次接觸試驗(yàn)的小鼠中純化了⑶Ilbhi骨髓APC以在存在或不存在13F3的情況下刺激OT-1I轉(zhuǎn)基因⑶4+T細(xì)胞。與其中和作用一致，13F3增強(qiáng)了⑶Ilbhi骨髓細(xì)胞刺激的T細(xì)胞增殖，所述骨髓細(xì)胞顯示出表達(dá)高水平的VISTA。實(shí)施例10:抗VISTA增強(qiáng)抗腫瘤免疫。由于抗VIST增強(qiáng)T細(xì)胞活化的能力，我們?cè)u(píng)估了抗VISTA是否會(huì)增強(qiáng)對(duì)免疫原性腫瘤的保護(hù)性免疫應(yīng)答。我們具有豐富經(jīng)驗(yàn)的模型為膀胱腫瘤MB49。MB49表達(dá)雄性抗原，因此其在雌性小鼠中的免疫原性溫和，然而，如果無(wú)免疫干預(yù)其將生長(zhǎng)并殺死雌性小鼠。為了測(cè)試口 VISTA治療的療效，向雌性小鼠皮下施用MB49腫瘤細(xì)胞并用□ VISTA處理。在之后的數(shù)天內(nèi)，測(cè)量腫瘤大小直到必須對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死。在圖20中可以容易地觀察到，抗VISTA治療大大減慢了腫瘤生長(zhǎng)。我們相信，這是由于抗VISTA增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(CMI)應(yīng)答的能力所致。實(shí)施例11:在4個(gè)小鼠腫瘤模型中口 VISTA對(duì)腫瘤退縮的影響。在免疫原性膀胱癌MB49中的實(shí)驗(yàn)已表明使用mab 13F3中和VISTA可避免宿主的腫瘤生長(zhǎng)。數(shù)據(jù)表明，VISTA在腫瘤微環(huán)境中具有相當(dāng)強(qiáng)的負(fù)免疫調(diào)節(jié)作用，因?yàn)槠錁O高的MDSC表達(dá)。調(diào)查抗小鼠VISTA對(duì)免疫原性(MB49)以及高非免疫原性(B16)腫瘤模型生長(zhǎng)的影響的研究將進(jìn)一步確認(rèn)a VISTA治療的療效、闡明作用機(jī)制以及提供選擇最佳劑量和時(shí)間的基礎(chǔ)。每個(gè)腫瘤模型的基本原理在下面詳述。雌性小鼠中的ΜΒ49:我們已經(jīng)在該鼠模型中展示了功效。此模型中的MDSC還表達(dá)提高水平的VISTA(未示出)。在此模型中，由于存在H-Y抗原，ΜΒ49腫瘤的免疫原性溫和。由于我們知道抗VISTA治療是有效的，因此我們將使用此模型作為“陽(yáng)性”對(duì)照以確定抗VISTA治療的治療性干預(yù)的劑量(1-100 μ g/小鼠)和時(shí)間(腫瘤接種的天數(shù)，或腫瘤后
4、7、10 天)。

權(quán)利要求
1.一種分離的或重組的免疫抑制性多聚體VISTA蛋白或其偶聯(lián)物，其包含與SEQ IDN0:2或4所示的人或鼠VISTA多肽胞外域至少90%相同的多肽的至少兩個(gè)拷貝或其包含與至少50個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的所述VISTA多肽的所述胞外域的片段至少90%相同的多肽的至少兩個(gè)拷貝。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的或重組的免疫抑制性多聚體VISTA蛋白或其偶聯(lián)物，其中所述VISTA多肽的所述胞外域的片段為至少75個(gè)氨基酸長(zhǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的或重組的免疫抑制性多聚體VISTA蛋白或其偶聯(lián)物，其中所述VISTA多肽的所述胞外域的片段為至少100個(gè)氨基酸長(zhǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的或重組的免疫抑制性多聚體VISTA蛋白或其偶聯(lián)物，其中所述VISTA多肽的所述胞外域的片段為至少125個(gè)氨基酸長(zhǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多聚體VISTA蛋白或偶聯(lián)物，其包含所述胞外域或其片段的至少三個(gè)拷貝。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多聚體VISTA蛋白或偶聯(lián)物，其包含所述胞外域或其片段的至少四個(gè)拷貝。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多聚體VISTA蛋白或偶聯(lián)物，其包含所述胞外域或其片段的至少五個(gè)拷貝。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多聚體VISTA蛋白或偶聯(lián)物，其包含所述胞外域或其片段的至少六個(gè)拷貝。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多聚體VISTA蛋白或偶聯(lián)物，其中所述胞外域或片段連接到寡聚化結(jié)構(gòu)域的N端。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的或重組的VISTA蛋白或偶聯(lián)物，其中所述寡聚化結(jié)構(gòu)域選自 GCN4、COMP、SNARE、CMP、MAT、含 I 個(gè) NLRC 的 LLR、結(jié)合 N0D2 核苷酸的 NLRC2、含 I個(gè)結(jié)合NLRC N0D2核苷酸的NLRC2的LRR和PS0RAS1。
11.一種藥學(xué)上可接受的組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求ι- ο中任一項(xiàng)的分離的或重組的VISTA蛋白或偶聯(lián)物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1i所述的藥學(xué)上可接受的組合物，其包含至少一種選自ro-1、PD-LUPD-L2.CTLA4和ICOS蛋白的其他免疫抑制劑以及對(duì)前述任一者具有特異性的抗體。(RANDY請(qǐng)檢查該列表)
13.—種在有需要的個(gè)體中引起免疫抑制的方法，包括施用根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的分離的或重組的VISTA多聚體蛋白或表達(dá)VISTA蛋白的腺病毒載體或組合物。
14.一種治療個(gè)體過(guò)敏性、炎性或自身免疫疾病的方法，包括施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的分離的或重組的VISTA多聚體蛋白或組合物。i
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述分離的或重組的VISTA蛋白在調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子控制下由表達(dá)所述蛋白的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述多聚體VISTA表達(dá)細(xì)胞為同種異體T細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述多聚體VISTA表達(dá)細(xì)胞還包含自殺基因，所述自殺基因使細(xì)胞在特定條件下被殺傷。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述過(guò)敏性、炎性或自身免疫疾病選自:銀屑病、皮炎、特應(yīng)性皮炎；系統(tǒng)性硬皮病、硬化癥；克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎；呼吸窘迫綜合征、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS);皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；結(jié)腸炎；腎小球腎炎；濕疹、哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化；白細(xì)胞粘附缺陷；類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；全身性紅斑狼瘡(SLE);糖尿病(例如I型糖尿病或胰島素依賴(lài)性糖尿病)；多發(fā)性硬化癥；雷諾氏綜合征；自身免疫性甲狀腺炎；過(guò)敏性腦脊髓炎；干燥綜合征；幼發(fā)型糖尿??；結(jié)核、結(jié)節(jié)病、多肌炎、肉芽腫病和血管炎；惡性貧血(阿狄森氏病)沖樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎癥性疾病；多器官損傷綜合征；溶血性貧血、冷沉淀球蛋白血癥或庫(kù)氏試驗(yàn)陽(yáng)性貧血；重癥肌無(wú)力；抗原抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾??；抗腎小球基底膜疾??；抗磷脂綜合征；過(guò)敏性神經(jīng)炎；格雷夫斯?。惶m伯特-伊頓肌無(wú)力綜合征；大皰性類(lèi)天皰瘡；天皰瘡；自身免疫性多內(nèi)分泌?。毁?lài)特??；僵人綜合征；白塞??；巨細(xì)胞動(dòng)脈炎；免疫復(fù)合物性腎炎；IgA腎病；IgM多發(fā)神經(jīng)病；免疫性血小板減少性紫癜(ITP)和自身免疫性血小板減少癥。
19.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述疾病選自關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性關(guān)節(jié)炎、慢性類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、急性痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎、慢性炎癥性關(guān)節(jié)炎、退化性關(guān)節(jié)炎、感染性關(guān)節(jié)炎、萊姆關(guān)節(jié)炎、增生性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、椎關(guān)節(jié)炎、幼年型類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)炎、變形性關(guān)節(jié)炎、原發(fā)慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎、炎癥性增生性皮膚疾病、銀屑病如斑塊型銀屑病、滴狀銀屑病、膿皰型銀屑病和指甲銀屑病、皮炎(包括接觸性皮炎、慢性接觸性皮炎、過(guò)敏性皮炎、過(guò)敏性接觸性皮炎、皰疹樣皮炎和特應(yīng)性皮炎)、X連鎖高IgM綜合征、蕁麻疹如慢性過(guò)敏性蕁麻疹和慢性特發(fā)性蕁麻疹(包括慢性自身免疫性蕁麻疹)、多發(fā)性肌炎/皮肌炎、幼年型皮肌炎、中毒性表皮壞死松解癥、硬皮病、系統(tǒng)性硬皮病、硬化癥、系統(tǒng)性硬化癥、多發(fā)性硬化癥(MS)、視神經(jīng)脊髓型MS、原發(fā)性進(jìn)展型MS (PPMS)、復(fù)發(fā)緩解型MS (RRMS)、進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥、動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈硬化、播散性硬化和共濟(jì)失調(diào)硬化癥、炎癥性腸道疾病(IBD)、克羅恩病、結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、顯微鏡性結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎、息肉狀結(jié)腸炎、壞死性小腸結(jié)腸炎、透壁性結(jié)腸炎、自身免疫性炎癥性腸道疾病、壞疽性膿皮病、結(jié)節(jié)性紅斑、原發(fā)性硬化性膽管炎、表層鞏膜炎、呼吸窘迫綜合征、成人或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、腦膜炎、全部或部分葡萄膜的炎癥、虹膜炎、脈絡(luò)膜炎、一種自身免疫性血液疾病、類(lèi)風(fēng)濕性脊柱炎、突發(fā)性聽(tīng)力喪失、IgE介導(dǎo)的疾病諸如過(guò)敏反應(yīng)和過(guò)敏性和特應(yīng)性鼻炎、腦炎、拉斯馬森腦炎、邊緣葉和/或腦干腦炎、葡萄膜炎、前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽腫性葡萄膜炎、非肉芽腫性葡萄膜炎、晶狀體抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎、自身免疫性葡萄膜炎、腎小球腎炎(GN)、特發(fā)性膜性GN或特發(fā)性膜性腎病、膜或膜性增生性GN(MPGN)、快速進(jìn)展性GN、過(guò)敏性疾病、自身免疫性心肌炎、白細(xì)胞粘附缺陷病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)諸如皮膚紅斑性狼瘡、亞急性皮膚型紅斑狼瘡、新生兒狼瘡綜合征(NLE)、播散性紅斑狼瘡、狼瘡(包括腎炎、腦炎、小兒、非腎性、腎外、盤(pán)狀、脫發(fā))、幼年型(I型)糖尿病(包括小兒胰島素依賴(lài)型糖尿病(IDDM))、成年型糖尿病(II型糖尿病)、自身免疫性糖尿病、特發(fā)性尿崩癥、與細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)性超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫應(yīng)答、結(jié)核病、結(jié)節(jié)病、肉芽腫病(包括淋巴瘤樣肉芽腫病、韋格納氏肉芽腫病)、粒細(xì)胞缺乏癥、血管炎病(包括血管炎(包括大血管炎(包括風(fēng)濕性多肌痛和巨細(xì)胞(大動(dòng)脈炎)動(dòng)脈炎)、中血管炎(包括川崎病和結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎)、顯微鏡下多動(dòng)脈炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管炎、壞死性、皮膚性或過(guò)敏性血管炎、系統(tǒng)性壞死性血管炎、和ANCA相關(guān)性血管炎，諸如變應(yīng)性肉芽腫性血管炎或綜 合征(CSS)))、顳動(dòng)脈炎、再生障礙性貧血、自身免疫再生障礙性貧血、庫(kù)氏試驗(yàn)陽(yáng)性貧血、先天性純紅細(xì)胞再生障礙性貧血、溶血性貧血或免疫性溶血性貧血(包括自身免疫性溶血性貧血(AIHA)、惡性貧血、阿狄森氏病、純紅細(xì)胞性貧血和再生障礙(PRCA))、第八因子缺乏癥、甲型血友病、自身免疫性中性粒細(xì)胞減少癥、全血細(xì)胞減少癥、白細(xì)胞減少癥、涉及白細(xì)胞滲出的疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病、多器官損傷綜合征諸如繼發(fā)于敗血癥、創(chuàng)傷或出血的那些、抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病、抗腎小球基底膜疾病、抗磷脂抗體綜合征、過(guò)敏性神經(jīng)炎、白塞病、Castleman綜合征、肺出血-腎炎綜合征、雷諾氏綜合征、干燥綜合征、史帝文-強(qiáng)生癥候群、類(lèi)天皰瘡諸如大皰性類(lèi)天皰瘡和皮膚類(lèi)天皰瘡、天皰瘡(包括尋常型天皰瘡、落葉型天皰瘡、天皰瘡粘膜類(lèi)天皰瘡和紅斑型天皰瘡)、自身免疫性多內(nèi)分泌腺病、賴(lài)特病或綜合征、免疫復(fù)合物性腎炎、抗體介導(dǎo)的腎炎、視神經(jīng)脊髓炎、多發(fā)性神經(jīng)病、慢性神經(jīng)病變諸如IgM多發(fā)性神經(jīng)病或IgM介導(dǎo)的神經(jīng)病變、血小板減少、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、自身免疫性睪丸炎和卵巢炎、原發(fā)性甲狀腺功能減退癥、甲狀旁腺功能減退癥、自身免疫性甲狀腺炎、橋本氏病、慢性甲狀腺炎(橋本甲狀腺炎)；亞急性甲狀腺炎、自身免疫性甲狀腺疾病、特發(fā)性甲狀腺功能減退癥、格雷夫斯病、多腺體綜合征諸如自身免疫性多腺體綜合征(或腺體內(nèi)分泌綜合征)、副腫瘤綜合征(包括神經(jīng)系統(tǒng)副腫瘤性綜合征諸如蘭伯特-伊頓肌無(wú)力綜合征或伊頓-蘭伯特綜合征)、僵人綜合征、腦脊髓炎、過(guò)敏性腦脊髓炎、實(shí)驗(yàn)性過(guò)敏性腦脊髓炎(EAE)、重癥肌無(wú)力、胸腺瘤相關(guān)重癥肌無(wú)力、小腦變性、神經(jīng)性肌強(qiáng)直、斜視眼陣攣或眼陣攣-肌陣攣綜合征(OMS)、和感覺(jué)神經(jīng)病變、多灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病變、席漢氏綜合征、自身免疫性肝炎、慢性肝炎、狼瘡樣肝炎、巨細(xì)胞肝炎、慢性活動(dòng)性肝炎或自身免疫性慢性活動(dòng)性肝炎、淋巴細(xì)胞性間質(zhì)性肺炎、閉塞性細(xì)支氣管炎(非移植)與NSIP、格林-巴利綜合征、伯杰疾病(IgA腎病)、特發(fā)性IgA腎病、線狀I(lǐng)gA皮膚病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肺硬變、自身免疫性腸病綜合征、脂瀉病、乳糜瀉、口炎性腹瀉(麥膠性腸病)、頑固性口炎性腹瀉、特發(fā)性口炎性腹瀉、冷球蛋白血癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS ;葛雷克氏癥)、冠狀動(dòng)脈疾病、自身免疫性耳部疾病諸如自身免疫性?xún)?nèi)耳病(AGED)、自身免疫性聽(tīng)力損失、眼陣攣-肌陣攣綜合征(OMS)、多軟骨炎諸如難治性或復(fù)發(fā)性多軟骨炎、肺泡蛋白沉積癥、淀粉樣變性、鞏膜炎、一種非癌性原發(fā)性淋巴細(xì)胞增多癥、一種原發(fā)性淋巴細(xì)胞增多癥(包括單克隆B細(xì)胞淋巴細(xì)胞增多癥(例如，良性單克隆丙種球蛋白病和意義未明的單克隆丙種球蛋白病，MGUS))、周?chē)窠?jīng)病變、副腫瘤綜合征、離子通道病諸如癲癇、偏頭痛、心律不齊、肌肉疾病、耳聾、失明、周期性麻痹、和中樞神經(jīng)系統(tǒng)離子通道病、自閉癥、炎癥性肌病、局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)、內(nèi)分泌性眼病、葡萄膜視網(wǎng)膜炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、自身免疫性血液病、纖維肌痛、多發(fā)性?xún)?nèi)分泌失調(diào)、施密特綜合征、腎上腺炎、胃萎縮、早老性癡呆、脫髓鞘性疾病諸如自身免疫性脫髓鞘性疾病、糖尿病性腎病、心肌梗塞后綜合征、圓形脫毛癥、CREST綜合征(鈣質(zhì)沉著、雷諾氏現(xiàn)象、食管運(yùn)動(dòng)功能障礙、指硬皮病和毛細(xì)血管擴(kuò)張癥)、男性和女性自身免疫性不育、混合性結(jié)締組織病、恰加斯氏病、風(fēng)濕熱、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、農(nóng)民肺、多形性紅斑、心臟切開(kāi)后綜合征、庫(kù)欣綜合征、養(yǎng)鳥(niǎo)人肺、變應(yīng)性肉芽腫血管炎、良性淋巴細(xì)胞性脈管炎；Alport綜合征、肺泡炎諸如過(guò)敏性肺泡炎及纖維化肺泡炎、間質(zhì)性肺病、輸血反應(yīng)、麻風(fēng)病、痕疾、利什曼病、kypanosomiasis、血吸蟲(chóng)病、蛔蟲(chóng)病、曲霉病、Sampter綜合征、卡普蘭綜合征、登革熱、心內(nèi)膜炎、心內(nèi)膜心肌纖維化、彌漫性肺間質(zhì)纖維化、肺間質(zhì)纖維化、特發(fā)性肺纖維化、囊性纖維化、 眼內(nèi)炎、持久性隆起性紅斑、胎兒成紅細(xì)胞增多病、嗜酸性筋膜炎、舒爾曼綜合征、Fe I Iy綜合征、絲蟲(chóng)病、睫狀體炎諸如慢性睫狀體炎、異色性睫狀體炎、虹膜睫狀體炎或Fuch睫狀體炎、過(guò)敏性紫癜、人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)感染、?？刹《靖腥尽⑿募〔?、阿爾茨海默氏病、細(xì)小病毒感染、風(fēng)疹病毒感染、接種后綜合征、先天性風(fēng)疹感染、EB病毒感染、腮腺炎、Evan綜合征、自身免疫性腺衰竭、西德納姆舞蹈病、鏈球菌感染后腎炎、血栓閉塞性脈管炎、甲狀腺毒癥、脊髓癆、絨膜炎、巨細(xì)胞性多肌痛、內(nèi)分泌性眼疾、慢性過(guò)敏性肺炎、干燥性角結(jié)膜炎、流行性角結(jié)膜炎、特發(fā)性腎病綜合征、微小病變性腎病、良性家族性和缺血-再灌注損傷、視網(wǎng)膜自身免疫性疾病、關(guān)節(jié)炎、支氣管炎、慢性阻塞性氣道疾病、矽肺、口瘡、阿弗他口炎、動(dòng)脈硬化性疾病、aspermiogenese,自身免疫性溶血、Boeck病、冷沉球蛋白血癥、杜普伊特倫攣縮、水晶體過(guò)敏性?xún)?nèi)眼球炎、過(guò)敏性腸炎、麻風(fēng)結(jié)節(jié)性紅斑、特發(fā)性面神經(jīng)癱瘓、慢性疲勞綜合征、風(fēng)濕性發(fā)熱、Hamman-Rich病、感音神經(jīng)性耳聾、血紅素尿癥發(fā)作、性腺機(jī)能減退；區(qū)域性回腸炎、白細(xì)胞減少、傳染性單核細(xì)胞增多癥、橫貫性脊髓炎、原發(fā)性特發(fā)性粘液水腫、腎病、交感神經(jīng)性眼炎、肉芽腫性睪丸炎、胰腺炎、急性多神經(jīng)根炎、壞疽性膿皮病、Quervain甲狀腺炎、獲得性脾萎縮、因抗精原細(xì)胞抗體導(dǎo)致的不育、非惡性胸腺瘤、白癜風(fēng)、SCID和EB病毒相關(guān)疾病、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、寄生蟲(chóng)病諸如利什曼蟲(chóng)病、中毒性休克綜合征、食物中毒、涉及T細(xì)胞浸潤(rùn)的病癥、白細(xì)胞粘附缺陷、與細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)性超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫應(yīng)答、涉及白細(xì)胞滲出的疾病、多器官損傷綜合征、抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病、抗腎小球基底膜疾病、過(guò)敏性神經(jīng)炎、自身免疫性多內(nèi)分泌腺病、卵巢炎、原發(fā)性粘液性水腫、自身免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎、風(fēng)濕性疾病、混合性結(jié)締組織病、腎病綜合征、胰島炎、多內(nèi)分泌不良、周?chē)窠?jīng)病變、自身免疫多腺體綜合征I型、成年發(fā)病型特發(fā)性甲狀旁腺功能減退癥(AOIH)、全禿、擴(kuò)張型心肌病、獲得性大皰性表皮松解癥(EBA)、血色沉著病、心肌病、腎病綜合征、原發(fā)性硬化性膽管炎、化膿性鼻竇炎或非化膿性鼻竇炎、急性或慢性鼻竇炎、篩竇、額竇、上頜竇或蝶竇炎、嗜酸性粒細(xì)胞相關(guān)疾病諸如嗜酸性粒細(xì)胞增多、肺嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)癥、嗜酸性粒細(xì)胞增多-肌痛綜合征、呂弗勒氏綜合征、慢性嗜酸性粒細(xì)胞性肺炎、熱帶肺嗜酸性粒細(xì)胞增多、支氣管肺曲霉病、曲霉腫或含嗜酸性粒細(xì)胞的肉芽腫、過(guò)敏性癥、血清陰性脊柱關(guān)節(jié)病、多內(nèi)分泌自身免疫性疾病、硬化性膽管炎、鞏膜、鞏膜外層、慢性皮膚粘膜念珠菌病、Bruton綜合征、嬰兒短暫性低丙種球蛋白血癥、Wiskott-Aldrich綜合征、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、與膠原疾病相關(guān)的自身免疫紊亂、膠原性疾病、風(fēng)濕病、神經(jīng)性疾病、缺血性再灌注障礙、血壓反應(yīng)降低、血管功能障礙、脈管擴(kuò)張、組織損傷、心血管缺血、痛覺(jué)過(guò)敏、腦缺血、以及伴隨血管化的疾病、過(guò)敏性超敏反應(yīng)紊亂、腎小球性腎炎、再灌注損傷、心肌或其他組織再灌注損傷、含急性炎癥成分的皮膚病、急性化膿性腦膜炎或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥疾病、眼睛和眼眶炎性疾病；粒細(xì)胞輸注相關(guān)綜合征、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的毒性、急性嚴(yán)重炎癥、慢性頑固性炎癥、腎盂炎、肺硬變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病大動(dòng)脈疾病、子宮內(nèi)膜增生、消化性潰瘍、心瓣炎和子宮內(nèi)膜異位。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的多聚體VISTA蛋白，其中所述多聚體VISTA蛋白直接或間接地連接到Ig蛋白。
21.一種分離的抗體或抗體片段，其特異性結(jié)合到包含在能在人受試者或鼠抗腫瘤模型中表現(xiàn)出抗腫瘤或抗轉(zhuǎn)移活性 的SEQ IDN0:2或4所示的VISTA蛋白的胞外域中的表位上。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的抗體，其結(jié)合包含在所述胞外域的1-20、20-40、30-50、60-80、70-90、80-100、90-110、100-120、11-130 或 120-136 位殘基中的表位。
23.一種分離的抗體或抗體片段，其特異性結(jié)合到包含在人或嚙齒動(dòng)物VISTA的IgV、莖區(qū)、胞質(zhì)區(qū)或跨膜區(qū)中的表位。
24.一種分離的抗體或抗體片段，其特異性結(jié)合到包含在能引起以下活性之一的SEQID NO:2或4所示的VISTA蛋白的胞外域、IgV、莖區(qū)、胞質(zhì)區(qū)或跨膜區(qū)中的表位上: (i)上調(diào)細(xì)胞因子； ( )誘導(dǎo)T細(xì)胞擴(kuò)增； (iii)促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞免疫； (iv )促進(jìn)CD4+和/或CD8+T細(xì)胞活化。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的抗體，其在存在TO-L3OR VISTA或者VISTA-1g的情況下體外增強(qiáng)TO-L3 OR VISTA或者VISTA-1g的抑制活性以及體內(nèi)抑制TO-L3 OR VISTA或者VISTA活性。
26.—種體外或體內(nèi)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞應(yīng)答的方法，包括將免疫細(xì)胞與根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的多聚體VISTA蛋白在存在初級(jí)信號(hào)的情況下接觸，使得調(diào)節(jié)所述免疫細(xì)胞的應(yīng)答。
27.一種體外或體內(nèi)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞應(yīng)答的方法，包括將免疫細(xì)胞與根據(jù)權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的抗體在存在初級(jí)信號(hào)的情況下接觸，使得調(diào)節(jié)所述免疫細(xì)胞的應(yīng)答。
28.—種在T細(xì)胞與骨髓源性APC之間發(fā)生的同種相互作用期間調(diào)節(jié)T細(xì)胞應(yīng)答的方法，方式是向有需要的受試者施用有效量的多聚體VISTA蛋白或VISTA的特異性抗體。
29.一種鑒定人或嚙齒動(dòng)物VISTA的反受體的方法,包括篩選一組B7家族成員或一組T細(xì)胞分泌的特異性結(jié)合到所述人或嚙齒動(dòng)物VISTA蛋白的表面蛋白。
30.一種治療有需要的受試者的癌癥的方法，方式是施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的抗體，所述抗體通過(guò)抑制髓樣樹(shù)突狀抑制細(xì)胞所表達(dá)的VISTA的免疫抑制活性而增強(qiáng)抗腫瘤免疫。
31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中發(fā)現(xiàn)所述患者在治療前在免疫細(xì)胞上表達(dá)升高水平的VISTA蛋白。
32.—種增強(qiáng)放療、化療或抗癌生物療法的療效的方法，包括在治療方案中向有需要的患者施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的抗體，所述治療方案包括施用放療、化療或抗癌生物療法。
33.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述患者在治療前患有對(duì)所述放療、化療或抗癌生物療法無(wú)應(yīng)答的癌癥。
34.一種加強(qiáng)包含病毒、腫瘤或細(xì)菌抗原的抗病毒、抗菌或抗腫瘤疫苗的療效的方法，進(jìn)一步包括在施用疫苗之前或之后施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的抗體以便增強(qiáng)免疫。
35.一種治療選自膀胱癌、卵巢癌、黑素瘤的癌癥的方法，其中所述癌癥為早期(非轉(zhuǎn)移)或轉(zhuǎn)移形式，包括施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的抗體。
36.一種治療炎性、自身免疫性、癌性、過(guò)敏性或感染性疾病的方法，包括施用有效量的免疫抑制性VISTA蛋白、VISTA結(jié)合蛋白(抗體或抗體片段)或者VISTA激動(dòng)劑或拮抗劑。
37.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中治療的所述疾病選自I型糖尿病、多發(fā)性硬化、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕性疾病、過(guò)敏癥、哮喘、過(guò)敏性鼻炎、皮膚病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、移植排斥、鏈球菌感染后和自身免疫性腎衰竭、敗血性休克、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)和毒液螯入；自身炎癥性疾病、骨關(guān)節(jié)炎、結(jié)晶性關(guān)節(jié)炎、囊炎、關(guān)節(jié)病、肌腱炎、韌帶炎和創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)損傷。
38.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中治療的所述疾病為多發(fā)性硬化或類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
39.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述疾病為選自肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、膀胱癌、卵巢癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤或惡性腫瘤。
40.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述疾病為選自乙肝、丙肝、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、HIV-1、HIV-2、結(jié)核、瘧疾和血吸蟲(chóng)病的傳染性疾病。
41.一種選擇具有作為治療劑或免疫調(diào)節(jié)劑潛在用途的抗H)-L30R VISTA或者VISTA抗體的方法，包括: (i )通過(guò)TO-L3 OR VISTA蛋白或免疫原性片段或包含其的偶聯(lián)物對(duì)免疫細(xì)胞或宿主進(jìn)行免疫； ( )選擇表達(dá)特異性結(jié)合到H)-L3 OR VISTA的抗體的淋巴細(xì)胞； (iii)基于抑制或增強(qiáng)H)-L3 OR VISTA或者VISTA以下活性中的一種或多種的能力，從( )得到的那些中選擇具有作為治療劑或免疫調(diào)節(jié)劑潛在用途的抗H)-L3 OR VISTA或者VISTA抗體或抗體片段: (1)抑制T細(xì)胞活化或分化； (2)抑制CD4+或CD8+T細(xì)胞增殖；或 (3)抑制T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。種根據(jù)權(quán)利要求39產(chǎn)生的抗TO-L3 OR VISTA或者VISTA抗體或片段，或其人源化、嵌合或單鏈變體。種包含根據(jù)權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的抗TO-L3 0RVISTA抗體的藥物組合物。
42.一種在有需要的受試者中調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的方法，包括施用根據(jù)權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的多聚體VISTA蛋白或抗VISTA抗體。
43.一種使用VISTA的抗體釋放VISTA對(duì)免疫的抑制作用的方法。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中發(fā)現(xiàn)所述治療的患者在治療前表達(dá)升高水平的VISTA。
45.根據(jù)權(quán)利要求43或44所述的方法，其中監(jiān)測(cè)治療后的VISTA水平以便評(píng)估免疫應(yīng)答已得到增強(qiáng)。
46.一種使用根據(jù)權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的VISTA的抗體增強(qiáng)有需要的受試者中細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的方法。
47.一種在有需要的受試者中治療或預(yù)防炎癥的方法，包括施用VISTA的抗體。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述受試者患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
49.一種治療細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病的方法，包括施用有效量的VISTA的抗體。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的 方法，其中所述細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病選自多發(fā)性硬化、EAE、I型糖尿病、卵巢炎和甲狀腺炎。
51.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，進(jìn)一步包括施用另一種免疫調(diào)節(jié)劑和/或抗原。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑為T(mén)LR激動(dòng)劑(TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR 10、TLRll 激動(dòng)劑)、為 I 型干擾素(α 干擾素、β干擾素)或?yàn)棰? 0激動(dòng)劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞蛋白。這種名為PD-L3ORVISTA的蛋白類(lèi)似于PD-L1家族的成員，表示了一種新型的且結(jié)構(gòu)不同的Ig超家族抑制性配體，其胞外域具有與B7家族配體PD-L1的同源性。此分子被稱(chēng)為PD-L3OR VISTA或T細(xì)胞活化的V結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白抑制劑(VISTA)。VISTA的表達(dá)主要位于造血室內(nèi)，且在骨髓APC和T細(xì)胞上受高度調(diào)節(jié)。VISTA抑制性途徑的治療性干預(yù)提出了一種調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫以治療多種癌癥例如卵巢癌、膀胱癌和黑素瘤的新方法。另外，VISTA蛋白，特別是多聚體VISTA蛋白和抗體可用于抑制自身免疫疾病、過(guò)敏、感染和炎性病癥例如多發(fā)性硬化和關(guān)節(jié)病癥諸如RA中的T細(xì)胞免疫。
文檔編號(hào)C07K16/18GK103119054SQ201180025788
公開(kāi)日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2011年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者R·J·諾雷, L·王 申請(qǐng)人:達(dá)特茅斯大學(xué)理事會(huì)