專利名稱：一種單一聚合度殼寡糖制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海洋化學(xué)工程技術(shù)，具體涉及ー種高純單ー聚合度殼寡糖制備方法。
背景技術(shù)：
殼聚糖是ー個天然的線性多糖，由氨基葡萄糖和こ酰氨基葡萄糖通過β -1，4糖苷鍵連接而成。由于殼聚糖來源豐富，且安全無毒具有良好的生物兼容性，與人體細(xì)胞有良好的相容性，在食品醫(yī)藥，農(nóng)業(yè)，材料科學(xué)領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。殼寡糖，又稱低聚葡萄糖胺、低聚氨基葡萄糖，是殼聚糖的降解產(chǎn)物。與殼聚糖相比，低分子量的殼寡糖水溶性大大提高，這有利于生物體吸收和利用。殼寡糖是目前僅知的唯一天然堿性寡糖，被發(fā)現(xiàn)具有多種生理活性，如抗腫瘤，抗菌，抗炎，抗氧化，調(diào)節(jié)血糖血脂，增強(qiáng)免疫力，活化腸道菌群等。殼寡糖顯示了比殼聚糖更優(yōu)越的生物活性，而這些活性作用產(chǎn)生的機(jī)理研究，將對人類及動植物的健康發(fā)展具有積極的推動作用。目前，殼寡糖主要通過殼聚糖的酸解，氧化降解，或酶解三種技術(shù)得到。然而，這些 技術(shù)制備的殼寡糖產(chǎn)物是ー個非常復(fù)雜的混合物，其中含有各個分子量各種脫こ酰度的殼寡糖。而大部分殼寡糖的生物活性都是采用這些混合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這很難知道具體是哪個或哪些殼寡糖分子在生物活性試驗(yàn)中起作用。因此，為了進(jìn)ー步研究殼寡糖的生物活性，從殼寡糖混合物中分離得到帶有準(zhǔn)確脫こ酰度和窄聚合度的殼寡糖是十分必要的。然而當(dāng)前的分離技術(shù)對于單一聚合度殼寡糖的分辨率是低的，尤其對于聚合度4以上的殼寡糖分離還是非常困難的，而一般認(rèn)為殼寡糖的生物活性要求其聚合度至少要大于4。單ー聚合度的殼寡糖的分離技術(shù)對于殼寡糖的活性篩選及進(jìn)ー步在食品醫(yī)藥中的應(yīng)用具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種單ー聚合度殼寡糖的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種單ー聚合度殼寡糖的制備方法，將全脫こ酰化殼寡糖溶解過濾后用離子交換色譜柱CM Sephadex C-25以0-3Μ濃度的NaCl溶液在2-5mL/min_l的流速下進(jìn)行分離純化，收集 240-360min、360-460min、460-560min、560-640min、640-720min、720-780min、780-840min的洗脫液，將所得洗脫液分別經(jīng)活性碳萃取脫鹽后濃縮，即得到單ー聚合度全脫こ?；瘹す烟?。所述單ー聚合度全脫こ?；瘹す烟菫槭絀所示，
OH
NH2 J
I
式I 中 n=2, 3，4，5，6，7 或 8。所述全脫こ?；瘹す烟菫閷ぞ厶墙?jīng)酸降解，酸濃度為4-12mol/L，降解后采用醇將其沉淀，沉淀后離心，上清液濃縮后待用。所述全脫こ?；瘹す烟菫槊摛初６却笥?0 %的殼聚糖中加入酸，在60-800C下降解2-6h ;降解后加入こ醇進(jìn)行沉淀，沉淀后以4000g離心15min，收集上清濃縮后冷凍干燥得全脫こ?；瘹す烟牵?；其中こ酰度大于80%的殼聚糖與酸的質(zhì)量體積比為I :10-100。所述降解后加入こ醇，使降解液中こ醇最終濃度為60-90%(體積分?jǐn)?shù))。將所述全脫こ酰化殼寡糖于pH=3-6的酸性溶液中溶解，而后并用孔徑為O. 45 μ m的微孔濾膜過濾，待用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
I.本發(fā)明采用離子交換色譜分離得到高純度的單ー聚合度系列殼寡糖(ニ糖至八糖)，具有流速快、分辨率高、產(chǎn)率高的特點(diǎn)，而且分離步驟少，只經(jīng)過ー步分離就能夠得到純的單ー聚合度殼寡糖。2.采用本發(fā)明方法得到的殼寡糖利用HPLC檢測其純度，其中全脫こ?；瘹ぅ颂侵翚ち羌兌却笥?8 %，全脫こ?；瘹て咛羌兌却笥?2 %，全脫こ酰化殼八糖純度大于75%。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例提供的離子交換色譜制備單ー聚合度殼寡糖的的洗脫層析圖。圖2A、B、C、D、E、F、G為本發(fā)明實(shí)施例提供的分離到的單ー聚合度殼寡糖的高效液相分析譜圖。圖3A、B、C、D、E、F為本發(fā)明實(shí)施例提供的分離到的單ー聚合度殼寡糖的質(zhì)譜分析圖譜。
具體實(shí)施例實(shí)施例I將Ig高脫こ酰度(90%)的殼聚糖置于三ロ瓶中，加入6mol/L鹽酸降解殼聚糖制備全脫こ?；臍す烟侨芤骸＜尤臌}酸的體積與殼聚糖質(zhì)量比為50:1，在70°C下降解5h。反應(yīng)后離心去除不溶物，上清液進(jìn)行濃縮，并加入こ醇進(jìn)行沉淀。使上清液中こ醇最終濃度為70% (體積分?jǐn)?shù))而后以4000g離心15min，收集上清濃縮后冷凍干燥得全脫こ
?；瘹す烟菢悠贰⑺玫饺摛初；瘹す烟怯胮H 4的醋酸緩沖液溶解后，經(jīng)孔徑為O. 45 μ m的微孔濾膜過濾后用離子交換色譜柱CM Sephadex C-25進(jìn)行分離純化，其中洗脫液為0-2MNaCl,流速為SmL/mirT1,以還原糖含量監(jiān)測洗脫液，收集290min, 400min, 510min, 600min,680min,750min,825min時間的七個組分洗脫液(參見圖I)，將收集的組分分別用活性碳萃取脫鹽后濃縮，濃縮后即得到所述式I所示的單ー聚合度全脫こ?；瘹す烟?，
權(quán)利要求
1.一種單ー聚合度殼寡糖的制備方法，其特征在于將全脫こ?；瘹す烟侨芙膺^濾后用離子交換色譜柱CM Sephadex C-25以0-3M濃度的NaCl溶液在Z-SmL/min—1的流速下進(jìn)行分離純化，收集 240-360min、360-460min、460-560min、560-640min、640-720min、720-780min、780-840min的洗脫液，將所得洗脫液分別經(jīng)活性碳萃取脫鹽后濃縮，即得到單一聚合度全脫こ?；瘹す烟恰?br> 2.按權(quán)利要求I所述的單一聚合度殼寡糖的制備方法，其特征在于所述單ー聚合度全脫こ酰化殼寡糖為式I所示，
3.按權(quán)利要求I或2所述的單一聚合度殼寡糖的制備方法，其特征在于所述全脫こ?；瘹す烟菫閷ぞ厶墙?jīng)酸降解，酸濃度為4-12mol/L，降解后采用醇將其沉淀，沉淀后離心,上清液濃縮后待用。
4.按權(quán)利要求3所述的單一聚合度殼寡糖的制備方法，其特征在于所述全脫こ?；瘹す烟菫槊摛初６却笥?0%的殼聚糖中加入酸，在60-80°C下降解2-6h ;降解后加入こ醇進(jìn)行沉淀，沉淀后以4000g離心15min，收集上清濃縮后冷凍干燥得全脫こ?；瘹す烟牵?；其中こ酰度大于80%的殼聚糖與酸的質(zhì)量體積比為I : 10-100。
5.按權(quán)利要求4所述的單一聚合度殼寡糖的制備方法，其特征在于所述降解后加入こ醇，使降解液中こ醇最終濃度為60-90% (體積分?jǐn)?shù))。
6.按權(quán)利要求I所述的單一聚合度殼寡糖的制備方法，其特征在于將所述全脫こ酰化殼寡糖于PH = 3-6的酸性溶液中溶解，而后并用孔徑為O. 45 μ m的微孔濾膜過濾，待用。
全文摘要
本發(fā)明屬于海洋化學(xué)工程技術(shù)，具體涉及一種高純單一聚合度殼寡糖制備方法。具體為，將全脫乙?；瘹す烟怯秒x子交換色譜柱CM SephadexC-25以0-3M濃度的NaCl溶液在2-5mLmin-1的流速下進(jìn)行分離純化，收集洗脫液，將所得洗脫液分別經(jīng)活性碳萃取脫鹽后濃縮，即得到單一聚合度全脫乙?；瘹す烟?，即得到單一聚合度全脫乙酰化殼寡糖。采用本發(fā)明方法得到的殼寡糖利用HPLC檢測其純度，其中全脫乙?；瘹ざ侵翚ち羌兌却笥?8％，全脫乙?；瘹て咛羌兌却笥?2％，全脫乙?；瘹ぐ颂羌兌却笥?5％。
文檔編號C07H5/06GK102653569SQ20121014604
公開日2012年9月5日 申請日期2012年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月11日
發(fā)明者于華華, 劉松, 孟祥濤, 李克成, 李冰, 李榮鋒, 李鵬程, 秦玉坤, 邢榮娥 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所