專利名稱：從藻類中分離制備藥用級(jí)藻藍(lán)蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體涉及一種從藻類中分離制備藥用級(jí)藻藍(lán)蛋白的方法。
背景技術(shù)：
藻類中的藻藍(lán)蛋白作為蛋白存儲(chǔ)單位，具有明顯的抗氧化、抗炎癥、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力作用，抗輻射等活性。藻藍(lán)蛋白分離純化后，成為高度熒光性的蛋白質(zhì)，可作為熒光探針等生物醫(yī)藥制劑。現(xiàn)有的藻藍(lán)蛋白的分離純化工藝主要包括沉淀、離心、透析、層析等過(guò)程，這一系列的方法開(kāi)展困難且昂貴，并且得到的純度也不高，只適用于實(shí)驗(yàn)室制備藻藍(lán)蛋白。Ganapathi Patil報(bào)道了一種純化C-藻藍(lán)蛋白簡(jiǎn)單有效的新方法,其中包括雙 水相萃取和離子交換色譜兩個(gè)步驟。使用高壓均質(zhì)法提取粗蛋白，經(jīng)過(guò)高速離心后取上清液，在雙水相萃取中，使用聚合體-無(wú)機(jī)鹽體系，聚合度4000的聚乙二醇和磷酸鉀溶液作為兩相，體積比為0.8，在pH6.0的條件下使得純度為I. 18的粗提液，經(jīng)過(guò)一次萃取后純度上升到了 3. 52，而經(jīng)過(guò)3次萃取后純度達(dá)到了 4. 05 (Ganapathi Patil，K. S. M. S.Raghavarao. Aqueous two phase extraction for purification of C-phycocyanin [J]
.Biochemical Engineering Journal ,2007,34:156 - 164.)。Ruperto Bermejo等使用陰離子表面活性劑Aerosol 0T(丁二酸_2_乙基己基酯磺酸鈉，簡(jiǎn)稱A0T)通過(guò)熒光光譜研究C-藻藍(lán)蛋白在水/AOT/異辛烷的溶解特性。結(jié)果顯示，當(dāng)WtlM(Fc)時(shí)C-藻藍(lán)蛋白溶解于反膠團(tuán)中。制得的溶解于非極性溶劑中的藻藍(lán)蛋白可以替代合成燃料用于食品和化妝品中(Ruperto Bermejo, Eva M. Talavera, Carmen delValle,et al. C-phycocyanin incorporated into reverse micelles: a fluorescence study[J] . Colloids and Surfaces B: Biointerfaces，2000，18 :51 - 59.)。劉楊研究了 CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)/正戊醇-正辛烷反膠團(tuán)溶液萃取分離螺旋藻藻藍(lán)蛋白的性能。結(jié)果表明0. 04 mo I/L CTAB/正戊醇-正辛烷(體積比1:4)的反膠團(tuán)體系用于萃取PH7.0，包含0. I mol/L KCl的螺旋藻細(xì)胞破碎液，藻藍(lán)蛋白萃取率可達(dá)96. 3%;采用pH5. 0，包含2 mol/L KBr的反萃液反萃取藻藍(lán)蛋白，反萃取率可達(dá)90. 6%(劉楊，王雪青，龐廣昌.反膠團(tuán)萃取分離螺旋藻藻藍(lán)蛋白[J].天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，6 (2) :30-33.)。Pertti J. Viskari等人利用3% 3_[3_ (膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸(Chaps)和0. 3%氮成穴大豆蛋白提取藻膽蛋白，提取率達(dá)到85%以上，并且提取全過(guò)程在3小時(shí)內(nèi)完成，其產(chǎn)物經(jīng)過(guò)毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)，得到了很好的效果(Pertti J.Viskari,Christa L. Colyer. Rapid extraction of phycobiliproteins from culturedcyanobacteria samples [J] . Analytical Biochemistry, 2003, 319 :263 - 271.X張厚森通過(guò)實(shí)驗(yàn)室自制羥基磷灰石色譜柱對(duì)藻藍(lán)蛋白進(jìn)行吸附，并通過(guò)梯度洗脫和透析脫鹽，得到了純度為2. 83的藻藍(lán)蛋白。而經(jīng)過(guò)兩次HA柱的藻藍(lán)蛋白純度達(dá)到4. 21，總回收率為38. 1% (張厚森.鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取分離及穩(wěn)定性研究[D].江蘇江蘇大學(xué)，2005.)。以上分離制備方法存在缺陷ー則可能產(chǎn)生較多的非食用的添加物質(zhì)；ニ則分離純化過(guò)程中樣品的損失也較大，造成產(chǎn)量過(guò)低；另外大量的溶劑洗脫和多級(jí)柱分離，使分離成本大幅度提高，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)提取藻類藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量低、成本高的不足，本發(fā)明提供了ー種從藻類中分離制備藥用級(jí)藻藍(lán)蛋白的方法。本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下 ー種從藻類中分離制備藥用級(jí)藻藍(lán)蛋白的方法，所述方法的步驟包括在低溫下采用超聲波輔助提取技術(shù)處理藻類植物，以蛋白提取緩沖溶液提取藻類蛋白，得到粗提液；然后將粗提液PH調(diào)至酸性，靜置、清液離心，取上清液調(diào)節(jié)pH至中性；或?qū)⒋痔嵋簆H調(diào)至酸性、靜置后膜過(guò)濾，得濾液；經(jīng)過(guò)羥基磷灰石柱層析，流動(dòng)相為蛋白提取緩沖溶液，收集藻藍(lán)蛋白洗脫峰，再噴霧干燥，得到藥用級(jí)藻藍(lán)蛋白。所述在低溫下采用超聲波輔助提取技術(shù)處理藻類植物的溫度條件為0°C -40°c。所述超聲波輔助提取技術(shù)的條件為超聲功率為50W-200 W，提取時(shí)間為5_30min。所述超聲宜工作時(shí)間4 s，間隔時(shí)間2 s。所述蛋白提取緩沖溶液為O. 05、. 15 mol/L、pH為6. 0-8. O的磷酸鹽、醋酸鹽或乳
酸鹽緩沖溶液。所述將粗提液pH調(diào)至酸性，其中酸性pH為3. 5-6. 0，采用的酸度調(diào)節(jié)劑為藥用級(jí)鹽酸。所述清液離心采用低溫離心，溫度為4_6°C，離心カ為8000_12000Xg。所述膜過(guò)濾采用的膜的孔徑大小為O. 20 μ m_0. 45 μ m。所述藻類植物為螺旋藻。本發(fā)明在傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分離基礎(chǔ)上，通過(guò)添加食品添加劑級(jí)的緩沖液和酸度調(diào)節(jié)齊U，采用酸性PH緩沖液沉降雜蛋白和羥基磷灰石色譜柱柱層析法洗脫目的蛋白的技木，首次得到藻藍(lán)蛋白純度A62(i/A28(i > 2. 0，藻藍(lán)蛋白回收率為25%以上的藻類色素蛋白復(fù)合物。這樣不僅可以使產(chǎn)品達(dá)到藥用級(jí)藻藍(lán)蛋白的純度，而且具有食用安全性，并且省略了復(fù)雜、繁瑣的多級(jí)柱層析的分離步驟，節(jié)約了生產(chǎn)成本。本發(fā)明方法中的藻藍(lán)蛋白提取方式得到的產(chǎn)品純度高，大大簡(jiǎn)化了分離步驟，操作簡(jiǎn)單，降低成本，藻藍(lán)蛋白的性質(zhì)穩(wěn)定。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
選取磷酸氫ニ鈉-檸檬酸鈉、磷酸氫ニ鈉-磷酸ニ氫鈉、磷酸氫ニ鈉-檸檬酸、磷酸氫ニ鈉-磷酸ニ氫鉀等磷酸鹽緩沖體系，制成PH7. O以及濃度為O. 15 mo I/L的緩沖液。稱取新鮮螺旋藻10. O g，分別加入100 mL緩沖液，使用200 w功率超聲破碎5 min，工作時(shí)間4s，間隔時(shí)間2 S。處理后的料液在5°C低溫條件下高速離心10 min后吸取上清液，使用藥用級(jí)HCl溶液調(diào)節(jié)提取液至pH3. 5—4. 5，靜置I h后，再高速離心10 min吸取上清液。離心后的沉淀中加入1/4上清液體積的緩沖液中充分溶解，離心后收集上清液，和原上清液合并，得到的溶液進(jìn)行噴霧干燥，干燥粉冷藏儲(chǔ)存。將摩爾濃度為0. 5 mol/L的CaCl2溶液和Na2HPO4溶液用恒流泵以10 mL/min的相同流速混合進(jìn)燒杯中，并低速攪拌，保證沉淀能夠懸浮在溶液中，不宜過(guò)快，靜置沉淀后倒出上清液，沉淀用蒸餾水洗滌4次。將沉淀加入蒸餾水后，緩慢滴加25 mL濃度為40%的NaOH溶液，加熱至沸騰并保持沸騰I h，靜置沉淀后棄去上清液，反復(fù)4次。加入緩沖溶液1000 mL，加熱煮沸后靜置，取沉淀，蒸餾水洗滌4次后，取沉淀物冷卻至室溫，4 1下保存，制備羥基磷灰石層析柱，裝填后在線性流速23 cm/h下，用緩沖液平衡過(guò)夜。并使用緩沖液作為流動(dòng)相，測(cè)定不同時(shí)間的洗脫峰在A62tl下的吸光值，洗脫液使用部分收集器收集A62tl出峰的藻藍(lán)蛋白，最后噴霧干燥，得到藥用級(jí)藻藍(lán)蛋白。干燥粉的藻藍(lán)蛋白純度A62tZA28tl >2.0，藻藍(lán)蛋白回收率達(dá)到25%以上。實(shí)施例2
選取醋酸鹽緩沖體系，配制成PH6.0以及濃度為0. 10 mol/L的緩沖液。稱取新鮮螺 旋藻10. 0 g，分別加入10 mL緩沖液，使用50 w功率超聲破碎30 min，工作時(shí)間4 s,間隔時(shí)間2 S。處理后的料液在4°C低溫條件下高速離心10 min后吸取上清液，使用藥用級(jí)HCl溶液調(diào)節(jié)提取液至PH5. 5-6. 0，靜置I h后，采用膜孔徑大小為0. 45 y m的濾膜過(guò)濾，得到的溶液進(jìn)行噴霧干燥，干燥粉冷藏儲(chǔ)存。將摩爾濃度為0. 5 mol/L的CaCl2溶液和Na2HPO4溶液用恒流泵以10 mL/min的相同流速混合進(jìn)燒杯中，并低速攪拌，保證沉淀能夠懸浮在溶液中，不宜過(guò)快，靜置沉淀后倒出上清液，沉淀用蒸餾水洗滌4次。將沉淀加入蒸餾水后，緩慢滴加25 mL濃度為40%的NaOH溶液，加熱至沸騰并保持沸騰I h，靜置沉淀后棄去上清液，反復(fù)4次。加入緩沖溶液1000 mL，加熱煮沸后靜置，取沉淀，蒸餾水洗滌4次后，取沉淀物冷卻至室溫，4 1下保存，制備羥基磷灰石層析柱，裝填后在線性流速23 cm/h下，用緩沖液平衡過(guò)夜。并使用緩沖液作為流動(dòng)相，測(cè)定不同時(shí)間的洗脫峰在A62tl下的吸光值，洗脫液使用部分收集器收集A62tl出峰的藻藍(lán)蛋白，最后噴霧干燥，得到藥用級(jí)藻藍(lán)蛋白。干燥粉的藻藍(lán)蛋白純度A62tZA28tl >2.0，藻藍(lán)蛋白回收率達(dá)到25%以上。實(shí)施例3
選取乳酸鹽緩沖體系，配制成pH8. 0以及濃度為0. 05 mol/L的緩沖液。稱取新鮮螺旋藻10. 0 g，分別加入100 mL緩沖液，使用100 w功率超聲破碎20 min，工作時(shí)間4 S，間隔時(shí)間2 S。處理后的料液在6°C低溫條件下高速離心10 min后吸取上清液，使用藥用級(jí)HCl溶液調(diào)節(jié)提取液至PH4. 5-5. 5，靜置I h后，采用膜孔徑大小為0. 20 的濾膜過(guò)濾，得到的溶液進(jìn)行噴霧干燥，干燥粉冷藏儲(chǔ)存。制備羥基磷灰石層析柱，裝填后在線性流速23 cm/h下，用緩沖液平衡過(guò)夜。并使用緩沖液作為流動(dòng)相，測(cè)定不同時(shí)間的洗脫峰在A62tl下的吸光值，洗脫液使用部分收集器收集慫2(|出峰的藻藍(lán)蛋白，最后噴霧干燥，得到藥用級(jí)藻藍(lán)蛋白。干燥粉的藻藍(lán)蛋白純度A62tl/A280 > 2. 0，藻藍(lán)蛋白回收率達(dá)到25%以上。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
權(quán)利要求
1.一種從藻類中分離制備藥用級(jí)藻藍(lán)蛋白的方法，其特征在于所述方法的步驟包括在低溫下采用超聲波輔助提取技術(shù)處理藻類植物，以蛋白提取緩沖溶液提取藻類蛋白，得到粗提液；然后將粗提液PH調(diào)至酸性，靜置、清液離心，取上清液調(diào)節(jié)pH至中性；或?qū)⒋痔嵋篜H調(diào)至酸性、靜置后膜過(guò)濾，得濾液；經(jīng)過(guò)羥基磷灰石柱層析，流動(dòng)相為蛋白提取緩沖溶液，收集藻藍(lán)蛋白洗脫峰，再噴霧干燥，得到藥用級(jí)藻藍(lán)蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從藻類中分離制備藥用級(jí)藻藍(lán)蛋白的方法，其特征在于所述在低溫下采用超聲波輔助提取技術(shù)處理藻類植物的溫度條件為0°C _40°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從藻類中分離制備藥用級(jí)藻藍(lán)蛋白的方法，其特征在于所述超聲波輔助提取技術(shù)的條件為超聲功率為50W-200 W，提取時(shí)間為5-30 min。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從藻類中分離制備藥用級(jí)藻藍(lán)蛋白的方法，其特征在于所述蛋白提取緩沖溶液為0. 05 0. 15 mol/L、pH為6. 0-8. 0的磷酸鹽、醋酸鹽或乳酸鹽緩沖溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從藻類中分離制備藥用級(jí)藻藍(lán)蛋白的方法，其特征在于所述將粗提液PH調(diào)至酸性，其中酸性pH為3. 5-6. 0，采用的酸度調(diào)節(jié)劑為藥用級(jí)鹽酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從藻類中分離制備藥用級(jí)藻藍(lán)蛋白的方法，其特征在于所述清液離心采用低溫離心，溫度為4-6°C，離心力為8000-12000 X g。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從藻類中分離制備藥用級(jí)藻藍(lán)蛋白的方法，其特征在于所述膜過(guò)濾采用的膜的孔徑大小為0. 20 V- m-0. 45 u m。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從藻類中分離制備藥用級(jí)藻藍(lán)蛋白的方法，其特征在于所述藻類植物為螺旋藻。
全文摘要
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體涉及一種從藻類中分離制備藥用級(jí)藻藍(lán)蛋白的方法。所述方法的步驟包括在低溫下采用超聲波輔助提取技術(shù)處理藻類植物，以蛋白提取緩沖溶液提取藻類蛋白，得到粗提液；然后將粗提液pH調(diào)至酸性，靜置、清液離心，取上清液調(diào)節(jié)pH至中性；或?qū)⒋痔嵋簆H調(diào)至酸性、靜置后膜過(guò)濾，得濾液；經(jīng)過(guò)羥基磷灰石柱層析，流動(dòng)相為蛋白提取緩沖溶液，收集藻藍(lán)蛋白洗脫峰，再噴霧干燥，得到藥用級(jí)藻藍(lán)蛋白。本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)提取藻類藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量低、成本高的不足，首次得到藻藍(lán)蛋白純度A620/A280>2.0，藻藍(lán)蛋白回收率為25%以上的藻類色素蛋白復(fù)合物，大大簡(jiǎn)化了分離步驟，操作簡(jiǎn)單，降低成本，藻藍(lán)蛋白的性質(zhì)穩(wěn)定。
文檔編號(hào)C07K1/34GK102731644SQ20121024690
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月17日
發(fā)明者傅紅, 閆巖 申請(qǐng)人:福州大學(xué)