專(zhuān)利名稱(chēng)：丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法。
背景技術(shù)：
某些微生物可以在細(xì)胞內(nèi)積累丁二磺酸腺苷蛋氨酸，通過(guò)這些微生物，特別是在培養(yǎng)基中加入一定量的前體物質(zhì)L-蛋氨酸，菌體的合成能力大大加強(qiáng)。當(dāng)前，通過(guò)微生物發(fā)酵進(jìn)而提取丁二磺酸腺苷蛋氨酸，仍是工業(yè)化生產(chǎn)的主要途徑，但目前工藝發(fā)酵周期長(zhǎng)，步驟繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法對(duì)菌株釀酒酵母依次進(jìn)行活化、種子培養(yǎng)、發(fā)酵和精制后得丁二磺酸腺苷蛋氨酸成品。在一些實(shí)施方式中，包括以下步驟(I)、將菌株釀酒酵母接入平板培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度26 30°C，6 8天后，再將單菌落移至斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度26 30°C，時(shí)間6 8天,得斜面孢子。(2)、用無(wú)菌的接種環(huán)挖取0. 5 Icm2步驟(I)所得的斜面孢子至一級(jí)種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為26 30°C，培養(yǎng)時(shí)間為20 30h ;再將一級(jí)種子接種至下一級(jí)種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度26 30°C，培養(yǎng)時(shí)間為20 30h，每一級(jí)種子的接種量為I 20% ；(3)、將步驟(2)所得的最后一級(jí)種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10 30%，培養(yǎng)溫度26 30°C，罐壓0 0. 05MPa，風(fēng)量為1:1 1:2(V: V)，發(fā)酵過(guò)程中pH控制在3. 5
6.0，發(fā)酵開(kāi)始后即補(bǔ)入葡萄糖水，葡萄糖水的濃度為200 400g/L，控制總糖在0. 3
3.0g/100ml，發(fā)酵24h后再補(bǔ)充三磷酸腺苷和L-蛋氨酸，三磷酸腺苷的補(bǔ)入重量為發(fā)酵培養(yǎng)基量的0. 5 2. 5%，L-蛋氨酸的補(bǔ)入重量為發(fā)酵培養(yǎng)基量的0. 5 I. 5%，發(fā)酵48 72h后得到腺苷蛋氨酸發(fā)酵液；(4)、在步驟(3)所得的腺苷蛋氨酸發(fā)酵液中添加防腐劑和助濾劑對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行破壁，破壁后的發(fā)酵液通過(guò)板框進(jìn)行過(guò)濾，得腺苷蛋氨酸清液；(5)、將步驟(4)所得到的腺苷蛋氨酸清液通過(guò)超濾膜，得腺苷蛋氨酸超濾液，再將腺苷蛋氨酸超濾液通過(guò)納濾膜進(jìn)行濃縮，得腺苷蛋氨酸納濾液；(6)、將步驟(5)所得到的腺苷蛋氨酸納濾液用工業(yè)色譜進(jìn)行分離，流動(dòng)相采用有機(jī)溶劑作為洗脫體系，將純化分離得到的收集液減壓濃縮得腺苷蛋氨酸濃縮液；再在腺苷蛋氨酸濃縮液中加入丁二磺酸后進(jìn)行噴霧干燥或冷凍干燥，得到丁二磺酸腺苷蛋氨酸成品。在一些實(shí)施方式中，步驟(I)中的平板培養(yǎng)基配方和斜面培養(yǎng)基配方均為2. 0%重量份的葡萄糖、0. 5%重量份的酵母膏、0. 1%重量份的氯化鈉、2. 0%重量份的瓊脂，余量為蒸餾水。在一些實(shí)施方式中，步驟(2)中的種子培養(yǎng)基配方為2.0%重量份的葡萄糖，1.0%重量份的蛋白胨，0. 2%重量份的酵母粉，0. 4%重量份的磷酸氫二鉀，余量為飲用水。在一些實(shí)施方式中，步驟(3)中的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為2. 0%重量份的葡萄糖，
I.5%重量份的酵母粉，0. 4%重量份的磷酸氫二鉀，2. 0%重量份的硫酸銨，余量為飲用水。
在一些實(shí)施方式中，步驟(4)中的防腐劑為苯甲酸及其鹽類(lèi)、山梨酸及其鹽類(lèi)或尼泊金酯類(lèi)，每100升腺苷蛋氨酸發(fā)酵液中添加的防腐劑重量為0. 05 lKg，助濾劑為珍珠巖,每100升腺苷蛋氨酸發(fā)酵液中添加的助濾劑重量為0. 5 5Kg。在一些實(shí)施方式中，步驟(5)中超濾膜的截留分子量為5000 20000，選自聚砜、聚醚砜、聚氯乙烯、聚砜酰胺、磺化聚砜或交聚乙烯醇，納濾膜的截留分子量為100 1000，選自醋酸纖維素、磺化聚砜、磺化聚醚砜或聚乙烯醇。在一些實(shí)施方式中，步驟(6)中的工業(yè)色譜柱為反相色譜柱，色譜柱填料為> 3um的十八烷基硅烷鍵合硅膠，洗脫流動(dòng)相為有機(jī)溶劑如乙腈、甲醇或異丙醇與水的混合液，比如含5 15%甲醇的水混合液，含5 30%乙腈的水混合液，含有5 30%異丙醇的水混合液，恒流泵流速> 50ml/min，采用紫外檢測(cè)器檢測(cè)相關(guān)物質(zhì)，吸收波長(zhǎng)設(shè)定范圍在240 280nm。在一些實(shí)施方式中，步驟(6)中的腺苷蛋氨酸與丁二磺酸質(zhì)量比為I :0. 8 I. 2。在一些實(shí)施方式中，步驟(6)中干燥方法為噴霧干燥法或冷凍干燥法，噴霧干燥法中噴塔溫度60 80°C，流速大于0. lL/h，噴霧干燥時(shí)間5 7h，冷凍干燥法中預(yù)凍溫度(-35°C,，真空度為I 10pa，加熱溫度在5°C 40°C，冷凍干燥時(shí)間30 40h。在一些實(shí)施方式中，步驟(6)中減壓濃縮溫度彡60°C，真空度彡-0. 08Mpa。在一些實(shí)施方式中，釀酒酵母為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ATCCl1909。斜面培養(yǎng)基是通過(guò)以下方法制成的先將瓊脂稱(chēng)好后放入搪瓷杯中，加入適量蒸餾水煮沸使其溶化。再將其他成分稱(chēng)好后放入小燒杯中，加少量水?dāng)嚢枋蛊淙芙夂?，倒入搪瓷杯中混勻，最后定容至所需體積，用2N鹽酸調(diào)pH至7. 0，分裝到20 X 200的試管中，裝樣量為15 30ml。塞上棉塞，消毒。消毒后擱成斜面，冷卻后即可用于斜面制備。將本發(fā)明制得的丁二磺酸腺苷蛋氨酸成品采用高效液相色譜法測(cè)定，色譜條件如下色譜柱為C18柱,洗脫液為甲酸銨水溶液，流速為I. Oml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm,注入體積為20uI,色譜柱溫度為常溫。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果通過(guò)對(duì)菌株釀酒酵母依次進(jìn)行種子培養(yǎng)、發(fā)酵和精制后得丁二磺酸腺苷蛋氨酸成品，發(fā)酵周期短，分離效果好，產(chǎn)品純度高。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一I、制備斜面先稱(chēng)取20g瓊脂放入搪瓷杯中，加入適量蒸餾水煮沸使其溶化。再稱(chēng)取20g葡萄糖、5g酵母膏和Ig氯化鈉放入小燒杯中，加少量水?dāng)嚢枋蛊淙芙夂?，倒入搪瓷杯中混勻，最后定?L，用211101/1鹽酸調(diào)？11至7.0，裝入20\200的試管中，裝樣量為20ml。塞上棉塞，擱成斜面，冷卻后即得斜面培養(yǎng)基。2、制備斜面孢子將菌株Saccharomyces cerevisiae ATCC11909接入平板培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度26°C，6天后，再將單菌落移至步驟I所得的斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度26°C，時(shí)間6天，得斜面孢子，平板培養(yǎng)基配方為2. 0%重量份的葡萄糖、0. 5%重量份的酵母膏、0. 1%重量份的氯化鈉、2. 0%重量份的瓊脂，余量為蒸餾水。3、一級(jí)種子用無(wú)菌的接種環(huán)挖取0. 5cm2步驟2所得的斜面孢子至裝有80ml —級(jí)種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，再將搖瓶放入北京安必升科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的型號(hào)為Y45H搖床內(nèi)，搖床轉(zhuǎn)數(shù)220n，培養(yǎng)溫度26°C，時(shí)間20h，一級(jí)種子培養(yǎng)基的配方為2. 0%重量份的葡萄糖，I. 0%重量份的蛋白胨，0. 2%重量份的酵母粉，0. 4%重量份的磷酸氫二鉀，余量為飲用水，得一級(jí)種子。4、二級(jí)種子將步驟3所得的一級(jí)種子以10%的接種量接入裝有8L 二級(jí)種子培養(yǎng)基的15L種子罐中，培養(yǎng)溫度26°C，時(shí)間20h，二級(jí)種子培養(yǎng)基的配方為2. 0%重量份的葡萄糖，I. 0%重量份的蛋白胨，0. 2%重量份的酵母粉，0. 4%重量份的磷酸氫二鉀，余量為飲用水，得二級(jí)種子。5、發(fā)酵培養(yǎng)將步驟4所得的二級(jí)種子以10%的接種量接入裝有80L發(fā)酵培養(yǎng)基中的200L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度26°C，罐壓0. 05MPa,風(fēng)量為1:1(V: V)，發(fā)酵過(guò)程中pH控制在
4.5 6. 0,發(fā)酵Imin開(kāi)后即補(bǔ)入葡萄糖水,葡萄糖水的濃度為250g/L,控制總糖在0. 3 3. 0g/100ml，發(fā)酵24h后再補(bǔ)充三磷酸腺苷和L-蛋氨酸，三磷酸腺苷的補(bǔ)入重量為發(fā)酵培養(yǎng)基重量的0. 8%，L-蛋氨酸的補(bǔ)入重量為發(fā)酵培養(yǎng)基重量的0. 8%。發(fā)酵64h后得到腺苷蛋氨酸發(fā)酵液。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為2. 0%重量份的葡萄糖，I. 5%重量份的酵母粉，0. 4%重量份的磷酸氫二鉀，2. 0%重量份的硫酸銨,余量為飲用水。6、取步驟5所得的腺苷蛋氨酸發(fā)酵液100L，在發(fā)酵液中加入防腐劑苯甲酸鈉100g，助濾劑珍珠巖500g，攪拌2小時(shí)進(jìn)行破壁；破壁后的發(fā)酵液通過(guò)昆山市昆工環(huán)保機(jī)械有限公司生產(chǎn)的型號(hào)為Y5/450-25板框式壓濾機(jī)過(guò)濾，得到腺苷蛋氨酸清液120L，腺苷蛋氨酸濃度2. 5mg/ml。在其它的實(shí)施例中防腐劑還可以采用苯甲酸、山梨酸及其鹽類(lèi)或尼泊
金酯類(lèi)。7、將步驟6得到的腺苷蛋氨酸清液通過(guò)超濾膜過(guò)濾，過(guò)截留分子量20000的超濾膜，超濾膜材質(zhì)為聚砜，收集濾液，結(jié)束后用去離子水水洗，得腺苷蛋氨酸超濾液體積150L，腺苷蛋氨酸濃度2. 0mg/mlo8、將步驟7得到的腺苷蛋氨酸超濾液，通過(guò)截留分子量200的納濾膜，納濾膜材質(zhì)為磺化聚砜，得腺苷蛋氨酸納濾液體積2. 1L，腺苷蛋氨酸濃度136mg/ml。9、取步驟8所得的腺苷蛋氨酸納濾液0. 5L，加入等體積的甲醇溶液，混合溶液進(jìn)樣上反向色譜柱，色譜柱填料采用10 y m的十八烷基硅烷鍵合硅膠，使用乙腈水=10 90作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，流速為150ml/min，收集腺苷蛋氨酸洗脫液。10、將步驟9中所得的腺苷蛋氨酸洗脫液真空濃縮，濃縮溫度50°C，濃縮真空度-0. 08Mpa，得濃度為251mg/ml的腺苷蛋氨酸濃縮液。11、在步驟10收集到的腺苷蛋氨酸濃縮液中加入丁二磺酸，腺苷蛋氨酸解析液與丁二磺酸質(zhì)量比為1:0. 8 ;再對(duì)該混合物冷凍干燥，預(yù)凍溫度為-40°C，真空度為5pa，加熱溫度在40°C，干燥時(shí)間30h，得到丁二磺酸腺苷蛋氨酸成品412. Og。12、將步驟11制得的丁二磺酸腺苷蛋氨酸成品采用高效液相色譜法測(cè)定，色譜條件如下色譜柱為C18柱，洗脫液為甲酸銨水溶液，流速為I. Oml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，注入體積為20ul，色譜柱溫度為常溫。樣品純度為99. 71% (見(jiàn)表一)。表一 丁二磺酸腺苷蛋氨酸樣品HPLC測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
1.丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法，其中，對(duì)菌株釀酒酵母依次進(jìn)行種子培養(yǎng)、發(fā)酵和精制后得丁二磺酸腺苷蛋氨酸成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法，其中，所述種子培養(yǎng)步驟包括 (1)、將菌株釀酒酵母接入平板培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度26 30°C，6 8天后，再落移至斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度26 30°C，時(shí)間6 8天，得斜面孢子； (2)、用無(wú)菌的接種環(huán)挖取0.5 Icm2步驟(I)所得的斜面孢子至一級(jí)種子培養(yǎng)基中，在26 30°C溫度下培養(yǎng)20 30小時(shí)；再將一級(jí)種子接種至下一級(jí)種子培養(yǎng)基中，在26 30°C溫度下培養(yǎng)20 30小時(shí)，每一級(jí)種子的接種量為I 20% ； 所述發(fā)酵步驟包括 (3)、將步驟(2)所得的最后一級(jí)種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10 30%，培養(yǎng)溫 度26 30°C，罐壓0 0. 05MPa，風(fēng)量為體積比1:1 1: 2，發(fā)酵過(guò)程中pH控制在3. 5 6. 0，發(fā)酵開(kāi)始后即補(bǔ)入葡萄糖水，葡萄糖水的濃度為200 400g/L，控制總糖在0. 3 3. 0g/100ml，發(fā)酵24小時(shí)后再補(bǔ)充三磷酸腺苷和L-蛋氨酸，三磷酸腺苷的補(bǔ)入量為發(fā)酵培養(yǎng)基重量的0. 5 2. 5%, L-蛋氨酸的補(bǔ)入量為發(fā)酵培養(yǎng)基重量的0. 5 I. 5%,發(fā)酵48 72h后得腺苷蛋氨酸發(fā)酵液； (4)、在步驟(3)所得的腺苷蛋氨酸發(fā)酵液中添加防腐劑和助濾劑對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行破壁，破壁后的發(fā)酵液通過(guò)板框進(jìn)行過(guò)濾，得到腺苷蛋氨酸清液； 所述精制步驟包括 (5)、將步驟(4)所得到的腺苷蛋氨酸清液通過(guò)超濾膜，得腺苷蛋氨酸超濾液，再將腺苷蛋氨酸超濾液通過(guò)納濾膜進(jìn)行濃縮，得腺苷蛋氨酸納濾液； (6)、將步驟(5)所得到的腺苷蛋氨酸納濾液用工業(yè)色譜進(jìn)行分離，流動(dòng)相采用有機(jī)溶劑作為洗脫體系，將純化分離得到的收集液減壓濃縮得腺苷蛋氨酸濃縮液；再在腺苷蛋氨酸濃縮液中加入丁二磺酸后進(jìn)行噴霧干燥或冷凍干燥，得到丁二磺酸腺苷蛋氨酸成品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法，其中，步驟(2)中所述的種子培養(yǎng)基配方為2. 0%重量份的葡萄糖，I. 0%重量份的蛋白胨，0. 2%重量份的酵母粉，0. 4%重量份的磷酸氫二鉀，余量為飲用水。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法，其中，步驟(3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為2. 0%重量份的葡萄糖，I. 5%重量份的酵母粉，0. 4%重量份的磷酸氫二鉀,2. 0%重量份的硫酸銨,余量為飲用水。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法，其中，步驟(4)中所述的防腐劑為苯甲酸及其鹽類(lèi)、山梨酸及其鹽類(lèi)或尼泊金酯類(lèi)，每100升腺苷蛋氨酸發(fā)酵液中添加的防腐劑重量為0. 05 lKg，助濾劑為珍珠巖，每100升腺苷蛋氨酸發(fā)酵液中添加的助濾劑重量為0. 5 5Kg。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法，其中，步驟(5)中所述的超濾膜的截留分子量為5000 20000，選自聚砜、聚醚砜、聚氯乙烯、聚砜酰胺、磺化聚砜或聚乙烯醇，所述納濾膜的截留分子量為100 1000，選自醋酸纖維素、磺化聚砜、磺化聚醚砜或聚乙烯醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法，其中，步驟(6)中所述的工業(yè)色譜柱為反相色譜柱，色譜柱填料為> 3um的十八烷基硅烷鍵合硅膠，洗脫流動(dòng)相有機(jī)溶劑為乙腈、甲醇、異丙醇，流速彡50ml/min。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法，其中，步驟(6)中所述腺苷蛋氨酸濃縮液與丁二磺酸質(zhì)量比為I :0. 8 I. 2，所述噴霧干燥法中噴塔溫度60 80°C，流速大于0. lL/h，噴霧干燥時(shí)間為5 7h，所述冷凍干燥法中預(yù)凍溫度< _35°C，真空度為I 10pa，加熱溫度在5°C 40°C，干燥時(shí)間為30-40h。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法，其中，步驟(I)中所述的平板培養(yǎng)基配方和斜面培養(yǎng)基配方均為2. 0%重量份的葡萄糖、0. 5%重量份的酵母膏、0. 1%重量份的氯化鈉、2. 0%重量份的瓊脂，余量為蒸餾水。
10.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法，其中，所述釀酒酵母為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) ATCC 11909。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法，對(duì)菌株釀酒酵母依次進(jìn)行種子培養(yǎng)、發(fā)酵和精制后得丁二磺酸腺苷蛋氨酸成品。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于發(fā)酵周期短，分離效果好，產(chǎn)品純度高。
文檔編號(hào)C07H1/06GK102747123SQ20121026977
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月31日
發(fā)明者付靜, 史佳棟, 張瑩, 徐建國(guó), 朱培碩 申請(qǐng)人:無(wú)錫福祈制藥有限公司