專利名稱：Crp單克隆抗體納米乳膠微球組合物及制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)免疫領(lǐng)域,涉及C反應(yīng)蛋白(c-reactive protein, CRP)單克隆抗體(Monoclonal antibody, McAb)的制備,涉及C反應(yīng)蛋白單克隆抗體納米乳膠微球的偶聯(lián)，涉及不同C反應(yīng)蛋白抗體納米乳膠微球偶聯(lián)物的組合，還涉及C反應(yīng)蛋白的檢測應(yīng)用。
背景技術(shù)：
C反應(yīng)蛋白是可在急性炎癥病人血清中濃度升高的可以結(jié)合肺炎球菌細(xì)胞壁C多糖的蛋白質(zhì)。人類C反應(yīng)蛋白至少可以有兩種存在形式，一種是由五個(gè)相同的亞基以非共價(jià)鍵形成五聚體(pentameric CRP, pCRP),這是血清中CRP主要存在形式；另一種為單個(gè)亞基的單體(modified/monomeric CRP,mCRP),可由五聚體在活化的血小板膜上分解形成。作為一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，血漿中CRP濃度在正常人中含量極微，一般新生兒血清CRP水平小于2mg/L，兒童和成人小于10mg/L，但在急性心肌梗死、創(chuàng)傷、感染、炎癥、外科手術(shù)、腫癌浸潤時(shí)迅速顯著的增高，可達(dá)正常水平數(shù)百倍甚至上千倍。CRP上升速度、幅度和持續(xù)時(shí)間與病情和組織損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，因此作為炎癥和組織損傷的非特異性標(biāo)志物被廣泛應(yīng)用于臨床疾病診斷和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。CRP濃度的臨床檢測方法主要有膠乳凝集法、免疫層析法、化學(xué)發(fā)光法、放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法及乳膠增強(qiáng)比濁法等，其中乳膠增強(qiáng)比濁法是目前公認(rèn)檢測效率最高的方法。CRP檢測按其濃度檢測范圍大致分為兩類:第一類是普通CRP檢測，檢測范圍通常在3-200mg/L，但其線性范圍不能覆蓋微量CRP。第二類是高敏CRP (high-sensitivityCRP, hs-CRP)檢測，它比常規(guī)檢測方法更敏感，靈敏度可低于0.3mg/L,能準(zhǔn)確定量
0.ri0mg/L濃度范圍內(nèi)的CRP，臨床上用于評(píng)估心臟病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但是高敏CRP試劑無法檢測更高濃度的CRP。目前在國內(nèi)用乳膠增強(qiáng)免疫比濁法測定CRP的試劑盒中，其致敏乳膠微球的抗體大多為CRP多克隆抗體(Polyclonal antibody, PcAb),或是采用兩種粒徑微球分別偶聯(lián)CRP多克隆抗體后混合作為反應(yīng)試劑。這些試劑盒有以下不足:首先，雖然多克隆抗體乳膠微球比單克隆抗體乳膠微球具有更高的靈敏度，但線性范圍較窄，單獨(dú)使用不易達(dá)到CRP全程測量的要求；其次，單一粒徑的微球偶聯(lián)CRP多克隆抗體制備乳膠微球增強(qiáng)免疫比濁試劑，無法同時(shí)測定高濃度和低濃度水平下的CRP含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)上的不足，提供多株互補(bǔ)配對(duì)的CRP單克隆抗體及多克隆抗體，并與納米乳膠微球偶聯(lián)，偶聯(lián)物按比例混合制成組合物，應(yīng)用于CRP免疫定量試劑盒的制備，可與全自動(dòng)生化分析儀、特種蛋白分析儀等儀器匹配進(jìn)行免疫透射和免疫散射比濁測定人全血、血清CRP濃度，實(shí)現(xiàn)CRP全量程檢測。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:選擇高親和力的CRP單克隆抗體的多株互補(bǔ)配對(duì)亞型，用特殊工藝分別與合適粒徑的羧基化聚苯乙烯微球偶聯(lián)，制成CRP單克隆抗體納米乳膠微球偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物可按不同的比例與CRP多克隆抗體乳膠微球偶聯(lián)物混合，從而提聞CRP檢測的性能指標(biāo)。本發(fā)明可應(yīng)用于免疫比濁法(散射免疫/透射免疫比濁)測定人血CRP濃度。本發(fā)明的具體步驟如下:1，從人血清純化天然CRP作為免疫原，制備高特異性、高親和力、高純度的CRP單克隆抗體。2，選擇合適粒徑的羧基化聚苯乙烯微球，通過1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(l-Ethyl-3-(3-dimethyl laminopropyl) carbodiimidehydrochloride, EDAC)活化微球表面的羧基，生成活性酯，再與CRP單克隆抗體上的伯胺基反應(yīng)，形成共價(jià)鍵，完成交聯(lián)，獲得CRP單克隆抗體乳膠微球偶聯(lián)物。3，選擇合適的儲(chǔ)存液懸浮CRP單克隆抗體乳膠微球偶聯(lián)物，或?qū)⒉煌珻RP抗體乳膠微球偶聯(lián)物按一定比例混合，配制成適合CRP檢測的試劑，使其同時(shí)滿足高靈敏度和寬線性范圍的要求，用于臨床上乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測CRP濃度。步驟I所述的CRP單克隆抗體是用人C反應(yīng)蛋白免疫，可以是人源性、鼠源性或兔源性等,但并不限于此。CRP單克隆抗體來源可以是雜交瘤細(xì)胞免疫動(dòng)物的腹水，也可以是CHO細(xì)胞表達(dá)，或雜交瘤無血清培養(yǎng)。純化方式為硫酸銨沉淀和親和柱純化。所獲得的抗體具有互補(bǔ)配對(duì)的不同抗原識(shí)別表位，可以是不同的抗體亞型，其抗原抗體親和力(affinity) Ka 彡 IXlO8M'步驟2所述的交聯(lián)方法為碳二亞胺法。碳二亞胺是一類很強(qiáng)的脫水劑，能使羧基與氨基脫水形成酰胺鍵。本發(fā)明選用EDAC作為交聯(lián)劑，它屬于碳二亞胺類中可溶于水的一種，適用于蛋白質(zhì)的偶聯(lián)。ED AC與羧基反應(yīng)形成O-?；惲螂逯虚g體，該中間體易于水解，在水溶液中很不穩(wěn)定。該中間體(O-?；惲螂?在N-羥基硫代琥珀酰亞胺(N-hydroxysulfosuccinimide, Sulfo-NHS)存在的情況下,可以形成具有與氨基反應(yīng)活性的NHS-活性酯，這種NHS-活性酯中間體非常穩(wěn)定。因此，本發(fā)明選用EDAC和Sulfo-NHS活化羧基微球，可提聞活化效率。步驟2所述的聚苯乙烯微球粒徑在50_500nm。其中，小粒徑微球偶聯(lián)弱親和力單克隆抗體，可提高測試的線性范圍。大粒徑微球偶聯(lián)強(qiáng)親和力單克隆抗體，可提高檢測靈敏度。與每毫克聚苯乙烯微球交聯(lián)的抗體量可根據(jù)檢測需要進(jìn)行調(diào)整，范圍可以是0.03-1毫克。步驟3所述的偶聯(lián)物，是指CRP單克隆抗體和羧基聚苯乙烯微球共價(jià)交聯(lián)的偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物可以是同種微球偶聯(lián)不同亞型的CRP單克隆抗體，也可以是不同粒徑微球偶聯(lián)不同亞型的CRP單克隆抗體。將幾種偶聯(lián)物懸液按不同比例混合，可拓寬CRP乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測的線性范圍。本發(fā)明所述CRP單克隆抗體納米乳膠微球組合物還涉及乳膠微球的懸浮緩沖液(儲(chǔ)存液)和與抗原反應(yīng)的緩沖液(反應(yīng)液)。本發(fā)明所涉及緩沖液可選用具有相似性質(zhì)的一種或幾種:磷酸鹽緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、2-嗎啉乙磺酸緩沖液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液、羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液、氯化銨緩沖液及甘氨酸緩沖液等。儲(chǔ)存液可選擇上述一種合適緩沖液，鹽濃度在20_300mM。其中可添加蛋白穩(wěn)定劑，如蔗糖(參考濃度5-15%)、SDS (參考濃度0.005-0.03%)等，還可添加非離子表面活性劑，如 TritonX-1OO (參考濃度 0.005-0.05%)。反應(yīng)液可選擇上述一種合適緩沖液，其中可添加非離子表面活性劑和加速反應(yīng)的增濁劑，如聚乙二醇4000 (參考濃度0.05-3%)和吐溫20 (參考濃度0.01-0.05%)等。溶血?jiǎng)┰跈z測樣本為全血時(shí)也可添加。儲(chǔ)存液和反應(yīng)液中可添加防腐劑如疊氮鈉(參考濃度小于0.1%)和小牛血清蛋白(參考濃度0.05-1%)。本發(fā)明具有以下特性與效果:1.本發(fā)明所涉及的CRP單克隆抗體所使用的免疫原是從人血清純化而來，比CRP重組蛋白有更多天然抗原表位。通過動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、篩選和克隆化，優(yōu)選出7C1 (IgG)和OTl(IgG)兩種互補(bǔ)配對(duì)的雜交瘤細(xì)胞亞型。經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)或接種小鼠，獲得高親和力的單抗，其抗原親和力均高于IXlO8M'本項(xiàng)目建立的雜交瘤細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝，使生產(chǎn)的CRP單克隆抗體在不同生產(chǎn)批次間差異小，質(zhì)量穩(wěn)定。單克隆抗體的純化采用硫酸銨初步沉淀捕獲抗體，隨后用蛋白G親和層析柱精細(xì)純化，使其純度大于99%。CRP單克隆抗體可作為ELISA、免疫沉淀、免疫層析和化學(xué)發(fā)光等CRP檢測試劑盒的原料，用途廣泛。2.本發(fā)明所涉及的CRP單克隆抗體納米乳膠微球，是用活化劑EDAC和Sulf0-NHS將乳膠微球上的羧基轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定中間體，使抗體上的伯胺與之能穩(wěn)定高效的形成肽鍵，從而將CRP單克隆抗體偶聯(lián)于合適粒徑的羧基化聚苯乙烯微球上。通過調(diào)節(jié)偶聯(lián)物儲(chǔ)存緩沖液的配方，CRP乳膠微球可在4°C條件下穩(wěn)定保存二年。3.CRP納米乳膠微球根據(jù)需要可調(diào)配成普通、高敏及全量程乳膠增強(qiáng)免疫比濁試齊U，它由不同乳膠微球混合配制實(shí)現(xiàn)。如要配制全量程CRP乳膠增強(qiáng)免疫比濁試劑，制備步驟為:兩種亞型的CRP單克隆抗體分別偶聯(lián)，或混合偶聯(lián)同一微球或不同微球；CRP多克隆抗體血清用抗原親和柱純化，先用低酸性洗脫液洗脫弱親和力的多抗部分，然后降低洗脫液PH值，洗脫下強(qiáng)親和力的多抗部分，將弱親和力多抗和強(qiáng)親和力多抗分別與不同微球偶聯(lián)。將這些抗體偶聯(lián)物分別與CRP抗原進(jìn)行免疫比濁反應(yīng)測試，篩選高靈敏度和寬線性范圍的偶聯(lián)物，將其按比例兩兩混合，確定符合臨床檢測需要的同時(shí)具有高靈敏度和寬線性范圍的最佳偶聯(lián)物比例。4.本發(fā)明所涉及的CRP納米乳膠微球組合物具有靈活、普適的特點(diǎn)，可用于血清及全血CRP的檢測。通過調(diào)節(jié)CRP抗體納米乳膠微球組合物配方及其比例，可以滿足免疫比濁透射和散射檢測的需要，為試劑盒生產(chǎn)提供可靠原料。


圖1a直接ELISA法對(duì)C反應(yīng)蛋白(CRP)單克隆抗體7C1親和力常數(shù)的測定。圖1b直接ELISA法對(duì)C反應(yīng)蛋白(CRP)單克隆抗體5D1親和力常數(shù)的測定。圖2夾心ELISA法檢測單克隆抗體7C1與的抗原表位互補(bǔ)性。7C1作為捕獲抗體，HRP-5D1為檢測抗體。圖3a CRP抗體乳膠顆粒組合物測定線性范圍曲線(透射比濁法，濃度范圍0_350mg/L)。圖3b CRP抗體乳 膠顆粒組合物測定線性范圍曲線(透射比濁法，濃度范圍0_20mg/L)。
圖4CRP抗體乳膠顆粒組合物測定線性范圍曲線(散射比濁法)。
圖5激光粒度分析儀分析CRP抗體納米乳膠顆粒偶聯(lián)物的直徑分布(動(dòng)態(tài)光散射法)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1CRP單克隆抗體的制備I人血清CRP的分離純化1.1硫酸按沉淀總蛋白用飽和度為80%的硫酸銨沉淀人血清樣本(CRP>100mg/L)中的總蛋白，4°C沉淀過夜；次日，以8000rpm，4°C離心30min，用基礎(chǔ)緩沖液(20mM Tris-HCl, pH7.8)溶解沉淀，充分透析，除去硫酸銨。1.2初級(jí)純化CRP取適量活化好的DEAE填料(Diethylaminoethyl cellulose)裝柱，用上述基礎(chǔ)緩沖液平衡。將上述預(yù)處理的樣品上樣，通過改變離子強(qiáng)度進(jìn)行梯度洗脫(洗脫液中NaCl濃度分別為80mM、120mM、250mM)，分別收集洗脫液，用紫外分光光度計(jì)測定蛋白濃度，至A280nm<0.002。洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western-blot檢測，以確定CRP所在的洗脫液區(qū)段。1.3親和層析精細(xì)純化CRP用ImM HCl 對(duì) Ig CNBr-activated Sepharose 4B(Sigma)填料進(jìn)行溶脹和洗漆，加入30mg用偶聯(lián)緩沖液(IOOmM NaHCO3, 500mM NaCl, pH8.3)充分透析的CRP多克隆抗體，4°C攪拌偶聯(lián)過夜；次日，用IM的乙醇胺封閉2小時(shí)；以緩沖液A(100mM NaAc, 500mMNaCl, pH4.0)與緩沖液 B (IOOmM Tris-HCl, 500mMNaCl, pH8.0)交替洗滌 3 次，然后裝柱。同時(shí)將上述初級(jí)純化的目的蛋白用結(jié)合緩沖液(20mM Tris-HCl, 120mM NaCl, pH7.8)充分透析后，上樣于上述親和層析柱，然后以洗脫液(IOOmM NaAc, 500mM NaCl, pH2.9)充分洗脫，收集洗脫液，至紫外分光光度計(jì)測量值A(chǔ)28tol〈0.002，采用BCA蛋白定量試劑盒(PIERCE)測定純化的CRP濃度，使用SDS-PAGE和免疫印跡法進(jìn)行鑒定。所獲得的純化CRP用于后述CRP抗原免疫小鼠和其他相關(guān)檢測。2CRP單克隆抗體的制備
2.1CRP抗原免疫小鼠首先飼養(yǎng)6-8周齡及體重為20_25g的BALB/c小鼠用于實(shí)驗(yàn)。取健康BALB/c小鼠3只，第I次用50 μ g純化的人CRP與等體積的完全福氏佐劑混合至完全乳化，經(jīng)頸背部皮下、腋下及腹股溝多點(diǎn)注射。以后每隔3周，以不完全福氏佐劑加50 μ g純化CRP蛋白溶液用相同方法加強(qiáng)免疫I次，重復(fù)3次。細(xì)胞融合前3天，取相同的抗原量在尾靜脈注射追加免疫I次，作為加強(qiáng)免疫。然后進(jìn)行效價(jià)測定，用血清多抗的稀釋度表示。如果免疫后的小鼠血清與抗原樣品有特異性結(jié)合(Western blot),抗血清效價(jià)在1:10000以上(Dot blot方法)，則進(jìn)入下列步驟。2.2免疫脾細(xì) 胞的制備和NS-1小鼠骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)免疫脾淋巴細(xì)胞的制備:上述加強(qiáng)免疫3天后，用頸椎脫白法將小鼠處死，然后將小鼠浸泡于75%酒精5分鐘。以下在超凈臺(tái)中無菌操作:取出小鼠脾臟，浸泡于PBS，在脾臟表面用注射器制造5-10個(gè)小孔，隨后將裝滿5ml PBS的注射器插入脾臟，逐步用PBS沖洗脾臟內(nèi)部，淋巴細(xì)胞從脾臟表面小孔流出到培養(yǎng)皿溶液中。最終收集I X IO8個(gè)淋巴細(xì)胞。NS-1骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng):選擇對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。為避免細(xì)胞返祖，每隔3個(gè)月用含有8-氮鳥嘌呤(8-AG)的培養(yǎng)液中培養(yǎng)一次。細(xì)胞密度適宜(0.1
IX IO6個(gè)/ml)，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，活細(xì)胞數(shù)應(yīng)>90%。2.3細(xì)胞融合將上述準(zhǔn)備好的淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞在PEG4000作用下進(jìn)行細(xì)胞融合。融合方法:將NS-1骨髓瘤細(xì)胞與脾淋巴細(xì)胞的比例為1:2 5混合，將Iml 50%的PEG4000 (無菌，預(yù)溫37°C )在I分鐘內(nèi)滴完，靜置90秒，然后立即將事先準(zhǔn)備的IOml細(xì)胞培養(yǎng)液逐滴加入，停止PEG作用。2.4雜交瘤細(xì)胞的選擇培 養(yǎng)由于骨髓瘤細(xì)胞帶有兩種基因的突變，在HAT培養(yǎng)液(hypoxanthine-aminopterin-thymidine medium)中不能生長；而脾淋巴細(xì)胞沒有上述兩種基因突變,能在HAT培養(yǎng)液中存活，但自身體外無法增殖，只有二者形成的雜交瘤細(xì)胞才能繁殖。根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入HAT培養(yǎng)基，使96孔板中每孔細(xì)胞數(shù)為(0.5-1.5) X IO5個(gè)。融合后7天，換用HT培養(yǎng)液。HT是次磺嘌呤(Hypoxanthine, IOmM)和胸腺卩密唳核苷(Thymidine,1.6mM)的混合劑,作為DNA補(bǔ)救合成途徑的補(bǔ)充劑,用以克服細(xì)胞內(nèi)殘留氨基喋呤(Aminopterin)對(duì)DNA經(jīng)典合成途徑的抑制作用。如果由于細(xì)胞密度過低不利于細(xì)胞生長繁殖，可用小鼠腹腔細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞，其存活一般不超過2周，不影響隨后雜交瘤細(xì)胞的純化。2.5雜交瘤細(xì)胞的篩選用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)4-7天后，當(dāng)細(xì)胞集落約20%左右時(shí)，利用已包被好CRP抗原的酶標(biāo)板，采用間接ELISA方法，進(jìn)行陽性克隆篩選，然后用Western blot鑒定。將兩種篩選均為陽性的細(xì)胞株進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，以確保產(chǎn)生的抗體具有較高特異性。首先進(jìn)行間接ELISA法鑒定單抗的特異性。用人CRP包被酶標(biāo)板(每孔IOng)，以篩選得到的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清為一抗，以NS-1細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陰性對(duì)照，37°C孵育1.5小時(shí)，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，37°C孵育I小時(shí)，最后以TMB顯色，測A45tod值。其中CRP蛋白包被板A45tl值高于空白對(duì)照板A45tl值2.1倍以上的融合細(xì)胞株視為陽性。通過以上ELISA初篩的克隆，用Western blot法進(jìn)行鑒定。取純化的人CRP蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至NC膜上；用50g/L的脫脂奶粉室溫封閉2小時(shí)；以篩選所得的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清為一抗，4°C孵育過夜；二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，I: 1000稀釋于50g/L的溶于PBS的脫脂奶粉，37°C孵育I小時(shí)。用ECL或ECL plus試劑盒(Amersham公司)顯色，成像。2.6雜交瘤細(xì)胞的克隆化上一步驟產(chǎn)生的細(xì)胞可能是分泌不同單抗的雜交瘤細(xì)胞的混合，或混有其他細(xì)胞，需要進(jìn)一步克隆以獲取分泌單一抗體的雜交瘤細(xì)胞系。選取檢測結(jié)果強(qiáng)陽性且細(xì)胞狀態(tài)佳的融合孔，通過有限稀釋法克隆化。細(xì)胞懸液通過系列稀釋，每個(gè)培養(yǎng)孔含預(yù)測細(xì)胞數(shù)目0.5-1個(gè)，然后再次篩選。如此重復(fù)，直到用間接ELISA檢測陽性率達(dá)100%。將陽性細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，收集上清并凍存融合細(xì)胞。
2.7單克隆抗體的生成和純化單克隆抗體生成:接種雜交瘤細(xì)胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價(jià)的單克隆抗體。接種前I周對(duì)BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml石蠟油，一周后取(0.5 1.0) X IO6個(gè)雜交瘤細(xì)胞·接種于該小鼠，1-3周內(nèi)形成腹水，腹水中單克隆抗體濃度可達(dá)5-10mg/ml。在CRP單克隆抗體純化之前，需對(duì)腹水進(jìn)行預(yù)處理，這是為了去除腹水中細(xì)胞及其殘?jiān)?、小微球物質(zhì)、以及脂肪滴等。用二氧化硅吸附法，將新鮮采集的腹水(或凍存的腹水)，2000rpm/min 15分鐘，除去細(xì)胞成分(或凍存過程中形成的固體物質(zhì))等。取上層清亮的腹水，等量加入ρΗ7.2巴比妥緩沖鹽水(VBS ；0.004Μ巴比妥，0.15Μ NaCl,0.8mM Mg2+，0.3mM Ca2+)稀釋；然后以每IOml稀釋腹水中加150mg 二氧化硅粉末，混勻，懸液在室溫孵育30分鐘，不時(shí)搖動(dòng)；2000g離心20分鐘，脂質(zhì)等通過該法除去，即可得澄清的腹水。經(jīng)上述預(yù)處理的腹水，進(jìn)一步用親和純化法進(jìn)行純化。用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗體與載體Sepharose交聯(lián)，制備親和層析柱將抗體結(jié)合后洗脫，回收率可達(dá)90%以上。葡萄球菌A蛋白可與IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3結(jié)合，同時(shí)還結(jié)合少量的IgM。洗脫液中的抗體濃度可用紫外分光光度計(jì)粗略測量，小鼠IgG單克隆抗體溶液A28tl為1.44時(shí)相當(dāng)于I mg/ml。為保持純化抗體的活性,需在收集管內(nèi)預(yù)置pH中和液,抗體經(jīng)過低pH值洗脫液洗脫于該收集管內(nèi)。2.8單克隆抗體的鑒定抗體Ig亞類鑒定:取雜交瘤培養(yǎng)上清及腹水單抗，用Sigma公司的小鼠單克隆抗體亞類鑒定試劑盒(IsoQuick kit for mouse monoclonal isotyping)進(jìn)行鑒定，方法按說明書進(jìn)行。所得兩個(gè)單克隆抗體7C1和5D1亞型都是IgGl。特異性測定:用Western blot方法檢測確定人血清除CRP外的其他抗原與所檢測單克隆抗體沒有非特異性結(jié)合。效價(jià)測定:用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示。篩選所得的McAb細(xì)胞培養(yǎng)上清為一抗，兩個(gè)單克隆抗體7C1和5D1抗血清效價(jià)在1:10000以上。2.9單克隆抗體的大量制備采用發(fā)酵罐式生物反應(yīng)器大規(guī)模制備單克隆抗體，并采用無血漿培養(yǎng)基技術(shù)以減少污染，簡化抗體提純，從而既可保證制備高純度抗體，提高試劑盒靈敏度，又可保證大規(guī)模生產(chǎn)的需要，能直接運(yùn)用于企業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。實(shí)施例2直接ELISA法測定CRP單克隆抗體親和力常數(shù)實(shí)驗(yàn)材料:鼠抗人CRP單克隆抗體，來自CRP單克隆抗體細(xì)胞株培養(yǎng)上清液，0.22 μ m濾膜過濾，經(jīng)Sepharose Protein G親和純化、Superdex 200凝膠過濾，收集200kD-100kD的分離組分，超濾濃縮至一定濃度后，0.22 μ m濾膜過濾，_20°C儲(chǔ)存于PBS緩沖液加20%(v/v)甘油中。間接ELISA法測定效價(jià)為2.5 X IO6。實(shí)驗(yàn)步驟:用非競爭酶免疫試驗(yàn)檢測單克隆抗體親和力常數(shù)。上述純化所獲得人CRP蛋白以每個(gè)反應(yīng)孔0.1 μ g和0.2 μ g鋪板固定，分別用單克隆抗體7C1和5D1作為一抗，辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的兔抗鼠IgG為二抗，在OD45tol讀數(shù)，分別檢測并計(jì)算單克隆抗體7C1和的親和力常數(shù)。以獲得的數(shù)據(jù)作圖1a和圖lb，其縱坐標(biāo)均為0D450值，橫坐標(biāo)均為單克隆抗體濃度(yg/ml)的對(duì)數(shù)。圖1a和圖1b分別顯示單克隆抗體7C1和不同抗體濃度在兩個(gè)抗原濃度(0.1 μ g和0.2 μ g)條件下的OD值曲線，將曲線接近平臺(tái)(表示全部抗體被結(jié)合)OD值的50%時(shí)結(jié)合抗體的濃度數(shù)值，代入公式Ka= (n-1) /2 [n (Ab’)卜撕)幻，求出親和力常數(shù)1(&。其中，CRP單克隆抗體7C1親合力常數(shù)Ka=L 1X10V,5D1親合力常數(shù)Ka=LSXlO8M'實(shí)施例3夾心ELISA法鑒定CRP單克隆抗體7C1和5D1具有不同抗原表位實(shí)驗(yàn)材料:見實(shí)施例2。實(shí)驗(yàn)步驟:選擇兩株互補(bǔ)配對(duì)的單克隆抗體7C1和OT1，檢測它們的抗原表位是否不同。每個(gè)反應(yīng)孔用0.2 μ g單克隆抗體7C1作為捕獲抗體包被固相載體，每個(gè)反應(yīng)孔用0.02 Ug辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的單克隆抗體5D1作為檢測抗體。人C反應(yīng)蛋白純化后用BCA法定量，然后用PBS緩沖液稀釋至不同濃度，進(jìn)行夾心ELISA法檢測。以O(shè)D45tol讀數(shù)檢測。檢測結(jié)果見表I。以表I數(shù)據(jù)作圖2。圖2縱坐標(biāo)為OD45tlnm的測量數(shù)值，橫坐標(biāo)為不同CRP抗原濃度(mg/L)的對(duì)數(shù)值。表I
權(quán)利要求
1.一種C反應(yīng)蛋白(CRP)抗體，其特征是:所述CRP抗體為人血清純化天然CRP作為免疫原，制備而得的互補(bǔ)配對(duì)單克隆抗體或多克隆抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的CRP抗體，其特征是:所述的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株為7C1和5D1。
3.—種CRP單克隆抗體納米乳膠微球組合物，其特征是:所述納米乳膠微球組合物為權(quán)利要求1或者2所述的單克隆抗體，分別與合適粒徑大小的羧基化聚苯乙烯微球在緩沖液中混合，在活化劑的作用下，聚苯乙烯微球上的羧基與抗體上的氨基縮合形成偶聯(lián)物。
4.如權(quán)利要求3所述的CRP單克隆抗體納米乳膠微球組合物，其特征是:所述CRP單克隆抗體是用人血清中C反應(yīng)蛋白天然抗原免疫小鼠，篩選多個(gè)親和力不同的細(xì)胞株，優(yōu)選互補(bǔ)配對(duì)的具有不同抗原識(shí)別表位的抗體亞型，其親和力在IXlO6 -1XlO8 M—1之間或以上。
5.如權(quán)利要求3所述的CRP單克隆抗體納米乳膠微球組合物，其特征是:C反應(yīng)蛋白單克隆抗體的不同種亞型，分別偶聯(lián)不同直徑的聚苯乙烯微球，或者以混合偶聯(lián)同一種直徑的聚苯乙烯微球。
6.如權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的CRP單克隆抗體納米乳膠微球組合物，其特征是:所述的羧基化聚苯乙烯微球直徑范圍在50-500nm。
7.如權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的CRP單克隆抗體納米乳膠微球組合物，其特征是:所述每毫克聚苯乙烯微球交聯(lián)抗體的量是0.03-1毫克。
8.如權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的CRP單克隆抗體納米乳膠微球組合物，其特征是:所述緩沖液選用磷酸鹽緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、2-嗎啉乙磺酸緩沖液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液、羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液、氯化銨緩沖液及甘氨酸緩沖液中的一種或幾種。
9.如權(quán)利要求7所述的CRP單克隆抗體納米乳膠微球組合物，其特征是:所述緩沖液包括添加物:所述的添加物為蛋白穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑和/或小牛血清蛋白中的一種或幾種。
10.一種制備CRP單克隆抗體納米乳膠微球組合物的方法，包括步驟: A)純化人血清CRP抗原； B)單克隆抗體制備和鑒定； C)單克隆抗體與聚苯乙烯微球偶聯(lián)，抗體乳膠微球偶聯(lián)物混合形成組合物； D)抗體乳膠微球組合物應(yīng)用于免疫透射比濁和免疫散射比濁檢測人血清CRP濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種CRP單克隆抗體、CRP抗體納米乳膠微球組合物及制備工藝；所述CRP抗體納米乳膠微球組合物為不同抗原表位的CRP單克隆抗體，與不同粒徑的羧基化聚苯乙烯微球共價(jià)交聯(lián)形成偶聯(lián)物，然后將不同偶聯(lián)物按一定比例混合制成CRP單克隆抗體納米乳膠微球組合物。本發(fā)明所述的CRP單克隆抗體納米乳膠微球組合物與全自動(dòng)生化分析儀、特種蛋白分析儀匹配，可全量程測定人全血和血清中C反應(yīng)蛋白濃度，應(yīng)用于細(xì)菌與病毒性感染的鑒別診斷、藥物治療監(jiān)測及心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。
文檔編號(hào)C07K17/08GK103073642SQ201210311219
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2012年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月29日
發(fā)明者王雷, 李一凡 申請(qǐng)人:深圳伯美生物醫(yī)藥有限公司