專利名稱：一種從板藍(lán)根中高效提取、分離和純化表告伊春的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從藥用植物中高效提取、分離和純化功能性成分的ー種方法，具體是從傳統(tǒng)中藥材板藍(lán)根中高效提取、分離和純化抗病毒活性成分表告伊春的方法，屬于天然產(chǎn)物提取、分離和純化領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
板藍(lán)根是ー種常用的傳統(tǒng)中藥材，首載于我國第一部本草著作《神農(nóng)本草經(jīng)》，《中華人民共和國藥典》(2010版)明確規(guī)定為十字花科植物蔣藍(lán)(Isatis indigotica Fort.)的干燥根，主產(chǎn)于我國河北、安徽、江蘇、河南、黑龍江等省，具有清熱解讀，涼血利咽之功效，用于溫毒發(fā)斑，舌絳紫暗，痄腮，喉痹，爛喉丹痧，大頭瘟疫，丹毒，癰腫等?，F(xiàn)代藥理研究證實，板藍(lán)根具有抗病毒、抗內(nèi)毒素、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗菌、抗炎、活血化瘀等眾多活性。其中，板藍(lán)根的抗病毒活性非常顯著，板藍(lán)根生藥及其相關(guān)制劑對于流感病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、單純皰疹病毒、こ型腦炎病毒、こ型肝炎病毒、腎綜合征出血熱病毒、柯薩奇B4病毒、偽狂犬病病毒等各種病毒具有不同程度的抑制作用。板藍(lán)根作為廣泛應(yīng)用于臨床的抗病毒天然植物藥材，對其抗病毒活性成分的提取、分離和純化具有十分重要的市場價值。國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報道生物堿為板藍(lán)根的主要活性成分，表告伊春(Epigoitrin)作為其中ー種主要的含硫生物堿，具有顯著的抗病毒活性，是目前評價板藍(lán)根生藥及其相關(guān)制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)成分(徐麗華等，中國天然藥物，2005，3 (6):359-360; Huang，Q.S., et al., Plant Medica, 1981, 42 (3): 308-310)。目前從板藍(lán)根中提取表告伊春主要采用傳統(tǒng)的技術(shù)手段，如煎煮法、浸潰法、滲漉法、熱回流法等，這些方法都是在完整細(xì)胞的情況下，通過浸潤與滲透，使提取溶劑進(jìn)入組織細(xì)胞，溶解胞內(nèi)活性物質(zhì)并使其擴(kuò)散至提取溶劑之中。由于細(xì)胞壁的屏障作用，使得中藥材有效成分的提取效率有一定的限度。同時這些提取方法存在提取溫度過高，耗時長、能源利用率低、提取出的雜質(zhì)多、后續(xù)處理繁瑣等缺點。中國專利申請?zhí)?00410016902.0和200710011038.9分別公開了一種表告伊春純
品的制備方法，是以中藥材板藍(lán)根為原料，通過提取、富集、分離和純化等步驟得到表告伊春。前者采用95%こ醇回流提取，成本過高，提取率極低，同時以高毒性的氯仿和甲醇作為洗脫液通過中性氧化鋁柱層析得到目標(biāo)物，安全隱患大。后者利用水煎煮提取，操作溫度高，對目標(biāo)成分破壞大，提取率低下，且以價格高昂的色譜甲醇為洗脫液采用高效液相制備手段純化表告伊春，成本過高，制備量小，無法實現(xiàn)エ業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。綜上所述，傳統(tǒng)的提取、分離和純化表告伊春的技術(shù)エ藝不能達(dá)到高效利用板藍(lán)根資源和獲得高得率、高純度的表告伊春的目的。因此有必要尋求ー種簡便、安全、經(jīng)濟(jì)、高效的提取、分離和純化表告伊春的方法，促進(jìn)對板藍(lán)根資源的深度開發(fā)和利用，為抗病毒新藥開發(fā)提供積極有利條件。本發(fā)明g在建立ー種通過現(xiàn)代生物誘導(dǎo)的提取技術(shù)和分離純化技術(shù)相結(jié)合的方法，實現(xiàn)從板藍(lán)根 中高效提取、分離和純化高純度表告伊春的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種以中藥板藍(lán)根為原料，通過勻漿破碎酶解技術(shù)，酶輔助負(fù)壓空化提取技木，絮凝除雜技木，大孔吸附樹脂富集分離技木，溶劑抽提純化技木，正相硅膠中壓柱層析技術(shù)以及低溫析晶和重結(jié)晶技術(shù)等一系列高效提取、分離和純化技術(shù)實現(xiàn)簡單、快速、大量的獲得高純度表告伊春単體成分。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案:將中藥板藍(lán)根和配制好的酶溶液混合，轉(zhuǎn)移入勻漿-負(fù)壓空化提取器中，進(jìn)行勻漿破碎酶解和酶輔助負(fù)壓空化提取，經(jīng)過勻漿破碎、外源酶水解細(xì)胞壁、內(nèi)源酶生物轉(zhuǎn)化以及負(fù)壓空化的高效提取，增強(qiáng)了表告伊春在粗提物中的含量，然后經(jīng)過絮凝除雜、大孔吸附樹脂富集分離、溶劑抽提純化、正相硅膠中壓柱層析后得到表告伊春產(chǎn)品，經(jīng)過低溫析晶和重結(jié)晶后得到純度大于98%的精制產(chǎn)品。具體方案如下:(I)勻漿破碎酶解:配制濃度為25(T500U/mL的酶溶液，加入檸檬酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值至4.(T5.0，將酶溶液和板藍(lán)根藥材以溶液體積與原料質(zhì)量比為3(T50mL/g混合，連續(xù)勻衆(zhòng)I 3次,姆次I 3min。(2)酶輔助負(fù)壓空化提取:將含有酶的勻漿液自動導(dǎo)入負(fù)壓空化提取裝置中，在溫度為35 45° C，壓カ為0.07 0.09Mpa下，連續(xù)負(fù)壓空化提取，每次6(T90min，提取I 3次。(3)絮凝除雜:在提取液中加入95%的こ醇，充分?jǐn)嚢柚寥芤捍紳舛冗_(dá)65%左右，(T4° C冷藏12 24h，過濾，濾渣棄去，濃縮濾液至干回收こ醇并得到固形物。絮凝除雜可以使ー些大分子水溶性雜質(zhì)如多糖，蛋白質(zhì)，粘液質(zhì)和鞣質(zhì)等形成沉淀而被去除，使目標(biāo)化合物的含量得到初步富集。(4)大孔吸附樹脂富集分離:將絮凝除雜后所得的固形物用蒸餾水溶解后，通過大孔吸附樹脂柱吸附，上樣量為0.5 1BV，流速為0.5 lBV/h。完全吸附后，以蒸餾水5 8BV充分洗去雜質(zhì)，10%こ醇1(T15BV解吸目標(biāo)化合物，收集解析液，濃縮至干回收こ醇并得到固形物，上述所用樹脂包括D101，HPD100, AB-8和ADS-17廣譜非極性大孔吸附樹脂。(5)溶劑抽提純化:將樹脂富集純化后得到的固形物加入蒸餾水溶解，以等體積的こ酸こ酯為萃取溶劑，萃取:T5次，減壓濃縮至干回收こ酸こ酯并得到富含表告伊春的粗品。(6)正相硅膠中壓柱層析:所用樣品為こ酸こ酯抽提純化后所得到的粗品，所用硅膠為300100目。預(yù)先稱取質(zhì)量為樣品量8 10倍的硅膠，采用濕法裝柱，所用溶劑包括正己烷和こ酸こ酷。將樣品用少量こ酸こ酯溶解，加入與樣品質(zhì)量相同的層析硅膠拌勻后在水浴鍋上炒樣至干，裝入預(yù)先裝好的層析硅膠柱上，先后以1(T20BV不同比例梯度的正己烷和こ酸こ酯溶液連續(xù)中壓洗脫，收集洗脫液，每份l/4(Tl/20BV，利用TLC監(jiān)測洗脫液成分，合并相同部分，TLC展開劑為正己烷:こ酸こ酷=20:廣1:1。(7)低溫析晶和重結(jié)晶:富含表告伊春的溶液經(jīng)過低溫析晶得到產(chǎn)品，重結(jié)晶后得到純度大于98%表告伊春純品，所用溶劑為こ酸こ酯和甲醇，所用溶劑的比例為こ酸こ酷:甲醇=1:廣5，低溫析晶和重結(jié)晶的溫度為-1025° C。本發(fā)明所述步驟(I)采用的勻漿破碎酶解技術(shù)與傳統(tǒng)干燥樣品粉碎技術(shù)相比，粉碎過程不產(chǎn)生粉塵，安全緑色，可將板藍(lán)根在酶溶液中粉碎成組織細(xì)胞，并具有破壞細(xì)胞壁、使植物細(xì)胞和酶充分接觸以及瞬時刺激誘發(fā)內(nèi)源性酶活性的作用。本發(fā)明所述步驟(2)在恒溫條件下進(jìn)行負(fù)壓空化提取兼具酶解和生物轉(zhuǎn)化作用，由于植物細(xì)胞壁在植物次生代謝產(chǎn)物提取過程中是ー種天然的屏障，它是以纖維素為骨架，并以半纖維素、果膠和蛋白質(zhì)等大分子聚合而成，単一的酶無法使細(xì)胞壁徹底破碎，利用外源混合酶(纖維素、半纖維素和果膠酶)將細(xì)胞壁成分水解或降解掉，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使有效成分充分游離出來，溶解、混懸或膠溶于提取溶劑中，加速胞內(nèi)活性成分釋放，同時經(jīng)過內(nèi)源酶的生物轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)前體物質(zhì)，使目標(biāo)成分的含量得到提高。負(fù)壓空化提取過程，是利用提取溶液內(nèi)部局部壓カ降低時，在液體內(nèi)部或液固交界面上會形成和發(fā)展空化泡，由于這些空化泡瞬間(微秒級)潰滅會產(chǎn)生極高的壓強(qiáng)，并且反復(fù)進(jìn)行，從而對固體材料表面造成極大的破壞，同時利用其強(qiáng)烈的機(jī)械振動，加速了胞內(nèi)活性成分的釋放、擴(kuò)散和溶解，從而促進(jìn)目標(biāo)成分的提取，整個提取過程無需高溫加熱，無需有機(jī)溶劑，高效綠色，環(huán)保節(jié)能。本發(fā)明的優(yōu)點:1.本發(fā)明采用勻漿破碎酶解技術(shù)，酶輔助 負(fù)壓空化提取技術(shù)、絮凝除雜技術(shù)、大孔吸附樹脂富集分離技術(shù)，溶劑抽提純化技術(shù)、正向硅膠柱層析技術(shù)以及低溫析晶和重結(jié)晶技術(shù)等一系列具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高效提取、分離和純化技術(shù)手段，實現(xiàn)了板藍(lán)根資源的高效利用。 2.與傳統(tǒng)提取制備エ藝相比，本發(fā)明的方法無需高溫加熱、提取溶劑為水，大大降低了生產(chǎn)成本，提取過程綠色環(huán)保、提取率高、高毒性有機(jī)溶劑用量少、操作安全簡便、目標(biāo)產(chǎn)品生產(chǎn)制備量大、純度高、可實現(xiàn)表告伊春大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，同時對其他藥用植物活性成分的提取、分離和純化具有指導(dǎo)意義。


圖1為表告伊春的分子結(jié)構(gòu)式圖2為表告依春的提取、分離和純化流程3為表告伊春高效液相色譜圖和光譜圖(A)表告伊春標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖和光譜圖；(B)本方法制備得到的表告伊春樣品高效液相色譜圖和光譜圖
具體實施例方式實施例1配制纖維素酶濃度為150U/mL、半纖維素酶濃度為50U/mL、果膠酶濃度為50U/mL的酶溶液，加入檸檬酸緩沖溶液調(diào)節(jié)PH值為4.0。精密稱取干燥的板藍(lán)根lOOOg，以酶溶液體積與原料質(zhì)量比為30mL/g的比例加入酶溶液，勻漿lmin，將勻漿液自動轉(zhuǎn)移入負(fù)壓空化提取裝置中，在壓カ為-0.07Mpa，溫度為35° C下連續(xù)負(fù)壓空化提取3次，每次60min，合并提取液，在其中加入95%的こ醇，充分?jǐn)嚢柚寥芤捍紳舛冗_(dá)65%左右，0° C冷藏12h，過濾,濾渣棄去,濃縮濾液至干回收こ醇并得到固形物。將固形物用水溶解后,通過AB-8大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附，上樣量為0.5BV，流速為lBV/h。吸附后用蒸餾水5BV洗去雜質(zhì)，然后用10%こ醇IOBV解析，收集解析液濃縮至干回收こ醇并得到固形物。固形物用蒸餾水溶解后以等體積的こ酸こ酯為溶劑萃取3次，萃取液減壓濃縮至干回收こ酸こ酯并得到富含告伊春的粗品。將所得樣品用こ酸こ酯溶解后，加入與樣品質(zhì)量相同的300100目的層析硅膠炒樣。預(yù)先稱好質(zhì)量為樣品量的8倍的層析硅膠，用正己烷:こ酸こ酷=80:1的溶劑濕法裝柱，將拌好樣的硅膠裝入中壓柱內(nèi)，然后以TLC監(jiān)測收集洗脫液，濃縮所得到的富含表告伊春的分段，低溫析晶和重結(jié)晶后得到高純度化合物，通過對比標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖及光譜圖確定為表告伊春，產(chǎn)品質(zhì)量為1.62±0.07g，得率為0.162±0.007%，純度為98.56 ±0.11%。實施例2配制纖維素酶濃度為300U/mL、半纖維素酶濃度為100U/mL、果膠酶濃度為100U/mL的酶溶液，加入檸檬酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值為5.0。精密稱取干燥的板藍(lán)根lOOOg，以酶溶液體積與原料質(zhì)量比為40mL/g的比例加入酶溶液，勻漿3min，將勻漿液自動轉(zhuǎn)移入負(fù)壓空化提取裝置中，在壓カ為-0.09Mpa,溫度為45° C下連續(xù)負(fù)壓空化提取3次，每次90min，合并提取液，在其中加入95%的こ醇，充分?jǐn)嚢柚寥芤捍紳舛冗_(dá)65%左右，4° C冷藏24h，過濾，濾渣棄去，濃縮濾液至干回收こ醇并得到固形物。將固形物用水溶解后，通過DlOl大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附，上樣量為1BV，流速為0.5BV/h。吸附后用蒸餾水8BV洗去雜質(zhì)，然后用10%こ醇15BV解析，收集解析液濃縮至干回收こ醇并得到固形物。將固形物用蒸餾水溶解后以等體積的こ酸こ酯為 溶劑萃取5次，萃取液減壓濃縮至干回收こ酸こ酯并得到富含告伊春的粗品。所得粗品用こ酸こ酯溶解后，加入與樣品質(zhì)量相同的30(T400目的層析硅膠炒樣。預(yù)先稱好質(zhì)量為樣品量的10倍的層析硅膠，用正己烷:こ酸こ酷=80:1的溶劑濕法裝柱，將拌好樣品的硅膠裝入中壓柱內(nèi)，然后以TLC監(jiān)測收集洗脫液，濃縮所得到的富含表告伊春的分段，低溫析晶得到產(chǎn)品，重結(jié)晶后得到高純度化合物，通過對比標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖及光譜圖確定為表告伊春，產(chǎn)品質(zhì)量為2.23±0.18g，得率為0.223±0.018%，純度為 98.31 ±0.16%。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及ー種從板藍(lán)根中提取、分離和純化表告伊春的方法，其主要特征在于:以干燥的板藍(lán)根為原料，采用勻漿破碎酶解技術(shù)、酶輔助負(fù)壓空化提取技術(shù)，絮凝除雜技術(shù)，大孔吸附樹脂富集分離技術(shù)，溶劑抽提純化技術(shù)、正相硅膠中壓柱層析技術(shù)以及低溫析晶和重結(jié)晶技術(shù)等一系列高效提取、分離和純化技術(shù)手段得到純度達(dá)98%以上的表告伊春。
2.按照權(quán)利要求1所述的勻漿破碎酶解技術(shù)，其特征在于:使用的酶為纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶的混合酶，酶溶液濃度為25(T500U/mL，通過檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值至4.0 5.0，按液固比30:1 50:1與中藥材板藍(lán)根勻漿I 3min。
3.按照權(quán)利要求1所述的酶輔助負(fù)壓空化提取技術(shù)，其特征在于:將含有酶的勻漿液轉(zhuǎn)移入負(fù)壓空化提取裝置中，在溫度為35 45° C，壓カ為0.07、.09Mpa下，連續(xù)負(fù)壓空化提取，毎次6(T90min，提取f 3次。
4.按照權(quán)利要求1所述的絮凝除雜技術(shù)，其特征在于:提取液中加入95%的こ醇，充分?jǐn)嚢柚寥芤捍紳舛冗_(dá)65%左右，(T4° C冷藏12 24h，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至干得到固形物。
5.按照權(quán)利要求1所述的大孔吸附樹脂富集分離技術(shù)，其特征在于:所用樹脂包括D101，HPD100, AB-8和ADS-17廣譜非極性大孔吸附樹脂，所有大孔吸附樹脂均采用濕法裝柱，保留適當(dāng)液面，將醇沉后所得的固形物用蒸餾水溶解后，進(jìn)行大孔吸附樹脂柱吸附，上樣量為0.5 1BV，流速為0.5 lBV/h，充分吸附后，用蒸餾水5 8BV充分洗去雜質(zhì)，10%こ醇1(T15BV解吸目標(biāo)化合，合并解析液，濃縮至干得到固形物。
6.按照權(quán)利要求1所述的溶劑抽提純化技術(shù)，其特征在于:將得到的樹脂富集純化后的固形物加入蒸餾水溶解，以等體積的こ酸こ酯為萃取溶劑，萃取3飛次，減壓濃縮至干后得到富含表告伊春的粗品。
7.按照權(quán)利要求1所述的正相硅膠中壓柱層析技術(shù)，其特征在于:所用樣品為萃取后得到的粗品，所用層析硅膠為30(T400目，所用有機(jī)試劑包括正己烷和こ酸こ酷，預(yù)先稱取質(zhì)量為樣品量8 10倍的層析硅膠，采用濕法裝柱，將樣品用少量こ酸こ酯溶解，加入與樣品量相同的層析硅膠拌勻后在水浴鍋上炒樣至干，然后裝入預(yù)先裝好的層析硅膠柱上，先后以1(T20BV不同比例梯度的正己烷和こ酸こ酯溶液連續(xù)中壓洗脫，收集洗脫液，每份l/4(Tl/20BV，利用硅膠薄層層析(TLC)檢測洗脫液成分，合并相同部分，展開劑為正己烷:こ酸こ酯=20:1 1:1。
8.按照權(quán)利要求1所述的低 溫析晶和重結(jié)晶技術(shù)，其特征在于:所用溶劑為こ酸こ酯和甲醇，所用溶劑的比例為こ酸こ酯:甲醇=1:廣5，低溫析晶和重結(jié)晶的溫度為-10 25。 C。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從常用中藥材板藍(lán)根中高效提取、分離和純化抗病毒活性成分表告伊春的方法，目的在于提供一種簡便、安全、經(jīng)濟(jì)、高效地從板藍(lán)根中提取、分離和純化高純度活性單體化合物表告伊春的技術(shù)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是以干燥的板藍(lán)根為原料，采用勻漿破碎酶解技術(shù)、酶輔助負(fù)壓空化提取技術(shù)，絮凝除雜技術(shù)，大孔吸附樹脂富集分離技術(shù)，溶劑抽提純化技術(shù)、正相硅膠中壓柱層析技術(shù)以及低溫析晶和重結(jié)晶技術(shù)等一系列高效提取、分離和純化技術(shù)手段得到純度達(dá)98%以上的表告伊春。本發(fā)明所得目標(biāo)化合物純度高，生產(chǎn)制備量大，適用于工業(yè)化應(yīng)用，對從中藥板藍(lán)根中獲取抗病毒活性單體成分表告伊春提供了一種高效的現(xiàn)代化技術(shù)手段，具有良好的市場前景。
文檔編號C07D263/16GK103113319SQ20121037945
公開日2013年5月22日 申請日期2012年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月9日
發(fā)明者付玉杰, 羅猛, 焦驕, 蓋慶巖, 魏福堯, 李吉, 彭霄 申請人:東北林業(yè)大學(xué), 付玉杰