杏仁過敏原蛋白amandin的制備方法
【專利摘要】杏仁過敏原蛋白amandin的制備方法，涉及amandin提取純化的具體方法，本發(fā)明提供了一種簡單的提取杏仁中amandin的方法，它以冷沉淀法得到抗原，得到的amandin的純度可達(dá)90％以上?？捎糜谑称分懈黝愋尤蔬^敏原的快速免疫檢測中作為標(biāo)品。
【專利說明】杏仁過敏原蛋白amandin的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品過敏原免疫化學(xué)和檢測分析【技術(shù)領(lǐng)域】；涉及分離純化，免疫化學(xué)，生物化學(xué)及物化測試技術(shù)等；特別涉及杏仁過敏原蛋白的提取純化和免疫動物特異性抗體的制備及其免疫分析方法的建立。
【背景技術(shù)】
[0002]食物過敏是人們對食物產(chǎn)生的一種不良反應(yīng)，屬機(jī)體對外源物質(zhì)產(chǎn)生的一種變態(tài)反應(yīng)，已經(jīng)成為一個全球性的食品安全問題。流行病學(xué)調(diào)查表明全球范圍內(nèi)有I %~2%的成年人對食物過敏，而小于3歲的嬰幼兒中有8%以上對食物過敏。另一項(xiàng)調(diào)查則顯示食物過敏反應(yīng)對5%的兒童和3%~4%的成年人產(chǎn)生危害，并且患病率呈逐年增加的趨勢。食物過敏是誘導(dǎo)皮膚疾病、腸道及呼吸道等多種癥狀的重要原因。
[0003]樹堅(jiān)果是世界各國公認(rèn)的八大主要食品過敏原之一，根據(jù)美國FDA資料統(tǒng)計(jì)，在美國所有過敏反應(yīng)中，由花生和樹堅(jiān)果引起的過敏占10%~47%。杏仁是世界范圍最受歡迎的樹堅(jiān)果類之一，在樹堅(jiān)果類產(chǎn)品中產(chǎn)量排名第一。據(jù)美國統(tǒng)計(jì)，堅(jiān)果(包括杏仁、核桃等)、鳳梨和花生這幾類過敏原大約影響美國總?cè)丝诘?.1%，其中對花生過敏的人數(shù)最多，占總數(shù)的30%，而對杏仁過敏的患者也占總數(shù)的10%以上。
[0004]蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)最復(fù)雜，也是最重要的物質(zhì)之一。食品過敏原的產(chǎn)生與蛋白質(zhì)密不可分，環(huán)境中能夠成為過敏原的物質(zhì)都含有蛋白質(zhì)，可以延伸地認(rèn)為:任何含有蛋白質(zhì)的食物對于某些敏感性人群來說都 可能是潛在的過敏反應(yīng)激發(fā)源。已知結(jié)構(gòu)的過敏原都是蛋白質(zhì)或糖蛋白，分子量從3kDa到90kDa,大部分在IOkDa到40kDa之間。
[0005]杏仁中含有大約188種蛋白，Amandin是一種水溶性蛋白，將濃度較高的脫脂杏仁粉水提液，長時間(12-14h)置于4°C左右，amandin可以析出，利用這一原理可以提純杏仁過敏原蛋白沉淀法簡單，且純度較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]需要解決的問題:
[0007]本發(fā)明的目的是提取純化的杏仁過敏原amandin ;獨(dú)特之處在于提取純化amandin的方法簡單，且純度較高，可用于免疫動物誘導(dǎo)產(chǎn)生親合性很高的特異性抗體。
[0008]技術(shù)方案:
[0009]本發(fā)明提供了一種簡單有效地提取杏仁中過敏原amandin的方法，可以用于免疫動物制備針對amandin的特異性抗體,抗體的特異性取決于amandin的純度。該技術(shù)研究的關(guān)鍵是冷沉淀法對杏仁中過敏原amandin的提取
[0010]根據(jù)amandin的物理化學(xué)性質(zhì)，提出利用以冷沉淀的方法對杏仁中過敏原amandin提取純化，取脫脂杏仁粉，用含0.02% NaN3的雙蒸水，以1: 30 (w/v)提取杏仁粉中的杏仁蛋白，搖床200rpm,室溫提取Ih,將混合物6000g離心IOmin,得到的沉淀物重復(fù)上述提取過程，收集兩次離心的上清液，過0.45 μ m纖維素膜，4°C保存12-14h，上述液體中會出現(xiàn)白色絮狀物冷沉淀下來，該白色沉淀中就含有杏仁過敏原蛋白amandin。4°C，12000g，離心上述液體20min，得到的白色沉淀就是含有目的蛋白amandin。這期間，沒有涉及到任何復(fù)雜的化學(xué)試劑與操作步驟。
[0011]有益效果:
[0012]與其他同類方法相比，本發(fā)明具有準(zhǔn)確、快速、方便、廉價等特點(diǎn)。該方法提取的杏仁過敏原純度高，，為制備特異性良好的抗體奠定了基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例1:
[0014]1.脫脂杏仁粉的制備
[0015]將杏仁、正己烷以1: 10(w/v)，搖床250rpm，室溫下脫脂3h后，抽濾，棄去有機(jī)溶劑，將上面得到的沉淀按照上述過程重復(fù)抽濾一次。抽濾，棄掉有機(jī)溶劑。將沉淀置于通風(fēng)櫥過夜，揮發(fā)殘留的正己烷，研缽研磨，分別得到苦杏仁和甜杏仁的脫脂杏仁粉，-20°C保存。
[0016]2.提取純化的杏仁過敏原蛋白amandin
[0017]取脫脂杏仁粉，用含0.02% NaN3的雙蒸水，以1: 30 (w/v)提取杏仁粉中的杏仁蛋白，搖床200rpm,室溫提取Ih,將混合物6000g離心IOmin,得到的沉淀物重復(fù)上述提取過程，收集兩次離心的上清液，過0.45 μ m纖維素膜，4°C保存12-14h，上述液體中會出現(xiàn)白色絮狀物冷沉淀下來，該白色沉淀中就含有杏仁過敏原蛋白amandin。4°C，12000g，離心上述液體20min,得到的白色沉淀就含有目的蛋白amandin,將沉淀溶于PBS (pH7.4)中，雙蒸水室溫透析9h，每3h —換水，最后取出凍干成粉，存在_20°C。
`[0018]連接電泳儀與電泳槽，打開電源，將電壓調(diào)至80V，待染料前沿遷移至距硅橡膠框底邊lcm-1.5cm處,停止電泳。
[0019]電泳結(jié)束后，切斷電源，從電泳槽中取出凝膠板，用不銹鋼藥鏟撬開短玻璃板，在凝膠切下一角作為加樣標(biāo)志，然后將凝膠放入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中，置于搖床上室溫下染色過夜。次日用脫色液脫色，至蛋白條帶清晰。電泳的條帶集中20-22KDa，42-46KDa，這與文獻(xiàn)中的結(jié)果吻和，且?guī)缀鯖]有雜蛋白。
【權(quán)利要求】
1.杏仁過敏原蛋白amandin的制備方法是使用杏仁粉為原料，經(jīng)過溶劑脫脂、雙蒸水提取和沉淀制備。
2.權(quán)利要求1所述的杏仁粉脫脂方法是將杏仁、正己烷以質(zhì)量體積比1: 10混合，250rpm室溫下脫脂3h后，抽濾，棄去有機(jī)溶劑，將上面得到的沉淀按照上述過程重復(fù)抽濾一次，將沉淀置于通風(fēng)櫥過夜，揮發(fā)殘留的正己烷，研缽研磨，得到脫脂杏仁粉，_20°C保存。
3.權(quán)利要求1所述杏仁過敏原蛋白amandin的提取純化是用含0.02% NaN3的雙蒸水以質(zhì)量體積比為1: 30與脫脂杏仁粉混合，200rpm室溫下提取lh，將混合物6000g離心lOmin，得到的沉淀物重復(fù)上述提取過程，收集兩次離心的上清液，過0.45 μ m纖維素膜，4°C保存12-14h后4°C 12000g離心上述液體20min，得到的白色沉淀就含有目的蛋白amandin,將沉淀溶于PBS (pH7.4)中，雙蒸水室溫透析9h,每3h—換水,最后取出凍干成粉，存在_20°C即為杏仁過敏原蛋白amandin。
【文檔編號】C07K1/14GK103788188SQ201210425588
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月31日
【發(fā)明者】王碩, 張燕, 王俊平, 張潔瓊, 談超, 生威 申請人:天津科技大學(xué)