專利名稱：一種木通皂苷d的富集和純化方法
技術領域：
本發(fā)明屬于中藥領域，具體涉及一種木通皂苷D的富集和純化方法。
背景技術：
木通皂苷D是中藥續(xù)斷中的主要有效成分之一，其含量達2%以上。木通皂苷D能夠從天然的中藥續(xù)斷中提取得到的，不同純度的木通皂苷D有抗老年癡呆活性。對木通皂苷D的制備過程為制備續(xù)斷藥材濃縮提取液；然后將濃縮提取液用大孔吸附樹脂富集，得到富集液；最后將富集液用大孔吸附樹脂精制得木通皂苷D。該方法富集和純化過程耗時較長，所得產(chǎn)品的純度低于93%。為提高效率需要提供一種耗時更短，產(chǎn)品純度更高的木通皂苷D的富集和純化方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種木通皂苷D的富集方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種木通皂苷D的純化方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案實現(xiàn)一種用HP-20大孔樹脂富集續(xù)斷藥材提取液中木通皂苷D的方法，包括以下步驟將用95%的乙醇浸泡后的HP20大孔樹脂，用95%乙醇洗脫，再用水洗脫至無醇味后備用；所用柱子的徑高比為I :6，上樣液濃度為O. Ig藥材/ml，上樣量為藥材濕樹脂重量比=1 I. 5^2. 5，依次用水、30%乙醇和35%乙醇除雜，然后用50%乙醇洗脫，得到木通皂苷D富集液。所述的用水除雜為中性的純化水、或用pH=3_4的酸性純化水、或用pH=7_8的堿性純化水、或用pH=8-9的堿性純化水、或用pH=9-10的堿性純化水單獨使用除雜，或者pH=3_4的酸性純化水與pH=8-9的堿性純化水聯(lián)合使用除雜；所述的用30%乙醇除雜為中性的30%乙醇、或用pH=3-4的酸性30%乙醇、或用pH=7-8的堿性30%乙醇、或用pH=8_9的堿性30%乙醇、或用pH=9-10的堿性30%乙醇單獨使用除雜，或用pH=3-4的酸性30%乙醇與pH=8_9的堿性30%乙醇聯(lián)合使用除雜；所述的35%乙醇為中性的35%乙醇；所述的50%乙醇為中性的50%乙醇。所述的中性的純化水，即為未調(diào)節(jié)pH值的一般純化水，所述的中性的30%乙醇、中性的35%乙醇和中性的50%乙醇為用一般純化水直接配制的30%乙醇、35%乙醇和50%乙醇溶液。所用酸性乙醇溶液或堿性乙醇溶液為用鹽酸溶液或氨水將用一般純化水直接配制的30%乙醇的調(diào)至所需的pH值范圍。所述的酸性或堿性的純化水為用鹽酸溶液或氨水將用一般純化水調(diào)至所需的pH值范圍。除雜時所述水的用量為6倍量柱體積，所述30%乙醇的用量為6倍量柱體積，所述35%乙醇的用量為2倍量柱體積，洗脫時所述50%乙醇的用量為6倍量柱體積。所述除雜和所述洗脫的過程優(yōu)選為用6倍量柱體積的pH=8-9的堿性純化水洗脫除雜，流速為2BV/h ;然后用6倍量柱體積的pH=8-9的堿性30%乙醇洗脫除雜，流速為2BV/h ;再用2倍量柱體積的中性的35%乙醇除雜，流速為2BV/h ;最后用6倍量柱體積的中性的50%乙醇洗脫，流速為2BV/h，得到木通皂苷D富集液。一種木通皂苷D富集液的純化方法，其在于向木通皂苷D富集液中加入有機溶劑制成純化前溶液，向純化前溶液中加入I倍體積量的石油醚，充分振搖，密閉，冷藏靜置過夜，抽濾，收集沉淀，于不超過70°c的溫度下減壓干燥，即得木通皂苷D純化物。上述的木通皂苷D富集液的純化方法，其在于所述的純化前溶液中有機溶劑的體積百分含量為5% 40%，優(yōu)選為10% 30%，更進一步優(yōu)選為20%。上述的有機溶劑為乙醇、甲醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯或正丁醇；優(yōu)選為乙醇或丙酮，更進一步優(yōu)選為丙酮。 所述的純化前溶液中藥材與純化前溶液的質(zhì)量體積比g :ml為1:0. 5^3 ;優(yōu)選為1:1。所述的木通皂苷D富集液為采用上述的用HP-20大孔樹脂富集續(xù)斷藥材提取液中木通皂苷D的方法制備的木通皂苷D富集液，或者現(xiàn)有技術中其他富集方法制備的木通皂苷 D 富集液，例如采用 24 種大孔樹脂 D101、HPD-100, HPD-100A, HPD-200A、AB-8、SepliteDlOU Seplite LX-68、 Seplite XDA-8、 Seplite LX-IU Seplite LX-17、 Seplite LX-28、HPD-200A、HPD-200B、HPD-300、HPD-400、HPD-400A、HPD-450、HPD-450A、HPD-500、HPD-600、HPD-700、HPD-710、HPD-722或HPD-721富集方法制備的木通皂苷D富集液。本發(fā)明所用乙醇溶液的百分含量均為體積百分含量。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的方法富集和純化木通皂苷D過程中耗時更短，富集和純化工藝更簡單，操作方便，所制備的木通皂苷D純度最高可達99%，轉(zhuǎn)移率更高。
具體實施例方式I、實驗儀器高效液相色譜儀(美國Agilentl200)，紫外檢測器，BS-124S型萬分之一電子天平(sartorius，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，RE-5203型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，101-2型干燥箱(上海市實驗儀器總廠)。2、實驗材料川續(xù)斷藥材(購自于四川涼山)，HP20大孔吸附樹脂(日本三菱)，乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇等(購自于南京化學試劑廠)。3、實驗試劑甲醇(色譜純，江蘇漢邦科技有限公司)，乙腈(色譜純，B&J)，純化水(純凈水，樂百氏食品飲料有限公司)。實施例I川續(xù)斷藥材中木通皂苷D的提取方法取續(xù)斷原藥材,粉碎成大米粒大小的藥材顆粒；取打碎至米粒大小的藥材顆粒適量；用90%的乙醇溶液10倍量(IKg藥材加IOL 90%的乙醇溶液)，浸泡2 h ;回流提取2 h，濾過，得濾液；藥渣再用90%的乙醇溶液分別提取兩次，每次10倍量，每次回流提取2h，濾過，得濾液；合并3次濾液；減壓(-0. 08Mpa)回收乙醇，至無醇味，濃縮液的濃度約為Ig藥材 /mL。實施例2續(xù)斷藥材提取液中木通皂苷D的HP-20大孔樹脂富集方法1、HP20樹脂預處理新購HP20樹脂預處理HP20樹脂用95%的乙醇浸泡過夜，然后將樹脂進行上柱，先用3BV 95%乙醇洗脫(流速lBV/h)，再用3BV水洗脫(流速lBV/h)，此洗脫步聚共操作3次，最終以水洗脫至無醇味后，待用。HP20舊樹脂的處理先用95%乙醇2BV洗脫樹脂柱，流速lBV/h ;再用純化水4BV洗脫，流速2BV/h，備用。2、裝柱按徑高比為I :6裝柱。按上述“HP20樹脂預處理”方法處理。 3、上樣液的制備取木通皂苷D濃縮液(濃度Ig藥材/ml) 100ml，加水稀釋至IOOOml (濃度O. Ig藥材/ml)，稀釋液抽濾，即得“HP20柱的上樣液”。4、上樣按上樣量為藥材濕樹脂重量比=1:2的量將“HP20柱的上樣液”加入到已處理好的HP20樹脂柱中，流速lBV/h。上樣結束后，靜置lh。5、“富集液-HP-中”的制備方法①水洗脫除雜用中性的純化水6BV洗脫，流速2BV/h，洗脫完后，檢查流出液是否為無色，若無色澄清，可以進入下一步，若還有顏色，需繼續(xù)用中性的純化水沖洗至無色。②30%乙醇除雜用中性的30%乙醇6BV洗脫，流速2BV/h。③35%乙醇除雜用中性的35%乙醇2BV洗脫，流速2BV/h。④50%乙醇洗脫用中性的50%乙醇6BV洗脫，流速2BV/h。收集50%乙醇洗脫液，即為純化液。⑤用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在70°C以下減壓回收純化液中的乙醇，回收乙醇至無醇味，濃縮液加水稀釋至90ml，放置室溫冷卻后得到木通皂苷D富集液(濃度Ig藥材/ml)，命名為“富集液-HP-中”。⑥“富集液-HP-中”(濃度Ig藥材/ml)固形物稱定將部分“富集液-HP-中”置于蒸發(fā)皿中，水浴揮干，再置真空干燥箱中干燥至恒重，精密稱定，稱量固形物，并按“富集液-HP-中”的總量，計算富集物的重量，結果，90g藥材，最后可以得到8. 4978g富集物。
⑦剩余的“富集液-HP-中”用于重結晶實驗。6、“富集液-HP-H+”的制備方法“富集液-HP-H+”的制備方法基本同“富集液-HP-中”的制備方法，區(qū)別僅在于①水洗脫除雜和②30%乙醇除雜時所用的純化水和30%乙醇用鹽酸調(diào)至pH=3. 5。得到的木通皂苷D富集液(濃度Ig藥材/ml)，命名為“富集液-HP-H+”。“富集液(濃度Ig藥材/ml)固形物稱定將部分“富集液-ΗΡ-Η"”置于蒸發(fā)皿中，水浴揮干，再置真空干燥箱中干燥至恒重，精密稱定，稱量固形物，并按“富集液-ΗΡ-Η+”的總量，計算富集物的重量，結果，90g藥材，最后可以得到8. 4011g富集物。剩余的“富集液-HP-H+ ”，用于重結晶實驗。7、“富集液-ΗΡ-0Η_ I ”的制備方法“富集液-ΗΡ-0Η— I ”的制備方法基本同“富集液-HP-中”的制備方法，區(qū)別僅在于①水洗脫除雜和②30%乙醇除雜時所用的純化水和30%乙醇用氨水調(diào)至pH=7. 5。得到的木通皂苷D富集液(濃度Ig藥材/ml)，命名為“富集液-ΗΡ-0Η_ I ”。
“富集液-ΗΡ-0Η— I (濃度Ig藥材/ml)固形物稱定將部分“富集液-ΗΡ-0Η— I ”中的部分置于蒸發(fā)皿中，水浴揮干，再置真空干燥箱中干燥至恒重，精密稱定，稱量固形物，并按“富集液-ΗΡ-OH— I ”的總量，計算富集物的重量，結果，90g藥材，最后可以得到8. 3232g富集物。剩余的“富集液-ΗΡ-0Η_ I，用于重結晶實驗。8、“富集液-ΗΡ-0Η_ II ”的制備方法“富集液-ΗΡ-0Η— II ”的制備方法基本同“富集液-HP-中”的制備方法，區(qū)別僅在于①水洗脫除雜和②30%乙醇除雜時所用的純化水和30%乙醇用氨水調(diào)至為pH=8. 5。得到的木通皂苷D富集液(濃度Ig藥材/ml )，命名為“富集液-ΗΡ-0Η— II ”。“富集液-ΗΡ-0Η_ II ”(濃度Ig藥材/ml)固形物稱定將部分“富集液_ΗΡ_0Η_ II ”置于蒸發(fā)皿中，水浴揮干，再置真空干燥箱中干燥至恒重，精密稱定，稱量固形物，并按“富 集液-ΗΡ-0Η_ II ”的總量，計算富集物的重量，結果，90g藥材，最后可以得到8. 2431g富集物。剩余的“富集液-ΗΡ-0Η_ II，用于重結晶實驗。9、“富集液-HP-0H_ III”的制備方法“富集液-ΗΡ-0Η— III”的制備方法基本同“富集液-HP-中”的制備方法，區(qū)別僅在于①水洗脫除雜和②30%乙醇除雜時所用的純化水和30%乙醇用氨水調(diào)至為pH=9. 5。得到的木通皂苷D富集液(濃度Ig藥材/ml)，命名為“富集液-ΗΡ-0Η— III”?！案患?ΗΡ-0Η_ III”(濃度Ig藥材/ml)固形物稱定將部分“富集液_ΗΡ_0Η_ III”置于蒸發(fā)皿中，水浴揮干，再置真空干燥箱中干燥至恒重，精密稱定，稱量固形物，并按“富集液-ΗΡ-0Η_ III”的總量，計算富集物的重量，結果，90g藥材，最后可以得到8. 1819g富集物。剩余的“富集液-ΗΡ-0Η_ III，準備用于重結晶實驗。10、“富集液-HP- Η+-0Η—”的制備方法“富集液-HP- Η+-0Η—”的制備方法基本同“富集液-HP-中”的制備方法，區(qū)別僅在于除雜時，先依次分別用pH=3. 5的酸性純化水、pH=3. 5的酸性30%乙醇除雜，再依次分別用pH=8. 5的堿性純化水、pH=8. 5的堿性30%乙醇除雜。得到的木通皂苷D富集液(濃度Ig藥材/ml)，命名為“富集液-HP- Η+-0Η_”?！案患?HP- Η+-0Η_”(濃度Ig藥材/ml)固形物稱定將部分“富集液_ΗΡ_ Η+_0Η_”置于蒸發(fā)皿中，水浴揮干，再置真空干燥箱中干燥至恒重，精密稱定，稱量固形物，并按“富集液-HP- Τ-ΟΗ”’的總量，計算富集物的重量，結果，90g藥材，最后可以得到8. 261 Ig富集物。 剩余的“富集液-HP- Η+-0Η”，用于重結晶實驗。11、由木通皂苷D富集液干燥后得到的富集物中木通皂苷D的含量測定11. I色譜條件色譜柱為AgilentC18柱(IOOmmX4. 6mm, 3. 5 μ m);流動相乙腈-水(30:70,流動相超聲脫氣30min);檢測波長為212nm ;流速為I. Oml/min ;柱溫為30°C ;進樣量20 μ I。11 · 2對照品溶液的制備取木通皂苷D對照品適量，精密稱定(木通皂苷D為10.05mg)，置50ml量瓶中，加流動相溶解，稀釋，定容，搖勻，制成濃度為O. 2mg/mL的溶液，用O. 45um微孔濾膜過濾，即得。11. 3各種富集物供試品溶液的制備富集物含量測定精密量取富集物10. 19mg,置于25ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，過O. 45 μ m微孔濾膜，即得。11. 4各種富集物中木通皂苷D的含量測定結果(I). “富集液-HP-中”的富集物中木通皂苷D的含量為72. 2%。藥材中木通皂苷D的轉(zhuǎn)移率為93. 4%。(2). “富集液-HP-H+”的富集物中木通皂苷D的含量為75.6%。藥材中木通皂苷 D的轉(zhuǎn)移率為90. 7%。(3). “富集液-ΗΡ-0Η_ I ”富集物中木通皂苷D的含量為76. 0%。藥材中木通皂苷D的轉(zhuǎn)移率為96. 3%。⑷.“富集液-ΗΡ-0Η_ II ”富集物中木通皂苷D的含量為77. 9%。藥材中木通皂苷D的轉(zhuǎn)移率為96. 8%。(5). “富集液-HP-0H_ III”富集物中木通皂苷D的含量為77. 7%。藥材中木通皂苷D的轉(zhuǎn)移率為96. 7%。(6). “富集液-HP- Η+-0Η_”富集物中木通皂苷D的含量為77. 1%。藥材中木通皂苷D的轉(zhuǎn)移率為96. 9%。實施例3富集液的純化方法I、富集液的純化方法-I(I)取實施例I制備的6種富集液(Ig藥材/ml) 25ml，分別置于6個IOOmL的小燒杯中濃縮至20mL，每個燒杯中加入5mL無水乙醇得到“純化前溶液”(溶液中乙醇的體積百分含量為20%,藥材與純化前溶液的體積質(zhì)量比g:mL為1:1)，再向各“純化前溶液”中加I倍體積量的石油醚(即25ml)，充分振搖，密閉，于4°C冷藏靜置過夜，抽濾，收集沉淀，于70°C減壓干燥，即由6種富集液制備的純化物，分別命名為木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP-中-I: I”)、木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP-H+-I: I”)、木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP- OF I -I: I”)、木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP- 0H_ II -1:1”)、木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP- 0H_ III-I: I”)、木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP-H+-0H、1:1”)。注解木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP-中-I: I”)中的“木通皂苷Dl法純化物”為富集液的純化方法-I得到的木通皂苷D 富集液-HP-中”為在制備富集液過程中，采用中性溶液系統(tǒng)進行除雜表示在純化過程中，“純化前溶液”的濃度，1:1即為Ig藥材溶在ImL的純化前溶液中。(2)取實施例I制備的6種富集液(Ig藥材/ml) 25ml，分別置于6個IOOmL的小燒杯中濃縮至10mL，每個燒杯中加入2. 5mL無水乙醇得到“純化前溶液”，再向各“純化前溶液”中加I倍體積量的石油醚(即12. 5ml)，充分振搖，密閉，于4°C冷藏靜置過夜，抽濾，收集沉淀，于70°C減壓干燥，即由6種富集液制備的純化物，分別命名為木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP-中-1:0. 5”)、木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP-H+-I: O. 5”)、木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP- OF I -1:0. 5”)、木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP-or II -1:0. 5”)、木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP- OH 111-1:0. 5”)、木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP- H+-0H--1:0. 5，，)。(3)取實施例I制備的6種富集液(Ig藥材/ml) 25ml，分別置于6個IOOmL的小燒杯中濃縮至15mL，每個燒杯中加入3. 75mL無水乙醇得到“純化前溶液”，再向各“純化前溶液”中加I倍體積量的石油醚(即18. 75ml)，充分振搖，密閉，于4°C冷藏靜置過夜，抽濾，收集沉淀，于70°C減壓干燥，即由6種富集液制備的純化物，分別命名為木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP-中-1:0. 75”)、木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP-H+-I: O. 75”)、木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP- 0H— I -1:0. 75”)、木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP-OH- II -1:0. 75”)、木通皂苷Dl法純化物(“富集液_ΗΡ_0Η_ III _1:0. 75”)、木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP- Η+-0Η--1:0. 75”)。(4)取實施例I制備的6種富集液(Ig藥材/ml) 25ml，分別置于6個IOOmL的小燒杯中加水稀釋至60mL，每個燒杯中加入15mL無水乙醇得到“純化前溶液”，再向各“純化 前溶液”中加I倍體積量的石油醚(即75ml)，充分振搖，密閉，于4°C冷藏靜置過夜，抽濾，收集沉淀，于70°C減壓干燥，即由6種富集液制備的純化物，分別命名為木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP-中-1:3”)、木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP-H+-1:3”)、木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP- 0H— I -1:3”)、木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP- 0H_ II -1:3”)、木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP- OF III -1:3”)、木通皂苷Dl法純化物(“富集液-HP-H+-0『-l:3”)。純化前溶液中藥材與純化前溶液的質(zhì)量體積比(g:ml)分別為1:0. 5、1:0. 75、1:1、1:3。例如，純化前溶液中藥材與純化前溶液的質(zhì)量體積比(g:ml)為1:0. 5，即Ig藥材溶在O. 5ml的純化前溶液之中。2、富集液的純化方法-2(I)取實施例I制備的6種富集液(Ig藥材/ml) 25ml，分別置于6個IOOmL的小燒杯中濃縮至20mL，每個燒杯中加入5mL丙酮得到“純化前溶液”(溶液中丙酮的體積百分含量為20%，藥材與純化前溶液的體積質(zhì)量比g:mL為1:1)，再向各“純化前溶液”中加I倍體積量的石油醚(即25ml)，充分振搖，密閉，于4°C冷藏靜置過夜，抽濾，收集沉淀，于70°C減壓干燥，即由6種富集液制備的純化物，分別命名為木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP-中-I: I”)、木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP-H+-I: I”)、木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP- OF I -I: I”)、木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP- 0H_ II -1:1”)、木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP- OF III -I: I”)、木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP-H+-0H、1:1”)。注解木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP-中-I: I”)中的“木通皂苷D2法純化物”為富集液的純化方法_2得到的結晶；“富集液-HP-中”為在制備富集液過程中，采用中性溶液系統(tǒng)進行除雜表示在純化過程中，“純化前溶液”的濃度，1:1即為Ig藥材溶在ImL的純化前溶液中。(2)取實施例I制備的6種富集液(Ig藥材/ml) 25ml，分別置于6個IOOmL的小燒杯中濃縮至10mL，每個燒杯中加入2. 5mL丙酮得到“純化前溶液”，再向各“純化前溶液”中加I倍體積量的石油醚(即12. 5ml)，充分振搖，密閉，于4°C冷藏靜置過夜，抽濾，收集沉淀，于70°C減壓干燥，即由6種富集液制備的純化物，分別命名為木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP-中-1:0. 5”)、木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP-H+-I: O. 5”)、木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP- OF I -1:0. 5”)、木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP- OH_ II-I:O. 5”)、木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP- OF III-I: O. 5”)、木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP-H+-Or-I: O. 5，，)。(3)取實施例I制備的6種富集液(Ig藥材/ml) 25ml，分別置于6個IOOmL的小燒杯中濃縮至15mL，每個燒杯中加入3. 75mL丙酮得到“純化前溶液”，再向各“純化前溶液”中加I倍體積量的石油醚(即18. 75ml)，充分振搖，密閉，于4°C冷藏靜置過夜，抽濾，收集沉淀，于70°C減壓干燥，即由6種富集液制備的純化物，分別命名為木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP-中-1:0. 75”)、木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP-H+-I: O. 75”)、木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP- 0H_ I -1:0. 75”)、木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP-OH- II -1:0. 75”)、木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP- OF III-I: O. 75”)、木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP- H+-0H--1:0. 75，，)。(4)取實施例I制備的6種富集液(Ig藥材/ml) 25ml，分別置于6個IOOmL的小燒杯中加水稀釋至60mL，每個燒杯中加入15mL丙酮得到“純化前溶液”，再向各“純化前溶液”中加I倍體積量的石油醚(即75ml)，充分振搖，密閉，于4°C冷藏靜置過夜，抽濾，收集沉淀，于70°C減壓干燥，即由6種富集液制備的純化物，分別命名為木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP-中-1:3”)、木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP-H+-1:3”)、木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP- 0H— I -1:3”)、木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP- 0H_ II -1:3”)、木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP- OF III -1:3”)、木通皂苷D2法純化物(“富集液-HP-H+-0『-l:3”)。3、富集液的純化方法-3(I)取實施例I制備的6種富集液(Ig藥材/ml) 25ml，分別置于6個IOOmL的小燒杯中濃縮至20mL，每個燒杯中加入5mL 二氯甲烷得到“純化前溶液”(溶液中二氯甲烷的體積百分含量為20%，藥材與純化前溶液的體積質(zhì)量比g:mL為1:1)，再向各“純化前溶液”中加I倍體積量的石油醚(即25ml)，充分振搖，密閉，于4°C冷藏靜置過夜，抽濾，收集沉淀，于70°C減壓干燥，即由6種富集液制備的純化物，分別命名為木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP-中-I: I ”)、木通皂苷D3法純化物(“富集液-ΗΡ-tf-l: I ”)、木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP- 0H— 1-1:1 ”)、木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP- 0H_ 11-1:1 ”)、木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP- OF III -I: I ”)、木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP-H+-0H、1:1”)。注解木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP-中-I: I”)中的“木通皂苷D3法純化物”為富集液的純化方法_3得到的結晶；“富集液-HP-中”為在制備富集液過程中，采用中性溶液系統(tǒng)進行除雜表示在純化過程中，“純化前溶液”的濃度，1:1即為Ig藥材溶在ImL的純化前溶液中。(2)取實施例I制備的6種富集液(Ig藥材/ml) 25ml，分別置于6個IOOmL的小燒杯中濃縮至10mL，每個燒杯中加入2. 5mL 二氯甲烷得到“純化前溶液”，再向各“純化前溶液”中加I倍體積量的石油醚(即12. 5ml)，充分振搖，密閉，于4°C冷藏靜置過夜，抽濾，收集沉淀，于70°C減壓干燥，即由6種富集液制備的純化物，分別命名為木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP-中-1:0. 5”)、木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP-H+-I = O. 5”)、木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP- or I -1:0. 5”)、木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP-OH_ II -1:0. 5”)、木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP- OH_ III -1:0. 5”)、木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP- H+-0H--1:0. 5，，)。(3)取實施例I制備的6種富集液(Ig藥材/ml) 25ml，分別置于6個IOOmL的小燒杯中濃縮至15mL，每個燒杯中加入3. 75mL 二氯甲烷得到“純化前溶液”，再向各“純化前溶液”中加I倍體積量的石油醚(即18. 75ml)，充分振搖，密閉，于4°C冷藏靜置過夜，抽濾，收集沉淀，于70°C減壓干燥，即由6種富集液制備的純化物，分別命名為木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP-中-1:0. 75”)、木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP-H+-I: O. 75”)、木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP- 0H— I -1:0. 75”)、木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP-OH- II -1:0. 75”)、木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP- OF III-I: O. 75”)、木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP- H+-0H--1:0. 75，，)。(4)取實施例I制備的6種富集液(Ig藥材/ml) 25ml，分別置于6個IOOmL的小燒杯中加水稀釋至60mL，每個燒杯中加入15mL 二氯甲烷得到“純化前溶液”，再向各“純化前溶液”中加I倍體積量的石油醚(即75ml)，充分振搖，密閉，于4°C冷藏靜置過夜，抽濾，收 集沉淀，于70°C減壓干燥，即由6種富集液制備的純化物，分別命名為木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP-中-1:3”)、木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP-H+-1:3”)、木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP- 0H— I -1:3”)、木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP- 0H_ II -1:3”)、木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP- OF III -1:3”)、木通皂苷D3法純化物(“富集液-HP-H+-0『-l:3”)。4、富集液的純化方法-4(I)取實施例I制備的6種富集液(Ig藥材/ml) 25ml，分別置于6個IOOmL的小燒杯中濃縮至20mL，每個燒杯中加入5mL乙酸乙酯得到“純化前溶液”(溶液中乙酸乙酯的體積百分含量為20%，藥材與純化前溶液的體積質(zhì)量比g:mL為1:1)，再向各“純化前溶液”中加I倍體積量的石油醚(即25ml)，充分振搖，密閉，于4°C冷藏靜置過夜，抽濾，收集沉淀，于70°C減壓干燥，即由6種富集液制備的純化物，分別命名為木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP-中-I: I ”)、木通皂苷D4法純化物(“富集液-ΗΡ-tf-l: I ”)、木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP- 0H— 1-1:1 ”)、木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP- 0H_ 11-1:1，，)、木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP- OF III -I: I ”)、木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP-H+-0H、1:1”)。注解木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP-中-I: I”)中的“木通皂苷D4法純化物”為富集液的純化方法_4得到的結晶；“富集液-HP-中”為在制備富集液過程中，采用中性溶液系統(tǒng)進行除雜表示在純化過程中，“純化前溶液”的濃度，1:1即為Ig藥材溶在ImL的純化前溶液中。(2)取實施例I制備的6種富集液(Ig藥材/ml) 25ml，分別置于6個IOOmL的小燒杯中濃縮至10mL，每個燒杯中加入2. 5mL乙酸乙酯得到“純化前溶液”，再向各“純化前溶液”中加I倍體積量的石油醚(即12. 5ml)，充分振搖，密閉，于4°C冷藏靜置過夜，抽濾，收集沉淀，于70°C減壓干燥，即由6種富集液制備的純化物，分別命名為木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP-中-1:0. 5”)、木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP-H+-I: O. 5”)、木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP- OF I -1:0. 5”)、木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP-or II -1:0. 5”)、木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP- 0H_ III -1:0. 5”)、木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP- H+-0H--1:0. 5，，)。(3)取實施例I制備的6種富集液(Ig藥材/ml) 25ml，分別置于6個IOOmL的小燒杯中濃縮至1 5mL，每個燒杯中加入3. 75mL乙酸乙酯得到“純化前溶液”，再向各“純化前溶液”中加I倍體積量的石油醚(即18. 75ml)，充分振搖，密閉，于4°C冷藏靜置過夜，抽濾，收集沉淀，于70°C減壓干燥，即由6種富集液制備的純化物，分別命名為木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP-中-1:0. 75”)、木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP-H+-I: O. 75”)、木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP- 0H_ I -1:0. 75”)、木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP-0H_ II -1:0. 75”)、木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP- 0H_ III _1:0. 75”)、木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP- H+-0H--1:0. 75，，)。(4)取實施例I制備的6種富集液(Ig藥材/ml) 25ml，分別置于6個IOOmL的小燒杯中加水稀釋至60mL，每個燒杯中加入15mL乙酸乙酯得到“純化前溶液”，再向各“純化前溶液”中加I倍體積量的石油醚(即75ml)，充分振搖，密閉，于4°C冷藏靜置過夜，抽濾，收集沉淀，于70°C減壓干燥，即由6種富集液制備的純化物，分別命名為木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP-中-1:3”)、木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP-H+-1:3”)、木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP- OF I -1:3”)、木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP- 0H_ II -1:3”)、木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP- OF III -1:3”)、木通皂苷D4法純化物(“富集液-HP-H+-0『-l:3”)。5、富集液的純化方法-5(I)取實施例I制備的6種富集液(Ig藥材/ml) 25ml，分別置于6個IOOmL的小燒杯中濃縮至20mL，每個燒杯中加入5mL正丁醇得到“純化前溶液”(溶液中正丁醇的體積百分含量為20%,藥材與純化前溶液的體積質(zhì)量比g:mL為1:1)，再向各“純化前溶液”中加I倍體積量的石油醚(即25ml)，充分振搖，密閉，于4°C冷藏靜置過夜，抽濾，收集沉淀，于70°C減壓干燥，即由6種富集液制備的純化物，分別命名為木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP-中-I: I ”)、木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP-H+-I: I ”)、木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP- OF I -I: I”)、木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP- 0H_ II -1:1”)、木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP- OF III -I: I”)、木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP-H+-0H、1:1”)。注解木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP-中-I: I”)中的“木通皂苷D5法純化物”為富集液的純化方法_5得到的結晶；“富集液-HP-中”為在制備富集液過程中，采用中性溶液系統(tǒng)進行除雜表示在純化過程中，“純化前溶液”的濃度，1:1即為Ig藥材溶在ImL的純化前溶液中。(2)取實施例I制備的6種富集液(Ig藥材/ml) 25ml，分別置于6個IOOmL的小燒杯中濃縮至10mL，每個燒杯中加入2. 5mL正丁醇得到“純化前溶液”，再向各“純化前溶液”中加I倍體積量的石油醚(即12. 5ml)，充分振搖，密閉，于4°C冷藏靜置過夜，抽濾，收集沉淀，于70°C減壓干燥，即由6種富集液制備的純化物，分別命名為木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP-中-1:0. 5”)、木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP-H+-I: O. 5”)、木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP- OF I -1:0. 5”)、木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP-0H_ II -1:0. 5”)、木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP- 0H_ III -1:0. 5”)、木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP- H+-OH--I: O. 5 ”)。(3)取實施例I制備的6種富集液(Ig藥材/ml) 25ml，分別置于6個IOOmL的小燒杯中濃縮至15mL，每個燒杯中加入3. 75mL正丁醇得到“純化前溶液”，再向各“純化前溶液”中加I倍體積量的石 油醚(即18. 75ml)，充分振搖，密閉，于4°C冷藏靜置過夜，抽濾，收集沉淀，于70°C減壓干燥，即由6種富集液制備的純化物，分別命名為木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP-中-1:0. 75”)、木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP-H+-I = O. 75”)、木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP- 0H_ I -1:0. 75”)、木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP-OH- II -1:0. 75”)、木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP- 0Γ III-I: O. 75”)、木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP- H+-0H--1:0. 75，，)。(4)取實施例I制備的6種富集液(Ig藥材/ml) 25ml，分別置于6個IOOmL的小燒杯中加水稀釋至60mL，每個燒杯中加入15mL正丁醇得到“純化前溶液”，再向各“純化前溶液”中加I倍體積量的石油醚(即75ml)，充分振搖，密閉，于4°C冷藏靜置過夜，抽濾，收 集沉淀，于70°C減壓干燥，即由6種富集液制備的純化物，分別命名為木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP-中-1:3”)、木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP-H+-1:3”)、木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP- 0H— I -1:3”)、木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP- 0H_ II -1:3”)、木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP- OF III -1:3”)、木通皂苷D5法純化物(“富集液-HP-H+-0『-l:3”)。實施例3中所述的6種富集液即為實施例I制備的“富集液-HP-中”、“富集液-HP-H+”、“ 富集液-HP- 0H— I ”、“ 富集液-HP- 0!Γ II ”、“ 富集液-HP- 0Η—III”、“ 富集液-HP-H+W'6、各種木通皂苷D純化樣品的純度測定6. I色譜條件色譜柱為AgilentC18柱(100mmX4. 6mm, 3. 5 μ m);流動相乙腈-水(30:70,流動相超聲脫氣30min);檢測波長為212nm ;流速為I. Oml/min ;柱溫為30°C ;進樣量20 μ I。6. 2對照品溶液的制備取MD對照品適量，精密稱定(MD為10. 05mg)，置50ml量瓶中，加流動相溶解，稀釋，定容，搖勻，制成濃度為O. 2mg/mL的溶液,用O. 45 μ m微孔濾膜過濾，即得。6. 3供試品溶液的制備精密稱取實施例3純化方法制備的各種木通皂苷D純化樣品適量(約50mg)，置50ml量瓶中，加甲醇溶解，稀釋，定容，搖勻，再精密量取I. Oml置5ml量瓶中，加流動相稀釋，定容，搖勻，制成濃度為O. 2mg/mL的溶液,用O. 45 μ m微孔濾膜過濾，即得。測定各木通皂苷D純化樣品的純度，檢測結果見表I。表I不同純化方法結合不同方法制備的富集液、純化溶解液的濃度變化對木通皂苷D純度、轉(zhuǎn)移率的影響實驗結果
權利要求
1.一種用HP-20大孔樹脂富集續(xù)斷藥材提取液中木通皂苷D的方法，其特征在于包括以下步驟將用95%的乙醇浸泡后的HP20大孔樹脂，用95%乙醇洗脫，再用水洗脫至無醇味后備用；所用柱子的徑高比為I :6，上樣液濃度為O. Ig藥材/ml，上樣量為藥材濕樹脂重量比=1:1. 5^2. 5，依次用水、30%乙醇和35%乙醇除雜，然后用50%乙醇洗脫，得到木通皂苷D富集液。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于所述的用水除雜為中性的純化水、或用pH=3-4的酸性純化水、或用pH=7-8的堿性純化水、或用pH=8_9的堿性純化水、或用pH=9-10的堿性純化水單獨使用除雜，或者pH=3-4的酸性純化水與pH=8_9的堿性純化水聯(lián)合使用除雜；所述的用30%乙醇除雜為中性的30%乙醇、或用pH=3-4的酸性30%乙醇、或用pH=7-8的堿性30%乙醇、或用pH=8-9的堿性30%乙醇、或用pH=9_10的堿性30%乙醇單獨使用除雜，或用pH=3-4的酸性30%乙醇與pH=8-9的堿性30%乙醇聯(lián)合使用除雜；所述的35%乙醇為中性的35%乙醇；所述的50%乙醇為中性的50%乙醇。
3.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于除雜時所述水的用量為6倍量柱體積，所述30%乙醇的用量為6倍量柱體積，所述35%乙醇的用量為2倍量柱體積，洗脫時所述50%乙醇的用量為6倍量柱體積。
4.根據(jù)權利要求Γ3中任意一項所述的方法，其特征在于所述除雜和所述洗脫的過程為用6倍量柱體積的pH=8-9的堿性純化水洗脫除雜，流速為2BV/h ;然后用6倍量柱體積的pH=8-9的堿性30%乙醇洗脫除雜，流速為2BV/h ;再用2倍量柱體積的中性的35%乙醇除雜，流速為2BV/h ;最后用6倍量柱體積的中性的50%乙醇洗脫，流速為2BV/h，得到木通皂苷D富集液。
5.—種木通皂苷D富集液的純化方法，其特征在于向木通皂苷D富集液中加入有機溶劑制成純化前溶液，向純化前溶液中加入I倍體積量的石油醚，充分振搖，密閉，冷藏靜置過夜，抽濾，收集沉淀，于不超過70°C的溫度下減壓干燥，即得木通皂苷D純化物。
6.根據(jù)權利要求5所述的木通皂苷D富集液的純化方法，其特征在于所述的純化前溶液中有機溶劑的體積百分含量為5°/Γ40%，優(yōu)選為10°/Γ30%，更進一步優(yōu)選為20%。
7.根據(jù)權利要求5或6所述的木通皂苷D富集液的純化方法，其特征在于所述的有機溶劑為乙醇、甲醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯或正丁醇；優(yōu)選為乙醇或丙酮，更進一步優(yōu)選為丙酮。
8.根據(jù)權利要求5所述的木通皂苷D富集液的純化方法，其特征在于所述的純化前溶液中藥材與純化前溶液的質(zhì)量體積比g ml為1:0. 5^3 ;優(yōu)選為1:1。
9.根據(jù)權利要求5所述的木通皂苷D富集液的純化方法，其特征在于所述的木通皂苷D富集液為采用權利要求I所述的方法制備的木通皂苷D富集液，或者采用24種大孔樹脂D101、HPD-100、HPD-100A、HPD-200A、AB-8、Seplite DlOUSeplite LX_68、S印Iite XDA-8、Seplite LX-IUSeplite LX_17、S印Iite LX-28、HPD-200A、HPD-200B、HPD-300、HPD-400、HPD-400A、HPD-450、HPD-450A、HPD-500、HPD-600、HPD-700、HPD-710、HPD-722 或 HPD-721富集方法制備的木通皂苷D富集液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種木通皂苷D的富集和純化方法，富集方法為將處理后的HP20大孔樹脂，依次用水、30%乙醇和35%乙醇除雜，然后用50%乙醇洗脫，得到木通皂苷D富集液。取木通皂苷D富集液，加入不同的有機溶劑制成純化前溶液，向純化前溶液中加入1倍體積量的石油醚，充分振搖，密閉，冷藏靜置過夜，抽濾，收集沉淀，于不超過70℃的溫度下減壓干燥，即為木通皂苷D純化物。本發(fā)明的方法富集和純化木通皂苷D過程中耗時更短，富集和純化工藝更簡單，操作方便，所制備的木通皂苷D純度最高可達99%，轉(zhuǎn)移率率更高。
文檔編號C07J63/00GK102924545SQ20121045445
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月13日 優(yōu)先權日2012年11月13日
發(fā)明者楊中林 申請人:楊中林