專利名稱：一種表皮細(xì)胞抑裂素及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化分離純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表皮細(xì)胞抑裂素及其制備方法和應(yīng)用.
背景技術(shù)：
表皮細(xì)胞抑裂素(簡稱皮抑素)是動物的表皮細(xì)胞產(chǎn)生的一種內(nèi)源性的蛋白質(zhì)細(xì)胞因子，它可以作用于動物的表皮細(xì)胞，抑制表皮細(xì)胞的有絲分裂使之停留在細(xì)胞生長周期的Gl期。20世紀(jì)初就有人發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)存在抑制細(xì)胞分裂的物質(zhì)，以后有人發(fā)現(xiàn)一種組織的抽提液加到同種組織中能抑制該組織細(xì)胞的分裂。1960年Bulough和Laurence在研究體內(nèi)上皮細(xì)胞分裂的控制中指出有一個(gè)內(nèi)源性的細(xì)胞專一的抑制劑可以阻斷細(xì)胞的生長周期，這種抑制劑是由細(xì)胞產(chǎn)生的一種內(nèi)源性物質(zhì)，在體內(nèi)起負(fù)調(diào)控作用，因此提出 “Chalone”這一名詞命名這一類物質(zhì),指它們在體內(nèi)起減速或中斷的作用。Chalone由于來源不同，靶細(xì)胞不同而有許多種，例如淋巴細(xì)胞抑裂素、表皮細(xì)胞抑裂素、粒細(xì)胞抑裂素、肝細(xì)胞抑裂素等。它們都有4方面的共性(1)有組織特異性(2)無種族特異性(3)無細(xì)胞毒性(4)可逆性。鑒于上述特異性，抑素對于一些異常的分裂、增殖應(yīng)該可以起到抑制作用。顯然具有潛在的應(yīng)用前景，例如淋巴細(xì)胞抑裂素有可能發(fā)展為抗排異藥、肝細(xì)胞抑裂素有抑制肝癌細(xì)胞快速生長的功能、表皮細(xì)胞抑裂素具有抑制某些類型銀屑病病人皮屑大量生成的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問題是對皮抑素的提取純化，作較大改進(jìn)使之更適合工業(yè)化生產(chǎn)，使工藝更合理、得率更高、質(zhì)量更好、更穩(wěn)定?；钚允褂肏aCat人永生化表皮細(xì)胞株中位測定法，使操作更方便、科學(xué)、可靠性、可比性更強(qiáng)本發(fā)明的技術(shù)方案
本發(fā)明所述表皮細(xì)胞抑裂素由動物皮分離純化，分子量為30000-50000。(I)、表皮細(xì)胞抑裂素的制備方法取新鮮豬皮削除所附脂肪組織，洗凈，用絞肉機(jī)絞成肉皮糜，稱量重量，加入三倍水用膠體磨將肉皮糜磨成勻漿，攪拌3小時(shí)、過濾，濾渣再加入二倍體積水再攪拌2小時(shí)，合并二次濾液。濾液脫脂肪，通過截止分子量10000的超濾膜過濾，濃縮至起始體積的3%-5%，將濃縮后超濾保留液用乙醇沉淀，取30% — 80%的沉淀部分用PH7. 5的磷酸緩沖液溶解，離心取上清。將上清液調(diào)至PH酸性此時(shí)皮抑素帶正電荷，可以交換至SP— S印harose離子交換柱上，而大量雜蛋白可以穿過而被洗去，改用PH8. 0的磷酸緩沖液洗脫可得洗脫峰I，再改用含0. 5 M NaCl的PH8. 0磷酸緩沖液洗脫可得洗脫峰2 (層析結(jié)果見

圖1)，測活性證明活性主要在峰I中，峰2中亦有部分活性SP—Sepharose F. F是一種陽離子交換劑，皮抑素在酸性條件下帶正電荷，可以交換在層析柱上，所有帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不能交換在柱上，都在穿過峰中，被K16. 5的磷酸緩沖液洗脫；然后改用PH8. 0的磷酸緩沖液，因?yàn)镻H8. 0高于皮抑素的等電點(diǎn)，皮抑素帶負(fù)電荷，因此將大部分皮抑素洗下，再用含0.5M NaCl的磷酸緩沖液，由于離子強(qiáng)度增加，其他等電點(diǎn)高的蛋白也被洗脫?；钚詼y定結(jié)果上柱前樣品的比活性為2975u/mg，穿過峰面積很大但比活性很低，只有989u/mg，洗脫峰I面積很小但比活性很高，達(dá)到244285u/mg比上柱前提高82倍。洗脫峰2面積較小仍有少部分皮抑素，比活性為62160u/mg。(2)、皮抑素的活性測定采用HaCat人永生化表皮細(xì)胞株(購自上海復(fù)祥生物技術(shù)有限公司)細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)液(含小牛血清10%)中，在37°C、C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至鋪滿培養(yǎng)瓶壁的80%左右時(shí)用0. 25%胰蛋白酶將細(xì)胞消化，制成3X 104/ml。細(xì)胞懸液在96孔培養(yǎng)板中每孔加160ii I細(xì)胞懸液,培養(yǎng)20小時(shí)后加入皮抑素40ii I。稀釋依溶液中皮抑素的含量而定，可以從每孔微克水平倍比稀釋至納克或者匹克水平，對照組加40 ill培養(yǎng)液。各種濃度做三孔重復(fù)，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后加入5mg/ml MTT 20iU，再培養(yǎng)4小時(shí)，倒去上清加入二甲亞砜IOOii I顯色，在酶標(biāo)儀0D492nm處讀數(shù)，將三個(gè)重復(fù)孔的讀數(shù)取平均值，與對照組的平均值計(jì)算抑制百分率，規(guī)定抑制1%為一個(gè)活性微單位(mu)。將抑制百分率對每孔的蛋白質(zhì)濃度做圖，可得一個(gè)S型曲線，得上下平臺，取上下平臺的中 值為活性點(diǎn)?；钚渣c(diǎn)的蛋白量/孔含有的活性單位稱為比活性(u/mg)，比活性代表皮抑素的純度，比活性高表示皮抑素的活性亦高。比活性(u/mg) =
(3)、皮抑素應(yīng)用將除菌后皮抑素(比活性大于2000u/mg)加入軟膏中，供銀屑病病人外用，病人黃某(尋常型銀屑病)為30多年的病人，全身性皮損，曾用多種治療方法，只能短暫緩解，試用皮抑素治療左腿三周，每日早晚兩次外擦，右腿作為對照，三周后左腿皮屑全消，皮膚恢復(fù)彈性、光滑，僅留紅色色素沉著印跡，亦不再搔癢，而未經(jīng)治療的右腿仍然覆蓋著很厚的皮屑、堅(jiān)硬、粗糙如故(結(jié)果見附圖3)。在醫(yī)生配合下，也曾給多位病人試用過皮抑素。在南京某醫(yī)院四位病人中有三位住院病人治療后療效很好，一位非住院病人療效不明顯。在天津某醫(yī)院治療10位病人，療效顯著，醫(yī)生反饋比進(jìn)口含激素的藥效更好。南京二位斑塊型銀屑病病人用藥后療效也十分顯著。皮抑素不但對人永生化表皮細(xì)胞有抑制分裂的作用，對A431皮膚癌細(xì)胞也有明顯的抑制作用，以一個(gè)部分純化制品比活500u/mg的皮抑素試驗(yàn)，每孔450ng的水平，A431細(xì)胞的生長被抑制40%。A431皮膚癌細(xì)胞I X 104/ml, 96孔板中每孔加160 ill細(xì)胞懸液，在C02培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)20小時(shí)，加皮抑素40 yl，皮抑素濃度從625ng/ml起倍比稀釋至19. 8ng。培養(yǎng)72小時(shí)后用MTT法顯色，0D492nm讀數(shù)，與對照組讀數(shù)計(jì)算抑制百分率，對每孔中蛋白質(zhì)量作圖，可見皮抑素對A431皮膚癌細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制作用，說明皮抑素可用于治療皮膚癌。結(jié)果見附圖4。本發(fā)明生產(chǎn)的皮抑素可制備成治療銀屑病或皮膚癌的藥物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比其有益效果是
(I)、現(xiàn)工藝將豬皮去脂肪，切成Icm2小塊，加水用高速組織搗碎機(jī)勻漿，過濾，濾渣再勻漿一次，合并濾液。本發(fā)明改用膠體磨，豬皮被完全磨成勻漿，蛋白質(zhì)提取率提高70%以上，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。(2)、現(xiàn)工藝水抽提液直接加乙醇，30% — 85%沉淀，溶解蛋白質(zhì)得率為I. 09g/kg豬皮，每公斤豬皮需43L乙醇。本發(fā)明將水抽提液先超濾，將分子量小于I萬的無活性蛋白質(zhì)去除，同時(shí)濃縮了抽提液體積至3% — 5%，再用30% — 70%乙醇沉淀，節(jié)省了乙醇97%以上，蛋白質(zhì)得率為3. 28g/kg豬皮，得率提高3倍、比活性提高6倍、總活性提高了 300倍，由于在純化過程中去除了豬皮中原來存在的表皮細(xì)胞生長因子類的物質(zhì)，故而總活性遠(yuǎn)超過起始水抽提液中的總活性，降低了生產(chǎn)成本、節(jié)約了人力、還節(jié)省了大量因使用易燃物品而必須增加的保護(hù)設(shè)施如乙醇的運(yùn)輸、回收、危險(xiǎn)品倉庫等各種必要的設(shè)備和監(jiān)管人員的費(fèi)用。比較結(jié)果見下表格
權(quán)利要求
1.一種表皮細(xì)胞抑裂素，其特征是從動物皮中分離純化，分子量為30000-50000。
2.權(quán)利要求I所述一種表皮細(xì)胞抑裂素的制備方法，其特征是由以下步驟構(gòu)成 (1)、以新鮮洗凈的去油脂豬皮作為原料，通過絞肉機(jī)將豬皮制成肉皮糜； (2)、以豬皮重量三倍的水作為提取液，加入肉皮糜中，通過膠體磨研磨成勻漿，在10°C以下攪拌2-3小時(shí)、過濾，濾渣再加入二倍體積水再攪拌2小時(shí)，合并二次濾液，4°C靜置過夜去除上層油脂； (3)、去油脂濾液通過截止分子量10000的超濾膜過濾，濃縮至起始體積的3%; (4)、將分子量大于10000的超濾保留液經(jīng)30-80%乙醇沉淀，再溶解； (5)、將上清液通過SP—S^harose F. F陽離子交換層析柱，皮抑素交換在層析柱上，改變PH增加離子強(qiáng)度，皮抑素被洗脫。
3.根據(jù).權(quán)利要求2所述一種表皮細(xì)胞抑裂素的制備方法，其特征是使用膠體磨研磨豬皮，使艱難勻漿的豬皮得到充分破碎。
4.權(quán)利要求I所述一種表皮細(xì)胞抑裂素的活性測定方法，其特征是用Hacat人胞培養(yǎng)方法測定皮抑素活性，在表皮細(xì)胞培養(yǎng)液中加入皮抑素，抑制表皮細(xì)胞的生長，以MTT法檢測皮抑素的抑制百分率，取皮抑素從微克水平，以倍比稀釋至納克水平甚至匹克水平，將每孔中蛋白質(zhì)濃度對抑制率作圖得出上下平臺，取上下平臺的中值為活性點(diǎn)。
5.將抑制1%規(guī)定為一個(gè)微活性單位mu，每毫克蛋白質(zhì)的活性單位為比活性(u/mg蛋白質(zhì)) 權(quán)利要求I所述一種表皮細(xì)胞抑裂素在制備治療銀屑病藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求I所述一種表皮細(xì)胞抑裂素在制備治療皮膚癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生化分離純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表皮細(xì)胞抑裂素及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明用膠體磨替代高速組織搗碎機(jī)，將豬皮制成勻漿的方法，更適合工業(yè)化生產(chǎn)需要，并且蛋白質(zhì)的得率提高70%以上。本發(fā)明將水抽提液經(jīng)超濾濃縮后加乙醇分級沉淀比原工藝直接乙醇沉淀的方法乙醇的用量降低97%，降低了生產(chǎn)成本，在純化過程中采用陽離子交換層析，大幅提高皮抑素的比活性。皮抑素可以有效地抑制表皮細(xì)胞的分裂，對銀屑病人的癥狀有明顯的緩解和止癢的作用，對皮膚癌也有一定的治療價(jià)值。
文檔編號C07K14/47GK102977203SQ20121048577
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月26日
發(fā)明者金以豐, 吳奇, 馬曉艷, 張?zhí)? 宣勤貴 申請人:南京必優(yōu)康生物技術(shù)有限公司