專利名稱：一種可抑制病毒粒子釋放的蛋白，其編碼序列及在抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒從細胞釋放中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可抑制病毒粒子釋放的蛋白，其編碼序列及在抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子從細胞釋放中的應(yīng)用，特別涉及一種馬tetherin蛋白，其編碼序列及在抑制EIAV、HIV以及SIV從細胞釋放中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
機體內(nèi)存在一些先天的免疫因子，這些因子可以起到控制病毒蔓延和防止病毒跨種間傳播的作用，被稱為“宿主限制因子”，參與先天性免疫反應(yīng)，干擾病毒生命周期的不同階段。在人免疫缺陷病毒研究中發(fā)現(xiàn)，宿主細胞天然存在若干種屏障，對病毒的侵入、復制和出芽存在限制作用。目前有四大類限制因子:APOBEC (可誘導前病毒DNA產(chǎn)生致命的超級突變)、Trim5a (可特異性與剛進入細胞的病毒核衣殼蛋白結(jié)合，從而阻止病毒的脫殼和逆轉(zhuǎn)錄)、Tetherin (限制逆轉(zhuǎn)錄病毒釋放)、SAMHDl (阻礙逆轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的合成，干擾病毒感染)。這些限制因子可有效地限制逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，是宿主抵抗病毒感染的一個重要防御屏障。 1994年人們首次發(fā)現(xiàn)BST-2表達在人的漿細胞系、骨髓間質(zhì)細胞和B細胞的表面，并推測該蛋白在B細胞的發(fā)育過程中發(fā)揮作用。2006年，研究人員證實BST-2是卡波西肉瘤相關(guān)性抱疫病毒(Kaposi’ s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)K5 蛋白(又稱 MIR2)的一個靶點，由此推測BST-2很可能與宿主抗病毒的防御機制有關(guān)。2008年這一抗病毒活性得到證實，它可以抑制Vpu缺陷的HIV-1病毒的釋放，重新命名為tetherin。Tetherin (BST2/CD317)是一種由干擾素誘導產(chǎn)生的抗病毒分子，它能夠抑制感染哺乳動物的多種衣殼病毒粒子從感染細胞中釋放。所有這些病毒共同具有的結(jié)構(gòu)——病毒外膜，是tetherin作用的祀點。Tetherin通常只在類楽；樹突狀細胞上、部分癌細胞、終末分化成熟的B細胞和骨髓間質(zhì)細胞中高效表達，但是tetherin也可以受I型干擾素(IFN-1)的誘導而表達。人體感染HIV-1病毒后，病毒粒子與樹突狀細胞(IFN的主要生成細胞)上的CD4受體結(jié)合，經(jīng)內(nèi)吞作用進入細胞漿，內(nèi)涵體中的病毒核酸與TLR7/9結(jié)合，啟動信號傳導通路，誘導IFN-1 (包括IFNa、IFN^和IFNco三種形式)的表達。IFN-1可以誘導上百種不同基因的表達，并活化天然殺傷性細胞、骨髓樹突細胞、T細胞、B細胞和巨噬細胞。IFN-a和IFN-β與它們相應(yīng)受體結(jié)合，通過JAK/STAT信號途徑誘導感染病毒的細胞中tetherin的表達。誘導產(chǎn)生的tetherin首先遷移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,然后通過COPI1-coated泡狀體運送到高爾基體的區(qū)室中，最終到達漿膜，同時利用胞質(zhì)尾區(qū)保守的酪氨酸基團與AP2銜接蛋白復合物結(jié)合，在網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用下進入包涵體，并在高爾基體和細胞表面之間循環(huán)往返。為了防止促炎細胞因子產(chǎn)生過剩，造成免疫亢奮，還有一個負反饋調(diào)節(jié)機制，即tetherin與漿細胞樹突狀細胞上的TLR7結(jié)合，抑制IFN-1和其他促炎細胞因子的表達。當新生的病毒出芽或釋放時，Tethein —端或兩端的膜錨定區(qū)可插入到病毒的衣殼中，進而將病毒錨定在細胞膜的表面，在細胞的內(nèi)吞作用下，利用溶酶體降解病毒粒子。
在長期進化過程中，病毒往往通過自身編碼的蛋白來抑制Tetherin的活性，從而形成了特定的逃逸機制。例如，人免疫缺陷病毒(HIV-1)的Vpu及猴免疫缺陷病毒(SIV)的Nef蛋白可拮抗tetherin的限制作用。然而適應(yīng)一種宿主的病毒只能對抗該宿主的tetherin的限制作用，對異種動物tetherin的限制不具有對抗作用。因此,tetherin被認為在防止病毒跨種間傳播方面具有重要作用。Vpu蛋白是HIV-1病毒的輔助調(diào)節(jié)蛋白之一，是一個大小為16kDa的跨膜蛋白，可直接與Tetherin的跨膜區(qū)相互作用。這種相互作用具有高度的特異性，tetherin跨膜區(qū)位點的突變可使其克服Vpu的拮抗作用。Vpu弓I起宿主細胞表面tetherin水平下降、也會使細胞中tetherin總量減少。Vpu在高爾基體反面的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)或早期內(nèi)涵體上祀定tetherin,通過β-TrCP (嵌合泛素連接酶)-依賴機制,經(jīng)蛋白酶或溶酶體途徑降解tetherin,從而將tetherin的作用沉默。然而，Vpu上的結(jié)合位點β-TrCP的突變并不能完全干擾Vpu克服tetherin的作用；而tetherin含量下調(diào)也并不完全取決于Vpu的中和作用。所以，tetherin在細胞表面表達減少、在細胞內(nèi)被降解或者沉默的確切機制，以及Vpu依賴性的病毒釋放增強機制中各因子的作用還需要進一步的研究。大多數(shù)靈長類慢病毒并不含有Vpu蛋白，有些慢病毒(例如分別感染烏白眉猴sooty mangabeys、短尾猴 macaques、Syke 猴、Syke，s monkeys 和非洲綠猴 African greenmonkeys的SIVsmm、SIVmac、SIVsyk和SIVagm病毒)利用自身編碼的Nef蛋白抵抗tetherin的抑制作用。另外，感染黑猩猩chimpanzees和大猩猩gorillaz的SIVcpz和SIVgor病毒是HIV-1的起源，也含有Vpu蛋白， 但是卻應(yīng)用Nef蛋白阻斷tetherin的作用。Nef是病毒在體內(nèi)有效復制的關(guān)鍵蛋白，它可以在宿主細胞中調(diào)控細胞的運輸、信號轉(zhuǎn)導和基因的表達。Nef是如何拮抗tetherin的作用目前還不清楚，但是Nef可作為銜接蛋白(adaptorprotein),與胞漿中的⑶4、⑶28和MHC-1相互作用，使它們的表達量降低。Nef還可以錨定Tetherin的胞質(zhì)尾區(qū)，降低tetherin在宿主細胞表面的表達。如果在Nef上做某些突變，可阻斷它對tetherin的作用，同時也可以消除它對⑶4表達量下調(diào)的作用。Tetherin抗病毒活性的發(fā)現(xiàn)為宿主防御機制研究方面開辟了一個新的領(lǐng)域。目前，人們對病毒與宿主之間相互作用的復雜機制的了解還剛剛開始，仍有一些宿主限制因子沒有發(fā)現(xiàn)，受IFN-1誘導產(chǎn)生因子的功能也還未可知。是否不能誘導IFN-1反應(yīng)的病毒就不需要有自身編碼的拮抗基因的存在還不清楚。Tetherin拮抗物對于病毒復制方面的重要意義還需要進一步的研究。進一步的研究不僅可以揭示病毒與其宿主相互斗爭的分子機制，而且還可以引入基因干預(yù)的思路來治療HIV和其他病毒

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過分子克隆技術(shù)，構(gòu)建馬tetherin蛋白基因和EIAV感染性克隆的真核表達載體，研究馬tetherin與EIAV的相互作用關(guān)系，并確定他們相互作用的關(guān)鍵位點。為了達到以上目的本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:本發(fā)明利用普通PCR從馬血中擴增馬tetherin基因，應(yīng)用克隆技術(shù)構(gòu)建該基因及其突變基因(delCT、delGP1、N51A、N78A)的重組質(zhì)粒，利用融合PCR技術(shù)和克隆技術(shù)構(gòu)建EIAVaenv的Gp2、Gp3包裝質(zhì)粒；通過脂質(zhì)體Lipofectamine2000在驢皮膚細胞上轉(zhuǎn)染馬tetherin重組質(zhì)粒，再感染EIAV病毒，或者在Hela或者HEK293T細胞上通過磷酸鈣法共轉(zhuǎn)染目的基因和包裝質(zhì)粒，收集細胞裂解液和培養(yǎng)液上清，進行Western Blotting分析，或者固定細胞進行間接免疫熒光試驗。結(jié)果成功構(gòu)建了 PEF4.HA.Flag和Eq.te重組質(zhì)粒，經(jīng)測序分析，克隆的馬tetherin基因與該基因的預(yù)測序列的同源性為99%(493/498)，相對應(yīng)的氨基酸序列同源率為94.0% (156/166);經(jīng)Western blottining分析,在26Ku處能夠檢測到目的蛋白的表達。在感染試驗中，通過研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染馬tetherin的驢皮膚細胞的培養(yǎng)液上清中檢測不到EIAV。在重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染試驗中，馬tetherin和Gpl/Gp2/Gp3重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T或Hela細胞,經(jīng)Western blottining分析,對照組未轉(zhuǎn)染tetherin的細胞裂解物和培養(yǎng)液上清中均可檢測到EIAV的病毒樣顆粒，而不能在轉(zhuǎn)染tetherin的細胞卻在上清液檢測到病毒；應(yīng)用間接免疫熒光試驗，在共聚焦顯微鏡下觀察，馬tetherin和EIAV共定位于細胞漿、細胞膜和核膜上。共轉(zhuǎn)染馬tetherin缺失基因delCT/delGPI或N51A/N78A和Gp2重組質(zhì)粒，delCT和delGPI的培養(yǎng)液上清中可檢測到EIAV，其所釋放的病毒量少于陰性對照、多于陽性對照的；N51A和N78A上清液中所釋放的病毒與陽性對照無明顯差異，與陰性對照相比病毒量均顯著降低。共轉(zhuǎn)染馬tetherin、EIAV的env和Gpl重組質(zhì)粒,在上清液中能夠重新檢測到EIAV的病毒樣顆粒。通過以上實驗證實本發(fā)明所克隆得到的馬tetherin基因所編碼的蛋白可以抑制EIAV病毒從細胞中釋放，并將EIAV限制在細胞膜和核膜上，馬tetherin基因中的胞漿尾區(qū)(CT)和GPI是tetherin與EIAV作用的關(guān)鍵位點，N51和N78糖基化位點的突變對病毒的限制作用沒有影響。在病毒與宿主的相互作用上，EIAV的env蛋白能夠拮抗tetherin對EIAV的限制作用。另外，通過進一步的實驗研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所克隆得到的馬tetherin基因所編碼的蛋白同樣可以抑制HIV以及SIV病毒從細胞中釋放。因此，在此研究的基礎(chǔ)上，提出了本發(fā)明。本發(fā)明的一種可抑制病毒粒子釋放的蛋白，為馬tetherin蛋白，其特征在于具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了編碼所述蛋白的核苷酸序列。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。含有所述的核苷酸序列的表達載體及含有該所述的表達載體的宿主細胞也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。再進一步的，本發(fā)明還提供了所述的蛋白在制備抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒從細胞釋放的藥物中的應(yīng)用，所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括馬傳染性貧血病毒(EIAV)、人免疫缺陷病毒(HIV)及猴免疫缺陷病毒(SIV)。所述的核苷酸序列在制備抑制病毒從細胞釋放的藥物中的應(yīng)用，所述的病毒包括馬傳染性貧血病毒(EIAV)、人免疫缺陷病毒(HIV)及猴免疫缺陷病毒(SIV)。更進一步的，本發(fā)明還提供了馬傳染性貧血病毒(EIAV)的囊膜蛋白(env)在制備拮抗本發(fā)明所述的蛋白對馬傳染性貧血病毒(EIAV)從細胞釋放的抑制作用的藥物中應(yīng)用。在本發(fā)明中，所述的囊 膜蛋白(env)的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。


圖1為VR-Gp2載體構(gòu)建示意圖；圖2為VR_Gp3載體構(gòu)建示意圖；圖3為pHAHA陽性質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果；I:pcDNA3.1 (+) ；2:pHAHA-Clonel ；3:pHAHA-Clone2圖4為pHF重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果；圖5為目的基因的擴增；圖6為Eq.te重組質(zhì)粒的鑒定；圖7為核苷酸序列的比對結(jié)果；圖8為蛋白質(zhì)序列的比對結(jié)果；圖9為Eq.te、delCT和delGPI陽性克隆序列的比對結(jié)果；圖10為Eq.te、delCT和delGPI重組質(zhì)粒在HEK293T細胞上的表達情況；圖11為馬Tetherin抑制EIAV病毒的釋放情況；圖12為馬tetherin與EIAV的共定位；圖13為馬teherin突變體對EIAV的影響；圖14 為 EIAV Env 對馬 tetherin 的影響；圖15為馬tetherin對HIV釋放的影響；圖16為馬tetherin對SIV釋放的影響。
具體實施例方式下面通過實驗并結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例11.材料與方法1.1 材料111 細胞E.coli HBlOl工程菌由本實驗室保存，培養(yǎng)與LB培養(yǎng)基中(細菌培養(yǎng)所用胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast Extract)均購自 Sigma 公司)；HEK293T、Hela、驢皮膚(FDD)細胞和驢血管內(nèi)皮細胞由本實驗室保存，培養(yǎng)于DMEM高糖(購自Gibco公司)培養(yǎng)基中。1.1.2載體與主要試劑pef4myc-his-B、pFD3-8(含有EIAV的全基因序列)質(zhì)粒為本實驗室留存，pMD-18T購自TaKaRa公司，pcDNA3.1 (+)、pVR載體由本實驗保存；pNL43_Hsas質(zhì)粒為HIV Vif缺失性的感染性克隆，pBR238.E.N質(zhì)粒為SIV Env和Nef缺失性的感染性克??；人Tetherin(H0.te)和猴Tetherin (M ac.te)、真核表達質(zhì)粒為本實驗室已構(gòu)建并保存的。AxyPrep血RNA小量制備試劑盒購自A XYGEN公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒均購自O(shè)mega公司；Lipofectamine2000脂質(zhì)體購自Invitrogen公司；細胞培養(yǎng)用試劑血清等均購自Gibco公司；M_MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Invitrogen公司；LA Taq、dNTP購自TaKaRa公司；EcoR1、NotI, BamHI等限制性內(nèi)切酶和T4DNA Iigase購自NEB公司。Monoclonal Ant1-HA clone HA_8Mouse Ascites Fluid(H9658)和 Monoclonalant1-beta-actin clone AC-15Mouse Ascites Fluid (A5441)購自 Sigma 公司 Ant1-mouseIgG (H & L) Antibody IRDye800Conjugated (MinXBvCh Gt GP Ham Hs Hu Rb Rt & Sh SerumProteins) (610-732-124)購自 ROCKLAND 公司；Rabbit polyclonal secondary antibodyto horse IgG-H&L (TRIC 或者 FITC)購自 abeam 公司，Ant1-Mouse IgG R-Phycoerythrin(或者FITC) conjugate購自SIGMA公司；HIV的p24單克隆抗體和SIV的p27單克隆抗體為實驗室自備；核酸 DL2000DNA Marker 購自 TianGEN 生化公司，PageRuler PrestainedProtein Ladder (SM0671)購自 Fermentas 公司。Fast Mutagenesis System 試劑盒購自Transgene 公司。1.1.3主要儀器MASTERCYCLER 梯度 PCR RGppendorf 公司)，Mupid-one 核酸電泳儀(TAKARA 公司)，Champ Gel-3220凝膠成像分析系統(tǒng)(SAGE CREATION公司)，蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀均購自 Bio-Rad 公司；0dyssey Infrared Imaging System (L1-COR 公司)和二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司)；激光共聚焦顯微鏡購自Leica公司。1.2 方法1.2.1RNA 的提取真空采取健康馬血，用AxyPrep血RNA小量制備試劑盒提取血液中的總RNA，300 μ I全血按說明書的步驟操作，最終加入100 μ I Buffer TE洗脫獲得馬血液RNA。1.2.2引物的合成根據(jù)Equus cabalIus tetherin 基因預(yù)測的序列(GeneBank 登錄號:XM-OO1915091.1)設(shè)計并合成引物，利用引物eq.te.F和eq.te.R擴增馬tetherin序列，利用上、下引物 HAHA.F/R、HAflag.F/R 或Ps`t1.Linker.S/Bgl I1.Linker.A退火構(gòu)建帶有HAHA,HAflag標簽和含有Linker序列的質(zhì)粒，利用引物eq.delCT.F和eq.te.R擴增5’端(N端)缺失胞衆(zhòng)尾區(qū)的馬tetherin序列,利用引物eq.te.F和eq.delGP1.R擴增3’端(C端)缺失GPI片段的馬tetherin序列，利用引物eqTe.N51A.F/R或eqTe.N78A.F/R引物進行N到A的定點突變；利用融合PCR分別擴增EIAV序列的A、B和C段序列，利用引物gpF和gpR擴增EIAV的gag和pol基因序列，利用引物gtpF和gtpR擴增EIAV的gag、tat和pol基因序列。擴增基因的引物名稱及其序列如表I所不。表1.擴增基因的引物名稱及其序列
權(quán)利要求
1.一種可抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子釋放的蛋白，為馬tetherin蛋白，其特征在于具有SEQID N0.1所示的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQIDN0.2所/Jn ο
4.一種表達載體,其特征在于含有權(quán)利要求2或3所述的核苷酸序列。
5.一種宿主細胞，其特征在于含有權(quán)利要求4所述的表達載體。
6.權(quán)利要求1所述的蛋白在制備抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒從細胞釋放的藥物中的應(yīng)用，所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括馬傳染性貧血病毒、人免疫缺陷病毒及猴免疫缺陷病毒。
7.權(quán)利要求2或3所述的核苷酸序列在制備抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒從細胞釋放的藥物中的應(yīng)用，所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括馬傳染性貧血病毒、人免疫缺陷病毒及猴免疫缺陷病毒。
8.馬傳染性貧血病毒的囊膜蛋白env在制備拮抗權(quán)利要求1所述的蛋白對逆轉(zhuǎn)錄病毒從細胞釋放的抑制作用的藥物中應(yīng)用，所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括馬傳染性貧血病毒、人免疫缺陷病毒及猴免疫缺陷病毒。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用,其特征在于所述的囊膜蛋白env的氨基酸序列如SEQIDN0.3所示。`
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子釋放的蛋白，其編碼序列及在抑制病毒從細胞釋放中的應(yīng)用。本發(fā)明研究了該蛋白與馬傳染性貧血病毒(EIAV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1)及猴免疫缺陷病毒(SIV)的相互作用關(guān)系，并確定他們相互作用的關(guān)鍵位點。本發(fā)明通過分子克隆技術(shù)，獲得了該蛋白基因和EIAV病毒樣顆粒的真核表達載體，經(jīng)測序分析，克隆的該蛋白基因與該基因的預(yù)測序列的同源性為99%，相對應(yīng)的氨基酸序列同源率為94.0%。該蛋白具有限制人免疫缺陷病毒1型、馬傳染性貧血病毒、以及猴免疫缺陷病毒病毒粒子從細胞釋放的能力，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，EIAV的env蛋白能夠拮抗該蛋白對病毒的限制作用。
文檔編號C07K14/47GK103073629SQ20131000196
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月4日
發(fā)明者王曉鈞, 胡哲 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所