專利名稱：一種分離純化10-去乙酰紫杉醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種從紫杉烷混合物中分離制備高純度醫(yī)藥中間體10-去乙酰紫杉醇的方法，尤其涉及10-去乙酰紫杉醇和其類似物10-去乙酰紫杉醇C的分離。
背景技術(shù)：
紫 杉醇被認為是上世紀天然藥物研發(fā)領(lǐng)域最重大的發(fā)現(xiàn)之一，其先后被美國FDA批準用于治療乳腺癌、卵巢癌以及非小細胞肺癌等實體癌的一線治療(Lancet，2000，355，1176)。目前紫杉醇的制備工藝主要有三種:1)直接提取，2)植物細胞培養(yǎng)，3)半合成。其中半合成主要以10-去乙?；涂ㄍII和10-去乙酰紫杉醇(10-Deacetyl-Paclitaxel,10-DAP)為原料，尤其是以10-DAP為原料的半合成工藝具有合成路線短、收率高、工藝簡單易操作等特點。10-DAP有兩個主要來源:1)紅豆杉屬植物直接提取天然的10-DAP ；2)木糖酶轉(zhuǎn)化多種紅豆杉中富含的7-木糖-10-去乙酰紫杉醇進而獲得10-DAP。但以上兩種方法都難以直接獲得高純度的10-DAP進而用于紫杉醇的半合成，主要是因為紅豆杉屬植物次生代謝路徑復(fù)雜，天然提取物中化學(xué)成分繁多，同時含有多種分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)與10-DAP的類似物，如10-去乙酰三尖杉寧堿及10-去乙酰紫杉醇C等，極大的影響了 10-DAP的分離與純化。由于這些類似物具有相同的母核及類似的側(cè)鏈，結(jié)構(gòu)上的唯一區(qū)別是側(cè)鏈3’-酰胺上的取代基不同(如圖1所示)。結(jié)構(gòu)的相似也決定了其具有相似的物理化學(xué)性質(zhì)和色譜保留行為，所以借助傳統(tǒng)分離工藝很難將這三種化合物分離。10-去乙酰紫杉醇和10-去乙酰三尖杉寧堿的分離，可借鑒紫杉醇和三尖杉寧堿的分離手段，如利用氧化、臭氧化、溴化等方法對三尖杉寧堿側(cè)鏈中不飽和雙鍵的特性對其衍生后再進行分離。但是由于10-去乙酰紫杉醇C結(jié)構(gòu)上無雙鍵難以實現(xiàn)選擇性化學(xué)修飾，對于10-去乙酰紫衫醇和其類似物10-去乙酰紫杉醇C 一直沒有高效的分離方法。目前直接分離10-去乙酰紫衫醇和其類似物10-去乙酰紫杉醇C的方法，主要是利用精細色譜技術(shù)進行分離，具體包括:1)反相色譜分離(J.Liq.Chromatogr.1993，16，3263)，這大大增加了生產(chǎn)成本；2)制備性TLC、HPLC以及HPLC與HSCCC(高速逆流色譜)相結(jié)合的方法分離。以上兩種方法由于反相填料造價昂貴、處理量小、同時紫杉烷類化合物在含水溶劑中溶解度低，易析出等因素導(dǎo)致無法實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從紫杉烷混合物中分離純化10-DAP的方法，通過此方法可獲得高純度10-DAP。整個工藝操作簡單，溫和可控且收率高，適于規(guī)?；苽涓呒兌?0-去乙酸紫杉醇。本發(fā)明提供的一種從紫杉烷中分離純化10-DAP的方法，具體為:天然提取或經(jīng)木糖酶水解10-去乙酰-7-木糖紫杉醇(DAXP)等方法獲得的含10-DAP的紫杉烷混合物為原料，在有機溶劑反應(yīng)體系中與弱極性或非極性羥基保護劑反應(yīng)，高選擇性地單一保護紫杉烷混合物C(2')位羥基，產(chǎn)物進行正相硅膠柱層析，采用三元梯度洗脫的方法分離獲得高純度C (2')位羥基保護的10-DAP，再去掉羥基保護基，即可得到高純度的10-DAP。上述方法中，所述的反應(yīng)體系選擇易溶解原料的非質(zhì)子性溶劑，包括氯仿、二氯甲烷、四氫呋喃、乙酸乙酯、N，N- 二甲基甲酰胺中的任意一種，優(yōu)選N，N- 二甲基甲酰胺或二氯甲烷。上述方法中，所述的羥基保護劑選自三甲基氯硅烷、三乙基氯硅烷、叔丁基二甲基氯硅烷、叔丁基二苯基氯硅烷等硅試劑或者氯甲酸芐酯等非極性保護基中的任意一種。上述方法中，所述的反應(yīng)溫度為-2(Γ 80 °e，反應(yīng)時間為f 15小時。上述方法中，所述的正相硅膠柱層析，分離柱選用普通玻璃柱或金屬柱，固定相選擇硅膠，硅膠粒徑選用200-400目；樣品與固定相質(zhì)量比為1: 10 1: 40。上述方法中，所述的正相硅膠柱層析，三元流動相分別選擇非極性、中等極性及高極性溶劑。其中非極性溶劑選擇石油醚、環(huán)己烷、正己烷中的一種；中等極性溶劑選擇乙酸乙醋、丙酮、氯仿中的一種；高極性溶劑選擇甲醇、乙醇或異丙醇中的一種；梯度范圍為100:10:1 20:10:1 (體積比)。本發(fā)明針對以提取天然紫杉烷為原料制備高純度紫杉醇中所涉及的10-去乙酰紫杉醇C的去除難題。通過采用硅烷等小極性基團對10-去乙酰紫杉烷C(2’)羥基進行高效，高選擇性的單一保護，增加了 10-去乙酰三尖杉寧堿、10-去乙酰紫杉醇和10-去乙酰紫杉醇C間的分離度。采用三元梯度洗脫實現(xiàn)了常規(guī)、廉價的硅膠柱分離去除10-去乙酰紫杉醇C獲得高純度DAP的目的。整個方法操作簡單，溫和可控且效率高，適于規(guī)?；苽浼兌却笥?9%的10-DAP。


圖1.紫杉醇、10-去乙酰紫杉醇及其類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式；
圖2.10-去乙酰紫杉烷混合物C(2’ )位羥基由叔丁基二甲基硅烷(TBS)保護及分離路線 圖3.柱層析前后的10-去乙酰紫杉醇C(2’ )位羥基由叔丁基二甲基硅烷(TBS)保護產(chǎn)物的LC-UV譜 圖4.10-去乙酰紫杉醇C(2’)位羥基由叔丁基二甲基硅烷(TBS)保護產(chǎn)物正負離子模式下 ES1-MS 分析譜圖，948 為[M+Na]+；ffl/z 924 為[Μ-ΗΓ ； Λ 970 為[M+HCOOHF ;圖5.10-去乙酰紫杉醇終產(chǎn)品的LC-UV譜 圖6.10-去乙酰紫杉醇負離子模式下ES1-MS分析譜圖.μ/ζ 810為[Μ_Η]_遇Λ 856為[M+HCOOHF。
具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步地說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對本發(fā)明制備方法的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。實施例1
稱取10-去乙酰紫杉烷樣品(含10-去乙酰紫杉醇70.16%，10-去乙酰三尖杉寧堿16.56，10-去乙酰紫杉醇C 6.59%) 1.6g溶于8ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并在冰水浴中攪拌溶清。加入咪唑850 mg，叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl) 900 mg，緩慢升至25°C反應(yīng)6 8h，TLC檢測反應(yīng)結(jié)束。加入NH4Cl水溶液和乙酸乙酯提取，有機相減壓(IOmm Hg)蒸干，二氯甲烷溶解上硅膠柱。硅膠粒徑30(Γ400目；樣品與固定相質(zhì)量比為1:20。石油醚/丙酮/甲醇(60:10:1，體積比)進行梯度洗脫。收集得到2’ -叔丁基二甲基硅基-10-去乙酰紫杉醇1.2g，純度98.65%，收率92.8% ;2’ -叔丁基二甲基硅基-10-去乙酰紫杉醇C90 mg。
將所得2’ -叔丁基二甲基硅基-10-去乙酰紫杉醇1.2g溶于10 ml 2%HC1甲醇中，25 °C反應(yīng)2 h，TLC檢測反應(yīng)結(jié)束。加入水和乙酸乙酯提取，有機相減壓(IOmm Hg)蒸干，甲醇水結(jié)晶得10-去乙酰紫杉醇980 mg,純度99.6%，收率95%。實施例2
稱取10-去乙酰紫杉烷樣品(含10-去乙酰紫杉醇70.16%，10-去乙酰三尖杉寧堿16.56，10-去乙酰紫杉醇C 6.59%) 1.2 g溶于8 ml 二氯甲烷(DCM)中，并在冰水浴中攪拌溶清。加入三乙胺(TEA ) 2 ml，三乙基氯硅烷(TESCl) 0.64ml，并在80°C反應(yīng)lh，TLC檢測反應(yīng)結(jié)束。加入NH4Cl水溶液和乙酸乙酯提取，有機相減壓(IOmm Hg)蒸干，二氯甲烷溶解上硅膠柱。硅膠粒徑30(Γ400目；樣品與固定相質(zhì)量比為1:25。環(huán)己烷/乙酸乙醋/乙醇(70:10:1，體積比)進行梯度洗脫。收集得到2’ -三乙基硅基-10-去乙酰紫杉醇750mg,純度 97.96%,收率 75.6%。將所得2’ -三乙基硅基-10-去乙酰紫杉醇750 mg溶于7 ml 1%HC1甲醇中，25°C反應(yīng)45 min, TLC檢測反應(yīng)結(jié)束。加入水和乙酸乙酯提取,有機相減壓(IOmm Hg)蒸干，甲醇水結(jié)晶得10-去乙酰紫杉醇570 mg，純度99.3%，收率90%。實施例3
稱取10-去乙酰紫杉烷樣品(含10-去乙酰紫杉醇70.16%，10-去乙酰三尖杉寧堿16.56，10-去乙酰紫杉醇C 6.59%)1.2g溶于8ml乙酸乙酯中，并在冰水浴中攪拌溶清。力口入咪唑800 mg，叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSC1) 1.4g，在20 °G反應(yīng)12 15h，TLC檢測反應(yīng)結(jié)束。加入NH4Cl水溶液和乙酸乙酯提取，有機相減壓(IOmm Hg)蒸干，二氯甲烷溶解上硅膠柱。硅膠粒徑30(Γ400目；樣品與固定相質(zhì)量比為1:30。正己烷/氯仿/異丙醇(80:10:I，體積比)進行梯度洗脫。收集得到2’-叔丁基二苯基娃基-10-去乙酸紫杉醇l.0g ,純度 98.15%，收率 90%ο將所得溶于2’ -叔丁基二苯基硅基-10-去乙酰紫杉醇Ig溶于10 ml 2% HF甲醇溶液中，25 °C反應(yīng)4 h，TLC檢測反應(yīng)結(jié)束。加入水和乙酸乙酯提取，有機相減壓(IOmmHg)蒸干，甲醇水結(jié)晶得10-去乙酰紫杉醇680 mg,純度99.5%，收率91%。實施例4
稱取10-去乙酰紫杉烷樣品(含10-去乙酰紫杉醇70.16%，10-去乙酰三尖杉寧堿16.56，10-去乙酰紫杉醇C 6.59%)1.2 g溶于8 ml氯仿中，并在冰水浴中攪拌溶清。加入三乙胺(TEA )2 ml，三甲基氯硅烷(TMSCl) 0.8 ml，并在O °C以下反應(yīng)2 4h，TLC檢測反應(yīng)結(jié)束。加入NH4C1水溶液和乙酸乙酯提取，有機相減壓(IOmm Hg)蒸干，二氯甲烷溶解上硅膠柱。硅膠粒徑30(Γ400目；樣品與固定相質(zhì)量比為1:25。石油醚/丙酮/甲醇(100:10:1，體積比)進行梯度洗脫。收集得到2’7-二三甲基硅基--10-去乙酰紫杉醇940 mg,純度 97.76%,收率 85.6%ο
將所得2’7_ 二三甲基硅基-10-去乙酰紫杉醇940 mg溶于10 ml 1%HC1甲醇中，25 °C反應(yīng)lh，TLC檢測反應(yīng)結(jié)束。加入水和乙酸乙酯提取，有機相減壓(IOmm Hg)蒸干，甲醇水結(jié)晶得10-去乙酰紫杉醇700 mg，純度99.1%，收率96%。實施例5
稱取10-去乙酰紫杉烷樣品(含10-去乙酰紫杉醇70.16%，10-去乙酰三尖杉寧堿16.56，10-去乙酰紫杉醇C 6.59%) 1.0g溶于8 ml四氫呋喃(THF)中，并在冰水浴中攪拌溶清。加入Na2CO3 400 mg，氯甲酸芐酯0.5 ml，并在-20 0C下反應(yīng)6 8 h，TLC檢測反應(yīng)結(jié)束。加入水溶液和乙酸乙酯提取，有機相NaHCO3飽和溶液洗三遍后，有機相減壓(IOmmHg)蒸干，二氯甲烷溶解上硅膠柱。硅膠粒徑30(Γ400目；樣品與固定相質(zhì)量比為1:40。石油醚/丙酮/甲醇(20:10:1，體積比)進行梯度洗脫。收集得到2-芐氧羰基-10-去乙酰紫杉醇680 mg,純度96.46%,收率80.5%。將所得2-芐氧羰基-10-去乙酰紫杉醇680 mg溶于20 ml甲醇中，加入10% Pd/C 70mg,通入H2在25 °C反應(yīng) 8 10h，TLC檢測反應(yīng)結(jié)束。反應(yīng)液過濾，濾液減壓(IOmm Hg)蒸干后，甲醇水結(jié)晶兩次得10-去乙酰紫杉醇400 mg，純度99.4%，收率76%。
權(quán)利要求
1.一種分離純化10-去乙酰紫杉醇的方法，其特征在于:將含10-去乙酰紫杉醇的原料，在有機溶劑反應(yīng)體系中與弱極性或非極性羥基保護劑反應(yīng)，產(chǎn)物進行正相硅膠柱層析，采用三元梯度洗脫的方法分離獲得高純度C(2')位羥基保護的10-DAP，再去掉羥基保護基即得，其中: 所述的反應(yīng)體系選自氯仿、二氯甲烷、四氫呋喃、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺中的任意一種； 所述的羥基保護劑選自三甲基氯硅烷、三乙基氯硅烷、叔丁基二甲基氯硅烷、叔丁基二苯基氯硅烷、氯甲酸芐酯中的任意一種； 所述反應(yīng)的溫度為-20 80 °C，反應(yīng)時間為f 15小時； 所述的正相硅膠柱層析，分離柱選用普通玻璃柱或金屬柱，固定相選擇硅膠，硅膠粒徑選用200-400目，樣品與固定相質(zhì)量比為1: 10 "1: 40,三元流動相分別選擇非極性、中等極性及高極性溶劑，所述非極性溶劑、中等極性溶劑、高極性溶劑體積比為100:10:1 20:10:1。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述三元流動相中非極性溶劑為石油醚、環(huán)己烷、正 己烷中的一種，中等極性溶劑為乙酸乙醋、丙酮、氯仿中的一種，高極性溶劑為甲醇、乙醇或異丙醇中的一種。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述的反應(yīng)體系為N，N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述反應(yīng)的溫度為O 25°C。
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述反應(yīng)的時間為Γ8小時。
6.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述硅膠粒徑為30(Γ400目。
7.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述樣品與固定相質(zhì)量比為1: 20:30ο
8.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述梯度范圍非極性:中等極性:高極性為60:10:1 80:10:lo
全文摘要
本發(fā)明公布了一種分離純化10-去乙酰紫杉醇的方法，其特征在于將含10-去乙酰紫杉醇的原料，在有機溶劑反應(yīng)體系中與弱極性或非極性羥基保護劑反應(yīng)，反應(yīng)后的產(chǎn)物進行正相硅膠柱層析，采用三元梯度洗脫的方法分離獲得高純度C(2′)位羥基保護的10-DAP，再去掉羥基保護基即得。整個方法操作簡單，溫和可控且效率高，適于規(guī)?；苽浼兌却笥?9%的10-DAP。
文檔編號C07D305/14GK103232416SQ20131014141
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月22日
發(fā)明者楊凌, 王平, 葛廣波, 鄒超, 張輝 申請人:無錫爾云科技有限公司