專利名稱：具有抑制腫瘤微環(huán)境血管再生和激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答雙功能的融合蛋白及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種具有抑制腫瘤微環(huán)境血管再生和激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答雙功能的融合蛋白CD137L-Tumstatin及其基因，以及含有該基因的表達(dá)載體與由該載體轉(zhuǎn)化得到的菌株，還涉及該融合蛋白的制備方法，同時(shí)涉及具有⑶137L和Tumstatin雙功能的蛋白在制備抑制腫瘤微血管再生以及相關(guān)腫瘤學(xué)疾病(如，黑色素瘤、直腸癌、肺癌等)和激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答功效藥物方面的應(yīng)用，另外涉及給藥途徑方面的應(yīng)用(如，口服給藥、噴霧給藥途徑等)。
背景技術(shù)：
癌癥發(fā)生是一個(gè)多基因合作、不同信號(hào)途徑參與的過程。就其本質(zhì)而言，癌癥是一種分子病癥。當(dāng)前，靶點(diǎn)單一的分子治療策略逐漸顯示出諸多弊端，而多靶點(diǎn)、多機(jī)制聯(lián)合用藥的治療方法顯示出更好的治療效果。1971年哈佛大學(xué)Folkman教授提出“腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于微環(huán)境血管再生”學(xué)說。該理論認(rèn)為，通過抑制腫瘤微環(huán)境血管再生，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。自發(fā)表至今，該學(xué)說在世界范圍內(nèi)已得到了大量實(shí)驗(yàn)室和臨床上的數(shù)據(jù)支持，因而成為了近來腫瘤治療領(lǐng)域內(nèi)的新策略。人腫瘤抑制素(Tumstatin)是一個(gè)源于血管基底膜IV型膠原α 3鏈羧基C末端的腫瘤血管再生抑制因子，由244個(gè)氨基酸組成。在所有血管基底膜中，IV型膠原蛋白形成的三維網(wǎng)狀骨架結(jié)構(gòu)是起支架作用的主要成分，可促進(jìn)細(xì)胞的黏附、遷移、分化和生長(zhǎng)。它由6個(gè)獨(dú)特的基因分別編碼產(chǎn)生6條鏈α α 6，并以不同或相同的α鏈形成三聚體，進(jìn)一步形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。IV型膠原蛋白的每條α 3鏈都由3部分功能區(qū)組成(7S結(jié)構(gòu)域、三螺旋區(qū)、非膠原肽NCl結(jié)構(gòu)域)，分布于腎小球、肺泡毛細(xì)血管、耳蝸、晶狀體囊、卵巢和睪丸的基底膜。新生血管的形成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵性步驟，包含了一系列復(fù)雜的過程。腫瘤組織內(nèi)由于低氧，使血管形成刺激因子合成增加，從而刺激腫瘤組織微環(huán)境新生血管的生成。近來研究表明，Tumstatin可特異性地抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白的合成,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，使血管生成受到抑制，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。另外，Tumstatin還具有直接作用于腫瘤細(xì)胞并抑制其增殖的特性。其作用機(jī)制為通過與整合素受體ανβ 3結(jié)合，特異地抑制腫瘤微環(huán)境血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白的合成，進(jìn)而阻斷血管再生，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。目前學(xué)術(shù)界就抗腫瘤免疫已達(dá)成共識(shí)，即在人和動(dòng)物體內(nèi)對(duì)惡性腫瘤存在著某種程度的免疫反應(yīng)。腫瘤患者免疫系統(tǒng)的細(xì)胞能夠識(shí)別腫瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原，如組織分化抗原、癌胚抗原以及突變基因的產(chǎn)物等等。隨著對(duì)腫瘤抗原識(shí)別及免疫應(yīng)答機(jī)制的了解，研究已經(jīng)表明通過輔助分子提供免疫共刺激信號(hào)可以提高抗腫瘤免疫應(yīng)答。由于腫瘤抗原特異性T細(xì)胞需要協(xié)同刺激來輔助第一抗原信號(hào)激發(fā)效應(yīng)細(xì)胞的功能，因而，協(xié)同刺激分子的輔助治療可用于調(diào)節(jié)針對(duì)惡性 腫瘤的免疫反應(yīng)。
共刺激分子在免疫應(yīng)答中起了極其重要的作用。一般而言，激活T淋巴細(xì)胞需要兩個(gè)信號(hào)的參與，分別是T細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR)接受抗原遞呈細(xì)胞(AntigenPresenting Cells, APC)傳導(dǎo)的主要組織相容復(fù)合體-抗原肽信號(hào)(第一信號(hào))，和細(xì)胞膜表面黏附分子提供的協(xié)同刺激信號(hào)(亦即第二信號(hào))。增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫的重要方法之一即是提供T淋巴細(xì)胞活化所需要的協(xié)同刺激信號(hào)。CD137與其配體CD137L是繼CD28/B7之外新發(fā)現(xiàn)的另一對(duì)重要的T細(xì)胞協(xié)同刺激信號(hào)分子。根據(jù)結(jié)構(gòu)可將共刺激分子分為兩類:腫瘤壞死因子受體超家族(Tumor NecrosisFactor Rec印tor，TNFR)和免疫球蛋白超家族。CD137是腫瘤壞死因子受體家族的成員。它在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡中發(fā)揮著重要作用。其配體CD137L也是TNF家族的成員，系細(xì)胞表面II型跨膜蛋白，與其他TNF家族有相似的C-端氨基酸。編碼人CD137L的基因位于19p3.3，其產(chǎn)物為254個(gè)氨基酸，其中胞漿區(qū)28個(gè)氨基酸，跨膜區(qū)21個(gè)氨基酸，胞外區(qū)205個(gè)氨基酸。CD137L首先由Goodwin等人利用表達(dá)篩選技術(shù)在小鼠胸腺瘤細(xì)胞中分離提出，隨后又在人CD4+T細(xì)胞克隆中分離得到。⑶137與其配體⑶137L之間的相互作用(⑶137/⑶137L)對(duì)T細(xì)胞活化的重要作用已得到充分認(rèn)可。在鼠和人T細(xì)胞中均可觀察到，在CD3抗體(第一信號(hào))存在下，CD137便可誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖、合成細(xì)胞因子(如IFN-α )，以及延長(zhǎng)活化細(xì)胞的生存期。協(xié)同刺激信號(hào)可通過提高抗原特異性和效應(yīng)CD8+T細(xì)胞的數(shù)量來增強(qiáng)效應(yīng)功能；但在缺乏CD3抗體信號(hào)時(shí)，⑶137分子的刺激并不能改變T細(xì) 胞的功能，表明⑶137與⑶137L相互作用所提供的只是一種協(xié)同刺激信號(hào)。Kim等對(duì)T細(xì)胞及細(xì)胞因子的研究顯示，⑶137單克隆抗體介導(dǎo)的抗腫瘤免疫依賴于CD4+T、CD8+T細(xì)胞的共同參與。CD137介導(dǎo)NF_kB的活化，進(jìn)而上調(diào)bcl_xL和bfl_l分子的表達(dá)，延長(zhǎng)⑶8+T、⑶4+T細(xì)胞的生存并促進(jìn)其增殖。Melero等人利用激活型鼠源⑶137單克隆抗體來開展CD137靶向免疫治療。結(jié)果表明CD137單抗能夠消除小鼠體內(nèi)已接種的P815實(shí)體瘤。與激活型CD137單克隆抗體的抗腫瘤效果一致，CD137L可協(xié)同激發(fā)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞效應(yīng)(Cytotoxic lymphocyte, CTL)和抗腫瘤效應(yīng)。OH37L-/-小鼠很好地說明了 CD137/CD137L系統(tǒng)在T細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)病毒和腫瘤免疫應(yīng)答中所起的重要作用。對(duì)⑶137或⑶137L缺陷型小鼠的研究表明⑶137/⑶137L的協(xié)同刺激作用對(duì)移植物抗宿主病、T細(xì)胞的抗病毒細(xì)胞性應(yīng)答很重要。綜上所述，⑶137/⑶137L提供的刺激信號(hào)能協(xié)同⑶28/B7分子對(duì)進(jìn)一步活化T細(xì)胞，維持⑶8+T細(xì)胞的增殖和生存。而Tumstatin可以有效抑制腫瘤血管的生成，對(duì)腫瘤細(xì)胞的存活、轉(zhuǎn)移起阻滯作用。所以本發(fā)明中的融合蛋白Tumstatin-CD137L可以從抑制血管生成與增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答兩個(gè)方面共同抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，從而避免單一治療引起的藥物耐受，為治療腫瘤患者提供新的策略。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過短的柔性連接肽將Tumstatin抗血管生成活性片段與⑶137L胞外區(qū)蛋白合成一個(gè)同時(shí)具有增強(qiáng)T細(xì)胞免疫與抗血管生成的雙功能、雙靶點(diǎn)的分子；并且在本發(fā)明中選取了 Tumstatin不同的相關(guān)活性位點(diǎn)(Tumstatinl第45位至第98位氨基酸片段，Tumstatin2第60位至第132位氨基酸片段，Tumstatin3第60位至第98位氨基酸片段，Tumstatin7第74位至第98位氨基酸片段)與CD137L胞外區(qū)蛋白氨基酸序列(CD137L1第46位至第254位氨基酸片段，⑶137L5第83位至第254位氨基酸片段，⑶137L6第45位至第85位氨基酸和第167位至第254位氨基酸的接合片段，示意圖如圖2所示)通過連接肽相連接，利用原核或真核表達(dá)系統(tǒng)制備，此方法具有制備簡(jiǎn)單及避免了全長(zhǎng)Tumstatin和全長(zhǎng)CD137L的副作用問題，本發(fā)明將在制備血管生成抑制劑、各種腫瘤相關(guān)疾病(如黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、大腸癌、腎癌、膀胱癌等)、視網(wǎng)膜病變、細(xì)胞增殖、機(jī)體細(xì)胞因子合成與分泌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等藥物，以及在制備以口服或注射等相關(guān)劑型藥物中有很好的應(yīng)用前景與市場(chǎng)價(jià)值。本發(fā)明的目的是提供一個(gè)兼有Tumstatin和⑶137L功能的蛋白。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼上述具有Tumstatin和⑶137L功能的蛋白的基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述具有Tumstatin和⑶137L功能的蛋白的制備方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述具有Tumstatin和⑶137L功能的蛋白及其基因在治療腫瘤學(xué)相關(guān)疾病(如，黑色素瘤、直腸癌、肺癌等)和給藥途徑方面(如，口服給藥、噴霧給藥途徑等)的應(yīng)用。本發(fā)明技術(shù)方案具體如下:
一種具有Tumstatin和CD137L雙功能重組蛋白，具有Tumstatin活性片段氨基酸序列和CD137L胞外區(qū)蛋白片段氨基酸序列，所述CD137L胞外區(qū)蛋白片段氨基酸序列和Tumstatin活性片段氨基酸序列通過柔性連接肽融合而成,所述Tumstatin活性片段氨基酸序列選自SEQ ID N0.52或SEQ ID N0.55，所述CD137L胞外區(qū)蛋白片段氨基酸序列選自SEQ IDN0.64至SEQ ID N0.66所示的氨基酸序列中的一種。上述連接肽氨基酸序列可采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段進(jìn)行設(shè)計(jì)，優(yōu)選SEQ ID N0.56至SEQ ID N0.63中的一種。本發(fā)明所述雙功能重組蛋白氨基酸序列優(yōu)選SEQ ID N0.19-SEQ ID N0.36所述中的一種，所述重組蛋白結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。本發(fā)明還提供了編碼上述具有Tumstatin和⑶137L雙功能重組蛋白基因，包括編碼CD137L胞外區(qū)蛋白片段的基因、編碼連接肽的基因和編碼tumstatin活性片段的基因，其中所述編碼CD137L胞外區(qū)蛋白片段的基因選自SEQ ID N0.49-SEQ ID N0.51中的一種，所述編碼Tumstatin活性片段的基因選自SEQ ID N0.37-SEQ ID N0.40中的一種。上述編碼連接肽的基因優(yōu)選SEQ ID N0.41-SEQ ID N0.48中的一種。上述重組蛋白基因，其優(yōu)選具有SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.18之一的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種編碼上述重組蛋白Tumstatin-⑶137L的基因，與上述的核苷酸序列相比具有70%及以上的同源性，能編碼本發(fā)明所述重組蛋白或其保守性變異多肽或其活性片段或其活性衍生物。本發(fā)明還提供了上述具有Tumstatin和⑶137L雙功能重組蛋白的制備方法,包括如下步驟:
(!)設(shè)計(jì)得到本發(fā)明所述編碼具有Tumstatin活性與⑶137L活性的重組蛋白基因序列；
(2)構(gòu)建含上述基因序列表達(dá)系統(tǒng)，包括構(gòu)建表達(dá)載體再將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，形成可表達(dá)本發(fā)明所述具有Tumstatin活性與⑶137L活性的重組蛋白的重組細(xì)胞；
(3)培養(yǎng)步驟(2)重組細(xì)胞；
(4)分離純化得到本發(fā)明所述具有Tumstatin活性與⑶137L活性的重組蛋白。上述表達(dá)系統(tǒng)可選用原核表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)系統(tǒng)，原核表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)選大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)或枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)，這兩個(gè)表達(dá)系統(tǒng)普遍適應(yīng)于本發(fā)明所述重組蛋白的表達(dá)，其中大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)載體優(yōu)選pET-1 la、pET-22b，枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)載體優(yōu)選pP43 ;真核表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)選酵母表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)載體優(yōu)選pPIC9K、pPICZ α Α,酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選 GSl 15 或 SMDl 168。上述制備方法的一種優(yōu)選方案為:將編碼上述具有Tumstatin活性與⑶137L活性的重組蛋白Tumstatin-CD137L的基因通過Ndel及Nhel雙酶切，然后連接至表達(dá)載體pET-1 Ia的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，經(jīng)液體培養(yǎng)工程菌獲得包涵體形式的目的蛋白。通過將包涵體進(jìn)行稀釋復(fù)性的方法，即用含低濃度尿素的溶液多次洗滌包涵體蛋白，然后用含8M尿素的變性液在50°C溶解包涵體，最后用含0.4M L-Arg的復(fù)性液稀釋復(fù)性包涵體(目的產(chǎn)物純度達(dá)80%以上)，得到本發(fā)明所述重組蛋白。上述制備方法的一種優(yōu)選方案為:將編碼上述具有Tumstatin活性與⑶137L活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L的基因通過PstI及HindIII雙酶切，然后連接至表達(dá)載體PP43的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，再電轉(zhuǎn)枯草桿菌WB800，經(jīng)液體培養(yǎng)工程菌獲得分泌至胞外可溶形式的目的蛋白。利用DEAE陰離子交換的方法進(jìn)行純化，純度達(dá)80%以上，得到本發(fā)明所述重組蛋白。上述制備方法的一種優(yōu)選方案為:將編碼上述具有Tumstatin活性與⑶137L活性的重組蛋白Tumstatin-⑶137L的基因通過EcoRI及NotI雙酶切，然后連接至表達(dá)載體pPICZ a A的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，再電轉(zhuǎn)畢赤酵母GSl 15，經(jīng)液體培養(yǎng)工程菌獲得分泌至胞外可溶形式的目的蛋白。通過DEAE陰離子交換的方法進(jìn)行純化，純度達(dá)90%以上，得到本發(fā)明所述重組蛋白。本發(fā)明還提供了上述具有Tumstatin和⑶137L雙功能重組蛋白在制備抑制腫瘤微環(huán)境血管再生以及相關(guān)腫瘤學(xué)疾病(如，黑色素瘤、直腸癌、肺癌等)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、T細(xì)胞增殖和機(jī)體細(xì)胞因子的合成與分泌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述具有Tumstatin和⑶137L雙功能重組蛋白基因在制備抑制腫瘤微環(huán)境血管再生以及相關(guān)腫瘤學(xué)疾病(如，黑色素瘤、直腸癌、肺癌等)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、T細(xì)胞增殖和機(jī)體細(xì)胞因子的合成與分泌的藥物中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，本發(fā)明所述的重組蛋白可以單獨(dú)使用或以藥物組合物的形式使用。藥物組合物包括作為活性成分的本發(fā)明所述的重組蛋白和可藥用載體。較佳的，藥物組合物有0.1-99.9%重量百 分比的作為活性成分本發(fā)明所述的重組蛋白?！翱伤幱幂d體”不會(huì)破壞本發(fā)明重組蛋白的藥學(xué)活性，同時(shí)其有效用量，即能夠起藥物載體作用時(shí)的用量對(duì)人體
母O“可藥用載體”包括但不限于:離子交換材料、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化藥物傳遞系統(tǒng)(SEDDS^n d-維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯、吐溫或其他類似聚合介質(zhì)等藥物制劑用的表面活性劑、血清蛋白如人血清白蛋白、緩沖物質(zhì)如磷酸鹽、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸部分甘油酯混合、水、鹽、電解質(zhì)如硫酸鹽精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅膠、硅酸鎂等。聚乙烯吡咯酮、纖維素物質(zhì)、聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、乙烯-聚氧乙烯-嵌段聚合物和羊毛脂、環(huán)糊精如α-、β_、Y-環(huán)糊精或其經(jīng)化學(xué)修飾的衍生物如2-和3-羥丙基-β -環(huán)糊精等羥烷基環(huán)糊精或其他可溶性衍生物等均可用于促進(jìn)本發(fā)明所述重組蛋白的藥物傳遞。其他可藥用輔料如填充劑(如無水乳糖、淀粉、乳糖珠粒和葡萄糖)、粘合劑(如微晶纖維素)、崩解劑(如交聯(lián)羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙基纖維素和交聯(lián)PVP)、潤(rùn)滑劑(如硬脂酸鎂)、吸收促進(jìn)劑、香味劑、甜味劑、稀釋劑、賦形劑、潤(rùn)濕劑、溶劑、增溶劑和著色劑等也可加入本發(fā)明的藥物組合物中。在上述的藥物組合物中，沒有限制可以任選使用的任何劑型。例如，可舉例說明的有口服給藥形式如片劑、膠囊劑、顆粒劑、粉劑或液體制劑，或胃腸外給藥形式如注射、局部產(chǎn)品或栓劑，他們可以以常規(guī)方法配制或非常規(guī)方法如脂質(zhì)體等。當(dāng)使用本發(fā)明所述重組蛋白作為治療劑時(shí)，其使用量對(duì)于成人大致每天0.0lmg至Ig的范圍內(nèi)，這取決于各患者的年齡、性別、體重和癥狀程度，并且日劑量可分為幾個(gè)劑量。本發(fā)明所述的重組蛋白還包括采用現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)方法對(duì)本發(fā)明所述重組蛋白進(jìn)行修飾的修飾蛋白。對(duì)于蛋白質(zhì)和 肽類藥物，在多數(shù)情況下，機(jī)體內(nèi)的氨肽酶及羧肽酶很容易從常見的直鏈肽的兩端進(jìn)行逐步的切割分解，使直鏈肽被降解。多肽修飾是改變肽鏈主鏈結(jié)構(gòu)和側(cè)鏈基團(tuán)的重要手段，已有大量文獻(xiàn)表明經(jīng)過修飾后的多肽藥物可以顯著降低免疫原性、減少毒副作用、增加水溶性、延長(zhǎng)體內(nèi)作用時(shí)間、改變其生物分布狀況等等，明顯改善藥物的療效。本發(fā)明所述重組蛋白常用修飾方法包括中間殘基的修飾、氨基酸替換、糖基化修飾及PEG修飾等，基本原理都是增加多肽分子的相對(duì)分子量和空間位阻，提高其對(duì)多肽水解酶的穩(wěn)定性，減少腎小球的濾過作用。替換肽鏈中的某幾個(gè)氨基酸是另一種推遲酶降解使多肽藥物的半衰期延長(zhǎng)的方式，替換對(duì)象通常為肽鏈中的易酶解的氨基酸。具體的說，可對(duì)重組蛋白中間殘基進(jìn)行糖基化、磷酸化、甲基化、乙酰化、硝基化、磺酸化或者連接PEG修飾或者偶聯(lián)蛋白質(zhì)，其中:
糖基化修飾最常用的為N-糖基化和O-糖基化。糖基化修飾肽優(yōu)選在本發(fā)明所述重組蛋白氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)Tyr、Ser或Thr殘基上的氧與糖相連或本發(fā)明所述重組蛋白的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)天冬酰胺側(cè)鏈的酰胺氮與糖相連。磷酸化修飾肽優(yōu)選在本發(fā)明所述重組蛋白氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)Tyr、Ser或Thr位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化。甲基化修飾肽包括側(cè)鏈甲基化修飾肽和N端甲基化修飾肽，側(cè)鏈甲基化優(yōu)選在本發(fā)明所述重組蛋白氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)Lys、Tyr或Arg側(cè)鏈上進(jìn)行甲基化,如Lys (For), Lys(Me), Lys(Me)2, Lys(Me)3, Arg(Me)2symmetrical, D-Tyr(Me), D-Tyr (Et)；
乙?；揎楇膬?yōu)選在本發(fā)明所述重組蛋白氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)Lys或Ser側(cè)鏈進(jìn)行乙酰化，如Ser (Ac)或Lys (Ac)。
硝基化或磺酸化修飾肽優(yōu)選在本發(fā)明所述重組蛋白氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)Tyr側(cè)鏈上進(jìn)行硝基化或磺酸化，Tyr(3-N02)，Tyr(SO3H2)。中間殘基的PEG修飾優(yōu)選在本發(fā)明所述重組蛋白氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)Lys側(cè)鏈的氨基進(jìn)行PEG修飾，PEG分子量?jī)?yōu)選為2000-10000?；蛘?，將本發(fā)明所述重組蛋白或其上述修飾蛋白的氨基酸序列中的一種或多種氨基酸替換成相應(yīng)的氨基酸衍生物或特殊氨基酸，如將丙氨酸替換成β -丙氨酸、高苯丙氨或萘基丙氨酸，將脯氨酸替換成羥脯氨酸，亮氨酸替換成正亮氨酸，纈氨酸替換成正纈氨酸，蘇氨酸替換成別蘇氨酸，異亮氨酸替換成別異亮氨酸，天冬酰胺替換成2-乙酰氨基-2-脫氧-β -D-吡喃葡萄糖基天冬酰胺(Asn (GlcNac (Ac) 3- β _D))，賴氨酸替換成Lys(palmitoyl)。或者，將本發(fā)明所述重組蛋白或其上述修飾蛋白的氨基酸序列中的一種或多種氨基酸替換成相應(yīng)的D型氨基酸。本發(fā)明中編碼上述具有Tumstatin活性與⑶137L活性的雙功能重組蛋白的基因(NCBI中Gene ID:1285與Gene ID:8744)使用常規(guī)策略通過全基因合成、PCR方法或其兩者結(jié)合的方法獲得，其中⑶137L全長(zhǎng)序列載體模板可參考文獻(xiàn)(Wang shuzhen.J IndMicrobiol Biotechnol.2012Mar;39(3):471-6.do1:10.1007/sl0295-011-1045_l.)中公開的方法制備得到。本發(fā)明構(gòu)建了含有上述編碼具有Tumstatin和⑶137L雙功能的蛋白基因的表達(dá)載體，即通過常規(guī)PCR技術(shù)及酶切、連接將Tumstatin-連接肽-⑶137L胞外區(qū)基因片段經(jīng)NdeI和NheI雙酶切后，連接入原核表達(dá)載體pETl Ia的相應(yīng)酶切位點(diǎn)之間，經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證得到正確的表達(dá)載體。本發(fā)明構(gòu)建了含上述表 達(dá)載體的基因工程菌，即通過將目的基因轉(zhuǎn)化BL21，通過液體培養(yǎng)基小量培養(yǎng)篩選表達(dá)目的蛋白的陽性工程菌。本發(fā)明提供了獲得具有Tumstatin和⑶137L雙功能的蛋白的方法，該方法是將陽性工程菌種進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵并經(jīng)常溫誘導(dǎo)使其高效表達(dá)具有Tumstatin和⑶137L雙功能的蛋白，再收集菌體，高壓破碎細(xì)胞、離心得到的菌體沉淀經(jīng)變性溶解和稀釋復(fù)性獲得具有Tumstatin和OH37L雙功能的重組蛋白。本發(fā)明對(duì)具有Tumstatin和⑶137L雙功能的重組蛋白的活性測(cè)定是通過開展人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性試驗(yàn)(HUVEC assay)和小鼠T細(xì)胞激活試驗(yàn)來進(jìn)行的。其中，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用。小鼠T細(xì)胞激活試驗(yàn)表明，所述重組蛋白能保持⑶137L的生物活性，可協(xié)同抗⑶3和抗⑶28單克隆抗體刺激T細(xì)胞的增殖。本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明表明，采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)由Tumstatin和⑶137L胞外區(qū)活性片段重組蛋白，可以產(chǎn)生兼具Tumstatin和⑶137L雙活性的蛋白。利用本發(fā)明生產(chǎn)的Tumstatin-連接肽-⑶137L重組蛋白(兼具Tumstatin和⑶137L功能的蛋白)，具有表達(dá)效率高、表達(dá)量大、表達(dá)周期短，易于純化等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，本發(fā)明提供的融合蛋白對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用，并且具有劑量依賴性，同時(shí)也可協(xié)同抗CD3和抗CD28單克隆抗體刺激小鼠T細(xì)胞的增殖。因此，本發(fā)明為大規(guī)模生產(chǎn)Tumstatin和⑶137L重組蛋白提供了新的、安全的途徑，為進(jìn)一步研究和開發(fā)成為新一代抗腫瘤藥物奠定了扎實(shí)的基礎(chǔ)，在制藥行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為本發(fā)明所述具有Tumstatin和⑶137L雙功能的重組蛋白結(jié)構(gòu)示意圖。柔性連接肽氨基酸序列選自SEQ ID N0.56-SEQ ID N0.63中的一種。圖 2 為 CD137L1 (SEQ ID N0.64)、CD137L5 (SEQ ID N0.65)和 CD137L6 (SEQ IDN0.66)在⑶137L氨基酸全長(zhǎng)序列中的區(qū)域示意圖。圖3為氨基酸序列如SEQ ID N0.19-SEQ ID N0.36所示的重組蛋白Tumstatin-連接肽-CD137L在大腸桿菌中的表達(dá)。泳道1-18分別對(duì)應(yīng)SEQ ID N0.19-36。圖4為代表性Tumstatin-連接肽-CD137L蛋白氨基酸序列(SEQ ID N0.23-SEQID N0.30)在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)。泳道1-8分別對(duì)應(yīng)SEQ ID N0.23、24、25、26、27、28、29、30。圖5為代表性Tumstatin-連接肽-CD137L蛋白氨基酸序列(SEQ ID N0.23-SEQID N0.30)在酵母菌中的表達(dá)。泳道1-8分別對(duì)應(yīng)蛋白氨基酸序列SEQ ID N0.23、24、25、26、27、28、29、30。圖6為代表性Tumstatin-連接肽-⑶137L蛋白樣品經(jīng)稀釋復(fù)性后進(jìn)行的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖。其中，第I泳道樣品氨基酸序列為SEQ ID N0.19 ;第2泳道樣品氨基酸序列為SEQ ID N0.20 ;第3泳道樣品氨基酸序列為SEQ ID N0.21 ;第4泳道樣品氨基酸序列為SEQ ID N0.31 ;第5泳道樣品氨基酸序列為SEQ ID N0.32 ;第6泳道樣品氨基酸序列為 SEQ ID N0.35。圖7為代表性Tumstatin-連接肽-⑶137L蛋白樣品對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。圖8為代表性Tumstatin-連接肽-⑶137L蛋白樣品對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述:
本發(fā)明共設(shè)計(jì)18種具有Tumstatin活性與⑶137L活性的雙功能重組蛋白，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.18所示序列，翻譯編碼氨基酸序列為SEQ ID N0.19至SEQ ID N0.36所示序列。該組蛋白具有Tumstatinl第45位至第98位氨基酸片段、Tumstatin2第60位至第132位氨基酸片段、Tumstatin3第60位至第98位氨基酸片段或Tumstatin7第74位 至第98位氨基酸片段與CD137L胞外區(qū)蛋白氨基酸序列(CD137L1第46位至第254位氨基酸片段，⑶137L5第83位至第254位氨基酸片段，⑶137L6第45位至第85位氨基酸和第167位至第254位氨基酸的接合片段中的一種，兩者通過柔性連接肽連接融合而成，其中連接肽氨基酸序列如SEQ ID N0.56至SEQ ID N0.63所示。本發(fā)明在連接有上述Tumstatin活性片段基因和連接肽基因的核苷酸序列的(如SEQ ID N0.76-SEQ IDN0.80所示)的5’端和3’設(shè)計(jì)EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)，交由上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行全合成，并連入具有相應(yīng)酶切位點(diǎn)pBluescriptll SK(+)載體,重組載體由上海捷瑞生物工程有限公司提供。各類表達(dá)載體由Novagen公司購(gòu)得，ToplO和BL21 (DE3)菌株由Invitrogen公司購(gòu)得。PMD18-T載體、溶液I (貨號(hào):D103A)、逆轉(zhuǎn)錄酶、T4DNA連接酶和Ndel、NheI等限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自TAKARA公司。引物的合成和核苷酸序列測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。變性溶解和稀釋復(fù)性所采用的尿素(分析純)購(gòu)自南京試劑化學(xué)品有限公司。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。小鼠T細(xì)胞增殖試驗(yàn)所使用的EasySep Negative Selection Kit 購(gòu)自 Stem Cell 公司?？?CD3 和抗 CD28 單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。實(shí)施例1:具有Tumstatin活性與OH37L活性的重組蛋白Tumstatin-Q)137L在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)
1.表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建
共設(shè)計(jì)了 18種具有Tumstatin活性與⑶137L活性的雙功能重組蛋白，該蛋白為Tumstatinl/ Tumstatin2/Tumstatin3/Tumstatin7 和 CD137L1/CD137L5/CD137L6 與連接肽融合而成(圖1)。其中，CD137L1、CD137L5、CD137L6分別來自CD137L全長(zhǎng)氨基酸序列的46-254位氨基酸、83-254位氨基酸，以及45-85位氨基酸和167-254位氨基酸(圖2)。該蛋白核苷酸序列為SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.18所示序列，翻譯編碼氨基酸序列為SEQ IDN0.19至SEQ ID N0.36所示序列，連接肽選自SEQ ID N0.56至SEQ ID N0.63所示序列中的一種。編碼⑶137L胞外區(qū)蛋 白(⑶137L1第46位至254位氨基酸片段，⑶137L5第83位至第254位氨基酸片段，⑶137L6第45位至第85位氨基酸和第167位至第254位)氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID N0.49-SEQ ID N0.51所示，采用PCR方法擴(kuò)增得到，其中，⑶137L全長(zhǎng)序列模板參考文獻(xiàn)(Wang shuzhen.J Ind MicrobiolBiotechnol.2012Mar; 39 (3):471-6.do1:10.1007/sl0295-011-1045-l.)中公開的方法制備得到。以上述文獻(xiàn)中提及方法制備本專利所用的⑶137L模板。以SEQ ID N0.49的上游引物(SEQ ID N0.81)和SEQ ID N0.49的下游引物(SEQ ID N0.82)為引物，rTaqDNA聚合酶催化擴(kuò)增得到⑶137L1(SEQ ID N0.49)基因片段(此時(shí)該基因兩端酶切位點(diǎn)分別為5’BamHI和3’NotI)，并將該產(chǎn)物連至pMDlS-Τ載體。隨后通過酶切連接等常規(guī)分子生物學(xué)手段，將⑶137L4基因片段從pMD18-T載體上切下連接至由捷瑞公司全合成的已含有Tumstatin和連接肽(SEQ ID N0.73-SEQ ID N0.80)的 pBluescriptll SK(+)載體上。到這一步，已將完整的融合蛋白基因(SEQ ID N0.5-SEQ ID N0.12)整合在pBluescriptll SK(+)載體上。之后選用上游引物SEQ ID N0.83，下游引物SEQ ID N0.84，通過PCR的方法擴(kuò)增該融合蛋白基因，產(chǎn)物5’酶切位點(diǎn)為Nhel，產(chǎn)物3’酶切位點(diǎn)為NdeI，最終連接至表達(dá)載體pETl la。以上述文獻(xiàn)中提及方法制備本專利所用的⑶137L模板。以SEQ ID N0.50的上游引物(SEQ ID N0.85)和SEQ ID N0.50的下游引物(SEQ ID N0.86)為引物，rTaqDNA聚合酶催化擴(kuò)增得到⑶137L5(SEQ ID N0.50)基因片段(此時(shí)該基因兩端酶切位點(diǎn)分別為5’BamHI和3’ NotI),并將該產(chǎn)物連至pMDlS-Τ載體。隨后通過酶切連接等常規(guī)分子生物學(xué)手段，將⑶137L5基因片段從pMD18-T載體上切下連接至由捷瑞公司全合成的已含有Tumstatin和連接肽(SEQ ID N0.67-SEQ ID N0.72)的 pBluescriptll SK(+)載體上。到這一步，已將完整的融合蛋白基因(SEQ ID N0.K SEQ ID N0.3, SEQ ID N0.13-SEQ ID N0.16)整合在 pBluescriptll SK(+)載體上。之后選用 SEQ ID N0.1 上游引物 SEQ ID N0.87、SEQ IDN0.3 上游引物 SEQ ID N0.88、SEQ ID N0.13-SEQ ID N0.14 上游引物 SEQ ID N0.89、SEQID N0.15-SEQ ID N0.16 上游引物 90，SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.13-SEQ IDN0.16下游引物SEQ ID N0.91，通過PCR的方法擴(kuò)增該融合蛋白基因，產(chǎn)物5’酶切位點(diǎn)為Nhel，產(chǎn)物3’酶切位點(diǎn)為NdeI，最終連接至表達(dá)載體pETl la。以上述文獻(xiàn)中提及方法制備本專利所用的⑶137L模板。以SEQ ID N0.51的上游引物 I (SEQ ID N0.92)和 SEQ ID N0.51 的下游引物 I (SEQ ID N0.93)為引物，以 SEQ IDN0.51的上游引物2 (SEQ ID N0.94)和SEQ ID N0.51的下游引物2 (SEQ ID N0.95)為弓丨物，rTaqDNA聚合酶催化擴(kuò)增得到CD137L6 (SEQ ID N0.51)的兩個(gè)基因片段，瓊脂糖電泳切膠回收該兩段基因。隨即使用分子生物學(xué)OverlapPCR技術(shù)，將回收得到的兩段基因用做模板，
以 CD137L6 的上游引物 I (SEQ ID N0.92)和 CD137L6 的下游引物 2 (SEQ ID N0.95)為引物，擴(kuò)增出最終的CD137L6 (SEQ ID N0.51)片段(兩端酶切位點(diǎn)5’BamHI和3’NotI)并連接至PMD18-T載體。隨后將CD137L6(SEQ ID N0.51)基因片段從pMD18_T載體上切下連接至由上海捷瑞公司合成的已含有Tumstatin和連接肽(SEQ ID N0.67、SEQ ID N0.68、SEQ ID N0.70,SEQ ID N0.72)的 pBluescriptll SK(+)載體上。到這一步，已把完整的融合蛋白基因(SEQ ID N0.2,SEQ ID N0.4,SEQ ID N0.17-18)整合在 pBluescriptll SK(+)載體上。之后分別選用 SEQ ID N0.2,SEQ ID N0.4 上游引物 SEQ ID N0.96、SEQ ID N0.17上游引物 SEQ ID N0.97、SEQ ID N0.18 上游引物 SEQ ID N0.98, SEQ ID N0.2, SEQ IDN0.4,SEQ ID N0.17、SEQ ID N0.18下游引物SEQ ID N0.99，通過PCR的方法擴(kuò)增該融合蛋白基因(SEQ ID N0.2,SEQ ID N0.4,SEQ ID N0.17、SEQ IDN0.18)，并連接至最終表達(dá)載體pETlla。上述實(shí)驗(yàn)操作過程中涉及到的引物有:
權(quán)利要求
1.一種具有Tumstatin和OH37L雙功能重組蛋白，其特征在于該蛋白具有Tumstatin活性片段氨基酸序列和CD137L胞外區(qū)蛋白片段氨基酸序列，所述CD137L胞外區(qū)蛋白片段氨基酸序列和Tumstatin活性片段氨基酸序列通過柔性連接肽融合而成,所述Tumstatin活性片段氨基酸序列選自SEQ ID N0.52至SEQ ID N0.55中的一種，所述⑶137L胞外區(qū)蛋白片段氨基酸序列選自SEQ ID N0.64至SEQ ID N0.66所示的氨基酸序列中的一種。
2.如權(quán)利要求1所述雙功能重組蛋白，其特征在于所述連接肽氨基酸序列選自SEQIDN0.56 至 SEQ ID N0.63 中的一種。
3.如權(quán)利要求2所述雙功能重組蛋白，其特征在于具有SEQID N0.19至SEQ ID N0.36所述的氨基酸序列。
4.編碼如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的具有Tumstatin和⑶137L雙功能重組蛋白基因，其特征在于包括編碼CD137L胞外區(qū)蛋白片段的基因、編碼連接肽的基因和編碼tumstatin活性片段的基因，其中所述編碼CD137L胞外區(qū)蛋白片段的基因選自SEQ ID N0.49-SEQ IDN0.51中的一種或幾種，所述編碼tumstatin活性片段的基因選自SEQ ID N0.37或SEQ IDN0.40。
5.如權(quán)利要求4所述的雙功能重組蛋白基因，其特征在于所述編碼連接肽的基因選自SEQ ID N0.41-SEQ ID N0.48。
6.如權(quán)利要求5所述的雙功能重組蛋白基因，其特征在于具有SEQID N0.1-SEQ IDN0.18之一的核苷酸序列。·
7.一種具有Tumstatin和⑶137L雙功能重組蛋白的基因，其特征在于與權(quán)利要求4_6任一項(xiàng)所述的核苷酸序列相比具有70%及以上的同源性。
8.一種如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的具有Tumstatin和⑶137L雙功能重組蛋白的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)設(shè)計(jì)得到如權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的核苷酸序列； (2)構(gòu)建含如權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的核苷酸序列表達(dá)系統(tǒng),包括構(gòu)建表達(dá)載體并將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，形成可表達(dá)如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的具有Tumstatin活性與⑶137L活性的重組蛋白的重組細(xì)胞； (3)培養(yǎng)步驟(2)重組細(xì)胞； (4)分離純化得到如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的具有Tumstatin和⑶137L雙功能重組蛋白。
9.如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于所述表達(dá)系統(tǒng)為原核表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)系統(tǒng)，所述原核表達(dá)系統(tǒng)選自大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)或芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)；所述真核表達(dá)系統(tǒng)選自酵母表達(dá)系統(tǒng)。
10.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的具有Tumstatin和⑶137L雙功能重組蛋白在制備抑制腫瘤微環(huán)境血管再生、各種腫瘤相關(guān)疾病、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、T細(xì)胞增殖和機(jī)體細(xì)胞因子的合成與分泌藥物中的應(yīng)用。
11.如權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的具有Tumstatin和⑶137L雙功能重組蛋白基因在制備抑制腫瘤微環(huán)境血管再生、各種腫瘤相關(guān)疾病、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、T細(xì)胞增殖和機(jī)體細(xì)胞因子的合成與分泌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
具有抑制腫瘤微環(huán)境血管再生和激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答雙功能的融合蛋白及其基因和應(yīng)用。本發(fā)明公開了一組具有Tumstatin和CD137L雙功能重組蛋白，其特征在于該蛋白具有Tumstatin活性片段氨基酸序列(SEQ ID NO.52至SEQ ID NO.55中的一種)和CD137L胞外區(qū)蛋白片段氨基酸序列(SEQ ID NO.64至SEQ ID NO.66中的一種)和，兩者通過柔性連接肽融合而成。該蛋白及編碼蛋白的基因可應(yīng)用于腫瘤血管生成抑制劑、各種腫瘤學(xué)相關(guān)疾病、機(jī)體免疫調(diào)節(jié)藥物的研究與應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K19/00GK103214584SQ201310162738
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月6日
發(fā)明者劉楠, 馬超, 何東洋, 陳依軍 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)