改進(jìn)的痘病毒疫苗的制作方法
【專利說明】改進(jìn)的痘病毒疫苗 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本申請涉及改進(jìn)的痘病毒疫苗,其包含編碼抗原性蛋白質(zhì)和不變鏈的核酸構(gòu)建 體,以及用于這類痘病毒載體的新施用方案。具體地,公開了所述痘病毒載體用于引發(fā)或加 強免疫應(yīng)答的用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 感染性疾病仍然是人類的主要威脅。預(yù)防或治療感染性疾病的一種方法是通過疫 苗接種人工誘導(dǎo)免疫應(yīng)答,所述疫苗接種是向個體施用抗原性材料使得產(chǎn)生針對相應(yīng)抗原 的適應(yīng)性免疫應(yīng)答??乖圆牧峡梢允墙Y(jié)構(gòu)完整但滅活(即,非感染性)或減毒(即,感 染性降低)的病原體(例如,微生物或病毒)或者已被發(fā)現(xiàn)具有高免疫原性的病原體之純 化組分。誘導(dǎo)針對病原體的免疫應(yīng)答的另一方法是提供包含一種或多種編碼病原體之免 疫原性蛋白質(zhì)或肽的載體的表達(dá)系統(tǒng)。這樣的載體可以是裸質(zhì)粒DNA形式,或者通過使用 病毒載體(例如基于經(jīng)修飾痘苗病毒(例如,經(jīng)修飾痘苗安卡拉病毒(Modified Vaccinia Ankara) ;MVA))或腺病毒載體)來遞送免疫原性蛋白質(zhì)或肽。這樣的表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點是包 含良好表征的對環(huán)境條件具有低敏感性的組分。
[0004] 在開發(fā)基于載體的表達(dá)系統(tǒng)時,一個特定目的是向患者應(yīng)用這些表達(dá)系統(tǒng)以引發(fā) 防御由各病原體引起之感染的免疫應(yīng)答。但是,雖然誘導(dǎo)了對抗病原體的免疫原性應(yīng)答,一 些表達(dá)系統(tǒng)不能引發(fā)足夠強從而完全防御由病原體所致感染的免疫應(yīng)答。因此,仍然需要 能夠誘導(dǎo)針對病原體的保護(hù)性免疫應(yīng)答的改進(jìn)的表達(dá)系統(tǒng)以及引發(fā)增強的免疫應(yīng)答的已 知表達(dá)系統(tǒng)的新施用方案。
[0005] 抗原是在抗原提呈細(xì)胞表面上通過MHC分子提呈的肽片段??乖梢允峭鈦淼?(即病原性)、起源于或來源自生物體本身,后者稱為自身或自體抗原。有兩類MHC分子, MHC I類(MHC-Ι)和MHC II類(MHC-II)。MHC-Ι分子提呈在相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)合成的肽的片段。 MHC-II分子提呈肽的片段,其通過吞噬作用被攝取,隨后在核內(nèi)體中消化。通常,MHC-II分 子僅由"專門"抗原提呈細(xì)胞如巨噬細(xì)胞或樹突細(xì)胞表達(dá)。結(jié)合MHC-II分子的抗原被T輔 助細(xì)胞識別。T輔助細(xì)胞的T細(xì)胞受體對由MHC-II分子提呈的抗原的結(jié)合,連同由抗原提 呈細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,誘導(dǎo)TH。表型的未成熟T輔助細(xì)胞成熟為各種類型的效應(yīng)細(xì)胞。
[0006] MHC-II分子是膜結(jié)合受體,其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成并離開MHC II類區(qū)室中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。 為了阻止內(nèi)源性肽(即自身抗原)結(jié)合MHC-II分子,新生的MHC-II分子與堵塞MHC-II分 子的肽結(jié)合裂縫的另一蛋白質(zhì)不變鏈組合。當(dāng)MHC II類區(qū)室融合至含有吞噬并降解的蛋白 質(zhì)的晚期核內(nèi)體時,不變鏈被切割以僅留下結(jié)合MHC-II分子的CLIP區(qū)。在第二步中,CLIP 被HLA-DM分子移除,留下可自由結(jié)合外來抗原的片段的MHC-II分子。一旦MHC II類區(qū)室 與質(zhì)膜融合,所述片段就提呈在抗原提呈細(xì)胞的表面上,如此將外來抗原提呈給其他細(xì)胞, 主要是T輔助細(xì)胞。
[0007] 之前已發(fā)現(xiàn)(W0 2007/062656,公開為US 2011/0293704且通過提述并入本文以 公開不變鏈序列)不變鏈與包含在用于疫苗接種的表達(dá)系統(tǒng)中的抗原的融合增加針對所 述抗原的免疫應(yīng)答,如果其與腺病毒一起施用的話。而且,在引發(fā)(prime)-加強疫苗接種 方案的背景中,所述腺病毒構(gòu)建體對于引發(fā)免疫應(yīng)答證明是有用的(WO 2010/057501,公開 為US 2010/0278904且通過提述并入本文以公開編碼不變鏈序列的腺病毒載體)。本發(fā)明 人驚訝地發(fā)現(xiàn),如果不使用腺病毒而是將痘病毒用于投遞不變鏈抗原融合物,甚至能增強 針對給定抗原的免疫應(yīng)答。以此方式可以生成免疫應(yīng)答。尤其令人驚訝的是,當(dāng)用于引發(fā) 免疫應(yīng)答時,痘病毒載體也引起該效果。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 在第一方面,本發(fā)明涉及用于引發(fā)或加強免疫應(yīng)答的包含核酸構(gòu)建體的痘病毒載 體,所述核酸構(gòu)建體包含:
[0010] (i)編碼至少一種抗原性蛋白質(zhì)或其抗原性片段的核酸序列,所述核酸序列可操 作地連接于
[0011] (ii)編碼至少一種不變鏈的核酸。
[0012] 在另一個方面,本發(fā)明涉及包含以下的疫苗組合:
[0013] (a)包含核酸構(gòu)建體的痘病毒載體,所述核酸構(gòu)建體包含:
[0014] (i)編碼至少第一抗原性蛋白質(zhì)或其抗原性片段的核酸序列,所述核酸序列可操 作地連接于
[0015] (ii)編碼至少一種不變鏈的核酸,
[0016] 和
[0017] 病毒載體,其包含編碼至少第二抗原性蛋白質(zhì)或其抗原性片段的核酸序列,
[0018] 或
[0019] 第二抗原性蛋白質(zhì)或其抗原性片段,
[0020] 其中所述第一抗原性蛋白質(zhì)或其抗原性片段的至少一個表位與所述第二抗原性 蛋白質(zhì)或其片段在免疫學(xué)上相同。
[0021] 在又一個方面,本發(fā)明涉及上文所述的疫苗組合,其用于引發(fā)-加強疫苗接種方 案。還提供使用這類痘病毒載體和組合的方法。
[0022] 發(fā)明詳述
[0023] 除非另有限定,否則本文所使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本領(lǐng)域普通技術(shù) 人員通常所理解的含義相同。
[0024] 例如,本文所使用的術(shù)語如 "A multilingual glossary of biotechnological terms :(IUPAC Recommendations) ",Leuenberger,H. G.W, Nagel, B.和 '.KBlbl,H.編輯 (1995),Helvetica Chimica Acta, CH_4010Basel,Switzerland 中所述的定義。
[0025] 在本說明書和所附權(quán)利要求書通篇中,除非上下文另有需要,否則詞語"包括"以 及其變化形式例如"包含"和"含有"應(yīng)理解為意在囊括所指出整數(shù)或步驟或者整數(shù)組或步 驟組,但是不排除任何其他整數(shù)或步驟或者整數(shù)組或步驟組。
[0026] 在本說明書通篇中引用了若干文獻(xiàn)。本文所引用的每篇文獻(xiàn)(包括全部專利、專 利申請、科學(xué)出版物、制造商的說明書、說明等),無論在上文或下文中,均通過提述完整并 入本文。憑借在先發(fā)明,本文中的任何內(nèi)容都不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明沒有資格早于這些公 開內(nèi)容。本文中在本發(fā)明的一個方面的背景下提供的所有定義也適用于本發(fā)明的其他方 面。
[0027] 本發(fā)明根本性的問題由權(quán)利要求和以下說明書中表征的實施方案解決。
[0028] 在第一個方面,本發(fā)明涉及用于引發(fā)或加強免疫應(yīng)答的包含核酸構(gòu)建體的痘病毒 載體,所述核酸構(gòu)建體包含:
[0029] ⑴編碼至少一種抗原性蛋白質(zhì)或其抗原性片段的核酸序列,所述核酸序列可操 作地連接于
[0030] (ii)編碼至少一種不變鏈的核酸。
[0031] 如本文中使用的,術(shù)語"痘病毒載體"指天然存在的痘病毒科(poxviridae)的成 員或自其衍生的病毒載體,其能將核酸構(gòu)建體引入個體的細(xì)胞中。在本發(fā)明的背景中,涵蓋 當(dāng)由痘病毒載體引入后,由引入的核酸構(gòu)建體編碼的抗原和不變鏈在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
[0032] 痘病毒科的特征在于由雙鏈DNA組成的基因組。適宜地,痘病毒載體屬于脊椎動 物痘病毒亞科(subfamily chordopoxvirinae),更優(yōu)選屬于選自下組的所述亞科中的屬: 正痘病毒(orthopox)、副痘病毒(parapox)、亞塔痘病毒(yatapox)、禽痘病毒(avipox)(優(yōu) 選金絲雀痘(ALVAC)或鳥痘(fowlpox,F(xiàn)PV))和軟疣痘(molluscipox)。甚至更優(yōu)選地,痘 病毒載體屬于正痘病毒且選自下組:痘苗(vaccinia)病毒、NYVAC(源自痘苗的哥本哈根毒 株)、修飾的痘苗安卡拉(MVA)、牛痘病毒和猴痘病毒。最優(yōu)選地,所述痘病毒載體是MVA。
[0033] 對 MVA 的描述可見于 Mayr A, Stickl H, Muller HK, Danner K, Singer H. "The smallpox vaccination strain MVA:marker, genetic structure, experience gained with the parenteral vaccination and behavior in organisms with a debilitated defense mechanism. "Abstammung, Eigenschaften und Verwendung des attenuierten Vaccinia-Stammes MVA. "Zentralbl Bakteriol B. 1978Dec ; 167 (5-6):375-90 和 Mayr, A. ,Hochstein-Mintzel, V. &Stickl, H. (1975) · Infection3, 6-14。
[0034] MVA是痘苗病毒的高度減毒株,其在雞胚胎成纖維細(xì)胞的超過570次傳代期間經(jīng) 歷了多次、完全表征的缺失。這些包括宿主范圍基因和編碼細(xì)胞因子受體的基因。該病毒 不能在人和大多數(shù)其他哺乳動物細(xì)胞中有效復(fù)制,但復(fù)制缺陷發(fā)生在病毒粒體裝配的后期 階段,從而病毒和重組基因表達(dá)并未受損,使得MVA成為不能在哺乳動物中引起感染的一 種有效的單輪表達(dá)載體。
[0035] 在一個實施方案中,MVA源自從在CEF細(xì)胞上痘苗病毒的第571次傳代獲得的病 毒種批次460MG。在另一個實施方案中,MVA源自病毒種批次MVA476MG/14/78。在又一個 實施方案中,MVA在1978年12月31前衍生或產(chǎn)生且沒有朊病毒污染。
[0036] 供本發(fā)明使用的另外的痘病毒載體具有類似于MVA的特性。具體地,它們是感染 性的,但在人中不能復(fù)制。由于這一性狀,可能有必要反式表達(dá)蛋白質(zhì)以復(fù)制。典型地,那 些蛋白質(zhì)在病毒生產(chǎn)者細(xì)胞系中穩(wěn)定或瞬時表達(dá),由此允許病毒的復(fù)制。
[0037] 術(shù)語"核酸"指從核苷酸單體制得的聚合大分子。核苷酸單體由核堿基、五碳糖 (如但不限于核糖或2' -脫氧核糖)和1至3個磷酸根基團(tuán)構(gòu)成。典型地,多核苷酸經(jīng)由 各個核苷酸單體之間的磷酸二酯鍵形成。在本發(fā)明的背景中,核酸分子包括但不限于核糖 核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)。而且,術(shù)語"多核苷酸"還包括DNA或RNA的人工類似 物,如肽核酸(PNA)。
[0038] 術(shù)語"核酸構(gòu)建體"指編碼至少一個抗原性蛋白質(zhì)和至少一個不變鏈的核酸。適 宜地,所述核酸另外包含指導(dǎo)由所述核酸構(gòu)建體編碼的多肽的轉(zhuǎn)錄和翻譯的元件。這類元 件包括啟動子和增強子元件以指導(dǎo)無細(xì)胞或基于細(xì)胞的系統(tǒng),例如基于細(xì)胞的系統(tǒng)中mRNA 的轉(zhuǎn)錄。適宜地,這類啟動子和/或增強子是痘病毒載體的內(nèi)源啟動子和/或增強子。如果 核酸構(gòu)建體以可翻譯RNA提供,則涵蓋核酸構(gòu)建體包含編碼至少一個免疫原性多肽的RNA 的翻譯和/或穩(wěn)定化必需的那些原件,例如聚A尾部、IRES、帽結(jié)構(gòu)等。
[0039] 術(shù)語"基本相似"在關(guān)于核酸序列或氨基酸序列使用時指的是對相應(yīng)指定的參照 核苷酸或氨基酸序列的超過80 %,超過85 %,超過90 %,超過95 %,超過98 %或超過99 % 的序列同一性程度。
[0040] 兩個或更多個多肽中的殘基在下述情況中被稱為彼此"對應(yīng)":該殘基或殘基組 占據(jù)多肽結(jié)構(gòu)中類似的一個或多個位置。如本領(lǐng)域中公知的,兩個或更多個多肽中類似的 位置可以通過基于氨基酸序列或結(jié)構(gòu)相似性將多肽序列比對來確定。這類比對工具是本 領(lǐng)域技術(shù)人員公知的且可以是,例如,在萬維網(wǎng)上獲得的,例如Clustalff (www. ebi. ac. uk/ clustalw)或 Align (www. ebi. ac. uk/emboss/align/index. html),其使用標(biāo)準(zhǔn)i受.置,負(fù)口 對于Align為EMBOSS: :needle,矩