專利名稱：一種尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1基因，相關(guān)蛋白及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I基因，相關(guān)蛋白及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)化生長因子β (Transforming Growth Factor beta,TGF-β )超家族是一類多效應(yīng)細(xì)胞因子，在抑制腫瘤、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、組織形成、世系決定、細(xì)胞遷移和細(xì)胞凋亡等多種生理過程中發(fā)揮重要的作用。TGF-β超家族成員包括轉(zhuǎn)化生長因子iKTGF-β )、活化素(Activin)和節(jié)/骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein, BMP)三個(gè)家族。狹義上的TGF-β通常指的是TGF-β家族。TGF-β I是以前體蛋白的形式編碼，每種TGF-β I都是由一個(gè)單獨(dú)的基因編碼。TGF-β I前體蛋白是單鏈蛋白，分子量約為13000D。TGF-β I蛋白前體在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過一系列的加工過程才分泌到細(xì)胞外。其中最重要的一步是前體蛋白的水解，將前體蛋白的N端切掉，切割位點(diǎn)處有RXXR的氨基酸序列標(biāo)志，剩下的C端為TGF-β I成熟肽序列。許多動物的TGF-β I的一級結(jié)構(gòu)已經(jīng)被闡明。人的TGF-β I由390個(gè)氨基酸組成，非洲爪蟾的TGF- β I由382個(gè)氨基酸組成，斑馬魚的TGF- β I有377個(gè)氨基酸組成。TGF-β I具有高度的保守性，尤其是在成熟肽序列部分。TGF-β I的功能主要與免疫相關(guān)。尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus),屬福鰭魚亞綱，S盧形目，S盧形亞目，麗魚科，羅非魚屬。由于其具有生長快速、起捕率高、出肉率好，池塘飼養(yǎng)條件要求不高、較好適應(yīng)網(wǎng)箱等特點(diǎn)而被廣大養(yǎng)殖戶認(rèn)可，同時(shí)因其肉味鮮美、肉質(zhì)細(xì)嫩，食性雜、耐低氧、繁殖強(qiáng)等特點(diǎn)，現(xiàn)成為世界水產(chǎn)業(yè)重點(diǎn)培養(yǎng)的一種淡水養(yǎng)殖魚類，且被譽(yù)為未來動物性蛋白質(zhì)的主要來源之一，也是我國非常重要的一類出口魚類，但是現(xiàn)在由于病害導(dǎo)致羅非魚養(yǎng)殖受到了重大的損失。常見的羅非魚病主`要可分為以下幾類:1.寄生蟲性疾病:粘孢子蟲病、車輪蟲病、小瓜蟲病、斜管蟲病、頭槽絳蟲病、雙穴吸蟲病、指環(huán)蟲病和三代蟲病等；2.真菌性疾病:水霉病、鰓霉病等；3.細(xì)菌性疾病:運(yùn)動性氣單胞菌病、假單胞菌病、愛德華菌病、鏈球菌病、豎鱗病、細(xì)菌性敗血病、細(xì)菌性赤皮病和細(xì)菌性爛鰓病等。這些羅非魚疾病中，又以鏈球菌病最為惡劣，造成的損失最大。傳統(tǒng)的治療手段主要是使用抗生素，但是抗生素缺乏針對性，長期使用會使病原體產(chǎn)生耐藥性，并且會影響水環(huán)境和涉及食品安全問題；也有通過在飼料中添加像益生菌、中草藥添加劑、維生素等來增強(qiáng)魚的免疫力；也有學(xué)者研究出了抗病的疫苗，但是發(fā)現(xiàn)疫苗對病原菌的變種效果不好。這些方法都沒能突破性地解決羅非魚疾病問題。所以，研制能顯著提高尼羅羅非魚抗病能力的免疫制劑是當(dāng)前急需要攻破的課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I 基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I基因的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的:
一種尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I基因，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1所示。SEQID NO:1為編碼序列(即cDNA序列，僅為外顯子)。一種尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I成熟肽基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，成熟肽基因的核苷酸序列對應(yīng)于尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF- β I基因cDNA全序列的808bp 1143bp的序列。一種尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β 1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。一種尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I成熟肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I的ORF的第270位至第381位氨基酸序列相應(yīng)的序列即尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子βI成熟肽對應(yīng)的序列。一對用于擴(kuò)增尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I基因的引物，引物序列如SEQ IDNO:5^6 所示。本發(fā)明的尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I全長基因是以尼羅羅非魚脾總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，經(jīng)PCR和RACE方法擴(kuò)增而得到的，它來源于尼羅羅非魚脾cDNA上的轉(zhuǎn)化生長因子β I的基因全長片段。從已經(jīng)克隆得到的轉(zhuǎn)化生長因子β I的cDNA的0RF1143bp,編碼381個(gè)氨基酸。分析發(fā)現(xiàn)，序列具有很高的保守性，與其他脊椎動物相似。推導(dǎo)的轉(zhuǎn)化生長因子β I前體氨基酸序列發(fā)現(xiàn)具有保守的九個(gè)半胱氨酸(這也是轉(zhuǎn)化生長因子β成員的一個(gè)標(biāo)志性特征)。其中的8個(gè)半胱氨酸以成對的方式形成分子中心區(qū)的4對鏈內(nèi)二硫鍵，結(jié)合第9個(gè)半胱氨酸形成鏈間二硫鍵，一起形成TGF-β I 二聚體。前體肽具有特征性標(biāo)志成熟肽起始的酶識別位點(diǎn)RXXR。并且具有整合素結(jié)合位點(diǎn)RGD。一種重組表達(dá)載體，由出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)插入如上所述序列的尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I成熟肽基因。本發(fā)明構(gòu)建的含有上述尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β 成熟妝基因序列的載體；特別是含有該基因的大腸桿菌克隆載體以及表達(dá)載體。這些載體的構(gòu)建方法是按常規(guī)方法，將通過PCR方法合成的尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I成熟肽基因序列經(jīng)酶切和分離純化后，接入到已有的相應(yīng)載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)(即Sph I和Hind III)之間，即構(gòu)建成所需的含有尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子βI成熟肽基因序列的表達(dá)載體。上述含尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I成熟肽基因序列的大腸桿菌表達(dá)載體優(yōu)選由本發(fā)明合成的尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I基因與大腸桿菌表達(dá)載體PQE30構(gòu)建成的重組表達(dá)載體，命名為PQE30- TGF-β I。上述表達(dá)載體的出發(fā)載體可以是一般表達(dá)載體，可以根據(jù)需要進(jìn)行選擇。對于原核表達(dá)體系來說，PQE30載體具有以下優(yōu)點(diǎn):首先PQE30空載只有3.4kb，方便質(zhì)粒構(gòu)建；其次，重組蛋白產(chǎn)量高，有組氨酸純化標(biāo)簽，方便重組蛋白的純化；再次，PQE30載體沒有分子伴侶，減少了后續(xù)去除分子伴侶的步驟，簡化了純化過程。一種重組株， 含有如上所述尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I成熟肽基因。本發(fā)明利用上述含有尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子βI成熟肽基因序列的相應(yīng)表達(dá)載體構(gòu)建了能高效表達(dá)尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子βI成熟肽的大腸桿菌重組株。本發(fā)明的上述能表達(dá)尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子βI成熟肽的大腸桿菌重組菌株優(yōu)選由含有尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I成熟肽基因的表達(dá)載體PQE30- TGF-β I轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Μ15而得到的菌株，命名為 PQE30- TGF-β 1-Μ15。一種尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I成熟肽的制備方法包括如下步驟:
51.將如上所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，利用氨芐青霉素抗性基因篩選陽性轉(zhuǎn)化子；
52.將陽性轉(zhuǎn)化子接種在含有氨芐青霉素和卡那霉素的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，次日接種于相同培養(yǎng)基中，并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，培養(yǎng)后收集菌體，經(jīng)變性和復(fù)性分離純化得到尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子βI成熟肽。所述尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I成熟肽的具體制備方法如下:
51.將如上所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，利用氨芐青霉素抗性基因篩選陽性轉(zhuǎn)化子；
52.將陽性轉(zhuǎn)化子接種在含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，370C，200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)過夜，次日接種于相同培養(yǎng)基中，并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，30°C，200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)，6小時(shí)后收集菌體，經(jīng)分離純化得到重組尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子βI成熟肽產(chǎn)品。一種尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I多克隆抗體，是由如上所述尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I成熟肽免疫小鼠后，得到的多克隆抗體，命名為鼠抗尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I多克隆抗體。制備得到的尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I多克隆抗體在制備免疫制劑中的
應(yīng)用。 尼羅羅非魚具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，采用常規(guī)的基因工程技術(shù)，可利用本發(fā)明的尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I基因和重組株P(guān)QE30- TGF-β 1-Μ15，生產(chǎn)重組尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I成熟肽，以及制備多克隆抗體，并可進(jìn)一步用作免疫制劑和科學(xué)研究。轉(zhuǎn)化生長因子βI成熟肽可以作為飼料添加劑或者注射用的免疫增強(qiáng)劑，調(diào)動機(jī)體應(yīng)對病原感染，制備的多克隆抗體可以用于關(guān)于尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子的理論研究，如western-blot和免疫組化實(shí)驗(yàn)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明首次利用原核表達(dá)的方法得到了重組尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子βI成熟肽。通過免疫小鼠的方法制備了尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I多克隆抗體，這是首次獲得魚轉(zhuǎn)化生長因子β I的多克隆抗體。


圖1.尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I基因cDNA中間長片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析圖；Μ.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)IOObp ladder ; 1.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2.尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I cDNA3’末端PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析圖；Μ.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DS2000 ;1.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖3.尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I cDNA 5’ -RACE PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析圖；M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DS2000;第1、3泳道為雙引物擴(kuò)增結(jié)果，第2、4泳道為單引物對照。圖4.尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I cDNA全長驗(yàn)證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析圖；M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DS2000 ;1.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖5.尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I cDNA全長和推導(dǎo)的氨基酸序列圖；下劃線表示為信號肽序列，方框處表示成熟肽切割標(biāo)志，陰影部分為成熟肽序列。圖6.尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β 成熟肽cDNA序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析圖；M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DS2000 ;1.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖7.重組表達(dá)載體PQE30- TGF-β I的構(gòu)建過程示意圖。圖8.重組尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I成熟肽表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE凝膠電泳；Μ.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.上清；2.沉淀。圖9.重組尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化 生長因子β I成熟肽表達(dá)產(chǎn)物純化后的SDS-PAGE凝膠電泳；Μ.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化后產(chǎn)物。圖10.尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I多抗的特異性分析；1.尼羅羅非魚頭腎裂解液；2.斜帶石斑魚頭腎裂解液；3.重組尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I成熟肽。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例1尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I基因中間片段的合成
根據(jù)已發(fā)表的魚類的轉(zhuǎn)化生長因子β I的CDNA序列的同源性比較結(jié)果，設(shè)計(jì)合成一套簡并引物，共有一條上游引物 Fl:5’-GARGCBATTMGRRGHCAGAT-3’ (SEQ ID N0:7 所示)和一條下游引物 Rl:5，- GCMGAKGCWCCDGGRTTGTG-3’ (SEQ ID NO:8 所示)，其中 R=A/G ；B=C/G/T ；M=A/C ；H=A/T/C ；K=G/T ；ff=A/T ;D=A/T/G。以尼羅羅非魚脾總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3分鐘；下邊為40個(gè)循環(huán)，分為兩個(gè)階段:(I) 94°C變性30秒，從65°C向50°C每個(gè)循環(huán)降0.5°C，退火30秒，共30循環(huán)，72°C延伸I分鐘；(2)94°C變性30秒，55°C退火30秒，共10循環(huán)，72°C延伸I分鐘；最后72°C延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見圖1。從圖1可見第一次PCR擴(kuò)增了一段長約920bp的序列。將920bp的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pTZ57R/T載體上得到重組質(zhì)粒pTZ57R/T-TGF-0 1_M。將重組質(zhì)粒pTZ57R/T-TGF-13 1-M用pTZ57R/T的一對通用引物進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果與Genebank的序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明克隆的PCR產(chǎn)物是尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I基因的中間片段。實(shí)施例2:尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I基因3’端片段的合成
根據(jù)已經(jīng)得到的中間片段設(shè)計(jì)上游引物F2:5’ -TTTACCATGTCCATCCCTA-3’ (SEQ IDΝ0:9所示)，根據(jù)已有的魚類轉(zhuǎn)化生長因子β cDNA的比對發(fā)現(xiàn)在在終止密碼子處十分保守，故在此設(shè)計(jì)特異性下游引物R2:5’-TTAGCTACACTTGCAGGACTT-3’ (SEQ ID NO: 10所示)。以尼羅羅非魚脾總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，共30循環(huán)；72°C延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見圖2。從圖2可見PCR擴(kuò)增了一段長約393bp的序列。將303bp的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pTZ57R/T載體上得到重組質(zhì)粒pTZ57R/T_TGF-β 1-3’。將重組質(zhì)粒pTZ57R/T- TGF-β 1-3’用pTZ57R/T的一對通用引物進(jìn)行序列測定。實(shí)施例3:尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I基因5’端片段的合成
依據(jù)已克隆到的轉(zhuǎn)化生長因子β I中間片段的序列設(shè)計(jì)了 5’ RACE的三條下游引物 5’ -Rl:5’ -GTTGAACCTGTTAAGCACCT-3’ (SEQ ID NO: 11 所示)、5，-R2:5，-TGCTCCTCATCCTGCTTCT-3’ (SEQ ID NO: 12 所示)和 5，-R3:5’-CTGGTGCTGTTGTAGAGTGATAG-3’ (SEQ ID NO: 13 所示)以進(jìn)行嵌套 PCR。第一次 PCR 以尼羅羅非魚脾總cDNA經(jīng)TdT加尾后的產(chǎn)物為模板，5’ -Rl和通用引物5’ -⑶S:5’ -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’(SEQ ID NO: 14所示)為引物，經(jīng)降落PCR方法擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3分鐘；下邊為40個(gè)循環(huán)，分為兩個(gè)階段:(1)94°C變性20秒，從60°C向50 V每個(gè)循環(huán)降0.5 °C，退火20秒，共20循環(huán)，72 °C延伸I分鐘；(2 ) 94°C變性20秒，50 V退火20秒，共20循環(huán)，72°C延伸I分鐘；最后72°C延伸10分鐘。第二次PCR以第一次PCR產(chǎn)物稀釋 10 倍為模板，以 NUPA:5’_ AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’ (SEQ ID NO: 15 所示):為上游引物，分別以5’ -R2和5’ -R3為下游引物，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3分鐘；下邊為40個(gè)循環(huán):94 V變性20秒，61 °C向55 °C每個(gè)循環(huán)降0.3 °C，72 °C延伸I分鐘；最后72°C延伸10分鐘。二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見圖3。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pTZ57R/T載體上得到重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒用pTZ57R/T的一對通用引物進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果與Genebank的序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明克隆的產(chǎn)物是尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I基因5’端序列。實(shí)施例4:尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I cDNA全長序列拼接和驗(yàn)證
將已經(jīng)測序的轉(zhuǎn)化生長因子β I中間片段、5’ RACE片段和3’片段進(jìn)行拼接，根據(jù)拼接的序列設(shè)計(jì)全長驗(yàn)證的引物ORF-F:5’-GATTCACTGTTCCCAAAGG-3’ (SEQ ID NO:5所示)和ORF-R:5’-TTAGCTACACTTGCAGGACTT-3’ (SEQ ID NO:6 所示)，用高保真性的 KOD 酶進(jìn)行 PCR得到1258bp的序列。經(jīng)過整理分析得到尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I基因的cDNA的ORF全長為1143bp，序列如SEQ ID N0:1所示。并推測出其氨基酸序列，序列如SEQ ID NO: 3 ^
/Jn οPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見圖4。從圖4可見PCR擴(kuò)增了一段長約1258bp的序列。此處的引物是在ORF之外的兩端設(shè)計(jì)的，所以比ORF要長，也是為了保證整個(gè)ORF的正確性。尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I cDNA全長序列和氨基酸序列見圖5。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pTZ57R/T載體上得到重組質(zhì)粒pTZ57R/T_TGF_ β 1-0RF。實(shí)施例5:尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I成熟肽對應(yīng)序列的合成
根據(jù)拼接好的尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I基因cDNA全序列，找到成熟肽對應(yīng)的序列，設(shè)計(jì)合成兩段引物，上游引物前加上Sph I的限制酶切位點(diǎn)F:5’ -CGCGGATCCTCCACTGACACAACGGACAG-3’ (SEQ ID NO: 16 所示);下游引物前加上 Hind III的限制酶切位點(diǎn)和終止 密碼子 R:5’- CCCAAGCTTTTAGCTACACTTGCAGGACT-3’ (SEQ ID NO: 17 所示)。以尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I全長驗(yàn)證重組質(zhì)粒DNA為模板，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I前體第270位至第381位氨基酸序列相應(yīng)的cDNA序列即尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I成熟肽對應(yīng)的序列，尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I成熟肽序列如SEQID Ν0:4所示，尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I成熟肽基因序列如SEQ ID ΝΟ:2所示。PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3分鐘；下邊為40個(gè)循環(huán):94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒；最后72°C延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見圖6。從圖6可見PCR擴(kuò)增了一段長約351bp的序列。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pTZ57R/T載體上得到重組質(zhì)粒pTZ57R/T_TGF_ β I。實(shí)施例6:含尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I成熟肽cNDA序列的大腸桿菌表達(dá)載體PQE30-TGF- β I 的構(gòu)建質(zhì)粒pTZ57R/T-TGF- β 1-E和PQE空載質(zhì)粒經(jīng)限制酶Sph I和Hind III雙酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分離純化約340bp的尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I成熟肽cDNA序列和PQE載體酶切的大片段，產(chǎn)物用Ε.Ζ.N.A. Gel Extraction Kit回收。將340bp的尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I成熟肽cDNA片段與載體片段按1:3混合，用T4連接酶4°C連接16小時(shí)后，用標(biāo)準(zhǔn)氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15中，篩選具氨芐青霉素和卡那霉素雙抗性的轉(zhuǎn)化子，以標(biāo)準(zhǔn)方法提取質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒用PQE30的通用引物測序，證明質(zhì)粒中插入了羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I成熟肽cDNA序列，并完全正確，重組質(zhì)粒命名為PQE30-TGF-13 I。質(zhì)粒構(gòu)建圖見圖7。實(shí)施例7:能高效表達(dá)尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I成熟肽的大腸桿菌重組株P(guān)QE30-TGF- β 1-Μ15 的構(gòu)建
CaCl2法將PQE30-TGF- β I轉(zhuǎn)化E.coli M15，在含氨芐青霉素和卡那霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒檢測和酶切分析獲得含PQE30-TGF-13 I的重組轉(zhuǎn)化子PQE30-TGF-β 1-Μ15。實(shí)施例8:利用大腸桿菌基因工程菌PQE30-TGF-P 1-M15生產(chǎn)重組尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子βI成熟肽
挑取大腸桿菌基因工程菌PQE30- TGF-β 1-Ml5單菌落接種在含有100ug/ml氨芐青霉素和卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，370C，200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)過夜，次日按1:50接種量接種于適當(dāng)體積的相同培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至A600為0.4 0.6，加入IPTG(終濃度為0.5mmol/l),于30°C誘導(dǎo)培養(yǎng)6小時(shí)后收菌。菌體經(jīng)超聲破碎后，分別去上清和沉淀加2X電泳上樣緩沖液，煮沸5分鐘后按標(biāo)準(zhǔn)方法跑SDS-PAGE凝膠電泳。結(jié)果顯示合成的尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I成熟肽在大腸桿菌基因工程菌PQE30- TGF-β 1-Μ15中已獲得高效表達(dá)，但是重組蛋白主要在沉淀中。見圖8。擴(kuò)大培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)后，收集菌體，用裂解液重懸，搖床震蕩裂解菌體，高速離心獲得裂解上清液，經(jīng)固定化金屬配體親和層析純化，收集洗脫的蛋白，SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)和純化結(jié)果。從SDS-PAGE結(jié)果可以得出:6XHis-羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I成熟肽能被固定化鎳金屬親和層析柱所吸附，用不同PH的洗脫緩沖液洗鎳層析柱時(shí)，能把目的蛋白洗下，經(jīng)透析復(fù)性后獲羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I成熟肽。見圖9。實(shí)施例9:尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I成熟肽多克隆抗體的制備免疫小鼠:將純化的尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β I成熟肽蛋白2mg/mL，與等體積弗氏完全佐劑混勻，形成油包水的乳化物；背腹部皮下多點(diǎn)免疫昆明鼠，0.2mL/只；間隔兩周，換用弗氏不完全佐劑以同樣劑量和方式加強(qiáng)免疫小鼠，如此重復(fù)免疫3次。采集小鼠抗血清:第3次加強(qiáng)免疫7d后，小鼠斷尾取血；血清37°C放置3(T60min后，4°C再放置4h以上；最后4°C 1500r/min，離心lOmin，收集血清。第4次免疫后10d，小鼠摘眼球采血，分離血清，方法同上。間接ELISA測定血清的抗體效價(jià):羅非魚頭腎組織裂解液用0.05mM pH 9.6碳酸鹽緩沖液稀釋至I μ g/mL，100 μ L/孔，37°C包被3h，PBS-T洗滌3次，3min/次；5%的脫脂奶粉，200 μ L/孔37°C封閉Ih ；PBS-T洗滌3次；加待測血清和陰性對照血清，設(shè)計(jì)空白對照，37°C孵育1.5 h，PBS-T洗滌3次；加HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體(1: 8000)，37°C孵育Ih，PBS-T洗滌5次；加TMB底物顯色，37°C反應(yīng)IOmin ；2M H2SO4 50 μ L/孔終止反應(yīng)，15min內(nèi)在酶標(biāo)儀上用波長450 nm測量OD值。不同稀釋倍數(shù)下的OD值見表1，將不同稀釋倍數(shù)下的OD45tl值繪圖后，觀察曲線的變化趨勢，應(yīng)是一條S型曲線，中點(diǎn)值為其效價(jià)。由表I的結(jié)果表明制備的多克隆抗體效價(jià)在1:4000左右。表I鼠抗魚IgG抗體效價(jià)測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-βΙ基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
2.一種尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I成熟肽基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQID NO:2 所示。
3.一種尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-βΙ，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID N0:3所/Jn ο
4.一種尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I成熟肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。
5.一對用于擴(kuò)增尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I基因的引物，其特征在于，引物序列如SEQ ID Ν05 6所示。
6.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，由出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)插入權(quán)利要求2所述尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I成熟肽基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體為PQE30-TGF-βI 。
8.—種重組株，其特征在于，是由權(quán)利要求6或7所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中所得。
9.一種尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF- β I成熟肽的制備方法，其特征在于，具體方法為將權(quán)利要求8所述的重組株接種在含有氨芐青霉素和卡那霉素的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，次日接種于相同培養(yǎng)基中 ，并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，培養(yǎng)后收集菌體，經(jīng)變性和復(fù)性分離純化得到尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子βI成熟肽。
10.一種尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I多克隆抗體，其特征在于，是由權(quán)利要求2所述尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β I成熟肽免疫小鼠制備得到的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1基因，相關(guān)蛋白及應(yīng)用，屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1基因核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其相關(guān)蛋白TGF-β1的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。將尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1成熟肽基因進(jìn)行原核表達(dá)，獲得重組尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β1成熟肽，成熟肽免疫小鼠后即可得到相應(yīng)的多克隆抗體。重組尼羅羅非魚轉(zhuǎn)化生長因子β1成熟肽，以及制備多克隆抗體可進(jìn)一步用作免疫制劑和科學(xué)研究。
文檔編號C07K16/22GK103233013SQ20131018381
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月17日
發(fā)明者吳金英, 詹緒良, 李文笙 申請人:中山大學(xué)